CN113981064B - 糖尿病性视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，公开了一种糖尿病性视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用，所述糖尿病性视网膜病变检测生物标记物为miRNA‑375‑3p，所述标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明确定miRNA‑375‑3p表达量的改变，与糖尿病性视网膜病变的发生存在显著地相关性。miRNA‑375‑3p可以作为糖尿病性视网膜病变早期诊断的生物标记物，定期评估糖尿病性视网膜病变的进展和治疗后的复发情况。本发明为糖尿病性视网膜病变疾病的早期诊断、预后判断和早期干预治疗提供重要的参考依据，具有较大的实际临床价值，可以及早进行干预和治疗，减少非高危复发病人不必要的治疗和花费。

Description

糖尿病性视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种糖尿病性视网膜病变检 测生物标记物、检测试剂盒及应用。
背景技术
目前，糖尿病视网膜病变是主要的致盲性眼病，视网膜微血管病变被认为 是主要病因。主要表现为高血糖损伤血-视网膜屏障后，引起微血管闭塞，进而 导致新生血管形成，视功能下降，可严重影响患者生活质量。在糖尿病性视网 膜病变早期，患者可能并没有明显的症状，直至开始出现明显视力下降或视野 缺损时，方才检查出相关缺血性眼病，但此时的视力损害已不可逆。目前，针 对糖尿病性视网膜病变的治疗方式主要包括针对原发病的药物、玻璃体内药物 注射、视网膜激光和手术等，而这些对症治疗方式很难逆转视神经退变和视力 下降。因此亟待对糖尿病性视网膜病变的发生进行早期诊断和预后评估，寻找 出新型创伤性小、操作性强和灵敏度高的生物标志物。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约22nt的内源性单链非编码 RNA，其在进化过程中也保持高度保守。miRNA通过与目的mRNA的3’端非 编码区结合对翻译过程进行阻滞或者直接引起mRNA降解，从而对转录水平及 转录后水平进行调控，并参与多种生物学过程，与肿瘤、心血管疾病和代谢系 统疾病等密切相关，有望成为新型的疾病诊断生物标志物。
但是，目前尚无miRNA-375-3p作为糖尿病性视网膜病变诊断的生物学标记 物的报道。因此，亟需一种新的糖尿病性视网膜病变检测生物标记物，以弥补 现有技术的空白。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：对糖尿病视网膜病变的早 期诊断和预后评估缺乏创伤性小、操作性强和灵敏度高的生物标志物，且目前 尚无miRNA-375-3p作为糖尿病性视网膜病变诊断的生物学标记物的报道。
解决以上问题及缺陷的难度为：新型生物标记物的筛选需要以测序技术为 基础，qPCR技术验证，细胞表型实验验证标记物干预对细胞功能的影响和大量 的临床样本验证其表达量。验证过程需要科学严谨的实验设计以及有意义的统 计学分析。
解决以上问题及缺陷的意义为：针对糖尿病视网膜病变患者的早期诊断和 预后评估提供一个新型的疾病诊断标记物，这可能为糖尿病视网膜病变的诊断 和治疗提供新的思路。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种糖尿病性视网膜病变检测生 物标记物、检测试剂盒及应用，旨在解决现有技术中的一部分问题或至少缓解 现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种糖尿病性视网膜病变检测生物标记物，所述糖 尿病性视网膜病变检测生物标记物为miRNA-375-3p，所述标记物的核苷酸序列 如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种用于糖尿病性视网膜病变检测生物标记物检测的引物， 所述引物序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的糖尿病性视网膜病变检测生物 标记物的糖尿病性视网膜病变实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述糖尿病性视 网膜病变实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR扩增体系，所述PCR扩增 体系包括2×EZ-probe qPCRMaster Mix for microRNA，Probe 10μM，特异性的 qRT-PCR的上游引物，即特异性识别miR-375-3p或U6，通用3’端下游引物。
进一步，所述miRNA-375-3p特异性的qRT-PCR上游引物序列如SEQ ID NO： 2所示，所述U6定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步，所述糖尿病性视网膜病变实时荧光定量PCR检测试剂盒，还包括 反转录反应体系，所述反转录反应体系包括gDNA Remover，4×miRNA RT Buffer，miRNA RTEnzyme Mix，Nuclease free ddH2O。
进一步，所述糖尿病性视网膜病变实时荧光定量PCR检测试剂盒，还包括 RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizol reagent，氯仿，无水乙醇，DEPC ddH2O，ddH2O，异丙醇。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的糖尿病性视网膜病变检测生物 标记物的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
步骤一，样本准备：构建大鼠糖尿病性视网膜病变DR细胞模型，取实验组 和对照组大鼠骨髓来源的内皮祖细胞BM-EPC；
步骤二，差异表达miRNA筛选：采用Illumina测序平台，分析糖尿病性视 网膜病变发生相关的miRNA；
步骤三，采用定量PCR验证测序分析的实验结果后，结合GO和KEGG信 号通路分析，最终确定一个靶点用于后续的测定；
步骤四，验证靶点miRNA-375-3p在糖尿病视网膜病变患者及白内障患者的 房水和血浆中的表达差异。
进一步，步骤一中，所述实验组为高糖刺激组，n＝3；所述对照组为Ctrl组， n＝3；RNA采用TRIzol试剂提取，并保存于-80℃备用。
步骤二中，所述分析糖尿病性视网膜病变发生相关miRNA，包括：
样品检测合格后，使用小RNA Sample Pre Kit构建文库；利用小RNA的3’ 及5’端特殊结构(5’端有完整的磷酸基团，3’端有羟基)，以total RNA为起始 样品，将小RNA两端加上接头，反转录合成cDNA,随后经过PCR扩增，PAGE 胶电泳分离，得到cDNA文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定 量，随后使用Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪，Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN 进行Q-PCR，对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量；使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)试剂在cBot上生成簇，随后在Illumina测序平 台上运行测序程序，得到测序reads；针对Illumina平台的小RNA测序数据进行 分析，通过与参考基因组比对来分析物种中小RNA的表达情况，并进行差异表 达分析。
本发明的另一目的在于提供一种所述的糖尿病性视网膜病变检测生物标记 物在制备糖尿病性视网膜病变诊断试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光 定量PCR技术检测糖尿病性视网膜病变诊断试剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的糖尿病性视网膜病变检测生物标记 物的反义核苷酸在制备治疗糖尿病性视网膜病变药物中的应用，反义核苷酸的 序列如SEQ IDNO：4所示。
本发明的另一目的在于提供一种所述的糖尿病性视网膜病变检测生物标记 物在制备糖尿病性视网膜病变治疗后的预后评估试剂中的应用，特别是在制备 基于实时荧光定量PCR技术进行糖尿病性视网膜病变治疗后的预后评估试剂中 的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提 供的糖尿病性视网膜病变检测生物标记物，可根据个体的miRNA-375-3p表达水 平进行人类糖尿病性视网膜病变的诊断及病情发展的判断。miRNA-375-3p反义 核苷酸与靶miRNA-375-3p互补，抑制或封闭基因的转换和表达，或诱导Rnase H识别或切割miRNA-375-3p，使其丧失功能，因此可以作为药物用于治疗糖尿 病性视网膜病变相关眼病。因此，本发明提供了miRNA-375-3p的新用途，可作 为诊断试剂用于糖尿病性视网膜病变的早期诊断。
本发明通过高通量测序筛选和探针法定量PCR验证，发现miRNA-375-3p 与糖尿病性视网膜病变发生呈现显著地相关性。本发明利用探针法实时荧光定 量PCR技术，通过检测糖尿病视网膜病变患者相对于白内障患者房水和血浆中 miRNA-375-3p表达量的明显差异，说明miRNA-375-3p可以用于临床糖尿病性 视网膜病变患者的筛选，为糖尿病性视网膜病变的早期干预提供理论依据。
本发明确定了miRNA-375-3p表达量的改变，与糖尿病性视网膜病变的发生 存在显著地相关性。通过干预内皮祖细胞中miRNA-375-3p的表达，在细胞活性， 增殖，迁移，成管的功能实验中验证miRNA-375-3p表达量改变可以显著影响细 胞功能。miRNA-375-3p在内皮祖细胞中表达沉默后，可以显著增强细胞活性， 促进细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡。miRNA-375-3p可以作为糖尿病性视网膜 病变早期诊断的生物标记物，定期评估糖尿病性视网膜病变的进展和治疗后的 复发情况。
本发明为糖尿病性视网膜病变疾病的早期诊断、预后判断和早期干预治疗 提供重要的参考依据，具有较大的实际临床价值，可以用于筛选出糖尿病性视 网膜病变的高危人群和复发人群，以期及早进行干预和治疗，减少非高危复发 病人不必要的治疗和医疗花费。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所 需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下 还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的MicroRNA高通量测序分析筛选糖尿病性视网 膜病变发生相关的miRNA的示意图。
图1A是本发明实施例提供的箱线图分析测序的质量示意图，其中每6个样 本混合构成一个生物学重复，消除个体差异。
图1B是本发明实施例提供的散点图从整体上显示糖尿病性视网膜病变(DR) 和非糖尿病性视网膜病变(Ctrl)样本的miRNA表达差异示意图。
图1C是本发明实施例提供的聚类图从整体角度，分析糖尿病性视网膜病变 和非糖尿病性视网膜病变样本的miRNA表达差异示意图。
图2是本发明实施例提供的定量PCR分析miR-375-3p在实验组(糖尿病视 网膜病变)和对照组(白内障)患者房水中的表达差异示意图。
图3是本发明实施例提供的定量PCR分析miR-375-3p在实验组(糖尿病视 网膜病变)和对照组(白内障)患者血浆中的表达变化示意图。
图4是本发明实施例提供的分析miR-375-3p干预对大鼠糖尿病性视网膜病 变(DR)内皮组细胞相关病理过程的影响示意图。
图4A是本发明实施例提供的定量PCR分析miR-375-3p mimics转染骨髓来 源的内皮祖细胞(BM-EPC)对miR-375-3p表达的影响示意图。
图4B是本发明实施例提供的采用MTT比色法分析miR-375-3p干预对 BM-EPC活性的影响示意图。
图4C是本发明实施例提供的采用CCK-8试剂盒分析miR-375-3p干预对 BM-EPC增殖的影响示意图。
图4D是本发明实施例提供的采用Calcein-AM和Propidium Iodide(PI)免 疫荧光染色法分析miR-375-3p干预对BM-EPC凋亡的影响示意图，其中上方图 片为荧光染色图，下方图片G为统计分析图。
图4E是本发明实施例提供的采用Transwell细胞迁移实验分析miR-375-3p 干预对BM-EPC迁移功能的影响示意图，其中上方图片为细胞迁移染色图，下 方图片H为统计分析图。
图4F是本发明实施例提供的采用Matrigel胶血管生成实验分析miR-375-3p 干预对BM-EPC血管生成活性的影响示意图，其中上方图片为细胞成管图，下 方图片I为统计分析图。
图5是本发明实施例提供的糖尿病视网膜病变患者手术治疗前后，血清标 本的定量PCR检测结果示意图，横坐标代表手术治疗前后血清标本，纵坐标代 表miRNA-375-3p的表达水平。
图6是本发明实施例提供的筛选方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种糖尿病性视网膜病变检测生 物标记物、检测试剂盒及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的糖尿病性视网膜病变检测生物标记物为 miRNA-375-3p，所述标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
如图6所示，本发明实施例提供的筛选方法包括以下步骤：
S101，样本准备：构建大鼠糖尿病性视网膜病变DR细胞模型，取实验组 和对照组大鼠骨髓来源的内皮祖细胞BM-EPC；
S102，差异表达miRNA筛选：采用Illumina NovaSeq 6000测序平台，分析 糖尿病性视网膜病变发生相关的miRNA；
S103，采用定量PCR验证测序分析的实验结果后，结合GO和KEGG信号 通路分析，最终确定一个靶点用于后续的测定；
S104，验证靶点miRNA-375-3p在糖尿病视网膜病变患者及白内障患者的房 水和血浆中的表达差异。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的 冷却或加热处理，一般常温控制在10-30℃，最好是15-25℃。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
本发明是这样实现的，一种基于实时荧光定量PCR技术检测糖尿病性视网 膜病变的生物标记物，所述标记物为miRNA-375-3p，核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。其中，SEQID NO.1:miR-375-3p核苷酸序列：>rno-miR-375-3p MIMAT0005307：UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA。
本发明标记物的检测引物如SEQ ID NO.2所示。其中，SEQ ID NO:2: miR-375-3p-F:TTTGTTCGTTCGGCTCG。
一种糖尿病性视网膜病变实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR扩增体 系，所述PCR扩增体系包括2×EZ-probe qPCR Master Mix for microRNA(包括 Ex Taq酶，dNTPMixture，Mg2+，Tli RNaseH，TB Green)100μL；Probe，1 管，1μl；miRNA-375-3p特异性的qRT-PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管； 通用3’端下游引物，1管，10μM，100μL/管；U6定量PCR上游引物，1管，10μM， 100μL/管。
进一步地，所述miRNA-375-3p特异性的qRT-PCR上游引物如SEQ ID NO:2 所示，U6定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:3所示。其中，SEQ ID NO:3:U6-F：CCTGCTTCGGCAGCACA。
进一步地，所述试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括 gDNAremover(包括DNase和buffer)，1管，55ul/管；miRNA RT Enzyme Mix， 1管，110ul/管；4×miRNA RT Buffer(包括Oligo dT-universal tag通用逆转录引 物，dNTPs和buffer)，1管，275ul/管；Nuclease free ddH2O，1ml/管。
具体为：gDNA Remover，4×miRNA RT Buffer，miRNA RT Enzyme Mix， Nucleasefree ddH2O。
进一步地，所述试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizolreagent，1管，2000μL/管；氯仿，1管，500μL/管；无水乙醇，1管，8000μL/ 管；DEPC ddH2O，1管，1000μL/管；ddH2O，1管，2000μL/管；异丙醇，8000μL/ 管。
本发明生物标记物在制备糖尿病性视网膜病变诊断试剂中的应用，特别是 在制备基于实时荧光定量PCR技术检测糖尿病性视网膜病变诊断试剂中的应用。
本发明生物标记物的反义核苷酸在制备治疗糖尿病性视网膜病变药物中的 应用。
本发明生物标记物在制备糖尿病性视网膜病变治疗后的预后评估试剂中的 应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行糖尿病性视网膜病变治疗 后的预后评估试剂中的应用。
在本发明实施例中，确定miRNA-375-3p作为糖尿病性视网膜病变诊断的生 物标记物，即筛选方法包括如下步骤：
第一步：样本准备：构建大鼠糖尿病性视网膜病变(DR)细胞模型，取实 验组(高糖刺激组，n＝3)和对照组(Ctrl，n＝3)大鼠骨髓来源的内皮祖细胞 (BM-EPC)。RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。
第二步：差异表达miRNA筛选：采用Illumina测序平台，分析糖尿病性视 网膜病变发生相关的miRNA。分析具体步骤为：样品检测合格后，使用小RNA Sample Pre Kit构建文库，利用小RNA的3’及5’端特殊结构(5’端有完整的磷 酸基团，3’端有羟基)，以total RNA为起始样品，将小RNA两端加上接头， 反转录合成cDNA,随后经过PCR扩增，PAGE胶电泳分离，得到cDNA文库。 文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，随后使用Bio-RADCFX 96 荧光定量PCR仪，Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN进行Q-PCR，对文库的有效浓 度进行准确定量，以保证文库质量；使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)试剂在cBot上生成簇，之后在Illumina测序平台上运行测 序程序(SE50)，得到测序reads；针对Illumina平台的小RNA测序数据进行 分析，通过与参考基因组比对来分析物种中小RNA的表达情况，并进行差异表 达分析。
第三步：采用定量PCR验证测序分析的实验结果，然后结合GO和KEGG 信号通路分析，最终确定一个靶点用于后续的测定。
第四步：验证靶点miRNA-375-3p在糖尿病视网膜病变患者及白内障患者的 房水和血浆中的表达差异。
miRNA-375-3p反义核苷酸与靶miRNA-375-3p互补，抑制或封闭基因的转 换和表达，或诱导Rnase H识别或切割miRNA-375-3p,使其丧失功能，因此可 以作为药物用于治疗糖尿病性视网膜病变相关眼病。反义核苷酸的序列如SEQ ID NO：4：ucacgcgagccgaacgaacaaa。
实施例2：miRNA-375-3p与糖尿病性视网膜病变相关性验证
MicroRNA高通量测序分析筛选糖尿病性视网膜病变疾病有关的miRNA并 进行验证。
第一步：样本准备：构建大鼠糖尿病性视网膜病变(DR)细胞模型，取实 验组(高糖刺激组，n＝3)和对照组(Ctrl，n＝3)大鼠骨髓来源的内皮祖细胞 (BM-EPC)。RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。
第二步：差异表达miRNA筛选：采用Illumina测序平台，分析糖尿病性视 网膜病变发生相关的miRNA。分析具体步骤为：样品检测合格后，使用小RNA Sample Pre Kit构建文库，利用小RNA的3’及5’端特殊结构(5’端有完整的磷 酸基团，3’端有羟基)，以total RNA为起始样品，将小RNA两端加上接头， 反转录合成cDNA,随后经过PCR扩增，PAGE胶电泳分离，得到cDNA文库。 文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，随后使用Bio-RADCFX 96 荧光定量PCR仪，Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN进行Q-PCR，对文库的有效浓 度进行准确定量，以保证文库质量；使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)试剂在cBot上生成簇，之后在Illumina测序平台上运行测 序程序(SE50)，得到测序reads；各个样本的分布如图1A所示。针对Illumina 平台的小RNA测序数据进行分析，通过与参考基因组比对来分析物种中小RNA 的表达情况，并进行差异表达分析(见图1B)。各个样本差异性表达的miRNA 分布如图1C所示。
第三步：采用定量PCR验证高通量测序分析的实验结果(见表1)；然后 结合GO和KEGG信号通路分析，最终确定一个靶点，即miR-375-3p (hsa-miR-375-3p)用于后续的测定。miR-375-3p的核苷酸序列见SEQ ID NO.1 所示。
表1定量PCR验证高通量测序分析的实验结果
Figure BDA0003313077850000111
第四步：验证靶点miR-375-3p在实验组(糖尿病视网膜病变)和对照组(白 内障)患者房水的表达差异(如图2所示，图2为各从每组200例中选取的50例典 型病例)。
实施例3：miR-375-3p在血浆中的表达检测
第一步：血浆样本分离
收集获得实验组(糖尿病视网膜病变)和对照组(白内障)每种患者各200 例的血液样本，使用肝素抗凝管，采用密度梯度离心方式从中分离血浆，用于 miRNA的检测。离心条件为4℃，12000rpm，10min。
第二步：血浆的RNA提取
在分离的血浆样本中，加入TRIzol后室温放置10min，使样品充分裂解(注： 如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存)。每1ml TRIzol加入200μl氯仿， 剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。4℃12000rpm离心15min。样品 会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水 相转移到新管中。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min。4℃ 12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇 (用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mlTRIzol加入1ml 75％ 乙醇。4℃8000rpm离心5min，弃上清。室温放置晾干后，在沉淀内加入50μl RNase-free水，以充分溶解RNA，-70℃保存。
第三步：RNA质量检测
在260nm和280nm吸光度处，采用紫外分光光度计测定RNA的浓度；RNA溶 液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。同时，结合琼脂糖凝 胶电泳检测RNA质量，紫外透射光下观察并拍照。
第四步：RNA逆转录获得cDNA样本
逆转录采用EZB公司的microRNA Reverse Transcription Kit，按照试剂盒提供的体系(20μl)分别加入：
Figure BDA0003313077850000121
将以上体系置于无Rnase的0.2μl EP管中，按下面程序反转为cDNA：37℃ 15min，42℃10min，95℃3min，得到的cDNA放于-20℃中保存。
第五步：探针法定量PCR
探针法定量PCR反应体系(50μl)，采用EZB公司EZ-probe qPCR Master Mix formicroRNA(ROX2 plus)，按照说明书提供的体系配置如下：2x EZ-probe qPCR Master Mixfor microRNA 25μl，Probe(10μM)1μl，特异性的qRT-PCR的上游引 物2μl(特异性识别miR-375-3p或U6)，下游引物2μl，待测样品cDNA 5μl，RNase free ddH2O补足至50μl。
U6定量PCR上游引物5’-CCTGCTTCGGCAGCACA-3’；
miR-375-3p定量PCR上游引物5’-TTTGTTCGTTCGGCTCG-3’；
PCR条件：95℃5min，92℃10s；60℃30s；40个循环。
第六步：数据分析
对同一样本分别进行目标RNA和内参RNA实时荧光定量PCR检测，以内参 的表达量为基准，对目标RNA进行归一化处理，随后对目标RNA的相对表达量 采用本领域通用的Delta Ct法分析，将所有样本的目的基因miR-375-3p的Ct值减 去自身内参基因U6的Ct值，得到所有样本的Delta Ct值(ΔCt)，公式表达为ΔCt＝Ct (目的基因miR-375-3p)-Ct(内参基因U6)。最后通过比较待测样本和目标样 本的miR-375-3p的表达差异，判断待测病人的疾病易感性(如图3为各从每组200 例中选取的50例代表性病例)。
第七步：结果判读
通过探针法定量PCR的方法检测靶点miR-375-3p的表达水平并得出各组对 照组样本的ΔCt范围，见表2。比较待测样本的ΔCt，分析实验组和对照组的组间 差异。进一步分析各个样本数值是否在对照组的范围内，若待测样本的ΔCt在对 照组的ΔCt范围内，或者小于该ΔCt范围，认为待测样本为糖尿病性视网膜病变 阴性；若ΔCt大于该ΔCt范围，认为其为糖尿病性视网膜病变阳性。
表2各组样本ΔCt范围
microRNA-375-3p Ct均数-U6 Ct均数
对照组患者房水 15.2-23.7
对照组患者血浆 14.3-24.2
实验组患者房水 2.6-3.9
实验组患者血浆 1.4-2.5
根据上述结果，分别收取经临床影像学诊断确诊的200例糖尿病性视网膜病 变和200例非糖尿病性视网膜病变患者血清样本，进行miR-375-3p血清含量分析。 评价基于miR-375-3p的方法检测的准确率，如表3结果显示血清样本准确率为 82.5％，灵敏度为84.0％，表明miR-375-3p可作为糖尿病性视网膜病变诊断的生 物学标记物。
表3miR-375-3p作为生物标记物进行糖尿病性视网膜病变诊断的结果
Figure BDA0003313077850000141
第八步：基于体外实验，从基本原理方面揭示miR-375-3p通过调控EPC细胞 功能，进而确证其参与糖尿病性视网膜病变过程调控。在体外实验中使用序列 为5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’，反义链为 5’-ACGCGAGCCGAACGAACAAAUU-3’的mimics(双链)和序列为 5’-UCACGCGAGCCGAACGAACAAA-3’的miR-375-3p inhibitor转染EPC以干预 miR-375-3p表达。使用定量PCR分析miR-375-3p转染EPC对miR-375-3p表达的影 响，如图4A为定量PCR分析miR-375-3p mimics转染骨髓来源的内皮祖细胞 (BM-EPC)对miRNA-375-3p表达的影响；如图4B为采用MTT比色法分析 miR-375-3p干预对BM-EPC活性的影响；如图4C为采用CCK-8试剂盒分析 miR-375-3p干预对BM-EPC增殖的影响；如图4D为采用Calcein-AM和Propidium Iodide(PI)免疫荧光染色法分析miR-375-3p干预对BM-EPC凋亡的影响，其中上方图片为荧光染色图，下方图片4G为统计分析图；如图4E为采用Transwell细 胞迁移实验分析miR-375-3p干预对BM-EPC迁移功能的影响，其中上方图片为细 胞迁移染色图，下方图片4H为统计分析图；如图4F为采用Matrigel胶血管生成实 验分析miR-375-3p干预对BM-EPC血管生成活性的影响，其中上方图片为细胞成 管图，下方图片4I为统计分析图；结果说明体外实验中miR-375-3p沉默对高糖胁 迫诱导的BM-EPC损伤具有保护作用；miR-375-3p过表达可加重高糖胁迫诱导的 BM-EPC损伤作用；提示miR-375-3p可以调控BM-EPC细胞功能，进而调控糖尿 病性视网膜病变过程。
实施例4：miR-375-3p作为预后评估标记的可行性应用
第一步；获得待检血液样本
收集治疗前后的糖尿病性视网膜病变200例患者的血清。
第二步：从待检血液样本中提取RNA
a)血清样本或冷冻血清取0.25ml样本移至离心管中，加1ml Trizol，用移液 枪上下反复吸打直至细胞完全裂解；
b)加入氯仿(样品液+Trizol Reagent体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖， 剧烈振荡15sec，室温静置5min；
c)4℃离心，12000g×15min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分 为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸 取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；
d)向上清液中加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
e)4℃离心，12000g×10min，在离心后，试管底部会出现沉淀，弃上清；
f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，弃去上清；
g)加入1ml无水乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，弃去上清；
h)室温晾干加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)，必要时可用 移液枪轻轻吹打沉淀；
i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。
第三步：将获得的RNA逆转录成cDNA，采用EZB公司的microRNA ReverseTranscription Kit，按照试剂盒提供的体系(20μl)配置如下：gDNA Remover处 理过的RNA5μl，4x miRNA RT Buffer 5μl，miRNA RT Enzyme Mix 2μl，Nuclease free ddH2O 8μl，按下面程序反转为cDNA：37℃15min，42℃10min，95℃3min， 得到的cDNA放于-20℃中保存。
第四步：探针法定量PCR
探针法定量PCR反应体系(50μl)，采用EZB公司EZ-probe qPCR Master Mix formicroRNA(ROX2 plus)，按照说明书提供的体系配置如下：2x EZ-probe qPCR Master Mixfor microRNA 25μl，Probe(10μM)1μl，特异性的qRT-PCR的上游引 物2μl(特异性识别miR-375-3p或U6)，下游引物2μl，待测样品cDNA 5μl，RNase free ddH2O补足至50μl。
PCR条件：95℃5min，92℃10s；60℃30s；40个循环。
第五步：数据分析
基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的基因和参照基因扩增效率都接 近100％且相对偏差不超过1Ct；ΔCt＝目的基因Ct均数-参照基因Ct均数，其中参 照基因选择U6。
第六步：结果判断
计算出待测样本的ΔCt，分析其在手术治疗前后的变化情况。结果如图5所 示：收集治疗前后的糖尿病性视网膜病变患者的血清；采用Trizol试剂提取总 RNA，通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA；通过探针法定量PCR的方法 检测靶点miR-375-3p的表达水平，图5为从200例中选取的50例代表性病例。探针 法定量PCR分析miR-375-3p在治疗前后糖尿病性视网膜病变患者血清中的表达 差异，结果表明miR-375-3p在接受治疗后的糖尿病性视网膜病变患者血清中表达 明显下调，说明miR-375-3p有望成为评估手术疗效及预后情况的靶标。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。
序列表
<110> 南京医科大学眼科医院
<120> 糖尿病性视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttgttcgtt cggctcg 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgcttcgg cagcaca 17
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ucacgcgagc cgaacgaaca aa 22

Claims (1)

1.miRNA-375-3p的反义核苷酸在制备增强糖尿病性视网膜病变患者的内皮祖细胞活性，促进糖尿病性视网膜病变患者的内皮祖细胞增殖 和迁移，或抑制糖尿病性视网膜病变患者的内皮祖细胞的凋亡试剂中的应用，所述反义核苷酸的序列如SEQ ID NO：4所示。
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Relationship between miR-375 regulating Ndrg2/IL-6/STAT3 signaling pathway and diabetic retinopathy in rats;L.-J.PU等;《European Review for Medical and Pharmacological Sciences》;20200331;第24卷;摘要，第2190页左栏第2段至第2195页左栏最后一段 *

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