CN116103387A - 一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116103387A
CN116103387A CN202211412486.0A CN202211412486A CN116103387A CN 116103387 A CN116103387 A CN 116103387A CN 202211412486 A CN202211412486 A CN 202211412486A CN 116103387 A CN116103387 A CN 116103387A
Authority
CN
China
Prior art keywords
choroidal neovascularization
biomarker
trf
complicated
high myopia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211412486.0A
Other languages
English (en)
Inventor
周行涛
刘畅
李美燕
魏若妍
王韵哲
沈亚明
韩笑言
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eye and ENT Hospital of Fudan University
Original Assignee
Eye and ENT Hospital of Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eye and ENT Hospital of Fudan University filed Critical Eye and ENT Hospital of Fudan University
Priority to CN202211412486.0A priority Critical patent/CN116103387A/zh
Publication of CN116103387A publication Critical patent/CN116103387A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/10—Ophthalmic agents for accommodation disorders, e.g. myopia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用。本发明公开了tRF‑22在制备高度近视并发脉络膜新生血管病变诊断试剂中的应用以及一种高度近视并发脉络膜新生血管病变的诊断试剂盒。本发明通过定量PCR验证，发现tRF‑22与高度近视并发脉络膜新生血管病变发生呈现显著地相关性。本发明利用实时荧光定量PCR技术，通过检测房水中tRF‑22的相对含量，可以用于临床高度近视并发脉络膜新生血管病变患者的筛选，为高度近视并发脉络膜新生血管病变的早期干预提供理论依据。

Description

一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用，可根据个体的tRF-22表达水平进行高度近视并发脉络膜新生血管病变的诊断及病情发展的判断。
背景技术
我国近视呈现高发病率、低龄化的严峻形势，儿童和青少年近视防控问题已上升为国家战略。若不得到及时有效控制，极易发展为高度近视，出现多种眼底并发症。其中，并发脉络膜新生血管(CNV)是威胁视力最严重的并发症之一，且缺乏有效的治疗方法。大量研究发现近视进展与脉络膜血管功能存在密切关联，脉络膜血管功能失调可导致近视进一步发展。目前采用物理测量和影像学检查监测近视进展过程中眼轴、屈光以及脉络膜血管病变情况，尚无与近视进展程度以及脉络膜血管病变相关的分子标志物应用于早期临床监测。房水作为重要的眼内容物处于动态循环状态，含有多种调节因子参与调节眼部组织生长和功能维持等重要的生理过程。目前关于房水中是否含有参与近视进展期脉络膜血管病变的关键调节分子研究较少，因此，寻找可靠且准确的临床生物标记物对近视进展期脉络膜血管病变的诊断具有非常重要的意义。
在近视进展过程中，多种病理刺激均参与脉络膜血管病变。例如，炎症反应、氧化应激以及缺氧等。tsRNA是在多种应激反应下产生于成熟tRNA或其前体的一种非编码RNA分子，广泛且稳定存在于各种生物体中，具有保守性、组织和时空表达特异性。研究表明tsRNA参与多种生物学过程，包括蛋白质翻译调控、肿瘤发生、干细胞生物学、核糖体生物合成、转座子调控、表观遗传调控、凋亡抑制等。因此，其表达类型、丰度及修饰与组织细胞类型和疾病状态等紧密相关。
tRF-22是源自tRNAGln-CTG 3’端，含有22个碱基的非编码RNA。目前，在高度近视并发脉络膜新生血管病变领域尚未见报道用于早期诊断的tsRNA标志物。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物，所述近视进展期脉络膜血管病变检测生物标记物为tRF-22，所述标记物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，tRF-22的序列为5’-UCAAAUCTCGGUGGAACCUCCA-3’。
本发明还提供一种用于高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物检测的引物，所述引物序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物的脉络膜血管病变实时荧定量PCR检测试剂盒，包括2×EZ-probe qPCRMaster Mix for microRNA，Probe、通用3’端下游引物、特异性识别tRF-22的qRT-PCR上游引物、特异性识别U6的qRT-PCR上游引物。2×EZ-probe qPCR Master Mix for microRNA、Probe、通用3’端下游引物采用EZB公司EZ-probe qPCR Master Mix for microRNA(ROX2plus)试剂盒中提供的试剂。所述tRF-22特异性的qRT-PCR上游引物如SEQ ID NO:2所示；U6定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，基于PCR检测试剂盒的PCR反应体系包括2x EZ-probe qPCR MasterMix for microRNA 25μl，Probe(10μM)1μl，特异性的qRT-PCR的上游引物2μl(特异性识别tRF-22或U6)，下游引物2μl，待测样品cDNA 5μl，RNase free ddH2O补足至50μl。
进一步地，所述试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括：gDNARemove，4×miRNA RT Buffer，miRNA RT Enzyme Mix，Nuclease free ddH2O。
进一步地，所述试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizolreagent，氯仿，无水乙醇，DEPC ddH2O，ddH2O，异丙醇。
本发明的另一目的在于提供一种所述的高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物在制备高度近视并发脉络膜新生血管病变诊断试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术检测高度近视并发脉络膜新生血管病变诊断试剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物的反义核苷酸在制备治疗高度近视并发脉络膜新生血管病变药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物在制备高度近视并发脉络膜新生血管病变治疗后的预后评估试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行高度近视并发脉络膜新生血管病变疗后的预后评估试剂中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的高度近视并发脉络膜新生血管病变检测生物标记物，可根据个体的tRF-22表达水平进行人类高度近视并发脉络膜新生血管病变的诊断及病情发展的判断。tRF-22反义核苷酸与靶tRF-22互补，抑制或封闭基因的转换和表达，或诱导RNase H识别或切割tRF-22，使其丧失功能，因此可以作为药物用于治疗高度近视并发脉络膜新生血管病变。因此，本发明提供了tRF-22的新用途，可作为诊断试剂用于高度近视并发脉络膜新生血管病变的早期诊断。
本发明通过定量PCR验证，发现tRF-22与高度近视并发脉络膜新生血管病变呈现显著地相关性。本发明利用探针法实时荧光定量PCR技术，通过检测高度近视并发脉络膜新生血管房水中tRF-22表达量的明显差异，可以用于临床高度近视并发脉络膜新生血管病变患者的筛选，为高度近视并发脉络膜新生血管病变的早期干预提供理论依据。
本发明确定了tRF-22表达量的改变，与高度近视并发脉络膜新生血管病变的发生存在显著地相关性。通过干预RF/6A细胞中tRF-22的表达量，在细胞活性、细胞增殖、细胞迁移及细胞成管的功能实验中验证了tRF-22的表达量改变可以显著影响细胞功能。tRF-22在脉络膜血管内皮细胞中过表达后，可以显著抑制细胞活性、增殖、迁移及成管。tRF-22可以作为高度近视并发脉络膜新生血管病变早期诊断的生物标记物，定期评估高度近视并发脉络膜新生血管病变进展和治疗后的复发情况。
本发明为高度近视并发脉络膜新生血管病变疾病的早期诊断、预后判断和早期干预治疗提供重要的参考依据，具有较大的实际临床价值，可以用于筛选出高度近视并发脉络膜新生血管病变的高危人群和复发人群，以期及早进行干预和治疗，减少非高危复发病人不必要的治疗和医疗花费。
附图说明
图1是是本发明实施例提供的定量PCR分析tRF-22在实验组(高度近视并发脉络膜新生血管病变)和对照组(白内障)患者房水中的表达差异示意图；
图2是本发明实施例提供的定量PCR分析tRF-22在实验组(高度近视并发脉络膜新生血管病变)和对照组(白内障)患者血浆中的表达差异示意图；
图3本发明实施例提供的分析tRF-22干预对RF/6A细胞相关病理过程的影响示意图。
图3A是本发明实施例提供的定量PCR分析tRF-22转染RF/6A细胞对tRF-22表达的影响示意图。
图3B是本发明实施例提供的采用MTT比色法分析tRF-22干预对RF/6A细胞活性的影响示意图。
图3C是本发明实施例提供的采用EdU试剂盒分析tRF-22干预对RF/6A细胞增殖的影响示意图。其中上方图片3C为细胞增值信号EdU染色图，下方图片3F为统计分析图。
图3D是本发明实施例提供的采用Transwell细胞迁移实验分析tRF-22干预对RF/6A细胞迁移功能的影响示意图，其中上方图片3D为细胞迁移染色图，下方图片3G为统计分析图。
图3E是本发明实施例提供的采用Matrigel胶血管生成实验分析tRF-22干预对RF/6A细胞血管生成活性的影响示意图，其中上方图片3E为细胞成管图，下方图片3H为统计分析图。
图4是本发明实施例提供的高度近视并发脉络膜新生血管病变治疗前后，患者血清中的定量PCR检测结果示意图，横坐标代表手术治疗前后血清标本，纵坐标代表tRF-22的表达水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
实施例1tRF-22高度近视并发脉络膜新生血管病变相关性验证
房水样本及处理：收集50例高度近视并发脉络膜新生血管的(HM-CNV)患者房水，同时收集50例白内障(不伴有眼底病变)患者的房水匹配作为对照。
第一步：获得待检房水样本
样本为高度近视伴发CNV和白内障患者的房水样本。
第二步：从待检房水样本中提取RNA
a)取0.03ml房水样本移至离心管中，加300μl Lysis Buffer，高速涡旋10s，使细胞完全溶解再裂解液中。(注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存)。
b)12,000x g离心2min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中。
c)在上清中加入等体积冰冷的100％乙醇，这一步可能会有沉淀。这是正常现象。将离心管倒置几次或上下移液使沉淀分散，然后将样品转移到旋转柱中。4℃4000x g离心1min，弃上清，RNA沉淀于管底。
d)将2μl gDNA去除剂和10μl ddH2O混合，添加到离心柱中心。室温孵育5min，降解残留DNA。
e)加入500μl Wash Buffer，12000x g离心1min。不需要倒掉液体，直接将柱转移到无RNase的1.5ml离心管中，打开盖子，在空气中静置2min。
f)在柱中心加入20～30μl Elution Buffer，室温孵育2min。12000x g离心1min(将Elution Buffer转移回柱中，孵育5min，再次离心可获得更多RNA)。
g)丢弃离心柱，测定RNA浓度，用纯化后的RNA进行以下实验，或-70℃保存。
第三步：RNA质量检测
在260nm和280nm吸光度处，采用紫外分光光度计测定RNA的浓度；RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。同时，结合琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外透射光下观察并拍照。
第四步：RNA逆转录获得cDNA样本
逆转录采用EZB公司的microRNA Reverse Transcription Kit，按照试剂盒提供的体系(20μl)分别加入：
gDNA Remover处理过的RNA 5μl
4x miRNA RT Buffer 5μl
miRNA RT Enzyme Mix 2μl
Nuclease free ddH2O 8μl
将以上体系置于无Rnase的0.2μl EP管中，按下面程序反转为cDNA：37℃15min，42℃10min,95℃3min，得到的cDNA放于-20℃中保存。
第五步：探针法定量PCR
探针法定量PCR反应体系(20μl)，采用EZB公司EZ-probe qPCR Master Mix formicroRNA(ROX2 plus)，按照说明书提供的体系配置如下：2x EZ-probe qPCR Master Mixfor microRNA 10μl，Probe(10μM)0.4μl，特异性的qRT-PCR的上游引物0.8μl(特异性识别tRF-22或U6)，下游引物0.8μl，待测样品cDNA 2μl，RNase free ddH2O补足至20μl。
U6定量PCR上游引物5’-CCTGCTTCGGCAGCACA-3’；
tRF-22定量PCR上游引物5’-GGGTCAAATCTCGGTGGAAC-3’。
PCR条件：95℃5min,92℃10s；60℃30s；40个循环。
第六步：数据分析
对同一样本分别进行目标RNA和内参RNA实时荧光定量PCR检测，以内参的表达量为基准，对目标RNA进行归一化处理，随后对目标RNA的相对表达量采用本领域通用的DeltaCt法分析，将所有样本的目的基因tRF-22的Ct值减去自身内参基因U6的Ct值，得到所有样本的Delta Ct值(ΔCt)，公式表达为ΔCt＝Ct(目的基因tRF-22)-Ct(内参基因U6)。
最后通过比较待测样本即高度近视并发CNV样本和目标样本即白内障组样本的tRF-22的表达差异，判断待测病人的疾病易感性(如图2为各从每组50例中选取的25例代表性病例)。
第七步：结果判读
通过探针法定量PCR的方法检测靶点tRF-22的表达水平并得出各组对照组样本的ΔCt范围，见表2。比较待测样本的ΔCt，分析实验组和对照组的组间差异。进一步分析各个样本数值是否在对照组的范围内，若待测样本的ΔCt在对照组的ΔCt范围内，或者小于该ΔCt范围，认为待测样本为高度近视脉络膜血管病变阴性；若待测样本ΔCt大于该对照组ΔCt范围，认为其为高度近视脉络膜血管病变阳性。结果如表2所示。
表2：各组样本ΔCt范围
tRF-22Ct均数-U6 Ct均数
对照组患者房水 13.2-16.7
对照组患者血浆 14.3-17.2
实验组患者房水 15.6-19.9
实验组患者血浆 16.4-19.5
根据上述结果，分别收取经临床影像学诊断确诊的100例高度近视脉络膜血管病变和100例非脉络膜血管病变患者血清样本，进行tRF-22血清含量分析。评价基于tRF-22的方法检测的准确率，如表3结果显示血清样本准确率为％，灵敏度为％，表明tRF-22可作为高度近视脉络膜血管病变诊断的生物学标记物。
表3：tRF-22作为生物标记物进行高度近视脉络膜血管病变诊断的结果
Figure BDA0003939243360000061
第八步：基于体外实验，从基本原理方面揭示tRF-22通过调控脉络膜血管内皮细胞功能，进而确证其参与脉络膜血管病变过程调控。
在体外实验中使用序列为5’-UCAAAUCTCGGUGGAACCUCCA-3’的tRF-22mimics和序列为UCACGCGAGCCGAACGAACAAA的tRF-22inhibitor转染RF/6A细胞以干预tRF-22表达。
实验中Scr mimic序列为：5'-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3'；
Scr inhibitor序列为：5'-CAGUACUUUUGTGUAGUACAAA-3'。
如图3A所示本发明实施例提供的定量PCR分析tRF-22转染RF/6A细胞对tRF-22表达的影响示意图。如图3B所示本发明实施例提供的采用MTT比色法分析tRF-22干预对RF/6A细胞活性的影响示意图。如图3C所示本发明实施例提供的采用EdU试剂盒分析tRF-22干预对RF/6A细胞增殖的影响示意图。其中上方图片3C为细胞增值信号EdU染色图，下方图片3F为统计分析图。如图3D所示本发明实施例提供的采用Transwell细胞迁移实验分析tRF-22干预对RF/6A细胞迁移功能的影响示意图，其中上方图片3D为细胞迁移染色图，下方图片3G为统计分析图。如图3E所示本发明实施例提供的采用Matrigel胶血管生成实验分析tRF-22干预对RF/6A细胞血管生成活性的影响示意图，其中上方图片3E为细胞成管图，下方图片3H为统计分析图。
结果说明：体外实验中tRF-22表达沉默可导致脉络膜内皮细胞异常激活，促发病理性新生血管生成；提示近视相关刺激导致tRF-22表达异常，调控脉络膜血管内皮细胞功能，进而调控脉络膜血管病变过程。
实施例2tRF-22作为预后评估标记的可行性应用
第一步；获得待检房水样本
收集治疗前后的高度近视并发脉络膜新生血管病变100例患者的血清。
第二步：从待检房水样本中提取RNA
a)取0.03ml房水样本移至离心管中，加300ul Lysis Buffer，高速涡旋10秒，使细胞完全溶解再裂解液中。(注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存)。
b)12,000x g离心2min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中。
c)在上清中加入等体积冰冷的100％乙醇，这一步可能会有沉淀。这是正常现象。将离心管倒置几次或上下移液使沉淀分散，然后将样品转移到旋转柱中。4℃4000x g离心1min，弃上清，RNA沉淀于管底。
d)将2μl gDNA去除剂和10μl ddH2O混合，添加到离心柱中心。室温孵育5min，降解残留DNA。
e)加入500μl Wash Buffer，12000x g离心1min。不需要倒掉液体，直接将柱转移到无RNase的1.5ml离心管中，打开盖子，在空气中静置2min。
f)在柱中心加入20～30μl Elution Buffer，室温孵育2min。12000x g离心1min(将Elution Buffer转移回柱中，孵育5min，再次离心可获得更多RNA)。
g)丢弃离心柱，测定RNA浓度，用纯化后的RNA进行以下实验，或-70℃保存。
h)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。
第三步：将获得的RNA逆转录成cDNA，采用EZB公司的microRNA ReverseTranscription Kit，按照试剂盒提供的体系(20μl)配置如下：gDNA Remover处理过的RNA5μl，4x miRNA RT Buffer 5μl，miRNA RT Enzyme Mix 2μl，Nuclease free ddH2O 8μl，按下面程序反转为cDNA：37℃15min，42℃10min,95℃3min，得到的cDNA放于-20℃中保存。
第四步：探针法定量PCR
探针法定量PCR反应体系(20μl)，采用EZB公司EZ-probe qPCR Master Mix formicroRNA(ROX2 plus)，按照说明书提供的体系配置如下：2x EZ-probe qPCR Master Mixfor microRNA 10μl，Probe(10μM)0.4μl，特异性的qRT-PCR的上游引物0.8μl(特异性识别tRF-22或U6)，下游引物0.8μl，待测样品cDNA 2μl，RNase free ddH2O补足至20μl。
PCR条件：95℃5min,92℃10s；60℃30s；40个循环。
第五步：数据分析
基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过1Ct；ΔCt＝目的基因Ct均数-参照基因Ct均数，其中参照基因选择U6。
第六步：结果判断
计算出待测样本的ΔCt，分析其在手术治疗前后的变化情况。结果如图4所示：收集治疗前后的高度近视并发脉络膜新生血管病变患者的血清；采用Trizol试剂提取总RNA，通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA；通过探针法定量PCR的方法检测靶点tRF-22的表达水平，如图4所示，图4为从100例中选取的50例代表性病例。探针法定量PCR分析tRF-22在治疗前后高度近视并发脉络膜新生血管病变患者血清中的表达差异，结果表明tRF-22在接受治疗后的脉络膜新生血管病变患者血清中表达明显上调，说明tRF-22有望成为评估手术疗效及预后情况的靶标。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变的生物标记物，所述生物标记物为tRF-22，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可作为诊断试剂用于高度近视并发脉络膜新生血管病变的早期诊断或定期评估治疗后的复发情况。
2.如权利要求1所述的一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变的生物标记物，生物标记物的检测引物如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的检测高度近视并发脉络膜新生血管病变的生物标记物，该生物标记物基于实时荧光定量PCR技术检测。
4.一种应用权利要求1-3任意一项所述生物标记物的高度近视并发脉络膜新生血管病变实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括2×EZ-probe qPCR Master Mix for microRNA、Probe、通用3’端下游引物、特异性识别tRF-22的qRT-PCR上游引物、特异性识别U6的qRT-PCR上游引物。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，特异性识别tRF-22的qRT-PCR上游引物如SEQ IDNO:2所示；U6的qRT-PCR上游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括：gDNA Remove，4×miRNA RT Buffer，miRNA RT Enzyme Mix，Nuclease free ddH2O。
7.如权利要求4或5或6所述的试剂盒，还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizol reagent，氯仿，无水乙醇，DEPC ddH2O，ddH2O，异丙醇。
8.一种如权利要求1-3任意一项所述生物标记物在制备高度近视并发脉络膜新生血管病变诊断试剂中的应用。
9.一种如权利要求1-3任意一项所述生物标记物的反义核苷酸在制备治疗高度近视并发脉络膜新生血管病变药物中的应用。
10.一种如权利要求1-3任意一项生物标记物在制备高度近视并发脉络膜新生血管病变治疗后的预后评估试剂中的应用。
CN202211412486.0A 2022-11-11 2022-11-11 一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用 Pending CN116103387A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211412486.0A CN116103387A (zh) 2022-11-11 2022-11-11 一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211412486.0A CN116103387A (zh) 2022-11-11 2022-11-11 一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116103387A true CN116103387A (zh) 2023-05-12

Family

ID=86262705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211412486.0A Pending CN116103387A (zh) 2022-11-11 2022-11-11 一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116103387A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117625794A (zh) * 2024-01-25 2024-03-01 山东大学齐鲁医院 一种与食管癌相关的tRF、试剂盒、药物及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117625794A (zh) * 2024-01-25 2024-03-01 山东大学齐鲁医院 一种与食管癌相关的tRF、试剂盒、药物及其应用
CN117625794B (zh) * 2024-01-25 2024-04-12 山东大学齐鲁医院 一种与食管癌相关的tRF、试剂盒、药物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105002182B (zh) LncRNA‑GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用
CN111926074B (zh) 一种缺血性视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用
CN104450707B (zh) 一种血清miRNA生物标志物的应用
CN106119385B (zh) 一种诊断2型糖尿病的miRNA分子标志物hsa-miR-149-3p及其应用
CN116103387A (zh) 一种检测高度近视并发脉络膜新生血管病变生物标记物、检测试剂盒及应用
CN108728532B (zh) 一种微小rna标志物及其应用
CN107519193A (zh) 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
CN108300788B (zh) 一种用于检测轻型脑外伤的微小核糖核酸组合及其应用
CN107312865B (zh) Loc100130111在制备骨肉瘤诊断产品、治疗药物中的用途
CN106434872A (zh) 一种诊断2型糖尿病的miRNA分子标志物hsa‑miR‑152‑3p及其应用
CN107012256A (zh) 腹主动脉瘤诊治标志物
JP2010502177A (ja) 診断方法
CN114921545B (zh) 人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒
CN113981064B (zh) 糖尿病性视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用
EP3775212A1 (en) Identification of muscular mirnas as molecular biomarkers and co-adjuvant for the treatment of spinal muscular atrophy
CN109355373B (zh) circRNA在制备增生性玻璃体视网膜病变诊断试剂中的应用
Ezzat et al. Expression of micro RNA192 in type 2 diabetes mellitus relation to glycemic control, metabolic abnormalities, renal and ocular complications
CN107523641B (zh) 血清miRNAs生物标志物及其应用
JP2010502940A (ja) 診断方法
EP3636772A1 (en) Two molecular markers for diagnosis of glaucoma, kit, and application
CN114381508B (zh) 与icp辅助诊断相关的血清/血浆外泌体标志物及其应用
CN116144759B (zh) LncRNA-ENST00000581911在制备甲状腺相关眼病诊断试剂中的应用
CN114032297B (zh) 一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体miRNA标志物及其应用
CN116622835B (zh) lncRNA CASC15作为肝纤维化生物标志物的应用
CN107012257A (zh) 用于诊治腹主动脉瘤的生物标志物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination