CN112567034A - 针对lcp-1阳性癌症的基于微小rna的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及miRNA组，其包含miR‑16‑5p、miR‑23a‑5p、miR‑125b‑5p、miR‑145‑5p、miR‑146a‑3p、miR‑181c‑5p、miR‑218‑5p、miR‑495‑3p、let‑7b‑5p，并进一步包含选自miR‑30a‑5p、miR‑30b‑5p、miR‑30c‑5p、miR‑30d‑5p、miR‑30e‑5p、miR‑194‑5p、miR‑302a‑3p、miR‑302a‑5p、miR‑335‑3p、miR‑335‑5p、miR‑367‑3p、miR‑373‑3p和miR‑885‑5p的一种或多种miRNA，并涉及装载所述miRNA组的例如干细胞来源的细胞外囊泡(EV)。本发明进一步提供了用于治疗患者中LCP‑1阳性癌症的方法的该组或EV。
Description
技术领域
本发明涉及使用miRNA的新技术及其在LCP-1阳性癌症中靶向和下调癌蛋白活性的能力。本技术设计用于递送封装在生物或合成囊泡中的特定miRNA抑制剂序列，其将影响与癌症的发生、生长、侵袭性和转移相关的一组基因和蛋白质(包括LCP1/LCP-1)的表达。
背景技术
癌症是一种具有细胞层次结构和许多不同的表型的异质性疾病，具有很高的肿瘤扩散和转移能力。发展至转移期对有效的癌症治疗提出了最严峻的挑战，并造成大多数与癌症相关的死亡。侵袭-转移级联是一个多步骤的细胞过程，涉及癌细胞通过周围细胞外基质的扩散，在循环中的存活和最初的接种，然后是在转移部位的微环境中随后的扩增(定殖)。这些步骤需要癌细胞具有高运动性，这通过调节细胞的细胞骨架来促进。最近的研究指出，细胞骨架结合蛋白是肿瘤转移的重要参与者，特别是由于它们结合和调节整联蛋白分子的能力。因此，这些分子是抑制肿瘤细胞转移特性的有希望的靶标。具体而言，某些癌症会表达肌动蛋白重组蛋白LCP-1(L-丝束蛋白(Plastin)，丝束蛋白-2，淋巴细胞胞浆蛋白(lymphocyte cytosolic protein)1)，其通常是白细胞特异性的，且在非造血细胞中不存在1。该蛋白质最近被鉴定为用于早期检测各种形式的癌症(例如肾癌、结肠癌和乳腺癌)的生物标志物2。LCP-1是一种70kDa的，受Ca2+调节且与肌动蛋白结合的蛋白，其在适应性和先天性免疫系统中都起着重要作用3。肌动蛋白结合蛋白的丝束蛋白家族由三种显示组织特异性表达的同工型(isoform)组成。它们表现出相似的分子排列，在C端包含两个连续的肌动蛋白结合结构域，每个结构域都由两个钙调理蛋白同源(CH)结构域组成。这种结构允许LCP-1可以将肌动蛋白丝(actin filament)组织成非常紧密的束4。LCP-1功能对于先天性以及适应性免疫系统的细胞都很重要。研究表明，LCP-1对于免疫突触的形成至关重要5，并且它调节粒细胞6和T细胞7的整联蛋白依赖性粘附和迁移。也有人认为它可能在肿瘤细胞运动中起作用。已知LCP-1的肌动蛋白束活性是钙依赖性的，因为增加钙浓度会抑制肌动蛋白束的形成。还显示，Ser5磷酸化可在体外增强LCP-1的肌动蛋白集束(actin bundling)活性，从而促进其靶向肌动蛋白组装位点。通过LCP-1磷酸化的调控已被描述为是由于免疫应答以及对触发迁移的信号的响应。
除了在人癌细胞中LCP-1表达和磷酸化的潜在预后相关性外，LCP-1还代表癌症治疗的有希望的靶标。肿瘤细胞中LCP-1表达的减少和/或磷酸化可能会干扰肿瘤细胞的侵袭性，迁移和侵袭，从而减少转移。为了抑制癌症进展的速度而研究的治疗工具已经基于由LCP1启动子以及LCP-1阻断肽(如蜂毒肽)驱动的重组腺病毒载体11。腺病毒载体的主要缺点之一是难以实现细胞特异性靶向，因为该病毒没有包膜以将细胞特异性配体附着在其上，同时还存在一些重要的安全问题，例如潜在产生可复制病毒和在患者体内引起炎症反应的可能性，特别是在重复施用时。此外，LCP-1阻断肽(如蜂毒肽)具有很强的溶血特性，使其对正常细胞有毒性，因此不适合直接临床应用15。因此，我们的发明的目的是开发用于成功和靶向地抑制LCP-1的新技术。同时，一组相关蛋白(蛋白质组，表1)代表了癌症治疗的其他新靶标，因此与LCP-1一起用于我们的发明中，以开发定制的靶向癌症治疗剂。
表1.相关蛋白质、基因和miRNA的选定组
基于RNA的方法被认为是癌症治疗的下一个主要类别。与RNA在不断扩展的细胞途径和过程中的作用有关的遗传学进展表明，RNA具有以前仅归因于DNA和蛋白质的许多遗传和调节特性。目前的工作主要集中在修饰的mRNA上，以促进治疗性蛋白质的表达，以及RNAi变体(例如siRNA和miRNA)上，它们可以沉默或扩增癌细胞中的基因。
MiRNA是一类小的(约22个核苷酸长)的非编码RNA，其与信使RNA(mRNA)结合，作为内源性翻译后基因调节子12。miRNA和mRNA之间的相互作用非常复杂，目前尚不完全清楚。但是，大约有三分之一的人类蛋白质编码基因受miRNA调控，从而突显了它们对蛋白质表达的非凡影响。众所周知，至少在哺乳动物中，miRNA通过不完全的互补性与其靶基因结合13。已经提出了几种作用机制用于miRNA介导的基因阻遏。可以通过抑制翻译起始，由于脱腺苷化引起的mRNA降解或在极少数情况下mRNA裂解来抑制蛋白质合成。在细胞中重新表达丢失的miRNA可以发挥巨大作用，因为miRNA可以调节大量的基因和途径。已显示miRNA重新表达和下调均具有抗肿瘤作用，而重新表达肿瘤抑制子miRNA则可以下调多种癌基因。在癌症中被下调的组织特异性miRNA的重新表达达到生理水平可以诱导癌细胞的去分化。
正如临床试验的早期失败所表明的那样，RNA治疗剂的成功取决于它们能否有效、安全地递送至癌细胞内的分子靶标。因此，为了充分实现其在癌症治疗中的全部潜力，必须使用新颖的创新药物递送技术。miRNA的全身递送面临其自身的局限性。未缀合的RNA的大小为7-20kDa，众所周知，大小小于50kDa的分子被肾脏过滤并从循环中去除(排泄)。与许多其他药物不同，miRNA不会自由扩散进入细胞，并且由于它们倾向于不稳定，它们一旦进入细胞就可能被降解。因此，有效的治疗策略需要确保有效递送至肿瘤部位，以及同样重要的是将功能序列成功插入靶细胞。另外，全身递送的主要障碍是基于寡核苷酸的疗法可能通过增加患者体内的IFN产生而引起不良反应，例如聚集、肝毒性和免疫应答的刺激。
目前在体内递送miRNA的方法包括抗miRNA寡核苷酸、antagomiR、锁核酸(LNA)、miRNA海绵、基于载体的系统、脂质体和纳米颗粒。每种方法都有优点，但也有显著的缺点；对于基于粒子的方法，主要局限性包括靶细胞的内吞效率低下和内体释放效率低下。使用病毒系统重新引入miRNA具有其自身的一系列可能的危害，因为始终存在插入诱变，致癌基因激活和强烈的免疫反应的风险。对于脂质体递送系统，靶向肿瘤和在体内递送其治疗有效载荷的效率低下已导致重大并发症和副作用，这在首批基于miRNA的治疗剂的早期临床试验中已得到证实。
附图说明
图1.EVmiRTM构建体的图形表示。EVmiRTM由细胞膜起源的脂质双层、膜蛋白、CD、转运蛋白等组成。它们包含天然存在的miRNA以及直接靶向LCP-1蛋白表达的患者特异性miRNA，例如miR-885-5p。此处还显示了使用扫描电子显微镜(SEM)分析的EVmiRTM显微照片，尺寸为140nm。
图2.EVmiRTM构建体的miRNA装载方法的验证。使用三种不同的过表达方法(方法A，B和C)评估EV中miR-885-5p的表达水平(通过使用实时PCR)。
图3.评估蛋白LCP-1的表达水平。使用定量蛋白质印迹分析，在用载有miR-885-5p的EVmiRTM处理之前和之后，在一系列对照和癌细胞系中测试了LCP-1的浓度。
图4.对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞增殖测定。在EVmiR(LC：低浓度，MC：中等浓度和HC：高浓度)，GSI抑制剂和DMSO作为已知细胞毒性因子作为对照，以及PBS/正常条件培养基作为内部对照的情况下，对MDA-MB-231乳腺癌的细胞增殖测定；细胞处理4天和7天。
图5.用EVmiR处理的MDA-MB-231细胞的体外实验证实了它们的内化和生物效应的诱导，如靶细胞中的膜损伤，细胞收缩和起泡(在不同的时间点，如处理的第2天、第5天和第7天)所证明的那样。显示了未经处理或经DMSO处理的对照细胞进行比较。
图6.体内全身生物分布测定。图6A将标记的EVmiR(DiD染色)和合成的DiD染色的颗粒施用于对照小鼠。标记的EVmiR(DiD染色)在经肿瘤GFP标记的荷瘤小鼠中施用。图6A显示了EVmiR与肿瘤部位的共定位。荧光已用虚线包围。图6B.使用内部开发的荧光成像系统在不同时间点对动物进行体内生物分布测试。在不同的时间点，EVmiR(荧光已用虚线包围)与肿瘤部位(左图中肿瘤已用虚线包围)的共定位是明显的。
图7.小图显示EVmiR的扫描电子显微照片，大图显示EVmiR对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的攻击。EVmiR与肿瘤细胞共定位并通过膜摄取机制装载其内容物。
发明内容
本发明设计用于递送封装在包含趋化因子和干细胞来源的蛋白质(表2)的生物学或合成来源(大小为30-300nm)的载体中的miRNA序列(包括miR-885-5p)的特定组合。提出的名为EVmiRTM的构建体(图1)将影响与LCP-1阳性癌症的癌症发生、生长、侵袭性和转移相关的一组基因和蛋白(包括LCP1/LCP-1)(表1)的作用。
表2.工程化EVmiRTM构建体的主要组分
治疗系统基于特定miRNA，这些特定miRNA选自包含序列miR-885-5p的一个组，并装载在包括细胞外囊泡的生物的、合成的或化学制剂中。该构建体靶向并调节特定组癌蛋白(包括LCP-1)的表达，该癌蛋白与LCP-1阳性癌症中的癌症发生、生长、侵袭性和转移潜力有关。成功的递送系统具有狭窄的尺寸范围(直径30-300nm)，具有生物学或合成来源的干细胞相关特性。这些囊泡充当特定治疗性miRNA序列的靶向载体，一旦施用，便会迁移到肿瘤部位，以便与癌细胞融合并直接将其治疗负荷递送到癌细胞中。
问题：当前市场上的抗癌药物尚未实现彻底根除肿瘤和有效治疗人类患者的癌症。这主要是由于难以阻止复杂的癌症生长和转移过程(治疗效率)，以及由于治疗剂向肿瘤部位的递送不足(肿瘤靶向)所致。缺乏有效的治疗选择为可能介入多种癌细胞过程的用于癌症治疗的靶向递送的新颖方法打开了新机遇之门。转移的发展会导致最严重的癌症临床后果，并导致90％以上的癌症相关死亡14。癌症生长和转移的过程很复杂，我们对调节它们的分子机制的理解仍然有限。肿瘤学领域关键靶标的发现将为抗击多种类型的癌症，例如黑色素瘤、成胶质细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌和前列腺癌等开辟新途径。肿瘤细胞的迁移和转移需要动态重新排列肌动蛋白细胞骨架。有趣的是，LCP-1负责肌动蛋白丝的组织，并在多种类型的血细胞中异常表达。我们已经确定，该蛋白在上皮癌中表达的增加激活了通过循环系统的转移途径，从而允许与其他特征基因(基因组，表1)结合在远处转移。同样，鉴定不仅在转移中而且还在与LCP-1相关的原发肿瘤的发生和发展中起作用的不断增加的致癌蛋白清单，将在肿瘤学领域为设计和开发可以靶向疾病多个阶段的新型癌症疗法提供大量机会。
解决方案：肿瘤细胞的起始、迁移和转移需要细胞骨架的动态重排和关键致癌途径的激活。有趣的是，最初被描述为白细胞特异性蛋白的LCP-1蛋白在几种恶性肿瘤中异常表达，并与其他几种与癌症相关的蛋白相互作用，例如表1(蛋白质组)中所述的蛋白。因此，我们开发了一组相关的miRNA(miRNA组，表1)，并已利用它来设计治疗性miRNA的定制组合，这些组合可以通过靶向其各自的基因来干扰上述癌症相关蛋白的表达(参见基因组，表1)。
在我们的发明中，尽管我们的miRNA组也可以与任何其他靶向肿瘤的载体系统(例如基于纳米颗粒或脂质体的载体)一起递送，治疗性miRNA通过基于细胞外囊泡(EVs)的新型递送系统施用给肿瘤。因此，可以通过允许miRNA或编码miRNA的核酸达到其靶标的任何可接受的方法来完成本文所述的我们的定制miRNA组合的施用。在本发明的一个具体实施方案中，已经对EV进行了专门的工程改造，以将我们的治疗性miRNA递送至肿瘤部位和癌细胞内部。EVmiRTM复合物是干细胞来源的工程化细胞外囊泡(EVs)，其中包含充当LCP-1的直接抑制剂的特定miRNA序列。EVmiRTM还经过工程设计，以靶向和操纵另一组癌蛋白的表达，这些癌蛋白直接参与LCP-1途径，并主要在实体瘤中上调(蛋白质组，表1)。这些EVmiRTM复合物是理想的递送载体，因为它们保留了可使干细胞选择性归巢到肿瘤部位并靶向恶性细胞的膜受体，从而避免了靶向健康细胞。EV通过特定的趋化因子受体归巢并植入实体瘤，融合到肿瘤细胞膜上，并将miRNA直接参入到靶癌细胞中，从而发挥其治疗作用，同时将与传统疗法相关的副作用降至最低。与靶向单个基因的方法相比，这些EVmiRTM复合物由于其靶向恶性细胞中多个分子的能力而具有增强的预防和治疗潜力，并通过细胞因子信号传导抑制诱导免疫抑制，这使得该方法特别适合作为复发性癌症疾病的治疗策略的组分。
在我们的发明中，我们通过递送包封在EVmiRTM或其他合适囊泡中的miRNA的组合，在体外和体内靶向癌症相关蛋白LCP-1(以及表1中的癌蛋白)。
我们已经构建了一种新型的细胞EVmiRTM复合物，其包含一组天然存在的和合成过表达的miRNA(通过使用合成的premiR，成熟的miR，antimiR或从头诱导的miR)。EV是完整的囊泡，直径为30-300nm，由质膜形成，并富含来自其亲代细胞的质膜的细胞质成分、细胞表面蛋白和生物活性磷脂(参见表2)。这种定制的复合物直接靶向LCP-1和其他癌症相关蛋白(表1)的表达，这些蛋白特别在肿瘤环境中发现，并且可以阻断癌症进程，例如肿瘤生长和转移性进展。我们已经发现，与细胞颗粒(例如我们的工程化EV)相关的miRNA可受保护而避免核酸酶降解，能够在多种细胞中转移，从而预防或治疗性地改变受体细胞的基因表达。
在某些实施方案中，所述组可以包含干细胞来源的天然存在的miRNA和(一个或多个)合成过表达的miRNA，其中所述合成过表达的miRNA是合成的premiR、成熟的miR、antimiR或从头诱导的miR。
作为更广泛的个性化医疗策略的一部分，我们的发明在预防和治疗上得到了应用，其中包括适当的患者选择以及诊断、预后、治疗和监测部分。我们的发明的好处是，与以前的选择相比具有高选择性和更低的毒性的改进的药物产品将是多因素的。由于毒性作用不必中断治疗，因此降低了非耐受性毒性的治疗成本，并且积极治疗的完成时间将大大减少。最佳的患者选择将基于肿瘤的分子谱(molecular profiling)和患者反应变量，从而为更有效地药物使用铺平道路并降低死亡率和发病率。为了这个目的，已经开发了用于测定LCP-1和其他癌蛋白靶标水平，以及监测我们的miRNA组在组织和/或液体活检组织中的表达的伴随诊断试剂盒。因此，通过在表达靶向的癌蛋白和相关miRNA序列的肿瘤的临床样品上使用试剂盒，已经验证了用于靶向癌症治疗的EVmiRTM方法。
优势：在过去的20年中，肿瘤学领域见证了基于靶向治疗概念的新型药物的引入-开发药物治疗以选择性靶向已证明在癌症发展中起作用的基因、蛋白质和信号通路。在分子生物学的新知识以及化学和分子合成以及高通量筛选方法(“组学”革命)的进展的推动下，几种靶向疗法已显示出对多种癌症的疗效，并且更多靶向疗法正在不断引入。在市场上或正在开发的新型治疗剂中，血管生成抑制剂、免疫治疗剂(单克隆抗体、细胞因子和癌症疫苗)、激酶信号抑制剂和基因(基于DNA或RNA的)治疗似乎是最有前途的。在过去的几年中，基于RNA(mRNA和RNAi)的方法引起了人们极大的兴趣，因为异常的RNA调节越来越多地牵涉到一系列对癌症发展至关重要的细胞途径和过程。
因此，基于RNA的靶向疗法的市场仍处于婴儿期，还处于发展的早期阶段。在阐明RNA在许多细胞机制中的关键作用方面的最新突破促进了将mRNA和RNAi序列工程化为临床认可的治疗剂的新方法的出现。这些技术旨在利用人体自身的自然过程，促进有益蛋白或沉默基因的表达，或者消除癌细胞中的特定蛋白，从而开发出具有更强特异性和功效的更安全的癌症治疗剂。根据靶向癌症的类型和位置，治疗剂的递送通常需要开发新型转运技术，例如纳米胶囊、纳米颗粒、脂质体和PEG化囊泡，以最大程度地减少对健康组织的毒性并最大化在肿瘤部位的有效治疗浓度。
我们的发明将提供针对基于RNA的靶向治疗癌症的显著优势：
■靶向递送仍然是RNA治疗的主要挑战。我们的体内研究表明，间充质干细胞可以选择性迁移至肿瘤(归巢)，因此，EVmiRTM复合物参入了必要的膜受体，其可以允许miRNA靶向递送至肿瘤部位。通过避免靶向健康细胞并最大程度地减少潜在的副作用，该方法的独特特异性转化为增强的抗肿瘤功效。
■基于miRNA的有效治疗的主要障碍是对稳定性和成功递送至靶组织的要求。与许多其他药物不同，miRNA不能自由扩散到细胞中；因此，miRNA需要特殊的递送方法才能达到理想的效果。我们已经证明EVmiRTM复合物可以与靶癌细胞融合，并使治疗性miRNA整合到受体细胞中。
■EV可递送治疗剂量的miRNA，这些miRNA已证明其会影响癌症发展中涉及的多种途径。已经鉴定出特定的miRNA，其通过减少或缺失致癌性miRNA以及通过扩增或过表达抑制肿瘤的miRNA来调节癌细胞中的基因表达。因此，与早期的靶向单一基因的方法相比，该miRNA方法可能会提供靶向癌细胞中的多个分子的机会，从而为使用单一方法减少肿瘤提供了多种途径。
■与早期的RNA治疗不同，由于未暴露治疗性miRNA序列，因此EVmiRTM复合物不会引发先天性免疫应答。取而代之的是，这些EV已显示出诱导免疫抑制作用(通过细胞因子抑制)，这使靶向递送方法更加有效，尤其是在复发病例中。
本发明代表了一种新的临床癌症治疗方式，具有重大商业化和在对恶性肿瘤治疗的未来临床研究中应用的潜力。通过产生关于肿瘤病理学的新知识并允许治疗的定制和个性化，本发明将导致为患者提供可销售产品和服务的快速发展以及癌症治疗领域的转变。
具体实施方式
为了减少LCP-1阳性癌症中的肿瘤生长和转移，在该实施方案中总共使用了22种miRNA。源自干细胞的miRNA(自然存在的9种miR)被指定为始终存在于治疗性混合物中，其负责靶向癌细胞并减少肿瘤的生长、侵袭和增殖。另一方面，根据所选患者的诊断情况，可以选择性或全部使用13种miRNA(合成地或从头诱导地)。miRNA混合物将主要通过EVmiRTM复合物施用，但不仅限于这种制剂。该技术的生产和使用示例如下：
EV生产：本实施方案提供了一种治疗癌症的方法，所述癌症对于LCP-1以及表1(蛋白质组)中任何其他癌蛋白是阳性的，EVmiRTM复合物包含：
a)能够下调靶向的癌蛋白(见表1)的特定miRNA；
b)使EV能够靶向并归巢于肿瘤生长和转移部位的特定细胞膜蛋白(见表2)。
EV(尺寸范围为30至300nm)是从源自脐带、脐带血、脐带胶质(Wharton’s jelly)、血液或骨髓(干细胞也可能是间充质来源)的干细胞或祖细胞中产生的。干细胞培养物承受应激条件，导致形成EV(直径小于300nm的分泌膜载体，包括外来体和微泡)，将其收获、纯化和浓缩。EV富含源自其亲代细胞质膜的细胞质成分、细胞表面蛋白和生物活性磷脂，例如P-选择蛋白、整联蛋白β-1、血管细胞粘附蛋白1膜联蛋白、肿瘤易感基因101蛋白和Hsp70-结合蛋白1，并且表征为CD9+、CD29+、CD63+、CD73+、CD81+、CD90+、CD31-、CD34-和CD45-。干细胞/祖细胞/间充质干细胞来源的EV也富含内源性miRNA，例如miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p(表3)，并可与其他通常在亲代细胞中表达不足或不存在的miRNA一起定制设计/生产(表4)。我们已经利用这些EV构建了新型的细胞EV-miRNA复合物(EVmiRTM)，该复合物携带了一系列miRNA，包括过表达的miR-885-5p序列。可以定制该复合物以直接靶向在肿瘤环境中特异性表达的癌症相关蛋白LCP-1，并阻断LCP-1依赖性癌症过程，例如肿瘤生长和转移进程。同样，可以进一步定制基于EVmiRTM的方法以靶向其他癌蛋白(参见表1)，从而确保我们的发明可以靶向并治疗尽可能广泛的癌症类型。
通过装载特定的miRNA来优化EV：在诱导靶序列过表达后，会生成装载有特定miRNA(例如miR-885-5p和其他选自表1的miRNA)的EV。遗传上干扰单个miRNA或其靶向转录物的表达会促进从细胞质到P体的双向miRNA迁移，并控制miRNA到EV的分类。我们已经采用了几种方法来实现具有所需miRNA序列的源自干细胞的EV的有效装载，如下所述(此处使用但不限于miR-885-5p为例)。
同样，在治疗性miRNA抑制策略的背景下，我们的专有EVmiRTM复合物可以装载特定的antagomiR，以抑制/阻断在特定癌症类型中上调的miRNA。特定的anttagomiR可以作为目标靶序列的抑制序列(“拮抗剂”)装载，并可以通过EV递送，以抑制特定癌症中的致癌性miRNA。
方法A.(预装载方法)。miR-885-5p的过表达可通过以下方法在亲代细胞中诱导过表达来实现：i)用pre-miR-885-5p或模仿内源性成熟miR-885-5p的合成miR-885-5p转染亲代干细胞；ii)可以引导miR-885-5p装载到EV中的苏素化(Sumoylated)的hnRNPA2B1；iii)重新设计的含exo-基序的miR-885-5p(图2)。可以使用选自表4的其他特定miRNA序列将该方法应用于EV的预装载。
方法B.(后装载方法)。从亲代细胞产生后，将miRNA直接装载到EV中。用于产生装载有特定miRNA(例如但不限于miR-885-5p)的EV的另一种方法是通过化学插入和/或电穿孔和/或声穿孔(图2)直接将合成miR-885-5p和其他特定miRNA(选自表4)转移到EV中。
方法C.(从头诱导)。我们还确定了趋化因子配体CXCL7应用于亲代细胞后，负责从头诱导miR-885-5p。这可以用作诱导源自干细胞的EV中天然miR-885-5p表达的备选方法(图2)。
方法D.(清空/重新装载EV)。清空其内源性miRNA的EV(通过超声处理、皂苷透化等)并通过将空的EV与特定miRNA温育进行重新装载是另一种可用于生产定制EVmiRTM复合物的方法(图2)。
举例来说，在我们的发明中，我们显示了在体外在一系列测试的癌细胞系(CaCo2、RKO、HT-29、MDA-MB-231、MCF-7、SKOV3、EFO-21、LNCaP和THP-1)中和在体内乳腺癌和结肠癌的原位小鼠模型中，LCP1,CDK2,MCM5,WNT/CTNNB1,CASC7/AGO2是miR-885-5p的确定靶标。我们进一步开发了一种新型的miRNA递送系统，该系统适用于使用源自干细胞的EV进行局部和全身施用。我们的发明表明LCP-1蛋白是miR-885-5p的确定靶标。体外比较组学研究表明，miR-885-5p表达的变化可调节LCP-1阳性细胞中的蛋白水平。为了建立机制联系，通过用miR-885-5p抑制剂和前体转染一系列癌细胞系来改变miR-885-5p的表达水平。抑制剂序列antimiR-885-5p是经过化学修饰的单链核酸，其被设计为特异性结合并抑制内源性miRNA。Pre-miR-885-5p模仿内源性成熟miR-885-5p。miR-885-5p的过表达(使用pre-miR)和抑制(使用antimiR)通过实时qPCR和定量蛋白质印迹验证。数据表明，miR-885-5p的过表达导致内源性LCP-1的敲减，而用miR-885-5p的前体miRNA转染癌细胞会导致迁移和转移能力受损；因此，miR-885-5p的上调通过抑制肿瘤细胞的生长和转移潜力来抑制LCP-1的表达并改变细胞功能。
本发明提供了如本文教导的miRNA或如本文教导的EV的组，用于治疗患者中LCP-1阳性癌症(的方法)。
除非另有说明，否则“受试者”或“患者”可互换使用，是指动物，优选为温血动物，更优选为脊椎动物，甚至更优选为哺乳动物，还更优选为灵长类动物，并且特别包括人类患者和非人类哺乳动物和灵长类动物。优选的受试者是人类受试者。
术语“哺乳动物”包括这样分类的任何动物，包括但不限于人类、家养和农场动物、动物园动物、运动动物、宠物、伴侣动物和实验动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、狗、猫、豚鼠、牛、奶牛、绵羊、马、猪和灵长类动物，例如猴子和猿。特别优选的是人类受试者，包括两种性别及其所有年龄类别。
一个相关方面提供了一种在需要这种治疗的患者中治疗LCP-1阳性癌症的方法，包括向该患者施用治疗有效量的一组如本文教导的miRNA或如本文教导的EV。
一个相关方面提供了一组如本文教导的miRNA或如本文教导的EV在制备用于治疗患者中LCP-1阳性癌症的药物中的用途。
如本文所用，诸如“需要治疗的受试者”之类的短语包括将从给定病症尤其是LCP-1阳性癌症的治疗中受益的受试者。这样的受试者可以包括但不限于已经被诊断为具有所述病症的受试者，易于发展为所述病症的受试者和/或要预防所述病症的受试者。
术语“治疗”涵盖已经发展的疾病或病症的治疗性治疗，例如已经发展的LCP-1阳性癌症的治疗，以及预防性或防护性措施，其中目的是预防或减少发生不希望的痛苦的机会，例如预防LCP-1阳性癌症的发生、发展和进展。有益或理想的临床结果可包括但不限于减轻一种或多种症状或一种或多种生物标志物、减轻疾病程度、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、改善或减轻疾病状态等。与未接受治疗的预期生存期相比，“治疗”还可能意味着生存期延长。
术语“预防有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的抑制或延迟受试者疾病发作的活性化合物或药剂的量。如本文所用，术语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的在受试者中引起生物学或医学反应的活性化合物或药剂的量，所述生物学或医学反应可包括尤其是减轻所治疗疾病或病症的症状。用于确定如本文教导的EV的治疗和预防有效剂量的方法是本领域已知的。
同时，我们开发了一个伴随诊断试剂盒，可根据靶向的特定癌症定制配制在我们的EVmiRTM复合物中的外源性miRNA序列。专有组可以测量/定量液体(血液、尿液、外来体等)和组织活检中的miRNA水平，以及评估一组至少五种癌蛋白的表达水平，例如一组已知在靶向的特定癌症类型中上调的五种癌蛋白(选自表1且包括LCP-1)。伴随诊断试剂盒可基于一组内源性和/或外源性miRNA分析患者样品的miRNA概况(profiling)。如果发现miRNA下调，则可以将这些miRNA包括在EV中，例如EVmiR方法。
因此，一方面涉及一种试剂盒，其包括用于确定来自患者，优选人类受试者的样品中的一组miRNA的表达水平的工具，所述miRNA包含miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。在某些实施方案中，所述试剂盒包含能够特异性结合miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p的引物。这样的试剂盒有利地允许确定(例如定量)样品中的miRNA水平，从而取决于所靶向的特定癌症，允许定制配制如本文所教导的EV中的miRNA序列，特别是外源性miRNA序列。
在某些实施方案中，可以通过实时/定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)，RNA测序(例如下一代测序)，miRNA微阵列和/或多重miRNA分析测定来确定一种miRNA或一组miRNA的表达水平。
在某些实施方案中，试剂盒包括用于确定来自患者，优选人类受试者的样品中的一组miRNA的表达水平的工具，所述miRNA包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。在某些实施方案中，所述试剂盒包含能够特异性结合miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p的引物。
在某些实施方案中，所述试剂盒包括用于确定一组癌蛋白表达水平的工具，所述癌蛋白选自由以下各项组成的组：argonaute-2蛋白，原癌基因c-Akt，膜联蛋白(Annexin)A3，淀粉状蛋白βA4蛋白，凋亡调节子Bcl-2，Bcl-2相关转录因子1，Bcl-2样蛋白2，杆状病毒IAP重复序列包含蛋白5(Baculoviral IAP repeat-containing protein 5,)，骨形态发生蛋白1，癌易感性候选基因7(cancer susceptibility candidate 7)，G1/S特异性细胞周期蛋白-D1，CD44抗原，钙黏着蛋白-2，钙黏着蛋白-11，细胞周期蛋白依赖性激酶2，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27，CCAAT/增强子结合蛋白α，细胞色素c氧化酶亚基2，连环蛋白β-1，CXC趋化因子受体类型4，Dickkopf相关蛋白1，表皮生长因子受体，脂肪酸合酶，高迁移率族蛋白HMGI-C，胰岛素样生长因子1受体，胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2，转录因子AP-1，有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4，诱导的髓样白血病细胞分化蛋白Mcl-1，DNA复制许可因子MCM5，E3泛素蛋白连接酶Mdm2、72kDa IV型胶原酶，基质金属蛋白酶9，转移相关蛋白MTA3，黏蛋白13，核因子NF-κB p105亚基，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3激酶催化亚基α同工型，尿激酶纤溶酶原激活物表面受体，肿瘤坏死因子配体超家族成员11，Ras GTPase激活蛋白1，Roundabout同源物1，Slit同源物2蛋白，锌指蛋白SNAI2，母抗Dpp同源物3(Mothersagainst decapentaplegic homolog 3)，锌指蛋白SNAI1，转录因子SOX-2-OT，转录因子Sp1，TGF-β受体2型，转化生长因子β-1，血管内皮生长因子A和原癌基因Wnt-1。例如，所述试剂盒可包括用于确定选自表1并包括LCP-1的一组五个癌蛋白的表达水平的工具。
如本文所用，术语“样品”或“生物样品”包括获自受试者的任何生物样品。
样品可以包括活检、液体活检(血液、尿液、唾液、其他体液)和组织样品、组织匀浆等。样品还可以包括但不限于细针抽吸物和细胞裂解物。优选地，样品是活检、组织样品或细针抽吸物，更优选地，样品是活检。优选地，样品可以通过外科手术方法或通过微创方法容易地获得，从而允许从受试者去除或分离所述样品。
另一个方面涉及如本文定义的试剂盒用于确定来自患者的样品中的miRNA(存在于组中)的表达水平的用途，优选用于制备如本文教导的适合施用给患者的EV。根据miRNA的表达水平，可以定制一组miRNA和/或EV用于患者的治疗。
表3.包含在工程化EVmiRTM中的内源性miRNA及其靶基因/蛋白
表4.在工程化EVmiRTM中过表达的外源性miRNA及其靶基因/蛋白
本申请还提供了以下陈述中阐述的方面和实施方案：
1.一种通过施用特定的miRNA序列(包括miR-885-5p)治疗LCP-1阳性癌症患者的方法。MiRNA序列可以嵌入递送载体中，所述递送载体已装载或过表达特定miRNA序列(包括EVmiRTM复合物)并已发现会影响与癌症生长和转移有关的癌症相关蛋白。
2.根据声明1的方法，其中一组miRNA对应于miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p、miR-885-5p(参见miRNA组，表1)。
3.根据声明1的方法，其中所述递送载体是源自脐带干细胞(包括脐带胶质细胞)、血液、脐带血或骨髓的细胞外囊泡(EV)或微囊泡，并且所述干细胞可以是间充质来源或祖细胞来源。
4.声明3中定义的方法，其中EV是从狭窄尺寸范围(30至300nm)的干细胞中产生的，其特征在于特定的细胞内和细胞膜蛋白(包括P-选择蛋白、整联蛋白β-1、血管细胞粘附蛋白1、膜联蛋白、肿瘤易感基因101蛋白、Hsp70结合蛋白1、CD9、CD29、CD63、CD73、CD81、CD90)和特定的内源性miRNA序列(参见表2)。
5.声明1中定义的方法，其中所述EV装载有针对癌症疾病的特定miRNA序列(参见表3和表4)。
6.声明2中定义的方法，其中根据基于患者的诊断情况的癌症类型和疾病分期，特定的miRNA序列选自由miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p组成的组(请参见表3和表4)。
7.声明1中定义的方法，其中特定的miRNA序列是(i)通过转染或从头诱导在亲代干细胞中特异性上调后预装载在EV中，或(ii)通过直接转移/化学插入/电穿孔装载在已形成的EV中(请参见方法部分)。
8.声明1中定义的方法，其中靶向的且在癌细胞中过表达的特定蛋白是但不限于argonaute-2蛋白，原癌基因c-Akt，膜联蛋白(Annexin)A3，淀粉状蛋白βA4蛋白，凋亡调节子Bcl-2，Bcl-2相关转录因子1，Bcl-2样蛋白2，杆状病毒IAP重复序列包含蛋白5(Baculoviral IAP repeat-containing protein 5,)，骨形态发生蛋白1，癌易感性候选基因7(cancer susceptibility candidate 7)，G1/S特异性细胞周期蛋白-D1，CD44抗原，钙黏着蛋白-2，钙黏着蛋白-11，细胞周期蛋白依赖性激酶2，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27，CCAAT/增强子结合蛋白α，细胞色素c氧化酶亚基2，连环蛋白β-1，CXC趋化因子受体类型4，Dickkopf相关蛋白1，表皮生长因子受体，脂肪酸合酶，高迁移率族蛋白HMGI-C，胰岛素样生长因子1受体，胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2，转录因子AP-1，有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4，诱导的髓样白血病细胞分化蛋白Mcl-1，DNA复制许可因子MCM5，E3泛素蛋白连接酶Mdm2、72kDa IV型胶原酶，基质金属蛋白酶9，转移相关蛋白MTA3，黏蛋白13，核因子NF-κB p105亚基，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3激酶催化亚基α同工型，尿激酶纤溶酶原激活物表面受体，肿瘤坏死因子配体超家族成员11，Ras GTPase激活蛋白1，Roundabout同源物1，Slit同源物2蛋白，锌指蛋白SNAI2，母抗Dpp同源物3(Mothers againstdecapentaplegic homolog 3)，锌指蛋白SNAI1，转录因子SOX-2-OT，转录因子Sp1，TGF-β受体2型，转化生长因子β-1，血管内皮生长因子A，原癌基因Wnt-1(参见表2)，因为单个miRNA具有多个靶标。
9.声明1中定义的方法，其中靶向的癌症类型是已显示出过表达LCP-1以及声明8中定义的蛋白质组成员的癌症类型，包括例如皮肤黑色素瘤、眼色素层黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、头颈癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肾癌(renal cancer)、肾癌(kidney cancer)、骨癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌的癌症类型，以及任何其他过表达以上声明8中定义的癌蛋白的癌症类型。
10.声明1中定义的方法，其中通过特定诊断试剂盒选择癌症患者以施用装载miRNA的EV，所述特定诊断试剂盒设计用于选择组织和液体活检和生物流体中的LCP-1阳性和/或LCP-1磷酸化状态、miR-885-5p阴性肿瘤、miR-885-5p表达、以及上述声明6和8中定义的miRNA和蛋白的组合。
11.声明1中定义的方法，其中所述装载miRNA的EV以液体或固体形式通过口服，肌内或静脉内局部或全身性地施用于癌症患者。
12.声明1中定义的方法，其中所述装载miRNA的EV可以作为主要治疗方法或与其他疗法(例如化学疗法，放射疗法和其他生物疗法)组合进行预防性或治疗性施用。
13.声明1中定义的方法，其中所述装载miRNA的EV迁移至肿瘤部位(原发性和转移性)，包括脑中的部位(通过穿过血脑屏障)。
14.声明1中定义的方法，其中所述装载miRNA的EV与癌细胞的细胞膜融合并在靶细胞的细胞质中释放治疗性miRNA。
15.声明1中定义的方法，其中源自干细胞和/或间充质干细胞的细胞外囊泡被其他生物或合成囊泡和材料(例如脂质体、胶原、PEG和纳米颗粒/微粒)取代/替换/包裹，并装载有针对肿瘤中LCP-1蛋白的特定miRNA序列(包括miR-885-5p)。
16.miRNA组，其包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p和let-7b-5p，还包括选自由下各项组成的组的一种或多种miRNA：miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
17.根据声明16所述的组，其中所述组包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p和miR-885-5p。
18.根据声明16或17所述的组，其中所述组包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
19.根据声明16至18中任一项所述的组，其中所述组包括天然存在的miRNA和合成过表达的miRNA，其中所述合成过表达的miRNA是合成的premiR、成熟的miR、antimiR或从头诱导的miR。
20.根据声明16至19中任一项所述的组，其中所述组被包埋在细胞外囊泡(EV)或其他生物或合成囊泡或材料中，例如脂质体、胶原、PEG、纳米颗粒或微粒。
21.一种细胞外囊泡(EV)，其装载有声明16至19中任一项所定义的miRNA组或装载有编码声明16至19中任一项所定义的miRNA组的核酸。
22.根据声明21所述的细胞外囊泡(EV)，其中所述EV从源自脐带、脐带胶质、血液、脐带血或骨髓的干细胞获得，其中所述干细胞是间充质来源或祖细胞来源。
23.根据声明21或22所述的EV，其中所述EV以10nm至500nm或30nm至300nm的尺寸范围生产。
24.根据声明21至23中任一项所述的EV，其中所述EV的特征在于细胞内和细胞膜蛋白，其包含P-选择蛋白、整联蛋白β-1、血管细胞粘附蛋白1、膜联蛋白、肿瘤易感基因101蛋白、Hsp70结合蛋白、CD9、CD29、CD63、CD73、CD81和CD90。
25.根据声明21至24中任一项所述的EV，其中所述miRNA序列(i)通过转染或从头诱导在亲代干细胞中上调后被预装载到EV中，和/或(ii)通过直接转移、化学插入和/或电穿孔被装载到已经形成的EV中。
26.根据声明16至20中任一项所述的组，或根据声明21至25中任一项所述的EV，其用于治疗患者中LCP-1阳性癌症的方法。
27.根据声明26使用的组，或根据声明26使用的EV，其中根据基于患者的诊断概况的癌症类型和疾病分期选择选自由以下各项组成的组的一种或多种miRNA：miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
28.根据声明26或27使用的组，或根据声明26或27使用的EV，其中LCP-1阳性癌细胞过表达选自由以下各项组成的组的任何一种或多种蛋白：argonaute-2蛋白，原癌基因c-Akt，膜联蛋白(Annexin)A3，淀粉状蛋白βA4蛋白，凋亡调节子Bcl-2，Bcl-2相关转录因子1，Bcl-2样蛋白2，杆状病毒IAP重复序列包含蛋白5(Baculoviral IAP repeat-containingprotein 5,)，骨形态发生蛋白1，癌易感性候选基因7(cancer susceptibility candidate7)，G1/S特异性细胞周期蛋白-D1，CD44抗原，钙黏着蛋白-2，钙黏着蛋白-11，细胞周期蛋白依赖性激酶2，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27，CCAAT/增强子结合蛋白α，细胞色素c氧化酶亚基2，连环蛋白β-1，CXC趋化因子受体类型4，Dickkopf相关蛋白1，表皮生长因子受体，脂肪酸合酶，高迁移率族蛋白HMGI-C，胰岛素样生长因子1受体，胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2，转录因子AP-1，有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4，诱导的髓样白血病细胞分化蛋白Mcl-1，DNA复制许可因子MCM5，E3泛素蛋白连接酶Mdm2、72kDa IV型胶原酶，基质金属蛋白酶9，转移相关蛋白MTA3，黏蛋白13，核因子NF-κB p105亚基，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3激酶催化亚基α同工型，尿激酶纤溶酶原激活物表面受体，肿瘤坏死因子配体超家族成员11，Ras GTPase激活蛋白1，Roundabout同源物1，Slit同源物2蛋白，锌指蛋白SNAI2，母抗Dpp同源物3(Mothers against decapentaplegic homolog 3)，锌指蛋白SNAI1，转录因子SOX-2-OT，转录因子Sp1，TGF-β受体2型，转化生长因子β-1，血管内皮生长因子A和原癌基因Wnt-1。
29.根据声明26至28中任一项使用的组，或根据声明26至28中任一项使用的EV，其中所述LCP-1阳性癌症选自由以下各项组成的组：乳腺癌、皮肤黑素瘤、眼色素层黑色素瘤、神经胶质瘤、头颈癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肾癌、肾癌、骨癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌和任何其他过表达如声明28所述的一种或多种癌蛋白的癌症类型。
30.根据声明26至29中任一项使用的组，或根据声明26至29中任一项使用的EV，其中通过诊断试剂盒选择癌症患者以施用所述组或装载miRNA的EV，所述诊断试剂盒设计用于选择组织和液体活检和生物流体中的LCP-1阳性肿瘤、LCP-1磷酸化状态、miR-885-5p阴性肿瘤、miR-885-5p表达、以及声明28中定义的miRNA和蛋白的组合的表达的一种或多种。
31.根据声明26至30中任一项使用的组，或根据声明26至30中任一项使用的EV，其中在癌症患者中局部或全身，以液体或固体形式口服、肌内或静脉内施用装载miRNA的EV。
32.根据声明26至31中任一项使用的组，或根据声明26至31中任一项使用的EV，其中可以将装载miRNA的EV作为主要治疗方法或结合其他疗法(例如化学疗法、放射疗法或其他生物疗法)来预防或治疗性地施用。
33.根据声明26至32中任一项使用的组，或根据声明26至32中任一项使用的EV，其中装载miRNA的EV迁移至肿瘤部位，例如脑中的肿瘤部位。
34.根据声明33使用的组，或根据声明33使用的EV，其中所述肿瘤部位是原发性或转移性肿瘤部位。
35.根据声明26至34中任一项使用的组，或根据声明26至34中任一项使用的EV，其中装载miRNA的EV与癌细胞的细胞膜融合并在靶细胞的细胞质中释放治疗性miRNA。
36.试剂盒，包括用于确定患者样品中miRNA组的表达水平的工具，所述miRNA组包括miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
37.根据声明36的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于确定患者样品中miRNA组的表达水平的工具，所述miRNA组包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
38.如声明36或37中所定义的试剂盒的用途，用于确定患者样品中miRNA的表达水平，优选用于制备声明21至25中任一项所定义的EV以施用给患者。
实施例
评估癌细胞对EV介导的miRNA治疗的反应的体外研究：将乳腺(MDA-MB-231&MCF-7)、结肠(RKO，HT-29，CACO2)和卵巢(SKOV3，EFO-21)腺癌、前列腺癌(LNCaP)和急性单核细胞白血病(THP-1)细胞系暴露于含有外源性治疗性miR-885-5p(以及内源性miRNA组，参见表2)的EV。通过细胞形态、增殖、迁移、基因表达和凋亡测定法评估对治疗的反应(图3和4)。我们的体外实验证实，源自干细胞的EV被多种癌细胞系内化，并诱导生物学效应，如靶细胞的膜损伤、细胞收缩和起泡所证明(图5)。重要的是，有证据表明EV以剂量/时间依赖性方式诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖并减弱肿瘤的生长和转移。在引入细胞培养物之前，通过EV的RNase处理，EV在癌细胞中的促凋亡和抗迁移作用几乎被完全消除。在体外、体内(图6)和计算机上对一系列不同大小的EV进行了测试，以通过对尺寸依赖性EV动力学和生物分布的实验和建模研究(使用SEC和TRPS进行颗粒分析)来实现最大的递送效率。图6显示了EVmiR与癌细胞在不同时间点在肿瘤部位的共定位(图6A和6B)。因此，EVmiR能够在体内特异性靶向和攻击癌细胞。
图7在左侧插图中显示了EVmiR的扫描电子显微照片。较大的图像显示了攻击MDA-MB-231细胞系的EVmiR。这说明了EVmiR与肿瘤细胞共定位并通过膜摄取机制装载其内容物。
用于评估对基于EVmiRTM的疗法的反应的体内癌症模型：通过我们的发明，我们开发了一种新型的基于miRNA的治疗剂，其靶向和抑制原发性和转移性肿瘤中的LCP1。在我们对转移性乳腺癌(从乳房到大脑的远处转移)和结肠直肠癌的体内研究中，我们能够监测和定量循环中荧光标记的EV，并对其在健康和荷瘤小鼠的细胞和器官中的生物分布和参入情况进行成像。我们发现治疗性EVmiRTM复合物积聚在包括大脑在内的原发性和转移性肿瘤生长部位(即EV能够穿过血脑屏障)。然后，通过在荷瘤小鼠中施用含有特定治疗性miRNA(选自表4)的工程化EV并使用体内成像技术实时监测，我们研究了EVmiRTM系统在动物癌症模型中的治疗潜力。通过体内成像的肿瘤负荷评估显示，与未治疗的小鼠相比，在用EVmiRTM治疗的小鼠中，肿瘤生长和转移负荷随时间降低。我们还确定了产生可测量的治疗结果所需的剂量方案，以及EVmiRTM复合物可以达到的最大组织/肿瘤深度。利用前列腺癌的小鼠模型，我们进一步证明了降低的LCP-1表达抑制了转移，而增加LCP-1表达和磷酸化刺激了原发肿瘤的转移。
治疗剂的作用方式(信号通路的构建)：对肿瘤部位的细胞，EV和外植组织进行了蛋白质组学，组织谱分析和miRNA组学等最新技术，以鉴定使我们的EVmiRTM复合物具有抗癌作用的途径和机制。通过测量LCP-1蛋白在Ser5和其他相关靶标上的磷酸化活性，采用定制的多重分析来阐明受我们的治疗剂影响的信号通路。利用最新的路径优化算法对数据进行归一化和分析，以确定治疗性EVmiRTM复合物的作用方式。此外，进行了AFM研究，以表征通过含miR-885-5p miRNA的EV对LCP-1蛋白下调后转移癌细胞的机械性质，并证明了癌细胞的细胞可塑性与高转移潜力之间的联系。
对基于miRNA的治疗的肿瘤反应进行建模：我们还利用创新的患者特异性多尺度计算模型，通过分析和预测以下项目来设计更有效的基于EVmiRTM的治疗递送系统：1)源自干细胞的EV的血管沉积(间充质或其他)；2)肿瘤对EV介导的miRNA治疗的反应。由于开发针对复杂肿瘤微环境(在大多数情况下，阻碍了其有效的渗透和治疗作用)的递送系统的任务的复杂性，这是我们治疗策略的整体部分。
在此，我们描述了本发明的特定实施方案/实施例，然而，应当理解，本发明包括落在如以下权利要求中所描述的本发明的范围和精神内的变型和修饰。
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序列表
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Claims (23)
1.miRNA组，其包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p和let-7b-5p，还包括选自由以下各项组成的组的一种或多种miRNA：miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
2.根据权利要求1所述的组，其中所述组包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p和miR-885-5p。
3.根据权利要求1或2所述的组，其中所述组包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组，其中所述组包括天然存在的miRNA和合成过表达的miRNA，其中所述合成过表达的miRNA是合成的premiR、成熟的miR、antimiR或从头诱导的miR。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组，其中所述组被包埋在细胞外囊泡(EV)或其他生物或合成囊泡或材料中，例如脂质体、胶原、PEG、纳米颗粒或微粒。
6.一种细胞外囊泡(EV)，其装载有权利要求1至4中任一项所定义的miRNA组或装载有编码权利要求1至4中任一项所定义的miRNA组的核酸。
7.根据权利要求6所述的细胞外囊泡(EV)，其中所述EV从源自脐带、脐带胶质、血液、脐带血或骨髓的干细胞获得，其中所述干细胞是间充质来源或祖细胞来源。
8.根据权利要求6或7所述的EV，其中所述EV以10nm至500nm或30nm至300nm的尺寸范围生产。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的EV，其中所述EV的特征在于细胞内和细胞膜蛋白，其包含P-选择蛋白、整联蛋白β-1、血管细胞粘附蛋白1、膜联蛋白、肿瘤易感基因101蛋白、Hsp70结合蛋白、CD9、CD29、CD63、CD73、CD81和CD90。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的EV，其中所述miRNA序列(i)通过转染或从头诱导在亲代干细胞中上调后被预装载到EV中，和/或(ii)通过直接转移、化学插入和/或电穿孔被装载到已经形成的EV中。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的组，或根据权利要求6至10中任一项所述的EV，其用于治疗患者中LCP-1阳性癌症的方法。
12.根据权利要求11使用的组，或根据权利要求11使用的EV，其中根据基于患者的诊断概况的癌症类型和疾病分期选择选自由以下各项组成的组的一种或多种miRNA：miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
13.根据权利要求11或12使用的组，或根据权利要求11或12使用的EV，其中LCP-1阳性癌细胞过表达选自由以下各项组成的组的任何一种或多种蛋白：argonaute-2蛋白，原癌基因c-Akt，膜联蛋白(Annexin)A3，淀粉状蛋白βA4蛋白，凋亡调节子Bcl-2，Bcl-2相关转录因子1，Bcl-2样蛋白2，杆状病毒IAP重复序列包含蛋白5(Baculoviral IAP repeat-containing protein 5,)，骨形态发生蛋白1，癌易感性候选基因7(cancersusceptibility candidate 7)，G1/S特异性细胞周期蛋白-D1，CD44抗原，钙黏着蛋白-2，钙黏着蛋白-11，细胞周期蛋白依赖性激酶2，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27，CCAAT/增强子结合蛋白α，细胞色素c氧化酶亚基2，连环蛋白β-1，CXC趋化因子受体类型4，Dickkopf相关蛋白1，表皮生长因子受体，脂肪酸合酶，高迁移率族蛋白HMGI-C，胰岛素样生长因子1受体，胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2，转录因子AP-1，有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4，诱导的髓样白血病细胞分化蛋白Mcl-1，DNA复制许可因子MCM5，E3泛素蛋白连接酶Mdm2、72kDa IV型胶原酶，基质金属蛋白酶9，转移相关蛋白MTA3，黏蛋白13，核因子NF-κB p105亚基，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3激酶催化亚基α同工型，尿激酶纤溶酶原激活物表面受体，肿瘤坏死因子配体超家族成员11，Ras GTPase激活蛋白1，Roundabout同源物1，Slit同源物2蛋白，锌指蛋白SNAI2，母抗Dpp同源物3(Mothers againstdecapentaplegic homolog 3)，锌指蛋白SNAI1，转录因子SOX-2-OT，转录因子Sp1，TGF-β受体2型，转化生长因子β-1，血管内皮生长因子A和原癌基因Wnt-1。
14.根据权利要求11至13中任一项使用的组，或根据权利要求11至13中任一项使用的EV，其中所述LCP-1阳性癌症选自由以下各项组成的组：乳腺癌、皮肤黑素瘤、眼色素层黑色素瘤、神经胶质瘤、头颈癌、口腔癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肾癌(renal cancer)、肾癌(kidney cancer)、骨癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌和任何其他过表达如权利要求13所述的一种或多种癌蛋白的癌症类型。
15.根据权利要求11至14中任一项使用的组，或根据权利要求11至14中任一项使用的EV，其中通过诊断试剂盒选择癌症患者以施用所述组或装载miRNA的EV，所述诊断试剂盒被设计为用于选择组织、液体活检或生物流体中的LCP-1阳性肿瘤、LCP-1磷酸化状态、miR-885-5p阴性肿瘤、miR-885-5p表达、以及权利要求13中定义的miRNA和蛋白的组合的表达的任何一种或多种。
16.根据权利要求11至15中任一项使用的组，或根据权利要求11至15中任一项使用的EV，其中在癌症患者中局部或全身性、以液体或固体形式口服、肌内或静脉内施用装载miRNA的EV。
17.根据权利要求11至16中任一项使用的组，或根据权利要求11至16中任一项使用的EV，其中可以将装载miRNA的EV作为主要治疗方法或联合其他疗法如化学疗法、放射疗法或其他生物疗法来预防或治疗性地施用。
18.根据权利要求11至17中任一项使用的组，或根据权利要求11至17中任一项使用的EV，其中装载miRNA的EV迁移至肿瘤部位，例如脑中的肿瘤部位。
19.根据权利要求18使用的组，或根据权利要求18使用的EV，其中所述肿瘤部位是原发性或转移性肿瘤部位。
20.根据权利要求11至19中任一项使用的组，或根据权利要求11至19中任一项使用的EV，其中装载miRNA的EV与癌细胞的细胞膜融合并在靶细胞的细胞质中释放治疗性miRNA。
21.试剂盒，其包含用于确定患者样品中miRNA组的表达水平的工具，所述miRNA组包括miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
22.根据权利要求21的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于确定患者样品中miRNA组的表达水平的工具，所述miRNA组包括miR-16-5p、miR-23a-5p、miR-125b-5p、miR-145-5p、miR-146a-3p、miR-181c-5p、miR-218-5p、miR-495-3p、let-7b-5p、miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-194-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-367-3p、miR-373-3p和miR-885-5p。
23.如权利要求21或22中所定义的试剂盒的用途，用于确定患者样品中miRNA的表达水平，优选用于制备权利要求6至10中任一项所定义的EV以施用给患者。
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