BR112021002321B1

BR112021002321B1 - Terapia à base de microrna direcionada a cânceres positivos para lcp-1

Info

Publication number: BR112021002321B1
Application number: BR112021002321-6A
Authority: BR
Inventors: Marianna Prokopi
Original assignee: Theramir Ltd
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2023-11-28
Also published as: CN112567034A; US20210369760A1; EP3833760B1; CA3108172A1; PL3833760T3; JP2024095750A; JP7545970B2; MX2021001517A; EP4424380A2; EP3833760C0; EA202190474A1; SG11202101069SA; KR20210044247A; WO2020030750A1; BR112021002321A2; AU2019319623A1; IL280622A; JP2021533822A; EP3833760A1

Abstract

TERAPIA À BASE DE MICRORNA DIRECIONADA A CÂNCERES POSITIVOS PARA LCP-1. A presente invenção se refere a um painel de miRNAs que compreende miR-16-5p, miR-23a- 5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218- 5p, miR-495-3p, let-7b-5p e que compreende ainda um ou mais miRNAs selecionados a partir do grupo que consiste em miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335- 3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p, e miR-885-5p, e a vesículas extracelulares (EVs), por exemplo, de origem em células-tronco carregadas com o painel de miRNAs. A presente invenção fornece ainda o painel ou EVs para uso em um método de tratamento de câncer positivo para LCP-1 em um paciente.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a uma nova tecnologia que usa miRNAs e sua capacidade de direcionar e regular negativamente a atividade de oncoproteínas em cânceres positivos para LCP-1. A presente tecnologia se refere à entrega de sequências de inibidores de miRNA específicas encapsuladas em vesículas biológicas ou sintéticas que afetarão a expressão de um grupo de genes e proteínas (incluindo LCP1/LCP-1) associados à iniciação, crescimento, agressividade e metástase de câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O câncer é uma doença heterogênea com hierarquias celulares e muitos fenótipos diferentes que possuem alta capacidade de propagação tumoral e metástase. A progressão para o estágio metastático fornece o desafio mais sério para o tratamento eficaz de câncer e é responsável pela maioria das mortes relacionadas ao câncer. A cascata de invasão- metástase é um processo celular de várias etapas que envolve a disseminação de células cancerosas através da matriz extracelular circundante, sobrevivência na circulação e semeadura inicial, seguida por expansão subsequente (colonização), no microambiente de sítio metastático. Essas etapas requerem uma alta motilidade para as células cancerosas, o que é facilitado pela modulação do citoesqueleto celular. Estudos recentes apontam as proteínas de ligação ao citoesqueleto como agentes importantes na metástase tumoral, principalmente devido à sua capacidade de se ligar e regular as moléculas de integrina. Portanto, tais moléculas são alvos promissores para inibir as propriedades metastáticas de células tumorais. Especificamente, alguns cânceres expressam a proteína reorganizadora de actina LCP-1 (L-Plastina, Plastina-2, proteína citosólica de linfócito 1), que normalmente é específica para leucócitos e não está presente em células não hematopoiéticas1. A proteína foi recentemente identificada como um biomarcador para a detecção precoce de várias formas de câncer, tais como câncer de rim, cólon e mama2. LCP-1 é uma proteína de 70 kDa, regulada por Ca2+ e de ligação à actina, que desempenha um papel importante tanto no sistema imunológico adaptativo quanto no inato3. A família da plastina de proteínas de ligação à actina consiste em três isoformas que apresentam expressão específica para tecidos. As mesmas exibem um arranjo molecular similar, que contém dois domínios de ligação de actina consecutivos no C-terminal, em que cada um consiste em dois domínios de homologia de calponina (CH). Essa estrutura permite que o LCP-1 direcione a organização de filamentos de actina em feixes4 muito compactos. A função de LCP-1 é importante para as células tanto do sistema imunológico inato quanto do adaptativo. Demonstrou-se que LCP-1 é fundamental para a formação5 de sinapse imunológica e que regula a adesão dependente de integrina e a migração de granulócitos6 e células T7. Também sugeriu-se que a mesma pode desempenhar um papel na motilidade de células tumorais. A atividade de agrupamento de actina de LCP-1 é conhecida por ser dependente de cálcio, pois o aumento de concentrações de cálcio inibem a formação de feixes de actina. A fosforilação de Ser5 também demonstrou aumentar a atividade de agregação de actina de LCP-1 in vitro para promover seu direcionamento para sítios de montagem de actina. A regulação através da fosforilação de LCP-1 foi descrita como uma consequência de respostas imunológicas, bem como em resposta a sinais que desencadeiam a migração8 a 10.

[0003] Além da relevância de prognóstico potencial de expressão e fosforilação de LCP-1 em células cancerosas humanas, LCP-1 representa um alvo promissor para a terapia de câncer. A redução de expressão e/ou fosforilação de LCP-1 em células tumorais pode interferir na agressividade, migração e invasão de células tumorais e, portanto, reduzir a metástase. Ferramentas terapêuticas que foram estudadas a fim de inibir a taxa de progressão do câncer foram baseadas em vetores adenovirais recombinantes que são direcionados pelo promotor LCP1, bem como em peptídeos bloqueadores de LCP-1, tal como a melitina11. Uma das principais desvantagens de vetores adenovirais é que o direcionamento específico de célula é difícil de alcançar, pois o vírus não tem envelope para anexar ligantes específicos de célula, embora também existam importantes questões de segurança, tais como a geração potencial de vírus competente para replicação e a possibilidade de provocar uma resposta inflamatória no paciente, especialmente quando administradas repetidas vezes. Além disso, os peptídeos bloqueadores de LCP- 1, tal como a melitina, têm fortes propriedades hemolíticas que os tornam tóxicos para as células normais e, portanto, não adequados para aplicações clínicas diretas15. Portanto, o objetivo desta invenção é o desenvolvimento de uma nova tecnologia para o sucesso e a inibição direcionada de LCP-1. Simultaneamente, um grupo de proteínas associadas (Painel de Proteínas, Tabela 1) representa alvos adicionais inovadores para a terapia de câncer e é, portanto, usado nesta invenção junto com LCP-1, a fim de desenvolver produtos terapêuticos de câncer direcionados adaptados.TABELA 1. PAINEL SELECIONADO DE PROTEÍNAS, GENES E miRNAS ASSOCIADOS PAINEL selecionado de proteínas, genes e miRNAs associados

[0004] As abordagens baseadas em RNA são consideradas a próxima grande classe de produtos terapêuticos de câncer. Avanços na genética relacionados ao papel do RNA em uma gama cada vez maior de vias e processos celulares demonstraram que o RNA tem muitas das propriedades genéticas e regulatórias anteriormente atribuídas apenas ao DNA e às proteínas. O trabalho atual está focado principalmente em mRNA modificado para promover a expressão de proteínas terapêuticas e em variantes de RNAi (tais como siRNA e miRNA), que podem silenciar ou amplificar genes em células cancerosas.

[0005] MiRNAs, uma classe de RNAs não codificadores pequenos (aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento) que se ligam a RNAs mensageiros (mRNAs), agindo como reguladores de genes pós-tradução endógenos12. A interação entre miRNAs e mRNAs é altamente complexa e atualmente não totalmente compreendida. No entanto, aproximadamente um terço dos genes codificadores de proteínas humanas é regulado por miRNAs, destacando seu extraordinário impacto na expressão de proteínas. O que se sabe é que, pelo menos em mamíferos, os miRNAs se ligam por complementaridade imperfeita a seus genes-alvo13. Vários mecanismos de ação foram propostos para a repressão gênica mediada por miRNA. A síntese de proteínas pode ser suprimida pela inibição de iniciação de tradução, degradação de mRNA devido à desadenilação ou, em casos raros, clivagem de mRNA. Reexpressar miRNAs perdidos em uma célula pode ter um efeito drástico, pois os miRNAs regulam um grande número de genes e vias. Demonstrou-se que a re-expressão e a regulação negativa de miRNA têm efeitos antitumorais, enquanto a re-expressão de um miRNA supressor de tumor pode diminuir a regulação de vários oncogenes. A re-expressão, para níveis fisiológicos, de miRNAs específicos de tecido que são regulados negativamente no câncer pode induzir à desdiferenciação de células cancerosas.

[0006] O sucesso de produtos terapêuticos de RNA depende de sua entrega eficaz e segura a seus alvos moleculares dentro das células cancerosas, como demonstraram as falhas iniciais em ensaios clínicos. Assim, novas e inovadoras tecnologias de entrega de fármacos são necessárias para realizar todo o seu potencial em terapia de câncer. A entrega sistêmica de miRNAs enfrenta seu próprio conjunto de limitações. O tamanho do RNA não conjugado é de 7 a 20 kDa, e é bem-conhecido que moléculas com tamanho inferior a 50 kDa são filtradas pelos rins e removidas da circulação (excretadas). Ao contrário de muitos outros fármacos, os miRNAs não se difundem livremente nas células e, uma vez que tendem a ser instáveis, podem se degradar ao entrarem na célula. Assim, estratégias terapêuticas eficazes precisam garantir a entrega eficiente aos sítios de tumor e, igualmente importante, a inserção bem- sucedida de sequências funcionais nas células-alvo. Além disso, um grande obstáculo à entrega sistêmica é que as terapias à base de oligonucleotídeos podem induzir efeitos adversos, tais como agregação, toxicidade hepática e estimulação da resposta imunológica, aumentando a produção de IFN em pacientes.

[0007] As abordagens atuais para a entrega de miRNAs in vivo incluem oligonucleotídeos anti-miRNA, antagomiRs, ácido nucleico bloqueado (LNA), esponjas de miRNA, sistemas baseados em vetores, lipossomas e nanopartículas. Cada abordagem traz vantagens, mas também desvantagens significativas; para abordagens baseadas em partículas, as principais limitações incluem a endocitose ineficiente por células-alvo e a liberação endossômica ineficaz. Reintroduzir um miRNA com o uso de um sistema viral acarreta seu próprio conjunto de riscos possíveis, já que sempre há o risco de mutagênese de inserção, ativação de oncogenes e uma forte resposta imunológica. Para os sistemas de entrega lipossomal, a ineficiência de direcionar os tumores e entregar sua carga terapêutica in vivo levou a complicações e efeitos colaterais significativos, conforme demonstrado nos primeiros ensaios clínicos dos primeiros produtos terapêuticos à base de miRNA.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0008] FIGURA 1. Representação gráfica do construto EVmiRTM. O EVmiRTM é composto por uma bicamada lipídica de origem de membrana celular, proteínas de membrana, CDs, transportadores e outros. Eles contêm miRNAs de ocorrência natural, bem como miRNAs específicos do paciente, tal como miR-885-5p, que tem como alvo direto a expressão de proteína LCP-1. Também é mostrada aqui uma micrografia do EVmiRTM analisado com o uso de microscopia eletrônica de varredura (SEM) com um tamanho de 140 nm.

[0009] FIGURA 2. Validação dos métodos de carregamento de miRNA de construto EVmiR™. Avaliação dos níveis de expressão de miR-885-5p (com o uso de PCR em tempo real) em EVs com o uso de três diferentes abordagens de superexpressão (Métodos A, B e C).

[0010] FIGURA 3. Avaliação dos níveis de expressão de proteína LCP-1. A concentração de LCP-1 foi testada em uma variedade de linhagens celulares de controle e de câncer antes e depois do tratamento com EVmiR™ carregado com o miR-885-5p com o uso de ensaios de Western blot quantitativos.

[0011] FIGURA 4. Ensaio de proliferação celular em células de câncer de mama MDA-MB-231. Ensaio de proliferação celular em câncer de mama MDA-MB-231 na presença de EVmiRs (LC: baixa concentração, MC: concentração média e HC: alta concentração), inibidor de GSI e DMSO como fatores citotóxicos conhecidos como controles e PBS/meios condicionados normais como controles internos; tratamento celular por 4 e 7 dias.

[0012] FIGURA 5. Experimentos in vitro de células MDA-MB-231 em tratamento com EVmiRs confirmaram sua internalização e a indução de um efeito biológico, conforme evidenciado por danos à membrana, encolhimento celular e bolhas nas células-alvo (em vários pontos de tempo, tais como Dia 2, 5 e 7 do tratamento). As células de controle sem tratamento ou com tratamento com DMSO são mostradas para comparação.

[0013] FIGURA 6. Ensaio de biodistribuição de corpo inteiro in vivo. FIGURA 6A. EVmiRs marcados (corados com DiD) e partículas coradas com DiD sintético foram administrados a camundongos de controle. EVmiRs marcados (corados com DiD) foram administrados em camundongos com tumor que foram marcados com tumor-GFP. A Figura 6A mostra a colocalização de EVmiRs com o sítio de tumor. A fluorescência foi circundada por linhas tracejadas. FIGURA 6B. Os animais foram testados em diferentes pontos de tempo quanto à biodistribuição in vivo com o uso de um sistema de imagem de fluorescência desenvolvido internamente. A colocalização de EVmiRs (a fluorescência foi circundada por linhas tracejadas) com o sítio de tumor (o tumor foi circundado por linhas tracejadas no painel esquerdo) foi evidente para diferentes pontos de tempo.

[0014] FIGURA 7. Imagem pequena mostra micrografia eletrônica de varredura de EVmiR e imagem maior mostra o ataque de EVmiRs contra a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231. EVmiRs colocalizam com as células tumorais e carregam seu conteúdo através de mecanismos de captação de membrana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] A presente invenção projeta a entrega de uma combinação específica de sequências de miRNA (incluindo miR-885-5p) encapsuladas em carreadores de origem biológica ou sintética (tamanho de 30 a 300 nm) contendo fatores quimiotáticos e proteínas de origem de células- tronco (Tabela 2). O construto proposto intitulado EVmiR™ (Figura 1) afetará a ação de um grupo de genes e proteínas (incluindo LCP1/LCP-1) associados à iniciação, crescimento, agressividade e metástase de câncer em cânceres positivos para LCP-1 (Tabela 1). TABELA 2. Os principais componentes do construto EVmiR™ geneticamente modificado.

[0016] Um sistema terapêutico baseado em miRNAs específicos selecionados a partir de um painel que inclui a sequência miR-885- 5p e são carregados em formulações biológicas, sintéticas ou químicas, incluindo vesículas extracelulares. Este construto tem como alvo e modula a expressão de um grupo específico de oncoproteínas (incluindo LCP-1) que estão associadas à iniciação, crescimento, agressividade e potencial metastático em cânceres positivos para LCP-1. O sistema de entrega bem-sucedido tem uma faixa de tamanho estreita (de 30 a 300 nm de diâmetro) com propriedades associadas a células-tronco de origem biológica ou sintética. Essas vesículas atuam como carreadores direcionados de sequências de miRNA terapêutico específicas e, uma vez administradas, migram para os sítios de tumor a fim de se fundir e entregar sua carga terapêutica diretamente em células cancerosas.

[0017] PROBLEMA: Os fármacos para câncer atualmente no mercado ainda não alcançaram a erradicação completa de tumores e o remédio eficaz para doenças cancerígenas em pacientes humanos. Isto é principalmente devido às dificuldades para bloquear o crescimento de câncer complexo e processo de metástase (eficiência terapêutica), bem como devido à entrega inadequada de agentes terapêuticos aos sítios de tumor (direcionamento de tumor). Essa falta de opções terapêuticas eficazes abre a porta para novas oportunidades para novas abordagens para a entrega direcionada de terapia de câncer que pode intervir em vários processos de células cancerosas. O desenvolvimento de metástases causa as consequências clínicas mais graves de câncer e é responsável por mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer14. O processo de crescimento e metástase de câncer é complexo e a compreensão dos mecanismos moleculares que os regulam permanece limitada. A descoberta de alvos-chave no campo de oncologia abrirá novos caminhos para a luta contra uma ampla gama de tipos de câncer, tais como melanoma, glioblastoma, câncer de ovário, mama, cervical, colorretal e de próstata, etc. A migração de células tumorais e metástases requerem rearranjos dinâmicos do citoesqueleto de actina. Curiosamente, LCP-1 é responsável pela organização de filamentos de actina e também é expressa de forma aberrante em muitos tipos de glóbulos vermelhos. Identificou-se que o aumento da expressão dessa proteína em cânceres epiteliais ativa a via de metástase através do sistema circulatório permitindo metástases em sítios distantes em combinação com outros genes de assinatura (Painel de Genes, Tabela 1). De modo similar, a identificação de uma lista cada vez maior de oncoproteínas que desempenham um papel, não apenas na metástase, mas também na iniciação e no crescimento de tumores primários ligados a LCP-1, abrirá uma grande variedade de oportunidades no campo de oncologia para projetar e desenvolver novos produtos terapêuticos para o câncer que podem atingir vários estágios da doença.

[0018] SOLUÇÃO: A iniciação, migração e metástase de células tumorais requerem rearranjos dinâmicos do citoesqueleto celular e a ativação de vias oncogênicas importantes. Curiosamente, a proteína LCP-1, originalmente descrita como uma proteína específica de leucócitos, é expressa de forma aberrante em vários tumores malignos e interage com várias outras proteínas associadas ao câncer, como as descritas na Tabela 1 (Painel de Proteínas). Portanto, desenvolveu-se um painel de miRNAs associados (painel de miRNA, Tabela 1) e utilizou-se o mesmo para projetar combinações personalizadas de miRNAs terapêuticos que podem interferir na expressão das proteínas associadas ao câncer acima por meio do direcionamento de seus respectivos genes (consultar Painel de genes, Tabela 1).

[0019] Em nossa invenção, os miRNAs terapêuticos são administrados a tumores por meio de um novo sistema de entrega baseado em vesículas extracelulares (EVs), embora o painel de miRNAs também possa ser entregue com qualquer outro sistema carreador de direcionamento de tumor (tais como sistemas baseados em nanopartículas ou lipossomas). Assim, a administração de combinações de miRNAs personalizadas descritas no presente documento pode ser realizada por qualquer método aceitável que permite que o miRNA ou ácido nucleico que codifica o miRNA alcance seu alvo. Em uma modalidade particular da invenção, EVs foram especificamente projetadas para entregar os miRNAs terapêuticos a sítios de tumor e dentro de células cancerosas. Os complexos de EVmiRTM são vesículas extracelulares (EVs) projetadas com origem em células-tronco que contêm sequências de miRNA específicas que atuam como inibidores diretos de LCP-1. O EVmiRTM também é projetado para direcionar e manipular a expressão de outro grupo de oncoproteínas que está diretamente envolvido na via LCP-1 e principalmente regulado positivamente em tumores sólidos (Painel de Proteínas, Tabela 1). Os complexos de EVmiRTM são veículos de entrega ideais, pois retêm os receptores de membrana que permitem que as células-tronco se alojem seletivamente em sítios de tumor e atinjam células malignas, evitando assim o direcionamento de células saudáveis. As EVs se alojam e são enxertadas em tumores sólidos por meio de receptores de quimiocinas específicos, se fundem às membranas de células tumorais e incorporam miRNA diretamente na célula cancerosa-alvo, exercendo assim seu efeito terapêutico, minimizando os efeitos colaterais associados às terapias convencionais. Esses complexos de EVmiRTM oferecem potencial profilático e terapêutico intensificado devido à sua capacidade de direcionar múltiplas moléculas em células malignas quando comparados com abordagens que visam genes únicos e induzem imunossupressão através da inibição de sinalização de citocina, tornando esta abordagem especialmente adequada como componente de estratégias terapêuticas em doenças de câncer recorrentes.

[0020] Nesta invenção, o alvo, tanto in vitro quanto in vivo, é a proteína relacionada ao câncer LCP-1 (bem como as oncoproteínas da Tabela 1) por meio da entrega de uma combinação de miRNAs encapsulados no EVmiR™ ou outras vesículas apropriadas.

[0021] Construiu-se um complexo de EVmiR™ celular inovador que contém um grupo de miRNAs de ocorrência natural e sintética superexpressos (com o uso de premiRs sintéticos, miRs maduros, antimiRs ou miRs ativamente induzidos de novo). As EVs são vesículas intactas, com um tamanho de 30 a 300 nm de diâmetro, formadas a partir da membrana plasmática e enriquecidas em componentes citoplasmáticos, proteínas de superfície celular e fosfolipídios bioativos derivados da membrana plasmática de suas células-mãe (consultar Tabela 2). Esse complexo adaptado tem como alvo direto a expressão de LCP-1 e outras proteínas relacionadas ao câncer (Tabela 1) que são encontradas especificamente no ambiente tumoral e que podem bloquear os processos do câncer, tais como o crescimento do tumor e a progressão metastática. Constatou-se que miRNAs associados a partículas celulares, tais como as EVs geneticamente modificadas, são protegidos da degradação de nuclease e podem ser transferidos em uma variedade de células para alterar profilaticamente ou terapeuticamente a expressão gênica das células receptoras.

[0022] Em determinadas modalidades, o painel pode compreender miRNAs de origem natural de células-tronco e (um ou mais) miRNAs sinteticamente superexpressos, em que os miRNAs sinteticamente superexpressos são premiRs sintéticos, miRs maduros, antimiRs ou miRs induzidos de novo.

[0023] Esta invenção é aplicada profilaticamente e terapeuticamente como parte de uma estratégia médica personalizada mais ampla que inclui a seleção de paciente apropriada, bem como componentes de diagnóstico, prognóstico, terapêuticos e de monitoramento. Os benefícios desta invenção, uma oferta farmacêutica melhorada que tem alta seletividade e menor toxicidade do que as opções anteriores, serão multifatoriais. O custo do tratamento de toxicidades não toleradas será reduzido e o tempo de conclusão do tratamento ativo será significativamente reduzido devido ao fato de que os efeitos tóxicos não terão que interromper os tratamentos. A seleção de pacientes otimizada será baseada no perfil molecular do tumor e nas variáveis de resposta do paciente, abrindo caminho para o uso mais eficiente de fármacos e levando a taxas de mortalidade e morbidade mais baixas. Para este propósito, um kit de diagnóstico complementar para avaliar os níveis de LCP-1 e os outros alvos de oncoproteína, bem como monitorar a expressão do painel de miRNAs em tecido e/ou biópsias líquidas, foi desenvolvido. Assim, a abordagem de EVmiRTM para terapia de câncer direcionada foi validada utilizando o kit em amostras clínicas de tumores que expressam as oncoproteínas direcionadas e sequências de miRNA associadas.

[0024] VANTAGENS: Nos últimos 20 anos, o campo de oncologia testemunhou a introdução de uma nova classe de fármacos com base no conceito de terapia direcionada - tratamentos com medicamentos desenvolvidos para direcionar seletivamente genes, proteínas e vias de sinalização que demonstraram desempenhar um papel no desenvolvimento do câncer. Diversas terapias direcionadas mostraram eficácia em uma ampla gama de cânceres e estão sendo cada vez mais introduzidas continuamente, impulsionadas por novos conhecimentos em biologia molecular e avanços na síntese química e molecular, bem como em métodos de triagem de alto rendimento (a revolução “ômica”). Entre a nova safra de agentes terapêuticos no mercado ou em desenvolvimento, inibidores de angiogênese, agentes imunoterapêuticos (anticorpos monoclonais, citocinas e vacinas contra o câncer), inibidores de sinalização de quinase e terapia gênica (baseada em DNA ou RNA) parecem ser os mais promissores. Abordagens baseadas em RNA (mRNA e RNAi) têm atraído considerável interesse nos últimos anos, uma vez que a regulação aberrante de RNA tem sido cada vez mais implicada em uma variedade de vias celulares e processos críticos para o desenvolvimento do câncer.

[0025] Portanto, o mercado de terapias baseadas em RNA direcionadas ainda está em sua fase inicial e em muitos estágios iniciais de desenvolvimento. Os avanços recentes na elucidação do papel fundamental do RNA em uma série de mecanismos celulares facilitaram o surgimento de abordagens inovadoras para a modificação genética de sequências de mRNA e RNAi em terapias clinicamente aprovadas. Essas tecnologias visam tirar proveito dos próprios processos naturais do corpo, para promover a expressão de proteínas benéficas ou silenciar genes e eliminar proteínas específicas em células cancerosas, levando ao desenvolvimento de produtos terapêuticos mais seguros para o câncer com especificidade e eficácia amplamente melhoradas. Dependendo do tipo e localização do câncer direcionado, a entrega dos agentes terapêuticos muitas vezes requer o desenvolvimento de tecnologias de transporte inovadoras, tais como nanocápsulas, nanopartículas, lipossomas e vesículas PEG-iladas, a fim de minimizar a toxicidade para tecidos saudáveis e maximizar as concentrações terapêuticas eficazes no sítio de tumor.

[0026] Esta invenção oferecerá vantagens significativas como terapia baseada em RNA direcionada para o câncer:

[0027] ■ A entrega direcionada continua sendo um grande desafio para os produtos terapêuticos de RNA. Estes estudos in vivo mostraram que as células-tronco mesenquimais podem migrar seletivamente para os tumores (homing), portanto, os complexos de EVmiRTM incorporam os receptores de membrana necessários que permitirão a entrega direcionada de miRNA ao sítio de tumor. A única especificidade da abordagem se traduz em maior eficácia contra tumores, evitando o direcionamento de células saudáveis e minimizando os potenciais efeitos colaterais.

[0028] ■ Um obstáculo importante para a terapia baseada em miRNA eficaz é a necessidade de estabilidade e entrega bem- sucedida aos tecidos-alvo. Ao contrário de muitos outros fármacos, os miRNAs não se difundem livremente nas células; assim, miRNAs requerem abordagens de entrega especiais para atingir o efeito desejado. Demonstrou-se que os complexos de EVmiRTM podem se fundir com as células cancerosas-alvo e permitir que o miRNA terapêutico se incorpore às células receptoras.

[0029] ■ As EVs podem fornecer doses terapêuticas de miRNAs que mostraram afetar várias vias que estão envolvidas no desenvolvimento do câncer. Já foram identificados miRNAs específicos, que regulam a expressão gênica em células cancerosas tanto por meio da redução ou deleção de miRNA oncogênicos quanto por meio da amplificação ou superexpressão de miRNA supressores de tumor. Assim, em comparação com abordagens anteriores que visam genes únicos, a abordagem de miRNA pode apresentar oportunidades para direcionar várias moléculas em células cancerosas e, assim, oferecer vários caminhos para a redução do tumor com uma única abordagem.

[0030] ■ Ao contrário das terapias de RNA anteriores, os complexos de EVmiRTM não induzem uma resposta imunológica inata, uma vez que as sequências de miRNA terapêuticas não são expostas. Em vez disso, demonstrou-se que essas EVs induzem imunossupressão (por meio da inibição de citocinas), o que torna a abordagem de entrega direcionada mais eficaz, especialmente em casos recorrentes.

[0031] Esta invenção representa uma nova modalidade terapêutica clínica do câncer, com potencial para comercialização e aplicações significativas em futuras investigações clínicas no tratamento de doenças malignas. Esta invenção levará ao rápido desenvolvimento de produtos e serviços comercializáveis para pacientes e à transformação do campo do tratamento de câncer, criando novos conhecimentos sobre a patologia de tumores e permitindo a adaptação e personalização de tratamentos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] Coletivamente, 22 miRNAs são usados nesta modalidade, a fim de reduzir o crescimento do tumor e metástases em cânceres positivos para LCP-1. miRNAs derivados de células-tronco (9 miRs de ocorrência natural) são atribuídos para estarem sempre presentes no coquetel terapêutico responsável pelo direcionamento de células cancerosas e redução do crescimento, invasão e proliferação de tumores. Por outro lado, 13 miRNAs (induzidos sinteticamente ou de novo) podem ser usados seletivamente ou no total, dependendo do perfil de diagnóstico de pacientes selecionados. O coquetel de miRNA será administrado principalmente por meio do complexo de EVmiRTM, mas sem limitação à esta formulação. Exemplos de produção e uso da tecnologia são fornecidos abaixo:

[0033] Produção de EV: A presente modalidade fornece um método de tratamento de cânceres que são positivos para LCP-1, bem como para qualquer uma das outras oncoproteínas da Tabela 1 (Painel de Proteínas), com o complexo de EVmiRTM que contém:

[0034] a) miRNAs específicos que são capazes de reduzir as oncoproteínas direcionadas (fornecidas na Tabela 1)

[0035] b) proteínas de membrana celular específicas que permitem que as EVs tenham como alvo e se alojem em sítios de crescimento tumoral e metástase (dados na Tabela 2)

[0036] As EVs (faixa de tamanho de 30 a 300 nm) são produzidas a partir de células-tronco ou células progenitoras provenientes do cordão umbilical, sangue do cordão, geleia de Wharton, sangue ou medula óssea (as células-tronco também podem ser de origem mesenquimal). As culturas de células-tronco estão sujeitas a condições de estresse, levando à formação de EVs (veículos de membrana secretada de < 300 nm de diâmetro, incluindo exossomos e microvesículas) que são colhidas, purificadas e concentradas. As EVs são enriquecidas em componentes citoplasmáticos, proteínas de superfície celular e fosfolipídios bioativos que são derivados da membrana plasmática de suas células parentais, tais como P-selectina, Integrina beta-1, Anexinas de proteína de adesão celular vascular, proteína 101 do gene de susceptibilidade a tumor e proteína 1 de ligação a Hsp70, e são caracterizadas como CD9+, CD29+, CD63+, CD73+, CD81+, CD90+, CD31-, CD34- e CD45-. As EVs derivadas de células-tronco/células progenitoras/células-tronco mesenquimais também são enriquecidas com miRNAs endógenos, tais como miR-16-5p, miR-23a-5p, miR- 125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let- 7b-5p (Tabela 3) e podem ser projetadas/produzidas com miRNAs adicionais que são normalmente subexpressos ou não presentes nas células-mãe (Tabela 4). Utilizou-se essas EVs para construir um complexo EV-miRNA celular (EVmiRTM) que carrega uma variedade de miRNAs, incluindo a sequência de miR-885-5p superexpressa. Esse complexo pode ser adaptado para direcionar diretamente a proteína relacionada ao câncer LCP-1, que é especificamente expressa no ambiente tumoral, e bloquear processos de câncer dependentes de LCP-1, tais como crescimento tumoral e progressão metastática. De modo similar, a abordagem baseada em EVmiRTM pode ser adaptada ainda mais para direcionar oncoproteínas adicionais (consultar Tabela 1), garantindo assim que esta invenção pode direcionar e tratar uma ampla gama de tipos de câncer tanto quanto possível.

[0037] Otimização de EVs carregando-se miRNAs específicos: As EVs carregadas com miRNAs específicos (por exemplo, miR- 885-5p e outros selecionados a partir da Tabela 1) são produzidas após a superexpressão induzida das sequências-alvo. Perturbar geneticamente a expressão de miRNAs individuais ou seus transcritos direcionados promove a realocação bidirecional de miRNA do citoplasma da célula para corpos P e controla a classificação de miRNA para EVs. Empregou-se vários métodos para atingir o carregamento eficaz de EVs derivadas de células-tronco com as sequências de miRNA desejadas, que são descritas abaixo (usando aqui, mas sem limitação, miR-885-5p como exemplo).

[0038] De modo similar, os complexos de EVmiRTM proprietários podem ser carregados com antagomiRs específicos para inibir/bloquear miRNAs que são regulados positivamente em tipos de câncer específicos, no contexto de uma estratégia de inibição de miRNA terapêutico. Os antagomiRs específicos podem ser carregados como sequências inibitórias (“antagonistas”) das sequências-alvo de interesse e podem ser entregues através de EVs a fim de inibir miRNAs oncogênicos em cânceres específicos.

[0039] Método A. (Abordagem de pré- carregamento). A superexpressão de miR-885-5p pode ser realizada por superexpressão induzida na célula-mãe com o uso de: i) Transfecção das células-tronco-mãe com pré-miR-885-5p ou miR-885-5p sintético que imita o endógeno, miR-885-5p maduro; ii) hnRNPA2B1 sumoilado que pode direcionar o carregamento de miR-885-5p em EVs; iii) miR-885-5p que contém exomotivo novamente modificado geneticamente (Figura 2). Esse método pode ser aplicado ao pré-carregamento de EVs com o uso de outras sequências de miRNA específicas selecionadas a partir da Tabela 4.

[0040] Método B. (Abordagem pós-carregamento). Carregamento de miRNAs diretamente nas EVs após a geração das células- mãe. Outro método usado para produzir EVs carregadas com miRNAs específicos (tal como, mas sem limitação, miR-885-5p) é por transferência direta de miR-885-5p sintético e outros miRNAs específicos (selecionados a partir da Tabela 4) nas EVs através de inserção química e/ou eletroporação e/ou sonoporação (Figura 2).

[0041] Método C. (Indução de novo). Também determinou-se que o ligante de quimiocina CXCL7 é responsável pela indução de novo de miR-885-5p quando aplicado às células-mãe. Isso pode ser usado como um método alternativo para induzir a expressão do miR-885-5p nativo nas EVs derivadas de células-tronco (Figura 2).

[0042] Método D. (Esvaziamento/recarregamento de EVs). Esvaziamento de EVs de seus miRNAs endógenos (através de sonicação, permeabilização de saponina, etc.) e recarregamento através de incubação das EVs esvaziadas com miRNAs específicos é outro método que pode ser utilizado para produzir complexos de EVmiRTM adaptados (Figura 2).

[0043] Como exemplo, nesta invenção, mostrou-se que LCP1, CDK2, MCM5, WNT/CTNNB1, CASC7/AGO2 são alvos definitivos de miR-885-5p in vitro, em uma gama de linhagens de células cancerosas testadas (CaCo2, RKO, HT- 29, MDA-MB-231, MCF-7, SKOV3, EFO-21, LNCaP e THP- 1) e in vivo, em modelos de camundongos ortotópicos de câncer de mama e cólon. Desenvolveu-se ainda um novo sistema para entrega de miRNA aplicável para administração local e sistêmica com o uso de EVs derivadas de células- tronco. Esta invenção indica que a proteína LCP-1 é um alvo definitivo de miR- 885-5p. Estudos ômicos comparativos in vitro demonstraram que mudanças na expressão de miR-885-5p podem modular os níveis de proteína em células positivas para LCP-1. Para estabelecer uma ligação mecanística, os níveis de expressão de miR-885-5p foram alterados pela transfecção de uma variedade de linhagens de células cancerosas com inibidores e precursores de miR-885- 5p. A sequência de inibidores, anti-miR-885-5p, é um ácido nucleico de filamento simples quimicamente modificado projetado para se ligar e inibir especificamente o miRNA endógeno. O pré-miR-885-5p imita o miR-885-5p endógeno maduro. A superexpressão (com o uso de pré-miR) e a inibição (com o uso de anti-miR) de miR-885-5p foram validadas por qPCR em tempo real e Western blots quantitativos. Os dados demonstram que a superexpressão de miR-885-5p leva ao knock-down de LCP-1 endógena, enquanto a transfecção de células cancerosas com o miRNA precursor para miR-885-5p leva a um comprometimento da capacidade de migração e metástase; assim, a regulação positiva de miR-885-5p inibe a expressão de LCP-1 e altera a função celular ao inibir o crescimento de células tumorais e o potencial metastático.

[0044] A presente invenção fornece o painel de miRNAs como ensinado no presente documento, ou as EVs como ensinado no presente documento, para uso em (um método de) tratamento de câncer positivo para LCP-1 em um paciente.

[0045] Exceto quando observado, “sujeito” ou “paciente” são usados de forma intercambiável e se referem a animais, de preferência, animais de sangue quente, com mais preferência vertebrados, com mais preferência ainda mamíferos, com mais preferência ainda primatas, e inclui especificamente pacientes humanos e mamíferos não humanos e primatas. Os sujeitos preferenciais são sujeitos humanos.

[0046] O termo “mamífero” inclui qualquer animal classificado como tal, incluindo, mas sem limitação, seres humanos, animais domésticos e de fazenda, animais de zoológico, animais de competição, animais de estimação, animais de companhia e animais experimentais, tais como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters, coelhos, cães, gatos, porquinhos-da- índia, gado, vacas, ovelhas, cavalos, porcos e primatas, por exemplo, macacos e símios. Particularmente preferenciais são os sujeitos humanos, incluindo ambos os sexos e todas as categorias de idade dos mesmos.

[0047] Um aspecto relacionado fornece um método de tratamento de câncer positivo para LCP-1 em um paciente em necessidade de tal tratamento, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um painel de miRNAs como ensinado no presente documento ou EVs como ensinado neste documento ao paciente.

[0048] Um aspecto relacionado fornece o uso de um painel de miRNAs como ensinado no presente documento ou EVs como ensinado no presente documento para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer positivo para LCP-1 em um paciente.

[0049] Conforme usado no presente documento, uma frase como “um sujeito em necessidade de tratamento” inclui sujeitos que se beneficiariam do tratamento de uma determinada condição, particularmente câncer positivo para LCP-1. Tais sujeitos podem incluir, sem limitação, aqueles que foram diagnosticados com a dita condição, aqueles propensos a desenvolver a dita condição e/ou aqueles em que a dita condição deve ser evitada.

[0050] Os termos “tratar” ou “tratamento” abrangem tanto o tratamento terapêutico de uma doença ou condição já desenvolvida, tal como a terapia de um câncer positivo para LCP-1 já desenvolvido, quanto medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou diminuir as chances de incidência de uma doença indesejada, quanto prevenção de ocorrência, desenvolvimento e progressão de câncer positivo para LCP-1. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, sem limitação, o alívio de um ou mais sintomas ou um ou mais marcadores biológicos, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (ou seja, sem agravamento) da doença, atraso ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e similares. “Tratamento” também pode significar prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não receber tratamento.

[0051] O termo “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade de um composto ativo ou agente farmacêutico que inibe ou retarda em um sujeito o início de um distúrbio, conforme buscado por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme usado no presente documento, se refere a uma quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que elicita a resposta biológica ou medicinal em um sujeito que está sendo buscada por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico, que pode incluir inter alia o alívio dos sintomas da doença ou condição a ser tratada. Os métodos são conhecidos na técnica por determinar doses terapeuticamente e profilaticamente eficazes para as EVs, conforme ensinado no presente documento.

[0052] Paralelamente, desenvolveu-se um kit de diagnóstico complementar para permitir a formulação adaptada de sequências de miRNAs exógenos em complexos de EVmiRTM, dependendo do câncer específico direcionado. O painel de propriedade pode medir/quantificar os níveis de miRNA em líquido (sangue, urina, exossomos etc.) e biópsias de tecido, bem como avaliar os níveis de expressão de um conjunto de pelo menos cinco oncoproteínas, por exemplo, de um conjunto de cinco oncoproteínas (selecionadas a partir da Tabela 1 e incluindo LCP-1) que são conhecidas por serem reguladas positivamente no tipo específico de câncer direcionado. O kit de diagnóstico complementar permite a análise do perfil de miRNA das amostras dos pacientes com base em um painel de miRNAs endógenos e/ou exógenos. Se os miRNAs forem regulados negativamente, esses miRNAs poderão ser incluídos nas EVs, por exemplo, abordagem de EVmiR.

[0053] Assim, um aspecto se refere a um kit de partes que compreende meios para determinar o nível de expressão de um painel de miRNAs que compreende miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p, em uma amostra de um paciente, de preferência, um sujeito humano. Em determinadas modalidades, o kit compreende iniciadores capazes de se ligar especificamente a miR-30a-5p, miR- 30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR- 302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p. Tais kits permitem vantajosamente determinar (por exemplo, quantificar) os níveis de miRNA na amostra, permitindo, assim, a formulação adaptada das sequências de miRNA, em particular, das sequências de miRNA exógenas, nas EVs como ensinado neste documento dependendo do câncer específico direcionado.

[0054] Em determinadas modalidades, o nível de expressão de um miRNA ou painel de miRNAs pode ser determinado por reação em cadeia da polimerase em tempo real/quantitativa de transcriptase reversa (qRT-PCR), sequenciamento de RNA (por exemplo, sequenciamento de próxima geração), microarranjo de miRNA e/ou ensaios de formação de perfil de miRNA multiplex.

[0055] Em determinadas modalidades, o kit de partes compreende meios para determinar o nível de expressão de um painel de miRNAs que compreende miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let-7b-5p, miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p, em uma amostra de um paciente, de preferência, um sujeito humano. Em determinadas modalidades, o kit compreende iniciadores capazes de se ligar especificamente a miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR- 146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let-7b-5p, miR-30a-5p, miR- 30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR- 302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p.

[0056] Em determinadas modalidades, o kit de partes compreende meios para determinar o nível de expressão de um conjunto de oncoproteínas selecionadas a partir do grupo que consiste em Proteína argonaute-2, Proto-oncogene c-Akt, Anexina A3, proteína Amiloide-beta A4, Regulador de apoptose Bcl-2, fator de transcrição associado a Bcl-2, proteína 2 semelhante a Bcl-2, proteína 5 que contém repetição de IAP baculoviral, proteína 1 morfogenética óssea, candidato 7 suscetível ao câncer, ciclina-D1 específica de G1/S, antígeno CD44, caderina-2, caderina-11, quinase dependente de ciclina 2, inibidor de quinase dependente de ciclina p27, proteína alfa de ligação a CCAAT/potenciador, subunidade 2 de Citocromo c oxidase, Catenina beta-1, receptor de quimiocina C-X-C tipo 4, proteína 1 relacionada a Dickkopf, receptor de fator de crescimento epidérmico, ácido graxo sintase, proteína de grupo de alta mobilidade HMGI-C, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1, proteína 2 de ligação ao mRNA de fator de crescimento semelhante à insulina 2, fator de transcrição AP-1, proteína ativada por mitogênio quinase 4, proteína de diferenciação celular de leucemia mieloide induzida Mcl-1, fator de licenciamento de replicação de DNA MCM5, E3 ubiquitina-proteína ligase Mdm2, colagenase de 72 kDa tipo IV, Metaloproteinase-9 de matriz, Proteína associada à metástase MTA3, Mucina-13, Subunidade NF-kappa-B p105 de fator nuclear, Isoforma alfa de subunidade catalítica de Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato 3- quinase, Receptor de superfície ativador de plasminogênio de uroquinase, Membro da superfamília de ligante de fator de necrose tumoral 11, proteína 1 de ativação de Ras GTPase, Homólogo 1 rotatório, proteína homóloga 2 de Slit, proteína de dedo de zinco SNAI2, Mães contra homólogo decapentaplégico 3, proteína de dedo de zinco SNAI1, fator de transcrição SOX-2-OT, Fator de transcrição Sp1, Receptor de TGF-beta tipo 2, Fator de crescimento de transformação beta-1, Fator A de crescimento endotelial vascular e Protooncogene Wnt-1. Por exemplo, o kit de partes pode compreender meios para determinar o nível de expressão de um conjunto de cinco oncoproteínas selecionadas a partir da Tabela 1 e incluindo LCP-1.

[0057] Os termos “amostra” ou “amostra biológica”, conforme usados neste documento, incluem qualquer espécime biológico obtido a partir de um sujeito.

[0058] As amostras podem incluir biópsias, biópsias líquidas (de sangue, urina, saliva, outros fluidos corporais) e amostras de tecido, homogeneizados de tecido e similares. As amostras também podem incluir, sem limitação, lisados celulares e aspirados por agulha fina. De preferência, a amostra é uma biópsia, amostra de tecido ou aspirado com agulha fina, com mais preferência, a amostra é uma biópsia. De preferência, a amostra é facilmente obtida por métodos cirúrgicos ou por métodos minimamente invasivos, permitindo a remoção ou isolamento da dita amostra do sujeito.

[0059] Outro aspecto se refere ao uso do kit conforme definido neste documento para determinar o nível de expressão dos miRNAs (presentes no painel) em uma amostra de um paciente, de preferência, para a preparação de EVs conforme ensinado neste documento adequado para administração ao paciente. Dependendo do nível de expressão dos miRNAs, o painel de miRNAs e/ou EVs pode ser adaptado à terapia do paciente. TABELA 3. OS miRNAS ENDÓGENOS INCLUÍDOS NO EVMIR™ GENETICAMENTE MODIFICADO E SEUS GENES/PROTEÍNAS- ALVO TABELA 4. OS miRNAS EXÓGENOS SUPEREXPRESSOS NO EVMIR™ GENETICAMENTE MODIFICADO E SEUS GENES/PROTEÍNAS-ALVO

[0060] O presente pedido também fornece aspectos e modalidades, conforme estabelecido nas seguintes Declarações:

[0061] 1. Um método de tratamento de pacientes com câncer positivo para LCP-1 por meio da administração de sequências de miRNA específicas (incluindo miR-885-5p). As sequências de miRNA podem ser incorporadas em veículos de entrega que foram carregados ou superexpressam sequências de miRNAs específicas (incluindo complexos de EVmiRTM) e que foram considerados afetar proteínas relacionadas ao câncer que foram ligadas ao crescimento do câncer e metástase.

[0062] 2. O método, de acordo com a declaração 1, em que o painel de miRNAs correspondente a miR-16-5p, miR-23a-5p, miR- 125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let- 7b-5p, miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR- 194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR- 373-3p, miR-885-5p (consultar painel de miRNA, Tabela 1).

[0063] 3. O método, de acordo com a declaração 1, em que o veículo de entrega é uma vesícula extracelular (EV) ou uma microvesícula derivada de células-tronco do cordão umbilical (incluindo células Jelly de Wharton), sangue, sangue do cordão ou medula óssea e em que as células-tronco podem ser de origem mesenquimal ou origem progenitora.

[0064] 4. O método, conforme definido na declaração 3, em que EVs são produzidas a partir de células-tronco em uma faixa de tamanho estreita (de 30 a 300 nm) e são caracterizadas por proteínas intracelulares e de membrana celular específicas (incluindo P-selectina, Integrina beta-1, proteína de adesão de células vasculares 1, Anexinas, proteína de gene 101 suscetível ao tumor, proteína 1 de ligação a Hsp70, CD9, CD29, CD63, CD73, CD81, CD90) e por sequências de miRNAs endógenos específicas (consultar Tabela 2).

[0065] 5. O método, conforme definido na declaração 1, em que as EVs são carregadas com sequências de miRNA específicas direcionadas contra doenças cancerígenas (consultar Tabela 3 e Tabela 4).

[0066] 6. O método, conforme definido na declaração 2, em que as sequências de miRNA específicas são selecionadas a partir do painel que compreende miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let-7b-5p, miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p, de acordo com o tipo de câncer e o estágios da doença com base no perfil diagnóstico dos pacientes (consultar Tabela 3 e Tabela 4).

[0067] 7. O método, conforme definido na declaração 1, em que as sequências de miRNA específicas são (i) pré-carregadas nas EVs após a regulação positiva específica na célula-tronco-mãe por meio de transfecção ou indução de novo ou (ii) carregadas nas EVs já formadas por meio de transferência direta/inserção química/eletroporação (consultar Seção de Métodos).

[0068] 8. O método, conforme definido na declaração 1, em que as proteínas específicas direcionadas e que são superexpressas em células cancerosas são Proteína argonaute-2, Proto-oncogene c-Akt, Anexina A3, proteína Amiloide-beta A4, Regulador de apoptose Bcl-2, Fator de transcrição 1 associado a Bcl-2, proteína 2 semelhante a Bcl-2, proteína 5 contendo repetição de IAP baculoviral, proteína morfogenética óssea 1, candidato 7 suscetível ao câncer, ciclina-D1 específica de G1/S, antígeno CD44, Caderina-2, Caderina-11, quinase dependente de ciclina 2, inibidor de quinase dependente de ciclina p27, proteína alfa de ligação a CCAAT/potenciador, Subunidade 2 de citocromo c oxidase, Catenina beta-1, Receptor de quimiocina C-X-C tipo 4, proteína relacionada a Dickkopf 1, Receptor de fator de crescimento epidérmico, ácido graxo sintase, proteína do grupo de alta mobilidade HMGI-C, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1, proteína 2 de ligação ao mRNA de fator de crescimento semelhante à insulina, fator de transcrição AP-1, proteína ativada por mitogênio quinase quinase 4, Proteína de diferenciação de células de leucemia mieloide induzida Mcl-1, fator de licenciamento de replicação de DNA MCM5, E3 ubiquitina-proteína ligase Mdm2, colagenase de 72 kDa tipo IV, Metaloproteinase-9 de matriz, proteína associada à metástase MTA3, Mucina-13, Subunidade NF-kappa-B p105 de fator nuclear, Isoforma alfa de subunidade catalítica de fosfatidilinositol 4,5- bisfosfato 3-quinase, Receptor de superfície de ativador de plasminogênio de uroquinase, membro da superfamília 11 do ligante de fator de necrose tumoral, proteína 1 ativadora de Ras GTPase, Homólogo 1 rotatório, Proteína 2 de Slit, Proteína do dedo de zinco SNAI2, Parentais contra homólogo 3 decapentaplégico, proteína de dedo de zinco SNAI1, fator de transcrição SOX- 2-OT, fator de transcrição Sp1, receptor TGF-beta tipo 2, fator de crescimento de transformação beta-1, fator de crescimento endotelial vascular A, proto oncogene Wnt-1 (consultar Tabela 2), mas sem limitação, como miRNAs individuais têm vários alvos.

[0069] 9. O método, conforme definido na declaração 1, em que os tipos de câncer direcionados são aqueles que mostraram superexpressar LCP-1, bem como membros do painel de proteínas, conforme definido na declaração 8 e incluem tipos de câncer, tais como melanoma de pele, melanoma uveal, glioma, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer oral, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer urotelial, câncer renal, câncer de rim, câncer ósseo, câncer de próstata, câncer testicular, câncer cervical, câncer de ovário e câncer endometrial, bem como quaisquer outros tipos de câncer que superexpressam as oncoproteínas definidas na declaração 8 acima.

[0070] 10. O método, conforme definido na declaração 1, em que pacientes com câncer são selecionados para administração das EVs carregadas com miRNA por meio de um kit de diagnóstico específico projetado para selecionar o estado de fosforilação de LCP-1 positivo e/ou LCP-1, tumores miR-885-5p negativos e expressão de miR- 885-5p em biópsias de tecidos e líquidos e biofluidos, bem como uma combinação dos miRNAs e proteínas, conforme definido nas declarações 6 e 8 acima.

[0071] 11. O método, conforme definido na declaração 1, em que as EVs carregadas com miRNA são administradas em pacientes com câncer local ou sistemicamente na forma líquida ou sólida por via oral, intramuscular ou intravenosa.

[0072] 12. O método, conforme definido na declaração 1, em que as EVs carregadas com miRNA podem ser administradas profilaticamente ou terapeuticamente como a abordagem terapêutica primária ou em combinação com outras terapias (tais como quimioterapia, radioterapia e outras terapias biológicas).

[0073] 13. O método, conforme definido na declaração 1, em que as EVs carregadas com miRNA migram para os sítios de tumor (tanto primários quanto metastáticos), incluindo sítios no cérebro (cruzando a barreira hematoencefálica).

[0074] 14. O método, conforme definido na declaração 1, em que as EVs carregadas com miRNA se fundem com a membrana celular das células cancerosas e liberam os miRNAs terapêuticos no citoplasma da célula-alvo.

[0075] 15. O método, conforme definido na declaração 1, em que as vesículas extracelulares derivadas de células-tronco e/ou células-tronco mesenquimais são trocadas por/substituídas por/envolvidas em outras vesículas e materiais biológicos ou sintéticos (tais como lipossomas, colágeno, PEG e nano/micropartículas) e que são carregados com as sequências de miRNA específicas (incluindo miR-885-5p) direcionadas contra a proteína LCP-1 em tumores.

[0076] 16. Um painel de miRNAs que compreende miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495 -3p e let-7b-5p, e que compreende ainda um ou mais miRNAs selecionados a partir do grupo que consiste em miR-30a-5p, miR-30b- 5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e -5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR- 302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p.

[0077] 17. O painel, de acordo com a declaração 16, em que o painel compreende miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145- 5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let-7b-5p e miR-885- 5p.

[0078] 18. O painel, de acordo com a declaração 16 ou 17, em que o painel compreende miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR- 145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let-7b-5p, miR- 30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR- 302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p.

[0079] 19. O painel, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 18, em que o painel compreende miRNAs de ocorrência natural e miRNAs superexpressos sinteticamente, em que os miRNAs superexpressos sinteticamente são premiRs sintéticos, miRs maduros, antimiRs ou miRs induzidos de novo.

[0080] 20. O painel, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 19, em que o painel é incorporado em uma vesícula extracelular (EV) ou outra vesícula ou material biológico ou sintético, tais como lipossomas, colágeno, PEG, uma nanopartícula ou uma micropartícula.

[0081] 21. Uma vesícula extracelular (EV) carregada com o painel de miRNAs, conforme definido em qualquer uma das declarações 16 a 19, ou com ácido nucleico que codifica o painel de miRNAs, conforme definido em qualquer uma das declarações 16 a 19.

[0082] 22. As vesículas extracelulares (EVs), de acordo com a declaração 21, em que as EVs são derivadas de células-tronco provenientes do cordão umbilical, geleia de Wharton, sangue, sangue do cordão ou medula óssea, em que as células-tronco são de origem mesenquimal ou progenitora.

[0083] 23. As EVs, de acordo com a declaração 21 ou 22, em que as EVs são produzidas em uma faixa de tamanho de 10 nm a 500 nm ou 30 nm a 300 nm.

[0084] 24. As EVs, de acordo com qualquer uma das declarações 21 a 23, em que as EVs são caracterizadas por proteínas intracelulares e de membrana celular que compreendem P-selectina, Integrina beta-1, proteína de adesão celular vascular 1, Anexinas, proteína do gene 101 suscetível ao tumor, proteína de ligação a Hsp70, CD9, CD29, CD63, CD73, CD81 e CD90.

[0085] 25. As EVs, de acordo com qualquer uma das declarações 21 a 24, em que as sequências de miRNA são (i) pré-carregadas nas EVs após a regulação positiva na célula-tronco parental por meio de transfecção ou indução de novo e/ou (ii) carregadas nas EVs já formadas através de transferência direta, inserção química e/ou eletroporação.

[0086] 26. O painel, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 20, ou as EVs, de acordo com qualquer uma das declarações 21 a 25, para uso em um método de tratamento de câncer positivo para LCP-1 em um paciente.

[0087] 27. O painel para uso, de acordo com a declaração 26, ou as EVs para uso, de acordo com a declaração 26, em que um ou mais miRNAs selecionados a partir do grupo que consiste em miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373 -3p e miR-885-5p são escolhidos de acordo com o tipo de câncer e o estadiamento da doença com base no perfil diagnóstico dos pacientes.

[0088] 28. O painel para uso, de acordo com a declaração 26 ou 27, ou as EVs para uso, de acordo com a declaração 26 ou 27, em que as células cancerosas positivas para LCP-1 superexpressam qualquer uma ou mais proteínas selecionadas a partir do grupo que consiste em Proteína argonauta-2, Proto-oncogene c-Akt, Anexina A3, Proteína Amiloide-beta A4, Regulador de apoptose Bcl-2, Fator de transcrição associado a Bcl-2, Proteína semelhante a Bcl-2, proteína 5 contendo repetição de IAP baculoviral, proteína morfogenética óssea 1, candidato 7 suscetível a câncer, ciclina-D1 específica de G1/S, antígeno CD44, Caderina-2, Caderina-11, quinase dependente de ciclina 2, inibidor de quinase p27 dependente de ciclina, Proteína alfa de ligação a CCAAT/potenciador, Subunidade 2 de citocromo c oxidase, Catenina beta-1, receptor de quimiocina C-X-C tipo 4, proteína 1 relacionada a Dickkopf, receptor de fator de crescimento epidérmico, ácido graxo sintase, proteína de grupo de alta mobilidade HMGI-C, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1, fator de crescimento semelhante à insulina 2 proteína 2 de ligação ao mRNA, fator de transcrição AP-1, Proteína ativada por mitogênio quinase quinase 4, Proteína de diferenciação celular de leucemia mieloide induzida Mcl-1, Fator de licenciamento de replicação de DNA MCM5, E3 ubiquitina-proteína ligase Mdm2, colagenase de 72 kDa tipo IV, matriz metaloproteinase-9, proteína associada à metástase MTA3, Mucin-13, Subunidade NF-kappa-B p105 de fator nuclear, Isoforma alfa de subunidade catalítica de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato 3- quinase, Receptor de superfície ativador de plasminogênio de uroquinase, Membro da superfamília de ligante de fator de necrose tumoral 11, Proteína de ativação de Ras GTPase 1, Homólogo rotatório 1, Proteína homóloga de Slit 2, Proteína de dedo de zinco SNAI2, Mães contra homólogo decapentaplégico 3, Proteína de dedo de zinco SNAI1, Fator de transcrição SOX-2-OT, Fator de transcrição Sp1, Receptor de TGF-beta tipo 2, Fator de crescimento de transformação beta-1, Fator de crescimento endotelial vascular A e Protooncogene Wnt-1.

[0089] 29. O painel para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 28, ou as EVs para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 28, em que o câncer positivo para LCP-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, melanoma de pele, melanoma de úvea, glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer oral, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer urotelial, câncer renal, câncer renal, câncer ósseo, câncer de próstata, câncer testicular, câncer cervical, câncer de ovário, câncer endometrial e qualquer outro tipo de câncer que superexpressa uma ou mais oncoproteínas, conforme definido na declaração 28.

[0090] 30. O painel para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 29, ou as EVs para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 29, em que o paciente com câncer é selecionado para a administração do painel ou das EVs carregadas com miRNA por meio de um kit de diagnóstico projetado para selecionar qualquer um ou mais dos tumores positivos para LCP-1, estado de fosforilação de LCP-1, tumores negativos para miR-885-5p, expressão de miR-885-5p e expressão de uma combinação de miRNAs e proteínas, conforme definido na declaração 28, em tecidos, biópsias líquidas ou biofluidos.

[0091] 31. O painel para uso de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 30, ou as EVs para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 30, em que as EVs carregadas com miRNA são administradas em pacientes com câncer local ou sistemicamente, na forma líquida ou sólida, por via oral, intramuscular ou intravenosa.

[0092] 32. O painel para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 31, ou as EVs para uso de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 31, em que as EVs carregadas com miRNA podem ser administradas profilaticamente ou terapeuticamente como a abordagem terapêutica primária ou em combinação com outras terapias, tais como quimioterapia, radioterapia ou outras terapias biológicas.

[0093] 33. O painel para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 32, ou as EVs para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 32, em que as EVs carregadas com miRNA migram para os sítios de tumor, tais como para os sítios de tumor no cérebro.

[0094] 34. O painel para uso, de acordo com a declaração 33, ou as EVs para uso, de acordo com a declaração 33, em que os sítios de tumor são sítios de tumor primário ou metastático.

[0095] 35. O painel para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 34, ou as EVs para uso, de acordo com qualquer uma das declarações 26 a 34, em que as EVs carregadas com miRNA se fundem com a membrana celular das células cancerosas e liberam os miRNAs terapêuticos no citoplasma da célula-alvo.

[0096] 36. Um kit de partes, que compreende meios para determinar o nível de expressão de um painel de miRNAs que compreende miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p, em uma amostra de um paciente.

[0097] 37. O kit de partes, de acordo com a declaração 36, em que o kit de partes compreende meios para determinar o nível de expressão de um painel de miRNAs que compreende miR-16-5p, miR-23a- 5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR- 495-3p, let-7b-5p, miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e- 5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367- 3p, miR-373-3p e miR-885-5p, em uma amostra de um paciente.

[0098] 38. Uso de um kit de partes, conforme definido na declaração 36 ou 37, para determinar o nível de expressão dos miRNAs em uma amostra de um paciente, de preferência, para preparar EVs, conforme definido em qualquer uma das declarações 21 a 25, para administração ao paciente.

EXEMPLOS

[0099] Estudo in vitro para avaliar a resposta das células cancerosas à terapia de miRNA mediada por EV: Linhagens celulares de adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231 & MCF-7), cólon (RKO, HT-29, CACO2) e ovário (SKOV3, EFO-21), carcinoma de próstata (LNCaP) e leucemia monocítica aguda (THP-1) foram expostos a EVs contendo o miR-885-5p terapêutico exógeno (bem como o painel endógeno de miRNAs, consultar Tabela 2). A resposta ao tratamento foi avaliada por ensaios de morfologia celular, proliferação, migração, expressão gênica e apoptose (Figuras 3 e 4). Os experimentos in vitro confirmaram que as EVs derivadas de células-tronco são internalizadas pelas várias linhagens de células cancerosas e induzem um efeito biológico, conforme evidenciado por danos à membrana, redução da célula e bolhas nas células-alvo (Figura 5). Significativamente, houve evidência de que EVs induzem apoptose, inibem a proliferação celular e atenuam o crescimento tumoral e metástases de uma maneira dependente da dose/tempo. Os efeitos pró-apoptóticos e antimigração das EVs em células cancerosas foram quase completamente anulados pelo tratamento com RNase das EVs antes da introdução nas culturas de células. Uma gama de EVs com diferentes tamanhos foram testadas in vitro, bem como in vivo (Figura 6) e in silico, a fim de atingir a eficiência máxima de entrega por meio de investigação experimental e de modelagem da cinética EV dependente de tamanho e biodistribuição (análise de partículas com o uso de SEC e TRPS). A Figura 6 mostra a colocalização de EVmiRs com as células cancerosas no sítio de tumor em diferentes pontos de tempo (Figuras 6A e 6B). EVmiRs foram, portanto, capazes de visar e atacar especificamente células cancerosas in vivo.

[0100] A Figura 7 mostra na inserção à esquerda uma micrografia eletrônica de varredura de EVmiRs. A imagem ampliada mostra EVmiRs atacando a linhagem celular de MDA-MB-231. É ilustrado que EVmiRs colocalizam com as células tumorais e carregam seu conteúdo através de mecanismos de absorção de membrana.

[0101] Modelos de câncer in vivo para avaliar a resposta à terapia à base de EVmiRTM: Com esta invenção, desenvolveu-se um novo agente terapêutico à base de miRNA que tem como alvo e suprime LCP1 em tumores primários e metastáticos. Nestes estudos in vivo de mama metastática (metástase à distância de mama para cérebro) e câncer colorretal, foi possível monitorar e quantificar EVs marcadas com fluorescência em circulação e obter imagens de sua biodistribuição e incorporação em células e órgãos tanto em camundongos saudáveis quanto em camundongos com tumor. Constatou-se que os complexos EVmiRTM terapêuticos se acumulam em sítios de crescimento de tumor, tanto primários quanto metastáticos, incluindo o cérebro (isto é, as EVs são capazes de cruzar a barreira hematoencefálica). Em seguida, investigou-se o potencial terapêutico do sistema EVmiRTM em modelos de câncer animal, administrando as EVs manipuladas contendo miRNAs terapêuticos específicos (selecionados a partir da Tabela 4) em camundongos com tumor e monitorando-os em tempo real usando técnicas de imagem in vivo. A avaliação da carga tumoral por meio de imagem in vivo demonstrou uma redução no crescimento tumoral e carga metastática ao longo do tempo em camundongos tratados com EVmiRTM em comparação com camundongos não tratados. Também identificou-se o regime de dose necessário para produzir resultados terapêuticos mensuráveis e também a profundidade máxima de tecido/tumor que o complexo EVmiRTM pode atingir. Utilizando um modelo de camundongo com câncer de próstata, demonstrou-se ainda que a expressão reduzida de LCP-1 inibe a metástase, enquanto o aumento da expressão e fosforilação de LCP-1 estimula a metástase de tumores primários.

[0102] Modo de ação do agente terapêutico (construção de vias de sinalização): Técnicas de última geração, tal como proteômica, perfil de tecido e miRNA-ômicos, foram realizadas em células, EVs e tecido explantado do sítio de tumor, a fim de identificar as vias e mecanismos que permitem o efeito anticâncer de complexos EVmiRTM. Ensaios multiplex personalizados foram empregados para elucidar as vias de sinalização afetadas pelo agente terapêutico medindo a atividade de fosforilação da proteína LCP-1 em Ser5 e outros alvos relacionados. A normalização e a análise de dados com algoritmos de otimização de vias de última geração foram utilizadas para identificar o modo de ação dos complexos EVmiRTM terapêuticos. Além disso, estudos de AFM foram realizados para caracterizar as propriedades mecânicas das células cancerosas metastáticas após a regulação negativa da proteína LCP-1 por EVs contendo o miRNA miR-885-5p e demonstraram a ligação entre a plasticidade celular e o alto potencial metastático das células cancerosas.

[0103] Modelagem de resposta do tumor à terapia à base de miRNA: Também utilizou-se modelos computacionais de múltiplas escalas específicos do paciente inovadores para permitir o projeto de sistemas de administração terapêutica baseados em EVmiRTM mais eficientes, analisando e prevendo: 1) a deposição vascular de EVs derivadas de células-tronco (mesenquimais ou não); 2) a resposta do tumor à terapia de miRNA mediada por EV. Isso é parte integrante da estratégia terapêutica devido à complexidade da tarefa de desenvolver sistemas de entrega direcionados a um microambiente tumoral complexo, que na maioria das vezes dificulta sua penetração e ação terapêutica eficazes.

[0104] Aqui, descreve-se modalidades/exemplos específicos da invenção, no entanto, deve ser entendido que a invenção abrange variações e modificações que estejam dentro do escopo e da essência da invenção, conforme descrito nas reivindicações abaixo. REFERÊNCIAS 1. Lin CS, Park T, Chen ZP, Leavitt J. Human plastin genes. comparative gene structure, chromosome location, and differential expression in normal and neoplastic cells. J Biol Chem. 1993;268(4):2.781 a 2.792. 2. Lommel MJ, Trairatphisan P, Gabler K, et al. L-plastin Ser5 phosphorylation in breast cancer cells and in vitro is mediated by RSK downstream of the ERK/MAPK pathway. FASEB J. 2016;30(3):1.218 a 1.233. 3. Shinomiya H. Plastin family of actin-bundling proteins: Its functions in leukocytes, neurons, intestines, and cancer. Int J Cell Biol. 2012;2012:213.492. 4. Samstag Y, Eibert SM, Klemke M, Wabnitz GH. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. J Leukoc Biol. 2003;73(1):30 a 48. 5. Wabnitz GH, Kocher T, Lohneis P, et al. Costimulation induced phosphorylation of L-plastin facilitates surface transport of the T cell activation molecules CD69 and CD25. Eur J Immunol. 2007;37(3):649 a 662. 6. Wang J, Chen H, Brown EJ. L-plastin peptide activation of alpha(v)beta(3)-mediated adhesion requires integrin conformational change and actin filament disassembly. J Biol Chem. 2001;276(17):14.474 a 14.481. 7. Freeley M, O'Dowd F, Paul T, et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 2012;188(12):6.357 a 6.370. 8. Janji B, Giganti A, De Corte V, et al. Phosphorylation on Ser5 increases the F-actin-binding activity of L-plastin and promotes its targeting to sites of actin assembly in cells. J Cell Sci. 2006;119(Pt 9):1.947 a 1.960. 9. Wabnitz GH, Lohneis P, Kirchgessner H, et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. Eur J Immunol. 2010;40(9):2.437 a 2.449. 10. Pazdrak K, Young TW, Straub C, Stafford S, Kurosky A. Priming of eosinophils by GM-CSF is mediated by protein kinase CbetaII- phosphorylated L-plasti J Immunol. 2011;186(11):6.485 a 6.496. 11. Ishida H, Jensen KV, Woodman AG, Hyndman ME, Vogel HJ. The calcium-dependent switch helix of L-plastin regulates actin bundling. Sci Rep. 2017;7:40.662. 12. Cai X, Hagedorn CH, Cullen BR. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 2004;10(12):1.957 a 1.966. 13. Baek D, Villen J, Shin C, Camargo FD, Gygi SP, Bartel DP. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 2008;455(7209):64 a 71. 14. Gupta GP, Massague J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 2006;127(4):679 a 695. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS hsa-miR-16-5p: UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (SEQ ID NO: 1) hsa-miR-23a-5p (também conhecido como hsa-miR-23a*): GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU (SEQ ID NO: 2) hsa-miR-30a-5p (também conhecido como hsa-miR-30a): UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG (SEQ ID NO: 3) hsa-miR-30b-5p (também conhecido como hsa-miR-30b): UGUAAACAUCCUACACUCAGCU (SEQ ID NO: 4) hsa-miR-30c-5p (também conhecido como hsa-miR-30c): UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC (SEQ ID NO: 5) hsa-miR-30d-5p (também conhecido como hsa-miR-30d): UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG (SEQ ID NO: 6) hsa-miR-30e-5p (também conhecido como hsa-miR-30e): UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG (SEQ ID NO: 7) hsa-miR-125b-5p (também conhecido como hsa-miR- 125b): UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA (SEQ ID NO: 8) hsa-miR-145-5p (também conhecido como hsa-miR-145): GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU (SEQ ID NO: 9) hsa-miR-146a-3p (também conhecido como hsa-miR- 146*): CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG (SEQ ID NO: 10) hsa-miR-181c-5p (também conhecido como hsa-miR- 181c): AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU (SEQ ID NO: 11) hsa-miR-194-5p (também conhecido como hsa-miR-194): UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA (SEQ ID NO: 12) hsa-miR-218-5p (também conhecido como hsa-miR-218): UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU (SEQ ID NO: 13) hsa-miR-302a-3p (também conhecido como hsa-miR- 302a/hsa-miR-302): UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA (SEQ ID NO: 14) hsa-miR-302a-5p (também conhecido como hsa-miR- 302a*): ACUUAAACGUGGAUGUACUUGCU (SEQ ID NO: 15) hsa-miR-335-3p (também conhecido como hsa-miR-335*): UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC (SEQ ID NO: 16) hsa-miR-335-5p (também conhecido como hsa-miR-335): UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU (SEQ ID NO: 17) hsa-miR-367-3p (também conhecido como hsa-miR-367): AAUUGCACUUUAGCAAUGGUGA (SEQ ID NO: 18) hsa-miR-373-3p (também conhecido como hsa-miR-373): GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU (SEQ ID NO: 19) hsa-miR-495-3p (também conhecido como hsa-miR-495): AAACAAACAUGGUGCACUUCUU (SEQ ID NO: 20) hsa-miR-885-5p: UCCAUUACACUACCCUGCCUCU (SEQ ID NO: 21) hsa-let-7b-5p (também conhecido como hsa-let-7b): UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEQ ID NO: 22)

Claims

1. Vesícula extracelular (EV) carregada com miRNAs ou com ácido nucleico que codifica miRNAs em que a EV é caracterizada por proteínas intracelulares e de membrana celular compreendendo P-selectina, integrina beta-1, proteína de adesão celular vascular 1, anexinas, proteína do gene 101 de suscetibilidade tumoral , proteína de ligação a Hsp70, CD9, CD29, CD63, CD73, CD81 e CD90, e em que os miRNAs compreendem miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218- 5p, miR-495-3p, let-7b-5p de ocorrência natural e miR-885-5p sinteticamente superexpresso, em que o miRNA sinteticamente superexpresso é premiRs sintéticos, miRs maduros , antimiRs ou miRs induzidos de novo.

2. EV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os miRNAs compreendem, adicionalmente, um ou mais miRNAs selecionados a partir do grupo que consiste em miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR- 30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR- 335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p e miR-373-3p.

3. EV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que os miRNAs são caracterizados pelo fato de que compreendem miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let-7b-5p, miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR- 30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR- 335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p.

4. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a EV é caracterizada pelo fato de que a EV é derivada de células- tronco sujeitas a condições de estresse, em que as células tronco são provenientes do cordão umbilical, Geleia de Wharton, sangue, sangue do cordão ou medula óssea, em que as células-tronco são de origem mesenquimal ou progenitora.

5. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a EV é caracterizada pelo fato de que é produzida em uma faixa de tamanho de 10 nm a 500 nm ou 30 nm a 300 nm.

6. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que os miRNA são (i) pré-carregadas na EV após a regulação positiva na célula-tronco parental por meio de transfecção ou indução de novo, e/ou (ii) carregadas na EV já formada através de transferência direta, inserção química e/ou eletroporação.

7. Uso de EV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer positivo para LCP-1 em um paciente, em que o câncer positivo para LCP-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, melanoma de pele, melanoma uveal, glioma, câncer de cabeça e pescoço, câncer oral, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer urotelial, câncer renal, câncer de rim, câncer ósseo, câncer de próstata, câncer testicular, câncer cervical, câncer ovariano, câncer endometrial.

8. Uso de EV, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as células cancerosas positivas para LCP-1 superexpressam qualquer uma ou mais proteínas selecionadas a partir do grupo que consiste em Proteína argonauta-2, Proto-oncogene c-Akt, Anexina A3, proteína beta-amiloide A4, regulador de apoptose Bcl-2, fator de transcrição 1 associado a Bcl-2, proteína 2 semelhante a Bcl-2, proteína contendo repetição IAP de baculovírus, proteína morfogenética óssea 1, candidato a suscetibilidade ao câncer 7, ciclina-D1 específica de G1/S, antígeno CD44, caderina-2, caderina-11, quinase dependente de ciclina 2, inibidor de quinase dependente de ciclina p27, proteína alfa de ligação do potenciador CCAAT, subunidade 2 de citocromo c oxidase, Catenina beta-1, receptor de quimiocina C-X-C tipo 4, proteína 1 relacionada a Dickkopf, receptor de fator de crescimento epidérmico, ácido graxo sintase, proteína de grupo de alta mobilidade HMGI-C, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1, proteína de ligação ao mRNA 2 de fator de crescimento semelhante à insulina 2, fator de transcrição AP-1, proteína quinase quinase quinase quinase 4 ativada por mitogênio, proteína de diferenciação celular de leucemia mieloide induzida Mcl-1, fator de licenciamento de replicação de DNA MCM5, E3 ubiquitina-proteína ligase Mdm2, colagenase tipo IV de 72 kDa, metaloproteinase-9 de matriz, proteína associada à metástase MTA3, Mucin-13, fator nuclear de subunidade NF-kappa-B p105 , isoforma alfa de subunidade catalítica de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato 3-quinase, receptor de superfície de ativador de plasminogênio de uroquinase, membro da superfamília 11 de ligante de fator de necrose tumoral, proteína ativadora de Ras GTPase 1, Homólogo 1 rotatório, Proteína homóloga de Slit 2, proteína de dedo de zinco SNAI2, mães contra homólogo decapentaplégico 3, proteína de dedo de zinco SNAI1, fator de transcrição SOX-2-OT, fator de transcrição Sp1, receptor de TGF-beta tipo 2, fator de crescimento de transformação beta-1, Fator de crescimento endotelial vascular A e Proto-oncogene Wnt-1.

9. Uso de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que o câncer positivo para LCP- 1 é câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata ou câncer de ovário.

10. Uso de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que o câncer positivo para LCP- 1 é câncer de mama.

11. Kit de partes caracterizado pelo fato de que compreende primers capazes de ligar especificamente miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR- 194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p e meios para avaliar os níveis de expressão de um conjunto de pelo menos cinco oncoproteínas, incluindo proteína citosólica de linfócito 1 (LCP-1) e adicionalmente selecionadas a partir do grupo que consiste em: proteína argonauta-2, proto-oncogene c-Akt, Anexina A3, Proteína beta-amiloide A4, Regulador de apoptose Bcl-2, Fator de transcrição 1 associado a Bcl-2, proteína 2 semelhante a Bcl-2, proteína contendo repetição de IAP baculoviral 5, proteína morfogenética óssea 1, candidato de suscetibilidade ao câncer 7, ciclina-D1 específica de G1/S, antígeno CD44, Caderina-2, Caderina-11, Quinase dependente de ciclina 2, Inibidor de quinase dependente de ciclina p27, Proteína alfa de ligação ao CCAAT/potenciador, Subunidade 2 de citocromo c oxidase, Catenina beta-1, Receptor de quimiocina CXC tipo 4, proteína relacionada a Dickkopf 1, Receptor de fator de crescimento epidérmico, Ácido graxo sintase, Proteína do grupo de alta mobilidade HMGI-C, Receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 1, Proteína 2 de ligação do mRNA do fator de crescimento semelhante à insulina 2, Fator de transcrição AP-1, Proteína quinase quinase quinase quinase 4 ativada por mitogênio, Proteína de diferenciação celular de leucemia mieloide induzida Mcl-1, Fator de licenciamento de replicação de DNA MCM5, E3 ubiquitina-proteína ligase Mdm2, colagenase tipo IV de 72 kDa, Metaloproteinase-9 de matriz, Proteína associada à metástase MTA3, Mucina- 13, Subunidade p105 de NF-kappa-B de fator nuclear, Isoforma alfa de subunidade catalítica de Fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato 3-quinase, Receptor de superfície do ativador do plasminogênio uroquinase, Membro da superfamília 11 do ligante do fator de necrose tumoral, Proteína ativadora de Ras GTPase 1, homólogo 1 rotatótio, Proteína do homólogo de Slit 2, Proteína de dedo de zinco SNAI2, mães contra homólogo decapentaplégico 3, Proteína de dedo de zinco SNAI1, Fator de transcrição SOX-2-OT, Fator de transcrição Sp1, Receptor TGF- beta tipo 2, transformador de fator de crescimento beta-1, Fator de crescimento endotelial vascular A e Proto-oncogene Wnt-1, em uma amostra de um paciente.

12. Kit de partes, de acordo com a reivindicação 11, em que o kit de partes é caracterizado pelo fato de que compreende primers capazes de ligar especificamente miR-16-5p, miR-23a-5p, miR-125b-5p, miR-145-5p, miR-146a-3p, miR-181c-5p, miR-218-5p, miR-495-3p, let-7b-5p, miR-30a-5p, miR-30b-5p, miR-30c-5p, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-194-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-367-3p, miR-373-3p e miR-885-5p.

13. Kit de partes, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que um grupo de pelo menos cinco oncoproteínas é um grupo de cinco oncoproteínas.

14. Uso de um kit de partes conforme definido nas reivindicações de 11 a 13, caracterizado pelo fato de que é para determinar o nível de expressão dos miRNAs em uma amostra de um paciente, preferivelmente para o preparo de EV, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão de miRNAs na amostra é determinado por reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa em tempo real/quantitativa (qRT-PCR), sequenciamento de RNA por microarranjo (microarray) de miRNA e/ou ensaios de perfis de miRNA multiplex; no qual o sequenciamento de RNA é sequenciamento de próxima geração.

16. Uso, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma biópsia, biópsia líquida, amostras de tecido ou tecido homogeneizado, tal como em que a biópsia líquida é sangue, urina, saliva ou outro fluido corporal.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a amostra é um aspirado de agulha fina ou um lisado de células.