CN118006761A - 外泌体miRNA作为诊断扩心病合并心衰的分子标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子诊断疗技术领域，具体为一种外泌体miRNA作为诊断扩心病合并心衰的分子标志物及其应用；外泌体miRNA为miR‑423‑5p、miR‑148a‑3p、miR‑185‑5p、miR‑320a‑3p、miR‑22‑3p、miR‑148b‑3p、let‑7i‑5p、miR‑103a‑3p、miR‑21‑5p和let‑7d‑5p中任一种或两种以上的分子标志物组合，外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQNO.1‑10所示，优选的，miRNA为miR‑423‑5p、miR‑148a‑3p、miR‑148b‑3p；本发明提供的技术方案对扩心病合并心衰的检测准确率有效提高，分子标志物|log(FC)|＞0.5，与健康对照组相比，在扩心合并心衰患者中具有显著的差异表达。此外优选的三个miRNA的分子组合比单个分子具有更好的诊断效能，具有一定临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断疗技术领域，具体为一种外泌体miRNA作为诊断扩心病合并心衰的分子标志物及其应用。
背景技术
扩张型心肌病（DCM）是最常见的遗传性心血管疾病之一，可引起心功能不全和心功能障碍。虽然基因突变已被确定为导致DCM的原因之一，但将RNA等基因生物标志物用于DCM的早期诊断仍被忽视。此外，RNA的变化可以反映疾病的进展，作为患者预后的指标。因此，开发基于基因的DCM诊断工具是有益的。RNA在循环系统内通常不稳定，导致临床应用不可行。最近发现的外泌体miRNAs具有当时诊断目的所需要的稳定性。因此，充分了解DCM患者中的外泌体miRNA对临床翻译至关重要。在本研究中，我们采用基于血浆外泌体miRNAs的下一代测序技术，全面表征了慢性心力衰竭（CHF）DCM患者血浆外泌体中miRNAs的表达。
现有技术中公开了众多利用miRNA作为心衰检测分子标志物，例如申请公布号为CN104988216A的中国发明专利申请公开了一种慢性心力衰竭相关的血清miRNA及其应用，本发明提供一类外周血miRNAs在慢性心力衰竭的作为生物标志物风险评估/诊断和预后中的 用途。其中，hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a-3p和hsa-miR-330-3p在慢性心力衰竭患者外周血中存在差异性表达;证明外周血hsamiR665等能特异性诊断慢性心力衰竭，并且其表达水平与射血分数呈相关性，具有评估预后的作用。从而，通过检测上述miRNAs的表达水平可用来预测和协助诊断已经存在的慢性心力衰竭或评估慢性心力衰竭的预后。
又如申请公布号为CN108165625A的中国发明专利申请公开了一种，miRNA在制备检测心脏病试剂、试剂盒中的应用及检测试剂、检测试剂盒，该发明通过开发新型的miRNA包括miR-155-5p、miR-216a-5p或miR-217F-5p，发现在患有心脏疾病的心肌细胞中表达显著上升，因此该发明中提供的miR-155-5p、miR-216a-5p或miR-217F-5p可以作为心脏相关疾病的风险预估与检测，另外，该发明还提供了miR-155-5p、miR-216a-5p或miR-217F-5p的检测试剂和检测试剂盒，借助于实时定量PCR的技术来统计微小RNA变化，具有分析样本需要量小、自动化程度高、避免污染等优点；并且根据该发明专利说明书第【0002】段及说明书第【0111】-【0112】段记载可知，该发明专利提供的技术方案用于心衰的诊断。
虽然前述发明专利公开的技术方案能够用于诊断心衰，但是不适用于诊断扩心病合并心衰。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了用于诊断扩心病合并心衰的外泌体miRNA分子标志物的应用及其试剂盒，解决了上述背景技术中提出的问题。
本发明技术方案如下：
一种外泌体miRNA作为诊断扩心病合并心衰的分子标志物，所述外泌体miRNA为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中任一种或两种以上的分子标志物组合，所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.1-10所示。
进一步，所述外泌体为血浆外泌体。
一种外泌体miRNA作为诊断扩心病合并心衰的分子标志物的应用，所述外泌体miRNA作为制备用于诊断扩心病合并心衰的试剂盒、微阵列或生物芯片的标志物。
进一步，检测所述外泌体miRNA表达量的物质为引物或探针。
进一步，采用荧光定量检测所述外泌体miRNA表达量的引物组合如下：
（1）miR-148b-3p的引物：5’-ATGTGCGTCAGTGCATCACAGA-3’
（2）miR-185-5p的引物：5’-AAGCGGATGGAGAGAAAGGCAG-3’
（3）let-7d-5p的引物：5’-CCACGGTCAGAGGTAGTAGGTTG-3’
（4）let-7i-5p的引物：5’-CGCGCGTGAGGTAGTAGTTTGT-3’
（5）miR-103a-3p的引物：5’-CAAGCCGAGCAGCATTGTACAG-3’
（6）miR-21-5p的引物：5’-GCGCGTAGCTTATCAGACTGA-3’
（7）miR-22-3p的引物：5’-ACTCCGGAAAGCTGCCAGTTG-3’
（8）miR-423-5p的引物：5’-AAGAATTGAGGGGCAGAGAGCG-3’
（9）miR-148a-3p的引物：5’-AACACGTGTCAGTGCACTACAGA-3’
（10）miR-320a-3p的引物：5’-ACGGCACAAAAGCTGGGTTGA-3’。
一种试剂盒，所述试剂盒用于诊断扩心病合并心衰，所述试剂盒用于检测血浆外泌体miRNA表达量，所述外泌体miRNA为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中任一种或两种以上的分子标志物组合。
有益效果
一、相对于现有技术，本发明提供的应用有以下有益效果：
本发明选择miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中任一种或两种以上的分子标志物组合作为外泌体miRNA表达量的分子标志物，对扩心病合并心衰的检测准确率有效提高，上述分子|log(FC)|＞0.5，差异具有统计学意义，相对于健康对照组具有明显的差异表达。
本发明公开了基于血浆外泌体miRNA的诊断扩心合并心衰的分子标志物及其应用。RT-qPCR结果表明，miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p等十种人血浆外泌体miRNA在扩心合并心衰患者与健康对照组间差异性表达。利用ROC曲线分析十种血浆外泌体miRNA的诊断效能，结果显示上述外泌体miRNA的AUC值分别为0.926、0.938、0.827、0.815、0.728、0.864、0.827、0.790、0.753、0.691。
本发明证明上述十种血浆外泌体miRNA可以作为扩心合并心衰的分子诊断标志物。将其制成诊断试剂盒、微阵列或生物芯片，通过检测受试者血浆外泌体miRNA的表达量，对扩心合并心衰进行快速诊断和判定：当外泌体miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中至少一种miRNA表达量上调，或miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p表达量均上调，则提示该受试者患有扩心合并心衰，具有重要的临床应用价值。
二、相对于现有技术，本发明提供的试剂盒具备以下有益效果：
本发明提供的试剂盒通过检测血浆外泌体miRNA表达量来诊断扩心病合并心衰，其中外泌体miRNA为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中任一种或两种以上的分子标志物组合，对扩心病合并心衰的检测准确率有效提高，该分子标志物的组合的P值＜0.05、|log(FC)|＞0.5，相对于健康对照组具有明显的差异表达。
附图说明
图1为健康对照组与扩心病合并心衰患者的血浆外泌体TEM图像；
图2为健康对照组与扩心病合并心衰患者的血浆外泌体径粒分析结果；
图3为外泌体特异性标志物的蛋白质印记图像，图中Nor-Exo，代表健康对照；DCM-Exo,代表扩心病合并心衰组；
图4为RT-qPCR验证miRNA在扩心病合并心衰患者及健康对照组中的差异表达；
图5为miRNA对扩心病合并心衰的诊断效能；
图6为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p分子标志物组合对扩心病合并心衰的诊断效能的ROC曲线分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种外泌体miRNA作为诊断扩心病合并心衰的分子标志物，所述外泌体miRNA为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中任一种或两种以上的分子标志物组合，所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.1-10所示。
本发明中，所述外泌体为血浆外泌体。
一种外泌体miRNA作为诊断扩心病合并心衰的分子标志物的应用，所述外泌体miRNA作为制备用于诊断扩心病合并心衰的试剂盒、微阵列或生物芯片的标志物。
本发明中，检测所述外泌体miRNA表达量的物质为引物或探针。
本发明中，采用荧光定量检测所述外泌体miRNA表达量的正向引物序列组合如下：
（1）miR-148b-3p的引物：5’-ATGTGCGTCAGTGCATCACAGA-3’
（2）miR-185-5p的引物：5’-AAGCGGATGGAGAGAAAGGCAG-3’
（3）let-7d-5p的引物：5’-CCACGGTCAGAGGTAGTAGGTTG-3’
（4）let-7i-5p的引物：5’-CGCGCGTGAGGTAGTAGTTTGT-3’
（5）miR-103a-3p的引物：5’-CAAGCCGAGCAGCATTGTACAG-3’
（6）miR-21-5p的引物：5’-GCGCGTAGCTTATCAGACTGA-3’
（7）miR-22-3p的引物：5’-ACTCCGGAAAGCTGCCAGTTG-3’
（8）miR-423-5p的引物：5’-AAGAATTGAGGGGCAGAGAGCG-3’
（9）miR-148a-3p的引物：5’-AACACGTGTCAGTGCACTACAGA-3’
（10）miR-320a-3p的引物：5’-ACGGCACAAAAGCTGGGTTGA-3’。
反向引物如下：5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。
优选的，所述miRNA为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p。一种试剂盒，所述试剂盒用于诊断扩心病合并心衰，所述试剂盒用于检测血浆外泌体miRNA表达量，所述外泌体miRNA为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中任一种或两种以上的分子标志物组合。
试验验证
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
1）试验试剂，本发明健康对照组和扩心病合并心衰患者的血浆样本来自于郑州大学第一附属医院。其他所用试剂或耗材为普通市售或本领域技术人员通过公开途径可以获得的。
2）试验方法，使用EDTA抗凝采血管采集人外周血，以2500g离心15min，取上层血浆至2ml无菌管中，置于-80℃冰箱中冻存。从冰箱取出血浆后于25℃水浴中进行解冻，然后转移至离心管中于4℃以3000g离心10min，去除样品中的细胞碎片；去除细胞碎片的离心上清液转移至新的离心管后，于4℃以10000g离心20min，去除样品中杂质。取1.6ml上清液，加入0.4ml Exoquick试剂(System Biosciences公司)4℃静置30分钟。离心(3000g×30分钟)后弃上清，再次离心(3000g×5分钟)后弃上清，所得沉淀物即为外泌体。使用Exoquick试剂盒(System Biosciences公司)提取外泌体。将所得的5μl外泌体悬液加到Formvar-carbon载样铜网上，使用PBS液清洗铜网后放在50μl1％戊二醛液滴上5min，然后放在100μlddH2O洗涤2分钟。用草酸双氧铀液和甲基纤维素液染色，滤纸上吸去多余液体后，空气中干燥5min，使用JEOL-1230透射电子显微镜对所得外泌体形态进行鉴定。并采用ZetaView PMX110粒子追踪器和蛋白质印迹对所得外泌体粒径和特异性标志物进行分析和鉴定。
3）分析方法，采用Graphpad Prism 8软件进行统计分析以及作图，符合正态分布的连续变量以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间数据比较采用独立样本t检验，采用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积并作图，评估外泌体miRNA的诊断效能， P<0.05为差异具有统计学意义。
实施例
收集来自14例健康对照和18例扩心病合并心衰患者的血浆，并在-80℃下及时保存。
使用Exoquick试剂盒(System Biosciences公司)从上述血浆样品中提取外泌体，并将所得外泌体固定于载样铜网上，染色、干燥后，使用JEOL-1230透射电子显微镜对所得外泌体形态进行鉴定；并采用ZetaView PMX 110粒子追踪器和蛋白质印迹对所得外泌体粒径和特异性标志物进行分析和鉴定。其中，TEM图像见图1；纳米粒子追踪分析(NTA)结果见图2；蛋白质印迹结果见图3(Alix，CD 63和Hsp 70)。图1至图3结果表明所提取的囊泡在形态、粒径分布以及特异性标志物标记方面符合外泌体特征。
前期研究提示10种外泌体miRNA与扩心病合并心衰具有关联性，分别为：miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p以及let-7d-5p，具体核酸序列如SEQ NO.1～10所示；利用qRT-PCR对其进行验证，具体过程如下：
1. 提取血浆外泌体总RNA: 取适量外泌体于1.5mlEP管中，加入800ul Trizol试剂(Invitrogen公司)，充分混合，裂解10min，12000rpm离心10min取上清。震荡混匀后，4℃放置10min，然后加入200ul氯仿，振荡混匀后，4℃放置10min后进行12000rpm离心(10min)；取上清，加入与上清等体积的异丙醇，加入一定体积的糖原，-20℃过夜，再次以12000rpm于4℃离心10min，弃上清；加入1ml 70％乙醇，于4℃以12000rpm再次离心；待RNA刚变透明时，加入适量Nuclease-free water，55℃水浴5min，使RNA完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
2. RNA逆转录cDNA：采用Evo M-MLV 反转录试剂盒（含去除gDNA试剂，用于qPCR）II (艾科瑞生物)试剂盒将RNA逆转录为cDNA。首先按表1于冰上配制反应混合液消除RNA中的基因组，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。在42℃孵育2分钟，4℃保存。
表1 消除RNA中的基因组
逆转录反应体系及反应条件如表2和3所示：
表2 逆转录反应体系
表3 逆转录反应条件
3. qRT-PCR检测
使用Stepone plus荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)对外泌体miRNA进行分析，每个样品进行三次重复分析。表4为10种miRNA的核酸序列以及其正向引物序列，通用反向引物序列为5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。引物对均由生工生物工程公司设计以及合成，并采用NCBI blast比对分析探索引物的灵敏度和特异度。表5和表6分别为qRT-PCR反应体系和反应条件，其中SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒（含 Rox）购自艾科瑞生物公司。以U6作为外参，Log2(2-ΔΔCT)表示目的基因的相对表达水平。
表4外泌体miRNA核酸序列以及其正向引物序列
表5 qRT-PCR检测反应体系
表6 qRT-PCR检测反应条件
结果分析
RT-qPCR检测结果显示miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p以及let-7d-5p在扩心合并心衰患者中存在差异性表达：与健康组相比，患病组患者的十种miRNA存在普遍上调，且差异具有统计学意义，结果见图4。
用R语言和SPSS 22.0进行统计分析以及作图，并计算曲线下的面积，评估外泌体miRNA的诊断效能。十种血浆外泌体miRNA表达水平的ROC曲线分析见图5。结果显示上述外泌体miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p以及let-7d-5p的AUC值分别为0.926、0.938、0.827、0.815、0.728、0.864、0.827、0.790、0.753、0.691。结果见图5。
将AUC值较高的外泌体miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p作为分子标志物组合进行考察，结果显示分子标志物组合的AUC值达到0.975，高于单个指标（P<0.001），灵敏度和特异度分别为88.9％和100％。证明该外泌体miRNA组合对扩心合并心衰具有良好的诊断效能。结果见图6。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.用于诊断扩心病合并心衰的外泌体miRNA分子标志物的应用，其特征在于：所述外泌体miRNA为miR-423-5p、miR-148a-3p、miR-185-5p、miR-320a-3p、miR-22-3p、miR-148b-3p、let-7i-5p、miR-103a-3p、miR-21-5p和let-7d-5p中任一种或两种以上的分子标志物组合，所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.1-10所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述外泌体为血浆外泌体。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述外泌体miRNA作为制备用于诊断扩心病合并心衰的试剂盒、微阵列或生物芯片的标志物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：检测所述外泌体miRNA表达量的物质为引物或探针。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：采用荧光定量检测所述外泌体miRNA表达量的引物组合如下：
(1)miR-148b-3p的引物：5’-ATGTGCGTCAGTGCATCACAGA-3’
(2)miR-185-5p的引物：5’-AAGCGGATGGAGAGAAAGGCAG-3’
(3)let-7d-5p的引物：5’-CCACGGTCAGAGGTAGTAGGTTG-3’
(4)let-7i-5p的引物：5’-CGCGCGTGAGGTAGTAGTTTGT-3’
(5)miR-103a-3p的引物：5’-CAAGCCGAGCAGCATTGTACAG-3’
(6)miR-21-5p的引物：5’-GCGCGTAGCTTATCAGACTGA-3’
(7)miR-22-3p的引物：5’-ACTCCGGAAAGCTGCCAGTTG-3’
(8)miR-423-5p的引物：5’-AAGAATTGAGGGGCAGAGAGCG-3’
(9)miR-148a-3p的引物：5’-AACACGTGTCAGTGCACTACAGA-3’
(10)miR-320a-3p的引物：5’-ACGGCACAAAAGCTGGGTTGA-3’。
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