CN110974969B - Adora1在制备pd-l1/pd-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用 - Google Patents

Adora1在制备pd-l1/pd-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了ADORA1在制备PD‑L1/PD‑1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用，具体为ADORA1可以作为生物标志物在PD‑L1/PD‑1单抗肿瘤免疫治疗用药前的应用，或者ADORA1作为靶位点检测试剂在制备PD‑L1/PD‑1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用，以及ADORA1的抑制剂与PD‑L1/PD‑1单抗药物联用在制备肿瘤免疫治疗辅助药物中的应用。所述肿瘤为实体肿瘤，优选为黑素瘤或肺癌，进一步优选为黑素瘤或非小细胞肺癌。

Description

ADORA1在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗领域。
背景技术
近些年来，免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockades,ICB)的相关疗法被全球科 学家们广泛研究，并为一些恶性肿瘤，如恶性黑素瘤(melanoma,MM)和非小细胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer,NSCLC)的治疗带来了巨大的临床益处。其中，阻断程序性细胞 死亡蛋白1(PD-1)与其配体(PD-L1)相互作用的中和抗体在多肿瘤的临床应用，给肿瘤免 疫治疗带来了突破性进展。但随着研究的深入，研究者们发现其仍有明显不足，仅有不到 40％的肿瘤患者对PD-L1/PD-1阻断疗法有应答，或在治疗过程中存在存在初次或二次耐 药。然而，这些现象的潜在发生机制尚不明确。最近的研究表明，肿瘤PD-L1表达水平 可作为评估抗PD-L1/PD-1治疗临床应答的一个重要因素，也是常见的生物标志物。因此， 了解肿瘤PD-L1调控的分子机制是至关重要的，这对于提高PD-L1/PD-1抗肿瘤的治疗效 果及临床预后具有重要意义。
腺苷是一种单核苷类物质，可在肿瘤微环境中积累，对肿瘤的进展起到促进作用。胞 外腺苷作为配体可与腺苷受体结合，从而激活下游级联信号反应影响肿瘤免疫稳态。例如， 腺苷A2A受体(ADORA2A)被认为是一种通过调控调节性T细胞的功能来促进肿瘤免疫逃避的新型免疫检查点。腺苷A2B受体(ADORA2B)通过与骨髓衍生抑制类免疫细胞的结合 促进肿瘤生长。此外，腺苷A1受体(adenosine A1 receptor,ADORA1)也曾被报道在结直肠 腺癌、人白血病Jurkat细胞、乳腺癌、肾癌中有促肿瘤生长的作用，但其在肿瘤免疫中的 作用尚不清楚。
cAMP依赖性转录因子(cAMP-dependent transcription factor 3，ATF3)是 ATF/cAMP-responsive element-binding protein(CREB)家族成员，其表达受到DNA损伤、 细胞损伤、氧化应激等多种细胞应激的快速诱导。最近的研究表明，ATF3通过诱导肿瘤 细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。在固有免疫中，ATF3在LPS-处理小鼠中作为免疫调节 剂与NF-κB和促炎细胞因子IL-6，IL-12b,toll样受体-4(TLR-4)有着交互作用,但它在免疫 反应中的具体作用机制仍不清楚。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫检测或者免疫 治疗辅助药物的新研发方向，开发新的联合用药的模式。
本发明的技术方案有以下几种：
本发明的技术方案一：
ADORA1作为生物标志物在PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗用药前的应用。
ADORA1作为靶位点检测试剂在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。
ADORA1的抑制剂与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫辅助治疗药物中的应用。
本发明的技术方案二：
DPCPX抑制剂在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫辅助治疗药物中的应用。
所述DPCPX抑制剂靶向抑制腺苷受体ADORA1制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物。
DPCPX抑制剂与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫辅助治疗药物中的应用。
本发明的技术方案三：
ATF3作为靶位点检测试剂在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明的技术方案四：
ATF3作为靶位点检测试剂联合DPCPX抑制剂在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。
ATF3作为靶位点检测试剂与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫治疗药物中 的应用。
本发明的技术方案五：
ADORA1-ATF3轴作为靶位点检测试剂在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。
ADORA1-ATF3轴作为靶位点检测试剂与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
前面五种技术方案中：所述肿瘤优先为实体肿瘤。所述肿瘤进一步优先为黑素瘤或肺 癌。所述肿瘤更进一步优先为黑素瘤或非小细胞肺癌。
在现有的研究中，PD-1阻断治疗显示出较为良好的抗癌作用，但其整体应答率仍不 尽如人意。这种现象产生的部分原因认为可能与PD-L1表达呈正相关，而目前我们对肿瘤PD-L1的调控机制仍不明确。从我们展现的研究数据来看，实施例1中，如图1所示， 我们构建了基因敲降腺苷受体ADORA1皮下移植瘤(黑素瘤)免疫小鼠模型，通过联合 PD-1单抗治疗小鼠肿瘤，我们发现靶向抑制腺苷受体ADORA1可显著增强PD-1单抗抗 小鼠肿瘤增殖，促进小鼠生存期的作用，且无显著毒副表现。如表1及图2所示，我们同 时观察了临床上已接受PD-1单抗(纳武单抗)治疗的非小细胞肺癌患者的组织病理染色 结果以及临床预后，通过比较ADORA1与PD-L1在肿瘤中的表达，并关联患者的无进展 生存时间及总生存时间，我们发现ADORA1表达较低的患者PD-L1表达较高，且患者接 受PD-1单抗的应答效果更好，患者无进展生存时间及总生存时间更长，且均有显著统计 学差异。从以上结果均可提示我们针对ADORA1这一新的靶点，可为PD-L1/PD-1单抗 肿瘤免疫治疗提供新的免疫检测靶点，开发检测试剂或者提供免疫治疗辅助药物的新研发 方向，开发新的联合用药的模式。实施例2中，如图3、4所示，我们构建了皮下移植瘤 (黑素瘤、非小细胞肺癌)免疫小鼠模型，通过ADORA1特异性抑制剂DPCPX联合PD-1 单抗治疗小鼠肿瘤，我们发现靶向抑制腺苷受体ADORA1可显著增强PD-1单抗抗小鼠 肿瘤增殖，促进小鼠生存期的作用，且无显著毒副表现。如图5所示，通过mRNA测序 结果我们发现基因敲降ADORA1可显著上调ATF3的表达，体外研究进一步证实基因敲 降ADORA1或者DPCPX抑制ADORA1受体可显著激活下游ATF3表达；通过生物信息 学分析肿瘤TCGA数据库我们还发现在多种肿瘤类型中，ATF3与PD-L1的表达存在显著 正相关，体外研究也发现基因敲降ATF3确实可以引起肿瘤PD-L1的表达下调；同理如图 6所示，我们上调ATF3表达可促进PD-L1的表达，且进一步通过荧光素酶报告基因检测及ChIP检测，我们发现ATF3可直接与PD-L1启动子结合，从而转录调控肿瘤PD-L1的 表达，而ATF3这一转录因子对肿瘤PD-L1的直接调控作用尚无研究报道，而通过靶向抑 制ATF3我们认为可达到类似于PD-L1/PD-1单抗的作用，从而抑制PD-L1/PD-1这一对免 疫检查点对肿瘤免疫逃逸的促进作用。如图7、8所示，我们构建了基因敲降转录因子 ATF3皮下移植瘤(黑素瘤、非小细胞肺癌)免疫小鼠模型，通过联合ADORA1特异性 抑制剂DPCPX治疗小鼠肿瘤，我们发现联合干预组较单药组或对照组抗小鼠肿瘤增殖能 力更强，小鼠生存时间更长，且无显著毒副表现。从以上结果均可提示我们针对靶向 ADORA1抑制剂的开发，可为PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗提供免疫治疗辅助药物的新 研发方向，开发新的联合用药的模式。实施例3中，如表2及图9所示，我们同时观察了 临床上已接受PD-1单抗(纳武单抗)治疗的非小细胞肺癌患者的组织病理染色结果以及 临床预后，通过比较ADORA1、ATF3与PD-L1在肿瘤中的表达，并关联患者的无进展 生存时间及总生存时间，我们发现ADORA1表达较低的患者ATF3及PD-L1表达较高， 且患者接受PD-1单抗的应答效果更好，患者无进展生存时间及总生存时间更长，且均有 显著统计学差异。从以上结果均可提示我们针对ADORA1-ATF3轴，可为PD-L1/PD-1单 抗肿瘤免疫治疗提供新的免疫检测靶点，开发检测试剂或者提供免疫治疗辅助药物的新研 发方向，开发新的联合用药的模式。
我们的研究表明，靶向腺苷受体ADORA1可通过上调下游转录因子ATF3直接调控肿瘤PD-L1转录水平，从而增强了PD-1单抗阻断治疗肿瘤的疗效。该机制直接探讨了 PD-1阻断剂作用的现存问题，为提供PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫检测或者免疫治疗辅助药 物的新研发方向，开发了新的联合用药的模式。
名称解释：PD-L1/PD-1中的“/”代表“和”或者“或”的意思。
以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
附图说明
图1为实施例1的小鼠模型实验数据图，其中图1A为小鼠实验流程示意图，图1B为实时测量的小鼠皮下移植瘤瘤体体积变化曲线图，从干预开始，每三天测量一次小鼠瘤体体积，并绘制体积曲线，于处死当天取出小鼠离体进行体外测量并绘制柱状统计图，数据用均数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Dunnett-t检验进一步进行两组间比较，NS,P>0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。图1C为处 死当天小鼠皮下移植瘤瘤体体积体外测量散点统计图，数据用均数±标准误表示，结果统 计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Dunnett-t检验进一步进行两组 间比较，NS,P>0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。图1D为实时测量的小鼠体重变化曲线图， 从干预开始，每三天观察一次小鼠一般状态并测量小鼠体重，并绘制体重曲线，数据用均 数±标准误表示，结果统计学分析采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Dunnett-t检验进一步进行两组间比较。图1E为小鼠Kaplan-Meier生存曲线图，采用 Gehan–Breslow–Wilcoxon检验进行组间差异比较。NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01。
图2为实施例1对PD-1单抗治疗NSCLC患者肿瘤组织样本石蜡切片进行免疫荧光染色标记肿瘤ADORA1与PD-L1表达水平，根据基因表达的高低分别比较患者无进展生存时 间(A,B)和总生存时间(C,D)，绘制Kaplan-Meier生存曲线图，采用 Gehan–Breslow–Wilcoxon检验进行组间差异比较。
图3为实施例2的黑素瘤小鼠模型实验数据图，其中，图3A为小鼠实验流程示意图；图3B为实时测量的小鼠皮下移植瘤瘤体体积变化曲线图；图3C为处死当天小鼠皮下移植瘤瘤体体积体外测量散点统计图；图3D为实时测量的小鼠体重变化曲线图；图3E为小鼠Kaplan-Meier生存曲线图。
图4为实施例2的肺癌小鼠模型实验数据图，其中图4A为小鼠实验流程示意图；图4B 为实时测量的小鼠皮下移植瘤瘤体体积变化曲线图；图4C为处死当天小鼠皮下移植瘤瘤 体体积体外测量散点统计图；图4D为实时测量的小鼠体重变化曲线图。
图5为实施例2、3中的ADORA1-ATF3-PD-L1轴的体外研究实验数据图，其中图5A为黑素瘤细胞系Sk-mel-28基因敲降ADORA1对比空载组的转录组测序分析的火山图结果, 校正后p值≤0.05则表示统计学差异；图5B为生物信息学分析肿瘤TCGA数据库多肿瘤间 ATF3与PD-L1表达相关性结果,统计学采用Spearman's rho关联分析，红点表示有统计学差 异，p≤0.05；图5C和5E分别代表在体外对黑素瘤细胞系进行基因敲降ADORA1或ATF3后 对ADORA1、ATF3及PD-L1表达的western blot检测结果；图5D和5F为对应的灰度分析统 计学结果，数据用均数±标准误表示，结果采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采 用Dunnett-t检验进一步进行两组间比较，**,P<0.01；***,P<0.001。
图6为实施例2、3中的ATF3对PD-L1的直接调控机制研究实验数据，其中图6A代表在 体外对黑素瘤细胞系进行基因过表达ATF3后对ATF3及PD-L1表达的western blot检测结 果；图6B为对应的灰度分析统计学结果，数据用均数±标准误表示，结果采用非配对t检验 进行两组间比较，**,P<0.01；***,P<0.001；图6C、6D构建了包含ATF3突变型PD-L1启动子序列的载体以及野生型PD-L1启动子序列的载体作为对照组，分别对黑素瘤细胞系转染ATF3多表达载体或者用ADORA1抑制剂DPCPX(50μM)处理诱导ATF3上调，并设置空载及 溶媒作为对照组，并且通过荧光素酶报告基因检测方法检测PD-L1荧光素酶活性变化。数 据用均数±标准误表示，结果采用单因素方差分析进行整体组间比较，并采用Dunnett-t检 验进一步进行两组间比较，ns p>0.05，**P<0.01，***P<0.001；图E为预测的PD-L1启 动子区ATF3结合位点的突变图谱。(F)在黑色素瘤细胞系中，使用anti-flag抗体，SYBR RT-PCR使用ATF3引物，通过ChIP检测证明ATF3与PD-L1有明显结合。
图7为实施例3的实验数据图，其中图7A为小鼠实验流程示意图；图7B为实时测量的 小鼠皮下移植瘤瘤体体积变化曲线图；图7C为处死当天小鼠皮下移植瘤瘤体体积体外测 量散点统计图；图7D为实时测量的小鼠体重变化曲线图。图7E为小鼠Kaplan-Meier生存曲 线图，采用Gehan–Breslow–Wilcoxon检验进行组间差异比较。NS,P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01。
图8为实施例3的另一组实验数据图，其中图8A为小鼠实验流程示意图；图8B为 实时测量的小鼠皮下移植瘤瘤体体积变化曲线图；图8C为处死当天小鼠皮下移植瘤瘤体 体积体外测量散点统计图；图8D为实时测量的小鼠体重变化曲线图。图8E为小鼠Kaplan-Meier生存曲线图，采用Gehan–Breslow–Wilcoxon检验进行组间差异比较。NS, P>0.05；*,P<0.05；**,P<0.01。
图9为实施例3对PD-1单抗治疗NSCLC患者肿瘤组织样本石蜡切片进行免疫荧光染色标记肿瘤ATF3与PD-L1表达水平，根据基因表达的高低分别比较患者无进展生存时间(A,B)和总生存时间(C,D)，绘制Kaplan-Meier生存曲线图，采用Gehan–Breslow–Wilcoxon检验进行组间差异比较。
具体实施方式
实施例1
1、基因敲降腺苷受体ADORA1联合PD-1单抗抗小鼠移植瘤(黑素瘤)增殖的体内 研究。
1.1组别设置：
Scramble+IgG2a(对照组)
shAdora1+IgG2a(Adora1敲降组)
Scramble+PD-1mAb(PD-1单抗治疗组)
shAdora1+PD-1mAb(联合干预组)
1.2实验流程，见图1A：
实验前6天左右：对6-8周C57BL/6小鼠分别于右侧背翼处皮下注射B16F10黑素瘤shAdora1敲降细胞株5*105个及同数量Scramble细胞株(对照组)各20只小鼠。
实验第0天：记录小鼠体重及瘤体体积，当肿瘤体积生长至约100mm3时开始，对shAdora1敲降细胞株及Scramble细胞株接种小鼠分别进行PD-1mAb 100ug/小鼠/3天， 腹腔注射，并设置同型IgG对照组，每组10只小鼠。
实验第1、4、7、10天：每三天称量一次小鼠体重及瘤体体积，体积＝π/6×长×宽2公 式计算。
实验第12天：处死一半小鼠，获取肿瘤拍照并保存组织样本，进行后续数据分析。
生存期观察：剩余小鼠进行生存时长观察并记录死亡时间。
1.3实验结果：
由图1B、1C所示，与对照组相比，Adora1敲降组瘤体体积无显著差异，PD-1单抗 组瘤体体积显著缩小，而联合干预组显著小于单独干预组，存在统计学差异。
由图1D所示，四组之间小鼠体重无明显统计学差异。说明药物对小鼠一般状况无显著毒副影响。
由图1E所示，与对照组相比，Adora1敲降组及PD-1单抗组生存时间无显著差异，而联合干预组显著长于对照组及单独干预组，存在统计学差异。
以上结果提示，基因敲降腺苷受体ADORA1可促进PD-1单抗抗肿瘤(黑素瘤)免 疫治疗疗效。
2.回顾性临床观察PD-1单抗(纳武单抗)治疗NSCLC患者中肿瘤PD-L1与ADORA1 表达水平的相关性分析
实验结果如表1所示，PD-1单抗治疗NSCLC患者中肿瘤PD-L1与ADORA1表达水 平呈显著负相关，存在统计学差异，P<0.05。
Figure BDA0002337304620000071
附表1说明：表1为对PD-1单抗治疗NSCLC患者肿瘤组织样本石蜡切片进行免疫荧光染色标记肿瘤PD-L1与ADORA1表达水平，表1中总结了每种类别的患者数量，根据 这些数据，用Fisher精确检验(双边检验)评估两者相关性的显著性。
3.回顾性临床观察PD-1单抗(纳武单抗)治疗NSCLC患者中肿瘤PD-L1及ADORA1 表达与患者预后(无进展生存时间和总生存时间)相关性
实验结果如图2所示，PD-1单抗治疗NSCLC患者中，相较于肿瘤PD-L1低表达及ADORA1高表达，PD-L1高表达和ADORA1低表达则表现出更好的预后，存在统计学差 异，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
实施例2
1.特异性抑制剂DPCPX靶向抑制腺苷受体ADORA1联合PD-1单抗抗小鼠移植瘤 (黑素瘤、非小细胞肺癌)增殖的体内研究。
1.1组别设置：
Vehicle+IgG2a(对照组)
DPCPX+IgG2a(Adora1抑制组)
Vehicle+PD-1mAb(PD-1单抗治疗组)
DPCPX+PD-1mAb(联合干预组)
1.2实验流程，见图3A、4A：
实验前6天左右：对6-8周C57BL/6小鼠分别于右侧背翼处皮下注射B16F10黑素瘤5*105个或LLC非小细胞肺癌1*106个野生型细胞株，各40只小鼠。
实验第0天：记录小鼠体重及瘤体体积，当肿瘤体积生长至约100mm3时开始，将接种小鼠分为四组，分别进行DPCPX 1mg/Kg/小鼠，腹腔注射或溶媒组对照，PD-1mAb 100 ug/小鼠/3天，腹腔注射，并设置同型IgG对照组，每组10只小鼠。
实验第1、4、7、10天：每三天称量一次小鼠体重及瘤体体积，体积＝π/6×长×宽2公 式计算。
实验第12天：处死一半小鼠，获取肿瘤拍照并保存组织样本，进行后续数据分析。
生存期观察：剩余小鼠进行生存时长观察并记录死亡时间。
1.3实验结果：
见图3B、3C、4B、4C，与对照组相比，Adora1抑制组瘤体体积无显著差异，PD-1 单抗组瘤体体积显著缩小，而联合干预组显著小于单独干预组，存在统计学差异。
见图3D、4D，四组之间小鼠体重无明显统计学差异。说明药物对小鼠一般状况无显著毒副影响。
见图3E，与对照组相比，Adora1抑制组生存时间无显著差异，PD-1单抗组生存时间较对照组延长，而联合干预组显著长于对照组及单独干预组，存在统计学差异。
以上结果提示，腺苷受体ADORA1特异性抑制剂DPCPX联合PD-1单抗可显著增强 抗肿瘤(黑素瘤、非小细胞肺癌)免疫治疗疗效。
2.ADORA1-ATF3轴调控肿瘤PD-L1表达水平的体外研究。
2.1实验方法：转录组测序、TCGA数据库生信分析、基因编辑，细胞基因干预、DPCPX药物干预、Western blot、荧光素酶报告基因，ChIP检测
2.2实验结果：
见图5A，通过转录组测序分析，我们发现在黑素瘤细胞系Sk-mel-28中，基因敲降ADORA1对比空载组，ATF3基因表达呈显著上调，存在统计学差异；
见图5B，通过TCGA数据库生信分析，我们发现在多种肿瘤类型中ATF3基因表达 于PD-L1呈显著正相关，红点表示统计学存在差异；
见5C、5D Western bolt检测基因敲降肿瘤ADORA1，相较对照组，可显著上调ATF3及PD-L1的表达水平，存在统计学差异；
见5E、5F Western bolt检测基因敲降肿瘤ATF3，相较对照组，可显著抑制PD-L1的表达水平，存在统计学差异；
见6A、6B Western bolt检测基因过表达肿瘤ATF3，相较对照组，可显著促进PD-L1的表达水平，存在统计学差异；
见6C、6D荧光素酶报告基因检测ATF3是否与PD-L1启动子结合，相较于对照组， 过表达ATF3或者DPCPX处理均可导致肿瘤PD-L1启动子荧光素酶活性显著增强， 但当PD-L1启动子ATF3结合位点被突变掉之后，上述效果消失，说明ATF3与PD-L1
启动子有直接结合，结果存在统计学差异；预测的PD-L1启动子区ATF3结合位点的突变图谱图详见图6E。
见图6F ChIP检测提示，相较对照组，ATF3与PD-L1有显著结合，统计学存在差异。
以上结果提示，基因敲降及特异性抑制剂DPCPX靶向抑制腺苷受体ADORA1，可 显著上调ATF3，ATF3作为转录因子可从mRNA层面直接调控PD-L1转录，故靶向腺苷 受体ADORA1-ATF3轴可直接调控肿瘤PD-L1的表达水平。
实施例3
1.基因敲降转录因子ATF3联合腺苷受体ADORA1特异性抑制剂DPCPX抗小鼠移植瘤(黑素瘤，非小细胞肺癌)增殖的体内研究。
1.1组别设置：
Scramble+vehicle(对照组)
Scramble+DPCPX(Adora1抑制组)
ShAtf3+vehicle(Atf3敲降组)
ShAtf3+DPCPX(联合干预组)
1.2实验流程，见图5A、6A：
实验前6-8天左右：对6-8周C57BL/6小鼠分别于右侧背翼处皮下注射B16F10黑素瘤瘤shAtf3敲降细胞株5*105个或LLC非小细胞肺癌shATF3敲降细胞株1*106个，及同 数量Scramble细胞株(对照组),各20只小鼠。
实验第0天：记录小鼠体重及瘤体体积，当肿瘤体积生长至约100mm3时开始，对shAtf3敲降细胞株及Scramble细胞株接种小鼠分别进行DPCPX 1mg/Kg/小鼠，腹腔注射，并设置溶媒对照组，每组10只小鼠。
实验第1、4、7、10天：每三天称量一次小鼠体重及瘤体体积，体积＝π/6×长×宽2公 式计算。
实验第12天：处死一半小鼠，获取肿瘤拍照并保存组织样本，进行后续数据分析。
生存期观察：剩余小鼠进行生存时长观察并记录死亡时间。
1.3实验结果：
见图7B、7C、8B、8C，结果显示与对照组相比，Adora1抑制组小鼠瘤体体积无显 著差异，Atf3敲降组瘤体体积显著缩小，而联合干预组显著小于单独干预组，存在统计 学差异。
见图7D、8D，四组之间小鼠体重无明显统计学差异。说明药物对小鼠一般状况无显著毒副影响。
见图7E、8E，与对照组相比，Adora1抑制组及Atf3敲降组生存时间无显著差异， 而联合干预组显著长于对照组及单独干预组，存在统计学差异。
以上动物实验结果显示基因敲降转录因子ATF3可显著下调PD-L1表达，可起到类似 PD-1单抗治疗肿瘤的效果，联合腺苷受体ADORA1特异性抑制剂DPCPX可显著抑制肿 瘤增殖，增强免疫微环境抗肿瘤(黑素瘤、非小细胞肺癌)作用。
2.回顾性临床观察PD-1单抗(纳武单抗)治疗NSCLC患者中肿瘤PD-L1与ATF3表达水 平的相关性分析。
结果如表2所示，PD-1单抗治疗NSCLC患者中肿瘤PD-L1与ATF3表达水平呈显著 正相关，存在统计学差异，P<0.05
Figure BDA0002337304620000101
附表2说明：表2为对PD-1单抗治疗NSCLC患者肿瘤组织样本石蜡切片进行免疫 荧光染色标记肿瘤PD-L1与ATF3表达水平，表2中总结了每种类别的患者数量，根据这 些数据，用Fisher精确检验(双边检验)评估两者相关性的显著性。
3.回顾性临床观察PD-1单抗(纳武单抗)治疗NSCLC患者中肿瘤PD-L1及ATF3表达水平与患者预后(无进展生存时间和总生存时间)相关性
实验结果如图9所示，PD-1单抗治疗NSCLC患者中，相较肿瘤PD-L1及ATF3低表达，基因高表达均预示更好的预后，存在统计学差异，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
以上所述为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉技术 领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替 换或改变，都应涵盖在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (2)

1.ADORA1的检测试剂在制备PD-L1/PD-1单抗肿瘤免疫治疗用药的检测试剂盒中的应用，所述肿瘤为黑素瘤或非小细胞肺癌。
2.ADORA1的抑制剂与PD-L1/PD-1单抗药物联用在制备肿瘤免疫治疗辅助药物中的应用，所述肿瘤为黑素瘤或非小细胞肺癌。
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