CN114350800B - Sphk1在制备pd-l1/pd-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用 - Google Patents
Sphk1在制备pd-l1/pd-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于PD‑L1/PD‑1单抗肿瘤免疫治疗领域，本发明提供了PD‑L1/PD‑1单抗肿瘤免疫检测或者免疫治疗辅助药物的新研发方向，开发新的联合用药的模式。具体本发明提供了SPHK1在制备治疗PD‑L1/PD‑1单抗肿瘤免疫用药的检测试剂盒中的应用以及SPHK1在制备PD‑L1/PD‑1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用，所述肿瘤为实体肿瘤，进一步的所述实体肿瘤为黑素瘤。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗领域。
背景技术
皮肤肿瘤是所有肿瘤中最常见的一类癌症，其中，皮肤恶性黑素瘤(Skincutaneous melanoma,SKCM)是黑素细胞来源的高度恶性皮肤肿瘤。侵袭性黑素瘤发病率仅占皮肤肿瘤病例的1％但却导致了极高的病死率。在过去的几十年间，黑素瘤发病率在过去几十年里呈上升趋势，据统计，在北美、北欧、澳大利亚等地区的高加索人种中，黑素瘤发病率以每年4％至6％的速度攀升。美国癌症协会最新统计显示，皮肤黑素瘤发病率仍然在持续上升，在2020年，美国诊断出约100350例黑素瘤新发病例，约6850例患者死于黑素瘤。皮肤黑素瘤死亡率在近年来显著下降，主要得益于新疗法及新型药物应用于转移性黑素瘤使患者的生存率提高。监测、流行病学与最终结果数据库(Surveillance,Epidemiology,andEnd Results Program,SEER)分析显示，在2011年美国食品药品监督管理局(FDA) 批准首个细胞毒性T细胞相关蛋白4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)免疫检查点抑制剂，(Ipilimumab)及针对BRAF V600E基因突变的靶向治疗药物(Vemurafenib)应用于进展期黑素瘤治疗后，患者的1年相对生存率从2008年至2010年的42％上升到2013年至2015年的 55％。
鞘氨醇激酶(Sphingosine kinases,SPHKs)是一类重要的限速酶，主要包括SPHK1和SPHK2同型，可以催化和磷酸化鞘氨醇(Sphingosine,SPH)生成鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1phosphate,S1P)。虽然两种同型的底物相同，氨基酸序列高度相似，但SPHK1和SPHK2在表达水平和亚细胞定位上存在显著差异。 SPHK1位于各器官的细胞质中，而SPHK2主要分布在细胞核和特异细胞器中。目前积累的证据表明，在细胞质中经SPHK1催化合成的S1P可以通过G蛋白偶联受体输出到细胞膜上，调节细胞生理功能，并参与炎症及肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)形成。SPHK1在S1P的细胞内外信号传输中起着重要的作用，因此，靶向SPHK1可能是阻断肿瘤进展的关键环节。最近的研究已经阐明了SPHK1在癌症进展中的功能，然而，SPHK1在肿瘤免疫逃逸中的具体机制尚未明确。
MTA3被认为是核小体改构复合体(Nucleosome remodeling complex,NuRD) 的重要组分，参与形成NuRD的组蛋白去乙酰酶核心亚复合物。此外，有研究报道了MTA3基因在乳腺癌中的生物学特性。大量研究表明雌激素受体α(Estrogen receptor-α,ER-α)通过与MTA3启动子结合对MTA3进行直接的转录调控，但它在黑素瘤免疫反应中的具体作用机制仍不清楚。
程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)，又称B7-H1(B7 homolog1)或CD274是一中细胞表面糖蛋白，属于B7家族的共刺激分子。在恶性黑素瘤中，PD-L1能够通过先天和适应性机制诱导上调。PD-L1在肿瘤细胞上的异常高表达被认为是免疫耐受和逃避免疫监控的重要因素。肿瘤细胞表面的PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞上表达的同源程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)结合后，PD-L1诱导的抑制信号通路可负向调节T细胞的激活和增殖，抑制细胞因子分泌，促进T细胞的衰竭，使肿瘤细胞逃避免疫监视。由于PD-1/PD-L1相关的抑制剂具有持久的抗肿瘤作用，尤其是在一些难治性恶性肿瘤中，自2014年起，多个靶向PD-L1/PD-1通路的药物相继获得了FDA 的批准用于治疗多种恶性肿瘤，其适应症相较于CTLA-4抑制剂更广泛，但由于各类肿瘤的病因学及发病机制不同，肿瘤微环境复杂，个体差异等因素， PD-1/PD-L1抑制剂只能使部分患者获益，约80％患者在使用药物后出现获得性耐药或不应答。因此在制定具体的治疗方案之前，根据生物标志物预测免疫检查点抑制剂适用人群，避免药物导致的免疫相关不良反应是目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫检测或者免疫治疗辅助药物的新研发方向，开发新的联合用药的模式。
本发明的技术方案是：
本发明的技术方案一：
SPHK1的检测试剂在制备治疗PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫用药的检测试剂盒中的应用。
SPHK1的抑制剂在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。
SPHK1-MTA3轴的检测试剂在制备治疗PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物试剂盒中的应用。
本发明的技术方案二：
PF543在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫辅助治疗药物中的应用。
进一步的，所述PF543靶向鞘氨醇激酶SPHK1制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物。
PF543与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明的技术方案三：
MTA3的检测试剂在制备治疗PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗用药的检测试剂盒中的应用。
MTA3的抑制剂与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
SPHK1-MTA3轴的抑制剂与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
前面是三种技术方案中：所述肿瘤优先为实体肿瘤。所述肿瘤进一步优先为皮肤恶性黑素瘤。
与现有技术相比，本发明的优势是：
以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
实施例1中，如图1及表1所示，我们使用TCGA公共数据库针对不同类型的肿瘤进行基因集变异分析，结果显示SPHK1与SPHK2在肿瘤组织中普遍存在表达异常。我们发现SPHK1在绝大多数的癌症类型中显著高表达。为了进一步探究SPHK1在肿瘤微环境中的潜在功能，我们针对33类癌症中SPHK1与免疫检查点表达水平进行相关性分析，发现SPHK1基因与多数具有免疫抑制功能的检查点存在显著正相关性。包括皮肤黑色素瘤在内的多类肿瘤中，我们发现 PD-1(PDCD1)及PD-L1(CD274)作为肿瘤微环境中定义明确的免疫抑制通路，与SPHK1基因表达量存在显著的正相关性。上述生信分析结果显示SPHK1 可能是重要的免疫抑制分子。如图2所示，我们构建了皮下移植瘤(黑素瘤)免疫小鼠模型，通过SPHK1特异性抑制剂PF543治疗小鼠肿瘤，我们发现靶向抑制鞘氨醇激酶可显著抑制小鼠肿瘤增殖，且无显著毒副表现。如图3所示，采用流式细胞术进一步分析SPHK1在黑素瘤局部微环境的功能，我们发现PF543处理能够诱导肿瘤局部CD4以及CD8+T细胞浸润。其中分泌颗粒酶GZMB的 CD8+T淋巴细胞(CTL)比例在药物处理组显著增加。由于GZMB是能够对靶细胞发挥杀伤功能的重要标志物，上述结果表明PF543处理后可能通过增加肿瘤微环境中特异性CTL细胞发挥抗肿瘤作用。此外我们发现肿瘤细胞PD-L1膜蛋白表达量在药物处理组中显著降低。
实施例2中，如图4、表4及表5所示，通过mRNA测序结果我们发现抑制SPHK1活性可显著下调PD-L1的表达，体外研究进一步证实基因敲降SPHK1 或者PF543抑制鞘氨醇激酶活性可显著抑制下游MTA3表达；通过生物信息学分析肿瘤TCGA数据库我们还发现在多种肿瘤类型中，MTA3与PD-L1的表达存在显著正相关。进一步通过ChIP检测，我们发现MTA3可直接与c-Myc启动子结合，从而进一步转录调控肿瘤PD-L1的表达。如图5所示，我们发现在体外发现基因敲降MTA3确实能够引起肿瘤PD-L1的表达下调。下调MTA3表达可抑制c-Myc介导的PD-L1表达，而MTA3这一转录因子对肿瘤PD-L1的直接调控作用尚无研究报道，而通过靶向抑制MTA3我们认为可达到类似于 PD-L1/PD-1单抗的作用，从而抑制PD-L1/PD-1这一对免疫检查点对肿瘤免疫逃逸的促进作用。
实施例3中，如图6所示，我们构建了基因过表达转录因子MTA3皮下移植瘤(黑素瘤)免疫小鼠模型，通过联合PD-1单克隆抗体治疗小鼠肿瘤，我们发现联合干预组较单药组或对照组抗小鼠肿瘤增殖能力更强，且无显著毒副表现。如图7所示，通过流式细胞术进一步探究了SPHK1-MTA3过表达在黑素瘤局部微环境中的免疫特征，SPHK1及MTA3均能够使肿瘤细胞PD-L1膜蛋白表达显著上调。同时我们发现PD-1单抗作用于SPHK1或MTA3高表达黑素瘤模型后，肿瘤局部GZMB+CD8+淋巴细胞比例显著上调，该结果表明PD-1单抗能够有效逆转SPHK1以及MTA3诱导PD-L1表达引起的肿瘤免疫逃逸，从而使肿瘤生长速度减慢。从以上结果均可提示我们针对靶向SPHK1抑制剂的开发，可为 PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗提供免疫治疗辅助药物的新研发方向，开发新的联合用药的模式。如图8所示，为了探究黑色素瘤患者MTA3表达的预后特征，我们在TCGA公共数据库中检索黑色素瘤患者生存相关数据并进行生存分析。在未接受免疫治疗的黑素瘤患者中，MTA3基因表达对总生存期无显著影响。而在接受免疫治疗的患者中，MTA3高表达组的死亡风险显著降低。我们同时观察了临床上已接受PD-1单抗(特瑞普利单抗)治疗的皮素黑素瘤患者的组织病理染色结果以及临床预后，通过比较SPHK1与MTA3在肿瘤中的表达，并关联患者的无进展生存时间，我们发现SPHK1及MTA3表达较高的黑素瘤患者接受 PD-1单抗的应答效果更好，患者无进展生存时间更长，且均有显著统计学差异。从以上结果均可提示我们针对SPHK1-MTA3轴，可为PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗提供新的免疫检测靶点，开发检测试剂或者提供免疫治疗辅助药物的新研发方向，开发新的联合用药的模式。如图9所示，我们的研究表明，靶向鞘氨醇激酶1可通过下调下游转录因子MTA3调控c-Myc介导的肿瘤PD-L1转录水平，从而抑制肿瘤的免疫逃逸，阻断肿瘤生长。该机制直接探讨了PD-1阻断剂作用的现存问题，为提供PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫检测或者免疫治疗辅助药物的新研发方向，开发了新的联合用药的模式。
名称解释：PD-L1/PD-1中的“/”代表“和”或者“或”的意思。
附图说明
图1为实施例1对鞘氨醇激酶在肿瘤组织的表达与功能分析图，其中图1A 为TCGA数据库中分析SPHK1与SPHK2在不同癌症中的表达水平图，与正常样本相比，SPHK1和SPHK2基因在16类癌症中的差异表达情况。数据采用基因差异倍数对数值(LogFC)表示，检验水准α＝0.05。右侧饼图表示基因表达在肿瘤组织中不显著(灰色)或显著上调(红色)及下调(蓝色)的癌症比例；图 1B为SPHK1基因与抑制性免疫检查点在不同癌症中的相关性分析图数据采用斯皮尔曼相关系数(Rs)表示，检验水准α＝0.05；图1C为SPHK1与PD-L1(CD274) 表达在各类癌症中的相关性分析图，数据采用斯皮尔曼相关系数表示，检验水准α＝0.05。
图2为实施例1的小鼠模型实验数据图，其中图2A为小鼠实验流程示意图；图2B为不同剂量(5mg/kg、10mg/kg)PF543处理黑素瘤小鼠模型9天后分离肿瘤图；图2C为处死当天小鼠皮下移植瘤瘤体体积体外测量散点统计图，数据用均数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Tukey HSD检验进一步进行两组间比较，NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***, P<0.001；图2D为实时测量的小鼠皮下移植瘤瘤体体积变化曲线图，从干预开始，每两天测量一次小鼠瘤体体积，并绘制体积曲线，于处死当天取出小鼠离体进行体外测量并绘制柱状统计图，数据用均数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Tukey HSD检验法进一步进行两组间比较，NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；图2E为实时测量的小鼠体重变化曲线图，从干预开始，每两天观察一次小鼠一般状态并测量小鼠体重，并绘制体重曲线，数据用均数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Tukey HSD检验法进一步进行两组间比较。
图3为实施例1的体内抑制SPHK1活性后细胞膜蛋白及胞内标志物染色流式细胞术分析图，其中图3A、3B分别为黑素瘤小鼠经PF543处理后肿瘤局部淋巴细胞分布的代表性散点图(左)及统计分析(右)；图3C、3D分别为黑素瘤小鼠经PF543处理后黑素瘤组织中肿瘤细胞表面PD-L1表达的代表性散点图(左) 及统计分析(右)。数据采用均值±均值标准误表示，NS,P>0.05；*,P<0.05；**, P<0.01；***,P<0.001。
图4为实施例2的转录组测序、生物信息机制探究图，其中图4A为转录组测序分析后筛选出候选转录因子在不同样本中的表达量，共两组，每组三个独立重复样本；图4B为qRT-PCR验证测序样本中PD-L1及转录因子的表达情况。数据采用均值±均值标准误表示。NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001； ****,P<0.0001；图4C为GDSC公共数据库中获取52个黑素瘤细胞株的转录组数据，采用皮尔森积矩相关系数及显著性检验分析SPHK1与候选转录因子的相关性，检验水准α＝0.05；图4D为使用皮尔森积矩相关系数及显著性检验分析评价MTA3基因表达与MsigDB癌症标志物相关通路相关性，检验水准α＝0.05；图4E为对转录组测序中SPHK1下游的差异基因进行GSEA富集分析；图4F为使用Westernblot检测MTA3稳定过表达黑素瘤细胞株中Flag-MTA3转染效率；图4G为预测的c-Myc启动子区MTA3结合位点的引物序列设计图谱；图4H为在黑素瘤细胞系中，使用anti-Flag抗体，SYBR RT-PCR使用c-Myc引物，通过染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitationassay,ChIP)检测证明MTA3 与c-Myc启动子有明显结合。
图5为实施例2的SPHK1-MTA3轴调控肿瘤PD-L1表达水平的体外研究实验数据图，其中图5A、5B为黑素瘤细胞经不同浓度PF543和IFN-γ(200ng/mL) 处理后24-36小时后，提取蛋白并使用Western blot检测MTA3、c-Myc表达水平。图5A为Western blot代表性图片；图5B为经三次重复实验对蛋白条带灰度值进行统计分析；图5C、5D为使用Western blot检测siSPHK1干扰沉默黑素瘤细胞SPHK1基因后敲降效率及MTA3、c-Myc表达水平。图5C为Western blot代表性图片；图5D为经三次重复实验对蛋白条带灰度值进行统计分析。图5E、5F为黑素瘤细胞系经siMTA3干扰沉默MTA3基因后使用Western blot检测敲降效率、c-Myc和PD-L1表达。图5E为Western blot代表性图片；图5F为经三次重复实验对蛋白条带灰度值进行统计分析。数据均采用均值±均值标准误表示。 NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
图6为实施例3的小鼠模型实验数据图，其中图6A为小鼠实验流程示意图；图6B为PD-1单抗处理黑素瘤小鼠模型14天后分离肿瘤图；图6C为处死当天小鼠皮下移植瘤瘤体体积体外测量散点统计图，数据用均数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Tukey HSD检验进一步进行两组间比较，NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；图6D为实时测量的小鼠皮下移植瘤瘤体体积变化曲线图，从干预开始，每两天测量一次小鼠瘤体体积，并绘制体积曲线，于处死当天取出小鼠离体进行体外测量并绘制柱状统计图，数据用均数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Tukey HSD检验法进一步进行两组间比较，NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；图6E为实时测量的小鼠体重变化曲线图，从干预开始，每两天观察一次小鼠一般状态并测量小鼠体重，并绘制体重曲线，数据用均数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Tukey HSD检验法进一步进行两组间比较。
图7为实施例3的高表达SPHK1或MTA3黑素瘤细胞经PD-1单克隆抗体处理后对肿瘤微环境影响流式细胞术分析图，其中图7A、7B分别为高表达 SPHK1或MTA3基因黑素瘤小鼠模型经PD-1单克隆抗体处理后黑素瘤组织中肿瘤浸润淋巴稀细胞比例肿瘤细胞PD-L1膜蛋白表达的代表性散点图及数据统计分析图。数据采用均值±均值标准误表示，NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***, P<0.001。
图8为实施例3对免疫治疗黑素瘤患者肿瘤组织进行公共数据数生物信息学分析及免疫荧光染色标记肿瘤SPHK1与MTA3表达水平。从TCGA公共数据库获取皮肤黑素瘤患者的总生存期，根据既往治疗方案将患者分为(图8A)未使用免疫治疗组与(图8B)免疫治疗组，患者MTA3基因基于表达量分为高表达(前65％)和低表达组(后35％)，采用乘积极限法(Kaplan-Meier,K-M)对黑素瘤患者总生存时间进行生存分析，使用Log-rank检验比较组间统计学差异；图8C、8D分别为根据SPHK1、MTA3基因表达量中位数将患者分组，采用K-M 法对黑素瘤患者无进展生存时间进行生存分析，使用Log-rank检验比较组间统计学差异。
图9为SPHK1-MTA3信号轴通过调控黑素瘤PD-L1促进肿瘤免疫逃逸模式图。
具体实施方式
实施例1
1、鞘氨醇激酶在肿瘤组织的表达与功能分析。
1.1实验方法：从癌症基因组图谱(TCGA)数据库 (http://gdac.broadinstitute.org/)中使用FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)算法获取33类癌症(包括10205个肿瘤样本)的基因转录组数据。使用limma1.4.5 分析基因在肿瘤及相应正常组织中的差异倍数(Fold change,FC)，筛选阈值为 |Log2(FC)|>0.58，采用Benjamini-Hochberg(BH)方法对假设检验概率P值进行校正。采用斯皮尔曼相关系数及其显著性检验进行肿瘤组织中基因间的相关性分析，检验水准α＝0.05。
1.2实验结果：
通过比较癌症基因组图谱(TCGA)公共数据库中不同癌症类型的肿瘤和正常组织进行基因集变异分析，并计算SPHKs的相对表达水平。结果显示SPHK1 与SPHK2在多类癌症中的显著差异表达，二者在在肿瘤组织中普遍存在表达异常。如图1A所示，SPHK1在12种癌症类型中显著高表达，包括乳腺浸润性癌 (BRCA,LogFC＝0.52,P＜0.001、食管癌(ESCA,LogFC＝2.38,P＜0.001)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC,LogFC＝1.30,P＜0.001)，肝细胞癌(LIHC,LogFC＝1.23, P＝0.002)、肺腺癌(LUAD,LogFC＝0.68,P＝0.001)、直肠腺癌(READ,LogFC＝1.24, P＝0.02)、胃癌(STAD,LogFC＝1.32,P＜0.001)、结肠癌(COAD,LogFC＝1.19,P ＜0.001)、肾透明细胞癌(KIRC,LogFC＝1.35,P＜0.001)、肾乳头状细胞癌 (KIRP,LogFC＝2.31,P＜0.001)、肺鳞癌(LUSC,LogFC＝1.32,P＜0.001)，甲状腺癌(THCA,LogFC＝1.17,P＜0.001)。为了进一步探究SPHK1在肿瘤微环境中的潜在功能，针对33类癌症中SPHK1与抑制类免疫检查点表达水平进行相关性分析。如图1B所示，SPHK1基因与多种具有免疫抑制功能的免疫检查点存在相关性，其中我们发现PD-1(PDCD1)及PD-L1(CD274)作为肿瘤微环境中定义明确的免疫抑制通路，与SPHK1基因表达量在包括皮肤恶性黑素瘤在内的多类肿瘤中存在显著的正相关性(见图1C)。
2、靶向鞘氨醇激酶SPHK1抑制小鼠移植瘤(黑素瘤)增殖的体内研究。
2.1组别设置：
Vehicle(溶剂对照组)
PF543(5mg/kg)(PF543低浓度组)
PF543(10mg/kg)(PF543高浓度组)
2.2实验流程，见图1A：
实验前6天左右：对6-8周C57BL/6小鼠分别于右侧背翼处皮下注射B16F10 黑素瘤细胞株8*105个，每组各10只小鼠。
实验第0天：记录小鼠体重及肿瘤体积，当肿瘤体积生长至50-100mm3开始，对成瘤小鼠分别进行PF543(5mg/kg)/小鼠/2天或PF543(10mg/kg)/小鼠/2 天，腹腔注射，并设置溶剂对照组，共三组，每组10只小鼠。
实验第2、4、6、8天：每两天称量一次小鼠体重及瘤体体积，体积＝(长×宽×宽×π)/6公式计算。
实验第8天：处死一半小鼠，获取肿瘤拍照并保存组织样本，进行后续数据分析。
2.3实验结果：
由图2B、2C、2D所示，与溶剂对照组相比，药物处理组肿瘤体积显著低于溶剂对照组，其中高剂量给药组(10mg/kg)肿瘤体积较低剂量组(5mg/kg)更低；
由图2E所示，在给药期间各组小鼠的体重无明显波动，体重增长在组间无统计学差异，表明PF543对荷瘤小鼠无明显毒副作用。
以上结果提示，使用鞘氨醇激酶抑制剂PF543可抑制黑素瘤生长。
3、靶向SPHK1促进肿瘤浸润淋巴细胞杀伤活性的体内研究。
3.1实验方法：细胞膜蛋白及胞内标志物染色。
3.2实验结果：
如图3A、3B所示，PF543药物处理能够显著诱导肿瘤局部CD4+T细胞及 CD8+T细胞浸润。其中生成颗粒酶B(GZMB)的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 比例在药物处理组显著增加。由于GZMB是能够对靶细胞发挥杀伤功能的重要生物标志物，上述结果表明PF543药物处理后可能通过增加肿瘤微环境中特异性CD8+CTL细胞发挥抗肿瘤作用；
如图3C、3D所示，我们发现肿瘤细胞PD-L1表面蛋白表达量在药物处理组中显著降低。
以上结果提示，SPHK1可能在皮肤黑素瘤局部微环境中发挥了免疫抑制功能，抑制SPHK1酶活性可能通过下调肿瘤细胞PD-L1膜蛋白表达逆转肿瘤浸润淋巴细胞的功能失调状态从而促进肿瘤的免疫应答。
4、回顾性观察黑素瘤患者中肿瘤PD-L1与SPHK1表达水平的相关性分析
实验结果如表1所示，黑素瘤患者中肿瘤PD-L1与SPHK1表达水平呈显著正相关，存在统计学差异，P<0.05。
附表1说明：表1为对黑素瘤患者肿瘤组织样本石蜡切片进行免疫荧光染色标记肿瘤PD-L1与SPHK1表达水平，表1中总结了每种类别的患者数量，根据这些数据，用皮尔森卡方检验(双边检验)进行变量间的关联性分析并评估两者相关性的显著性。
实施例2
1、SPHK1-MTA3轴调控肿瘤PD-L1表达水平的体外研究。
1.1实验方法：转录组测序、TCGA数据库生信分析、基因编辑，细胞基因干预、PF543药物干预、Western blot、ChIP检测
靶基因siRNA Oligo序列如表2所示：
根据扩增曲线判断引物特异性，对于特异性不佳的基因引物需重新设计合成。
经优化的基因引物序列如下表3所示：
1.2实验结果：
见图4A，与对照组相比，在给药组检测到的4182个显著下调基因中，根据基因差异表达倍数确定了九个候选转录因子；
见图4B，为了评价测序分析结果的可靠性，我们使用相同批次的RNA样本进行qRT-PCR检测候选转录因子表达情况；
见图4C，通过在GDSC公共数据库中获取的黑素瘤细胞相关转录组数据，我们发现SPHK1基因与九个候选转录因子中的MTA3存在显著的正相关性；
见图4D，MTA3表达与促进癌症的靶点相关，如G2M、c-Myc等；
见图4E，通过基因富集分析，我们发现SPHK1下游的下调基因显著富集于 c-Myc相关通路。
见图4F、4G、4H，ChIP检测MTA3是否与c-Myc启动子结合，相较于对照组，MTA3与c-Myc启动子有显著结合，统计学存在差异。
以上结果提示，MTA3作为SPHK1的下游基因可能参与了c-Myc介导的 PD-L1的表达。
见图5A、5B、5C、5D，黑素瘤细胞经SPHK1特异性抑制剂处理或敲低SPHK1 基因均能够显著下调MTA3及c-Myc表达量；
见图5E、5F，在黑素瘤细胞系中敲低MTA3基因后能够显著降低c-Myc及经IFN-γ诱导的PD-L1表达量。
上述结果提示SPHK1能够通过MTA3正向调控PD-L1表达。
2、回顾性观察黑素瘤患者中肿瘤MTA3与SPHK1表达水平的相关性分析
实验结果如表4所示，黑素瘤患者中肿瘤MTA3与SPHK1表达水平呈显著正相关，存在统计学差异，P<0.05。
附表4说明：表4为对黑素瘤患者肿瘤组织样本石蜡切片进行免疫荧光染色标记肿瘤MTA3与SPHK1表达水平，表4中总结了每种类别的患者数量，根据这些数据，用皮尔森卡方检验(双边检验)进行变量间的关联性分析并评估两者相关性的显著性。
3、回顾性观察黑素瘤患者中肿瘤PD-L1与MTA3表达水平的相关性分析。
实验结果如表5所示，黑素瘤患者中肿瘤PD-L1与MTA3表达水平呈显著正相关，存在统计学差异，P<0.05。
附表5说明：表5为对黑素瘤患者肿瘤组织样本石蜡切片进行免疫荧光染色标记肿瘤PD-L1与MTA3表达水平，表5中总结了每种类别的患者数量，根据这些数据，用皮尔森卡方检验(双边检验)进行变量间的关联性分析并评估两者相关性的显著性。
实施例3
1、SPHK1与MTA3诱导的肿瘤PD-L1表达的体内研究。
1.1组别设置：
CTL+IgG2α同型对照组(对照组)
CTL+PD-1单抗组(PD-1单抗治疗组)
SPHK1-OE+IgG2α同型对照组(SPHK1过表达组)
SPHK1-OE+PD-1单抗组(SPHK1过表达PD-1单抗组)
MTA3-OE+IgG2α同型对照组(MTA3过表达组)
MTA3-OE+PD-1单抗组(MTA3过表达PD-1单抗组)
1.2实验流程，见图6A：
实验前6天左右：对6-8周C57BL/6小鼠分别于右侧背翼处皮下注射B16F10 黑素瘤SPHK1过表达细胞株、MTA3过表达细胞株8*105个及相同数量CTL细胞株(空载对照组)各20只小鼠。
SPHK1基因过表达序列SEQ ID NO:037所示。
MTA3基因过表达序列如SEQ ID NO:038所示。
实验第0天：记录小鼠体重及肿瘤体积，当肿瘤体积生长至50-100mm3开始，对成瘤小鼠分别进行PD-1单抗200μg/小鼠/3天，腹腔注射，并设置IgG2α同型对照组，共六组，每组10只小鼠。
实验第2、4、6、8、10、12、14天：每两天称量一次小鼠体重及瘤体体积，体积＝(长×宽×宽×π)/6公式计算。
实验第14天：处死一半小鼠，获取肿瘤拍照并保存组织样本，进行后续数据分析。
1.3实验结果：
见图6B、6C、6D，PD-1单克隆抗体处理组肿瘤体积大小显著低于同型对照IgG2α组，其中PD-1单克隆抗体处理后能够显著抑制SPHK1及MTA3介导的肿瘤生长；
见图6E，在给药期间各组小鼠的体重无明显波动，体重增长在组间无统计学差异，表明PD-1单克隆抗体与IgG2α同型对照对荷瘤小鼠无明显毒性。
以上结果提示，PD-1单克隆抗体处理组肿瘤体积大小显著低于同型对照 IgG2α组，其中PD-1单克隆抗体处理后能够显著抑制SPHK1及MTA3介导的肿瘤生长。
2、高表达SPHK1或MTA3黑素瘤细胞经PD-1单克隆抗体处理后对肿瘤微环境影响的体内研究。
2.1实验方法：细胞膜蛋白及胞内标志物染色。
2.2实验结果：
见图7A、7B，SPHK1及MTA3均能够使肿瘤细胞表面PD-L1蛋白显著上调。同时与IgG2a对照组相比，我们发现PD-1单克隆抗体作用于SPHK1或MTA3 高表达黑素瘤模型后，肿瘤局部GZMB+CD8+淋巴细胞比例显著上调，该结果表明PD-1单克隆抗体能够逆转SPHK1及MTA3诱导PD-L1表达引起的肿瘤免疫逃逸，从而使肿瘤生长速度减慢。
3、回顾性临床观察免疫治疗黑素瘤患者中肿瘤SPHK1及MTA3表达水平与患者预后(总生存时间或无进展生存时间)相关性研究。
见图8A，在未接受免疫治疗的黑素瘤患者中，MTA3基因表达量对总生存期无显著影响(风险比1.20,95％可信区间0.87-1.64)；
见图8B，在接受免疫治疗的患者中，MTA3高表达组的死亡风险显著降低 (风险比0.40,95％可信区间0.19-0.85)；
见图8C、8D，SPHK1(风险比0.30,95％可信区间0.13-0.72)、MTA3(风险比0.44,95％可信区间0.20-0.95)高表达的黑素瘤患者在接受PD-1单克隆抗体治疗后的无进展生存时间显著延长。
上述结果表明SPHK1-MTA3轴可通过上调肿瘤细胞PD-L1表达逆转对PD-1 单克隆抗体治疗的耐药性。
以上所述为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> SPHK1在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用
<141> 2021-12-28
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gugcaacaga aacgucuaat t 21
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uucuccgaac gugucacgut t 21
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tctagaatgg aaccagtaga atgccctcga ggactgctcc cacggccatg cagagtgctg 60
gtgctgctga acccccaggg tggcaagggc aaggctctgc agctcttcca gagccgtgtg 120
cagcccttcc tggaggaggc agagataacc tttaaactga tactcaccga acggaagaac 180
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tccggtgatg gtctgatgca tgaggtggtg aatgggctaa tggaacggcc agactgggag 300
actgccatcc agaaacccct gtgtagcctc cctggaggct ccggcaatgc gctggcagct 360
tctgtgaacc actatgctgg gtacgagcag gtgactaatg aagacctgct catcaactgc 420
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ctcgagagtg agaagtacag gcgcttgggg gagattcgtt tcacagtggg caccttcttt 600
cgcctagcaa gcctgcgcat ctaccaaggc caactggcct accttcctgt aggaactgtg 660
gcctctaaga gacccgcctc tacactggtg cagaagggcc ccgtcgacac acaccttgtt 720
cctctggagg agccagtgcc ttctcattgg actgtggtac cagaacagga cttcgtcctg 780
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tgtgaggctg gtgttatgca tctgttctac gtacgtgcgg gggtgtcaag ggctgcgctg 900
ctgcgcctct tcctggccat gcagaagggc aagcatatgg aacttgactg tccatacctg 960
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gtggatggag agctgatggt atgtgaagct gtgcagggcc aagtgcaccc aaactacctt 1080
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ttcgaagaag cactggaaaa atacggcaaa gatttcaacg acattcgtca ggactttctc 900
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caggtctgca aaagcaccct gcggctgcgg caggcagcga gacggccgtt tgttgctatt 1500
aattatgctg ccattagggc agaatatgca gacagacatg ccgaactttc tggaagccca 1560
ctgaaaagca gaagcaccag gaaacctttg tcgtgtatca ttgggtattt agagatccat 1620
cccgcaaaga aacctaatgt aattcggtct ccaccaagcc tgcaaactcc agctaccaag 1680
aggatgctcg ccgctccgaa tcacacatct ctgagcattc tggggaaaag aaactacagc 1740
catcacaatg gtctagatgg tacggattac aaggacgacg atgacaagta agcggccgc 1799
Claims (1)
1.MTA3的siRNA在制备黑素瘤治疗药物中的应用，所述siRNA如SEQ ID NO:005和SEQID NO:006所示，具体为5’-gugcaacagaaacgucuaatt-3’、5’-uuagacguuucuguugcactt-3’。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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