CN117625794B - 一种与食管癌相关的tRF、试剂盒、药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种与食管癌相关的tRF、试剂盒、药物及其应用。本发明提供一种与食管癌相关的tRF，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过检测本发明所述tRF表达量能够明确食管癌预后的情况，同时抑制该tRF表达，能够达到治疗食管癌的效果。由此可见，本发明所述tRF为食管癌的治疗提供扎实的理论依据和实验基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种与食管癌相关的tRF、试剂盒、药物及其应用。
背景技术
在全球范围内，食管癌的发病率和死亡率比较高，是第三常见的消化道肿瘤和第六常见的恶性肿瘤。病理类型分为鳞癌和腺癌，我国以鳞癌为主，约占总体发病率的90%。尽管有手术、化疗、放疗、靶向治疗等治疗方式的临床应用，但治疗效果有限，食管癌的5年生存率仅有30%左右。近年来，免疫治疗的临床应用给癌症患者带来了新的希望，靶向PD-1及其配体PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂在多种癌症治疗中显示出令人鼓舞的结果，但只有一部分患者获得了良好的治疗响应。包含食管癌在内的多种“免疫冷”型实体瘤对该疗法总体应答较差，且不同患者肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润丰度和状态分布均存在较大个体差异。同一患者肿瘤内也存在较大的瘤内异质性，常常表现为“冷”区域和“热”区域同时存在，这些都为免疫治疗的应用带来了巨大挑战。免疫抑制性肿瘤微环境导致T细胞功能障碍和死亡是形成“冷”肿瘤的原因之一，成为阻碍提高免疫治疗应答率的“绊脚石”。
据报道，由tRNA成熟体或前体剪切生成的小RNA（tRNA-derived fragment，tRF）在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。tRFs种类繁多，功能复杂，大致归纳为三类：①RNA沉默：发挥类似miRNA的功能。②翻译调节：tRF通过结合靶mRNA或蛋白调控翻译。③依赖RBP发挥功能：tRF通过结合RBP调控肿瘤进展。据文献报道，tRF在调控肿瘤免疫过程中也扮演重要的角色。深度测序发现，免疫细胞胞质内存在丰富的5’tRFs和3’tRFs，其中5’tRFs主要选择性富集在免疫细胞的囊泡内并向胞外分泌，作为免疫信号分子从免疫细胞传递至细胞外基质，改变肿瘤微环境中其他细胞的功能。在免疫活化信号存在时，T细胞选择性地将抑制其自身活化的tRFs通过细胞外囊泡分泌排出，从而促进并维持自身的激活。tRF在肿瘤免疫调控过程中的研究仍然处于起步阶段，尚无tRF调控食管癌免疫微环境的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与食管癌相关的tRF、试剂盒、药物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。通过检测本发明所述tRF表达量能够明确食管癌预后的情况，同时抑制该tRF表达，能够达到治疗食管癌的效果。由此可见，本发明所述tRF为食管癌的治疗提供扎实的理论依据和实验基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种与食管癌相关的tRF，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。
本发明提供了检测上述的tRF表达量的试剂在制备食管癌预后预测试剂盒中的应用。
优选的，所述食管癌包括食管鳞癌。
优选的，所述tRF表达量与患者的生存期呈负相关。
本发明提供了一种食管癌预后预测的试剂盒，所述试剂盒包括检测上述tRF表达量的试剂。
本发明提供了抑制tRF表达的制剂在制备治疗食管癌药物中的应用，所述tRF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述食管癌包括食管鳞癌。
本发明提供了一种治疗食管癌的药物，所述药物的有效成分包括抑制tRF表达的制剂；所述tRF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述药物还包括药物学可接受的载体。
优选的，所述药物的剂型包括注射剂、凝胶剂或固体制剂。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了如SEQ ID No.1所示的tRF，通过检测本发明所述tRF表达量能够明确食管癌预后的情况，同时抑制该tRF表达，能够达到治疗食管癌的效果，可以作为食管癌免疫治疗增敏的分子靶标。由此可见，本发明所述tRF为食管癌的治疗提供扎实的理论依据和实验基础。
而且在本发明具体实施例中同一食管鳞癌患者肿瘤内，常同时存在CD8+T细胞耗竭区域和CD8+T细胞非耗竭区域，本发明分析不同CD8+T细胞状态区域内肿瘤细胞基因表达谱异常，挖掘并发现调控CD8+T细胞耗竭的新靶点和新机制，为把“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的策略开发提供重要的理论依据。同时将ago修饰的tRF单独使用，或将ago修饰（全链甲基化修饰、胆固醇修饰、硫代修饰）的tRF与αPD-1、趋化因子受体阻断剂联合用药，治疗效果明显，为tRF治疗应用于临床试验提供了扎实的理论支持和实验基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为食管鳞癌组织（耗竭T细胞区和非耗竭T细胞区）经激光俘获显微切割后进行tRF PCR芯片检测工作流程；
图2为食管鳞癌组织CD8+T耗竭区相对于非耗竭区上/下调的tRFs的对比图；
图3为差异最显著的Top 10 tRFs与TCGA食管鳞癌患者预后的相关性分析图；
图4为TCGA数据分析tRF-22-DRF与食管鳞癌患者生存的相关性分析图；
图5为tRF-22-DRF与本单位食管鳞癌患者生存的相关性分析图；
图6为Estimate算法计算免疫打分图；
图7为山东大学齐鲁医院收集的食管鳞癌组织与癌旁组织中tRF-22-DRF表达量的差异分析图；
图8为不同分期食管鳞癌患者癌组织中tRF-22-DRF表达量的差异分析图；
图9为tRF-22-DRF抑制食管鳞癌抗肿瘤免疫并促进癌细胞增殖的分析图，其中A为改变tRF-22-DRF的表达量，C57BL/6N小鼠mEC25细胞皮下移植瘤的生长情况对比图；B为改变tRF-22-DRF的表达量，裸鼠mEC25细胞裸鼠皮下移植瘤的生长情况对比图；C为改变tRF-22-DRF的表达量，裸鼠KYSE150细胞裸鼠皮下移植瘤的生长情况对比图；D为敲低人和鼠源食管鳞癌细胞tRF-22-DRF的表达，裸鼠和C57BL/6N小鼠移植瘤生长的抑制率对比图；E为敲低mEC25细胞tRF-22-DRF的表达，裸鼠和C57BL/6N小鼠移植瘤生长抑制率的倍数关系对比图；F为改变tRF-22-DRF的表达量，裸鼠Eca109细胞裸鼠皮下移植瘤的生长情况对比图；
图10为tRF-22-DRF促进食管鳞癌组织Treg细胞浸润的分析图，其中A为TCGA数据中与食管鳞癌患者预后相关的免疫细胞相关性的火山图；B为TCGA数据中与食管鳞癌患者预后相关的免疫细胞相关性的森林图；C为改变tRF-22-DRF的表达量，流式检测mEC25细胞C57BL/6N小鼠皮下移植瘤内Treg细胞的浸润情况；
图11为食管鳞癌细胞分别敲降tRF-22-DRF和HNRNPAB的转录组测序图；
图12为食管鳞癌细胞分别敲降tRF-22-DRF和HNRNPAB后，下调的候选差异基因的显示图；
图13为改变食管鳞癌细胞tRF-22-DRF的表达后，获得培养上清图；
图14为D为改变食管鳞癌细胞tRF-22-DRF的表达，检测培养上清对Treg细胞的趋化作用；
图15为Treg与CD8+ T细胞以不同比例共培养，检测CD8+ T细胞的增殖能力；
图16为Treg与CD8+ T细胞以不同比例共培养，检测CD8+ T细胞的IFN-γ的产生。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
准备例：
1、构建C57BL/6N小鼠mEC25（鼠源细胞）皮下移植瘤模型（mEC25细胞裸鼠皮下移植瘤模型）：采用mEC25细胞分别构建tRF-22-DRF过表达或敲降的稳转株细胞，扩增细胞并用PBS重悬，制作成4×107cell/mL的液体，接种于C57BL/6N小鼠皮下，接种量为0.1mL，得到C57BL/6N小鼠mEC25（鼠源细胞）皮下移植瘤模型，具体步骤如下：
1.1、构建tRF-22-DRF过表达或敲降的稳转株细胞：通过将tRF-22-DRF的sense序列（5'-AAUCCAGCGAUCCGAGUUCAAA-3'，SEQ ID No .4）和antisense序列（5'-UUUGAACUCGGAUCGCUGGAUU-3'，SEQ ID No .5）连接入慢病毒载体pLent-U6-shRNA-CMV-copGFP-P2A-Puro中，将该重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞制备慢病毒，并将收集到的慢病毒颗粒感染mEC25食管鳞癌细胞，在用嘌呤霉素筛选后得到稳定过表达/敲降tRF-22-DRF的稳转株细胞；
1.2、将筛选得到的稳定过表达/敲降tRF-22-DRF的稳转株细胞并用PBS重悬，制作成4×107cell/mL的液体，接种于C57BL/6N小鼠皮下，接种量为0.1mL，得到C57BL/6N小鼠mEC25（鼠源细胞）皮下移植瘤模型。
2、构建KYSE150细胞裸鼠皮下移植瘤模型：采用KYSE150细胞分别构建tRF-22-DRF过表达或敲降的稳转株细胞，扩增细胞并用PBS重悬，制作成4×107cell/mL的液体，接种于C57BL/6N小鼠皮下，接种量为0.1mL，得到KYSE150细胞裸鼠皮下移植瘤模型，具体步骤同构建C57BL/6N小鼠mEC25（鼠源细胞）皮下移植瘤模型（mEC25细胞裸鼠皮下移植瘤模型）的方法，区别仅为采用KYSE150细胞替换mEC25细胞。
3、构建Eca109细胞裸鼠皮下移植瘤模型：采用Eca109细胞分别构建tRF-22-DRF过表达或敲降的稳转株细胞，扩增细胞并用PBS重悬，制作成4×107cell/mL的液体，接种于C57BL/6N小鼠皮下，接种量为0.1mL，得到Eca109细胞裸鼠皮下移植瘤模型，具体步骤同构建C57BL/6N小鼠mEC25（鼠源细胞）皮下移植瘤模型（mEC25细胞裸鼠皮下移植瘤模型）的方法，区别仅为采用Eca109细胞替换mEC25细胞。
4、构建转染空载体的mEC25细胞：将无义序列（TTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT，SEQ ID No .6）插入慢病毒载体pLent-U6-shRNA-CMV-copGFP-P2A-Puro，该重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞制备慢病毒，并将收集到的慢病毒颗粒感染mEC25食管鳞癌细胞，在用嘌呤霉素筛选后得到稳定过表达/敲降tRF-22-DRF的稳转株细胞。
实施例1：
为寻找食管癌免疫治疗增敏的分子靶标，分析了大量免疫组化数据，发现同一食管鳞癌患者肿瘤内，常同时存在CD8+T细胞耗竭区域（PD-1+CD8+T细胞为主）和CD8+T细胞非耗竭区域（PD-1-CD8+T细胞为主）；之后分别圈选不同区域并通过激光俘获显微切割（LaserCapture Microdissection，LCM）捕获收集目标区域组织，提取RNA进行tRF PCR Array检测（详见图1），tRF PCR Array检测的芯片名称为nrStarTM Human tRF&tiRNA PCR Array 货号为AS-NR-002-1，厂家为数谱生物。结果如图2-图4所示，与CD8+T细胞非耗竭区相比，CD8+T细胞耗竭区组织中有30个tRFs显著上调，8个tRFs显著下调；差异最显著的Top 10 tRFs与TCGA食管鳞癌患者（癌症基因组图谱）的生存期做相关性分析，对分析数据从低到高进行排序，将前1/2样本记为低表达，后1/2样本记为高表达，结果显示只有tRF-22-DRF-FR87D6UF（简称tRF-22-DRF）与食管鳞癌患者的生存显著相关，且tRF-22-DRF高表达患者的预后更差，其中tRF-22-DRF的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示，具体为AAUCCAGCGAUCCGAGUUCAAA。
在104例本单位（山东大学齐鲁医院，齐鲁医院队列）食管鳞癌队列中验证，具体步骤为：提取104例患者的癌与癌旁组织的总RNA，进行qPCR扩增，其中上游引物如SEQ ID No.2所示，具体为ACACGAATCCAGCGATCCG，下游引物如SEQ ID No .3所示，具体为TATCCTTCTTCACGACTCCTTCAC，上游引物和下游引物由上海吉玛生物公司设计合成；qPCR的总体系为10μL体系：2xSYBR Green Pro Taq Premix 5μL，cDNA 1ul; Primer F 0.2μL，Primer R0.2μL， RNase free water 3.6μL；两步法qPCR扩增程序：95℃ 30 sec；95℃ 5 sec后60℃30 sec，循环40次。qPCR扩增结果表明，tRF-22-DRF表达量越高，患者的总生存期越短（图5），这些结果提示，tRF-22-DRF在食管癌肿瘤微环境中存在很显著的瘤内异质性。
进一步通过Estimate算法计算免疫打分，根据tRF-22-DRF表达量比较两组食管鳞癌患者免疫浸润丰度的差异，发现tRF-22-DRF高表达的食管鳞癌患者免疫浸润丰度更低，这提示tRF-22-DRF在食管鳞癌患者间也存在着显著的个体差异，且与个体免疫浸润丰度相关（图6）。tRF-22-DRF在癌旁正常组织中表达极低，而在食管鳞癌组织中表达显著升高，晚期（III/IV期）患者组织表达量显著高于早期（I/II期）患者（图7和图8）。
实施例2：
体内实验研究了tRF-22-DRF对食管鳞癌微环境的影响，构建C57BL/6N小鼠mEC25（鼠源细胞）皮下移植瘤模型，具体方法详见准备例，以考察tRF-22-DRF对移植瘤生长的影响，采用游标卡尺测量肿瘤体积，比较各组瘤体生长速度，测量时间为建模后的第1周、2周、3周、4周、5周和6周，以转染空载体的mEC25细胞（具体方法详见准备例）为对照组。结果表明，相比于对照组，tRF-22-DRF敲降组移植瘤生长速度显著减慢，提示tRF-22-DRF调控食管鳞癌微环境并促进肿瘤生长（图9中的A）。
为研究在免疫缺陷鼠体内tRF-22-DRF对食管鳞癌细胞增殖的影响，分别构建mEC25细胞裸鼠皮下移植瘤模型、KYSE150细胞裸鼠皮下移植瘤模型和Eca109细胞裸鼠皮下移植瘤模型，具体方法详见准备例。采用游标卡尺测量肿瘤体积，比较各组瘤体生长速度，测量时间为建模后的第1周、2周、3周、4周、5周和6周，以转染空载体的mEC25细胞为对照组。结果表明，相比于对照组，tRF-22-DRF敲降组移植瘤的生长速度适度减缓，且肿瘤生长抑制率不足C57BL/6N小鼠的1/2，提示在食管鳞癌恶性进展过程中，相比于对肿瘤细胞本身的促增殖作用来说，tRF-22-DRF对肿瘤免疫的抑制作用可能占据更为重要的位置（图9中的B-F）。
实施例3：
为探究食管鳞癌肿瘤微环境中受tRF-22-DRF调控的具体免疫细胞类别，我们分析了TCGA数据中食管鳞癌RNA-seq和small RNA-seq数据，采用单因素COX回归分析，筛选出5个与食管鳞癌患者预后显著相关的免疫细胞，其中Regulatory T cell（Treg细胞）与预后的相关性最强。同时，采用GSVA量化免疫细胞丰度，并分析与tRF-22-DRF表达量的相关性，结果发现只有Treg细胞与tRF-22-DRF的表达量呈显著正相关（图10中的A-B）。
分别使用对照（转染空载体的mEC25细胞）、稳定敲降tRF-22-DRF的mEC25细胞株，构建C57BL/6N小鼠皮下移植瘤模型，解离肿瘤组织进行单细胞测序。实验结果显示，tRF-22-DRF敲降组Treg细胞占比显著下降，且变化倍数最大。
为验证单细胞测序结果，分别使用稳定过表达tRF-22-DRF的mEC25细胞株和敲降tRF-22-DRF的mEC25细胞株，构建C57BL/6N小鼠mEC25（鼠源细胞）皮下移植瘤模型，具体方法详见准备例，解离肿瘤组织并进行流式检测。实验结果如图10中的C所示，tRF-22-DRF过表达组肿瘤内Treg细胞浸润更多；反之，tRF-22-DRF敲降，得到相反结果。以上结果提示，tRF-22-DRF诱导食管鳞癌组织中Treg细胞浸润增多。
实施例4：
有文献报道，hnRNPAB可调控基因的转录或翻译过程，为寻找tRF-22-DRF和hnRNPAB共同调控的效应基因，本实施例分别将tRF-22-DRF KD的KYSE150、HNRNPAB KD的KYSE150以及转染空载体的mEC25细胞（对照组）进行转录组测序，生信分析结果如图11和图12所示，与对照组相比，tRF-22-DRF KD和HNRNPAB KD均能下调Chemokine signalingpathway（趋化因子信号通路）关键基因的表达。在tRF-22-DRF KD和HNRNPAB KD共同下调的19个关键基因中，CCL22、CCL28和CXCL12是已知的Treg细胞趋化因子，但tRF-22-DRF和hnRNPAB调控哪个趋化因子表达及具体调控机制仍待进一步研究。
为验证tRF-22-DRF是否影响Treg细胞趋化作用，收集tRF-22-DRF KD的KYSE150、tRF-22-DRF OE的KYSE150以及转染空载体的mEC25细胞（对照组）分别培养上清并置于transwell下室，从人全血分离外周血单个核细胞（PBMC）并置于上室，6小时后收集从上室迁移过来的细胞进行流式分析。结果如图13和图14所示，与对照组相比，tRF-22-DRF OE组迁移过来的Treg细胞更多，而tRF-22-DRF KD组则更少，提示tRF-22-DRF可能通过调控趋化因子表达以募集Treg细胞。Treg细胞以浓度依赖的模式抑制CD8+T细胞的增殖和IFN-γ的产生。
将磁珠分选的CD8+T细胞和体外诱导的Treg细胞共培养，其中Treg细胞和CD8+T细胞的数量比分别为0:1、1:8、1:4、1:2或1:1，流式检测肿瘤细胞凋亡，结果表明，肿瘤细胞通过分泌趋化因子，使Treg细胞迁移到下室，抑制CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，肿瘤细胞凋亡较少；而肿瘤细胞tRF-22-DRF敲降减少Treg细胞趋化因子表达，Treg细胞迁移减少，从而恢复了CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，肿瘤细胞大量凋亡（图15和图16）。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.检测tRF表达量的试剂在制备食管癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于，所述tRF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述食管癌为食管鳞癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述tRF表达量与患者的生存期呈负相关。
3.抑制tRF表达的制剂在制备治疗食管癌药物中的应用，其特征在于，所述tRF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述食管癌为食管鳞癌；所述抑制tRF表达的制剂为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的制剂。
4.一种治疗食管癌的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括抑制tRF表达的制剂；所述tRF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述食管癌为食管鳞癌；所述抑制tRF表达的制剂为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的制剂。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药物学可接受的载体。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、凝胶剂或固体制剂。
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