CN112322748A - 一种gas5基因的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种gas5基因的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112322748A
CN112322748A CN202011281377.0A CN202011281377A CN112322748A CN 112322748 A CN112322748 A CN 112322748A CN 202011281377 A CN202011281377 A CN 202011281377A CN 112322748 A CN112322748 A CN 112322748A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gas5
kit
detection
cell
quantitative pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011281377.0A
Other languages
English (en)
Inventor
林爱福
桑凌杰
石成瑜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202011281377.0A priority Critical patent/CN112322748A/zh
Publication of CN112322748A publication Critical patent/CN112322748A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种GAS5基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括GAS5基因检测引物、内参引物；所述检测引物为GAS5 F#1+GAS5 R#1、GAS5 F#2+GAS5 R#2或GAS5 F#3+GAS5 R#3中的一组或三组。本发明提供了一种GAS5核酸丰度检测的试剂盒，灵敏性好，特异性强，在科学实验中具有良好的适应性和实用性，可用于随时检测细胞生长状态和生长活力。

Description

一种GAS5基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种检测GAS5核酸表达水平的试剂盒及应用。
(二)背景技术
细胞是生物体基本的结构和功能单位，其生长状态直接影响机体一系列生理功能，包括癌症的发生和转移在内的多种生命活动都与其细胞的生长状态密切相关。
细胞的生长状态检测通常以细胞计数、CCK8试剂盒的方法进行。细胞计数法可以通过量化的手段准确地反映细胞的生长状态，但其所需的巨大的时间与人力成本也为研究人员带来了诸多不便；CCK8试剂盒较前者略显简便，但相对而言使用成本较高。优化检测方法已然成为实时监控细胞生长状态的当务之急，一种高效、便捷、准确的细胞生长状态检测手段将为研究人员进行细胞生物学研究提供强有力的支持。
分子标记是指细胞内可遗传可检测的核酸序列或蛋白质，已被广泛用于基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及疾病相关基因的诊断和分析等领域。分子标记检测兼具高灵敏度、高特异性、可量化的优点，且随着生物化学与分子生物学技术的发展，分子标记的使用也趋于平民化与简易化。因此，筛选合适的分子标记用于指示细胞的生长状态具有极高的应用前景与研究价值。
GAS5(growth arrest-special transcript 5)，是一个在多种实验中常用细胞及人体组织中广泛稳定表达的基因，其通过信号通路调控细胞的生长状态，GAS5的表达量与细胞生长状态间呈强烈的负相关。以样品RNA为模板，选择GAS5检测引物与内参引物进行RT-qPCR反应，按照2ΔΔCq计算相对丰度，该数值反映了实验细胞或组织中GAS5的转录活跃水平，即可判断细胞生长状态情况。
基于上述理论，本发明开发了一个基于GAS5分子标记的乳腺癌诊断试剂盒，只需少量病例样本，按照所提供的方法进行检测，即可对临床乳腺癌的发生及预后效果诊断提供依据。该试剂盒为乳腺癌的术前精确诊断、预后准确评估乳腺癌的转移提供了新的高灵敏，高特异性的分子检测标志，具有很高临床应用价值。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种检测GAS5基因的试剂盒及应用，该试剂盒内包含了三对GAS5表达水平检测引物，一对B2M内参引物。该试剂盒可用于所培养细胞系生长状态检测，具有高特异性，稳定性，灵敏性的特征，具有极大的潜在应用价值。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种GAS5基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括GAS5基因检测引物、内参引物，
所述检测引物为GAS5 F#1+GAS5 R#1、GAS5 F#2+GAS5 R#2或GAS5 F#3+GAS5R#3中的一组或三组：
GAS5 F#1：5’-ATGGTGGAGTCCAACTTGCC-3’(SEQ ID NO.1)；
GAS5 R#1：5’-AGGATAACAGGTCTGCCTGC-3’(SEQ ID NO.2)；
GAS5 F#2：5’-GGACAGTTGTGTCCCCAAGG-3’(SEQ ID NO.3)；
GAS5 R#2：5’-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3’(SEQ ID NO.4)；
GAS5 F#3：5’-TGAAGACAGTTCCTGTCATACCTT-3’(SEQ ID NO.5)；
GAS5 R#3：5’-GCATGCTTGCTTGTTGTGGT-3’(SEQ ID NO.6)；
内参引物B2M F：5’-AGA TGA GTA TGC CTG CCG TG-3’(SEQ ID NO.7)；B2M R：5’-TCA TCC AAT CCA AAT GCG GC-3’(SEQ ID NO.8)。
进一步，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应液，所述反应液包含PCR扩增酶，盐溶液，SYBR-dNTP，待测样品的cDNA，优选iTaqTM Universal SYBR Green Supermix(Bio-RAD)。
本发明所述试剂盒以TRIzol(Ambion)试剂盒提取目标细胞RNA，iScriptTMgDNAClear cDNA Synthesis Kit(Bio-RAD)试剂盒将RNA逆转录为cDNA，利用iTaqTM UniversalSYBR Green Supermix(Bio-RAD)试剂盒及本发明GAS5基因检测引物、内参引物，采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测。
本发明还提供所述GAS5基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测细胞生长活力中的应用，所述应用的方法为：使用Trizol(Roche)提取待测细胞样品的基因组RNA，逆转录为cDNA为模板，使用试剂盒中GAS5基因检测引物与内参引物进行RT-qPCR反应，以正常样品为对照，按照2^(ΔΔCq)计算相对丰度，若统计学显著(t检验，p<0.05)且GAS5丰度低于正常对照组，则检测样品的细胞活力高于对照组；若统计学显著(t检验，p<0.05)且GAS5丰度高于正常对照组，则检测样品的细胞活力低于对照组。
本发明所述细胞包括人胚胎肾细胞293T(即HEK293T细胞)。
本发明所述细胞可以是活体组织中细胞，通过检测活体组织中细胞的生长活力水平，基于细胞生长活力检测来辅助判断区分癌与癌旁组织。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种GAS5核酸丰度检测的试剂盒，灵敏性好，特异性强，在科学实验中具有良好的适应性和实用性，可用于随时检测细胞生长状态和生长活力。本试剂盒提供3对检测引物，相比传统只使用1对检测引物大大减少结果的随机性，更具统计学意义，结果更加准确可靠；试剂盒内的检测引物具有很高的灵敏度，仅需少量样本即可完成筛查；本试剂盒可用于细胞生长状态的监测，结果客观有效，可将细胞生长状态转化为量化指标，便于统计研究。
(四)附图说明
图1为实施例1引物熔解曲线。
图2为实施例2本试剂盒提供的引物对GAS5表达水平检测的相对丰度柱形图，1#和2#分别代表GAS5敲低细胞的平行样。
图3为实施例3中HEK293T细胞培养时间与细胞活力曲线图。
图4为实施例4中HEK293T细胞饥饿培养时间与GAS5相对丰度柱形图。
图5为实施例5中葡萄糖浓度与HEK293T细胞的GAS5相对丰度或cck-8细胞活力关系柱形图。
图6为本试剂盒提供的GAS5核酸探针对组织中细胞生长活力的检测。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、GAS5核酸转录本检测引物的选取与质量鉴定
GAS5核酸转录本RNA序列的NCBI数据库编码NR_002578.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_002578.3)。基于该序列，寻找具有合适Tm值(60左右)及低自互补的序列(20bp左右)作为检测引物，从若干条中，筛选得到三对检测引物。
三对检测引物：
GAS5 F#1：5’-ATGGTGGAGTCCAACTTGCC-3’；
GAS5 R#1：5’-AGGATAACAGGTCTGCCTGC-3’。
GAS5 F#2：5’-GGACAGTTGTGTCCCCAAGG-3’；
GAS5 R#2：5’-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3’。
GAS5 F#3：5’-TGAAGACAGTTCCTGTCATACCTT-3’；
GAS5 R#3：5’-GCATGCTTGCTTGTTGTGGT-3’。
一对内参引物B2M F：5’-AGA TGA GTA TGC CTG CCG TG-3’；B2MR：5’-TCA TCCAAT CCA AAT GCG GC-3’。
将该引物于NCBI BLAST检测验证，没有非特异的靶向基因，引物熔解曲线质检结果如图1。结果显示，本发明提供的三对GAS5检测引物均检测有效，熔解曲线呈特异性单峰，证明扩增片段单一，可以特异性、高灵敏地用于检测GAS5基因表达情况，而其他几对候选引物则效果不佳，弃去。
实施例2、本试剂盒提供的引物对GAS5表达水平检测的灵敏度验证
将野生型HEK293T细胞接种至含10％胎牛血清DMEM培养基(Gibico)，37℃，5％CO2培养至汇合度达到30％，每10ml培养液加入5ml包装了GAS5敲低质粒的慢病毒液(Genomeditech)，继续培养2d，弃去培养液，加入含10％胎牛血清DMEM培养基(Gibico)10ml和嘌呤霉素(1μg/ml)，继续培养，每隔2天更换为含10％胎牛血清DMEM培养基，获得GAS5特异敲低的HEK293T细胞株。野生型HEK293T细胞株作为对照组，GAS5特异敲低的HEK293T细胞株(记为1#及2#两株)作为GAS5敲低组。每份样品处理方法如下：每组分别取适量(约100万个)细胞，加入到盛有1ml Trizol试剂的1.5ml离心管中，充分混匀，之后依照TRIzol试剂盒(Ambion)说明提取RNA；使用NanoDrop(Thermo)按A260法将RNA定量后，取等量RNA按照iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit商品试剂盒(Bio-RAD)说明逆转录为cDNA；使用实施例1筛选的3对引物(#1～#3)及内参引物(B2M)，按照iTaqTM Universal SYBR GreenSupermix(Bio-RAD)商品试剂盒说明，对此cDNA模板进行荧光定量PCR检测，根据Cq值计算2ΔΔCq获得GAS5的RNA相对丰度，即表征GAS5基因的表达活跃水平。
荧光定量PCR的条件为：94℃预变性2min，94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环，然后计算熔解曲线。将所有样品进行GAS5表达水平检测，分别以3对检测引物的检测效果为重复，以B2M基因作为内参，统计分析后，绘制成表，结果如图2。将对照组细胞与两GAS5敲低细胞株分别对比分析，敲低细胞株中GAS5表达水平下调显著(**P<0.01)，统计误差(SD，标准差)小，检测结合符合预期。该实施例显示由本试剂盒提供的引物检测法对GAS5基因转录水平检测灵敏准确，误差小，效果好，可以用于细胞GAS5水平的准确特异性检测。
实施例3、GAS5检测指标与细胞生长活力具有显著负相关性
将实施例2中包装了GAS5敲低质粒的慢病毒液替换为GAS5过表达质粒的慢病毒液(Genomeditech)，其他同实施例2，获得GAS5过表达的HEK293T细胞株。
使用HEK293T的野生型及GAS5过表达细胞株进行细胞生长实验检测。使用血细胞计数板计数细胞。将HEK293T的野生型及GAS5过表达细胞株于96孔板中，按照每孔3000个细胞接种至含10％胎牛血清DMEM培养基(Gibico)，37℃，5％CO2培养，分别于24、48、72小时收取细胞，吸去培养液，每孔分别加入100μl检测混合液(10μl cck-8细胞生长活力检测试剂(YEASEN)及90μl DMEM培养基)，细胞培养箱静置2小时。取出后于酶标仪读取450nm波长吸光度，作为细胞活力的指标。同样条件下，以无细胞孔，加入上述100μl检测混合液作为空白对照。将各孔数值减去空白对照孔的读数，分别进行平均值及标准差，组间差异使用t-test分析，**P<0.01。结果(图3)显示，过表达GAS5的细胞株细胞活力显著下调，证明了GAS5表达水平确实与细胞生长活力具有显著负相关性，GAS5检测指标越高，细胞生长活力越低，显示出GAS5作为细胞生长状态监测指标的可行性。
实施例4、GAS5指标可以相对定量表征细胞生长活力
将HEK293T细胞均匀铺于6孔细胞培养板中，细胞培养于37℃，5％CO2，使用DMEM培养基加10％胎牛血清培养。培养12小时待细胞完全贴壁正常生长时，吸去细胞培养液，替换成不含葡萄糖及丙酮酸的DMEM培养基(Gibico)培养。对各孔细胞分别缺糖饥饿处理0、2、4、8、12、24小时。之后弃去培养液，收取细胞，按实施例2中方法，分别提取各组细胞的RNA，并使用本试剂盒提供的GAS5核酸引物(分别使用三对GAS5引物同时进行检测)及B2M内参引物进行RNA提取、逆转录-荧光定量PCR(RT-qPCR)检测，根据Cq值计算各组GAS5的相对丰度。结果(图4)显示随着细胞被饥饿的时间越长，GAS5的丰度随时间进展梯度上调，相对于0小时组都呈现统计学显著差异(t-test分析，**P<0.01，***P<0.001)。该结果与细胞缺糖饥饿培养后的细胞生长活力状态随时间进展逐渐变差的事实吻合，呈现出GAS5检测指标与细胞生长活力的显著负相关性，显示出了本细胞活力检测试剂盒良好的检测灵敏度，不仅可定性判断细胞生长活力，还可以相对定量检测细胞生长活力的相对程度。
实施例5、本试剂盒与cck-8试剂盒检测细胞生长活力结果对比
使用HEK293T的野生型细胞株进行细胞生长实验检测。细胞培养于37℃，5％CO2，使用DMEM培养基加10％胎牛血清培养。使用血细胞计数板计数细胞，并在96孔板中接种每孔3000个细胞。培养12小时待细胞完全贴壁正常生长时，吸去细胞培养液，替换成不含葡萄糖及丙酮酸的DMEM培养基(Gibico)，同时再加入终浓度0、5、12.5、25mM的葡萄糖培养12小时。之后弃去培养液，一组细胞按实施例2分别提取各孔细胞的RNA，并使用本试剂盒提供的GAS5核酸引物(分别使用三对GAS5引物反应，同时检测)及B2M内参引物进行RNA提取、逆转录-荧光定量PCR(RT-qPCR)检测，根据Cq值计算各组GAS5的相对表达量，另一组细胞按实施例3中的cck-8使用方法测定吸光度后归一化处理。结果(图5)显示GAS5相对表达量所指示的细胞生长活力，和用cck-8试剂盒法测定结果相同。
实施例6、本试剂盒提供的GAS5核酸引物对组织中细胞生长活力的检测
收集中山大学肿瘤防治中心(SYSUCC)的乳腺癌临床组织样本48例，样本收集均征得患者的知情同意。每份样品处理方法如下：分别剪取适量肿瘤组织中癌细胞部分与癌旁正常组织部分，分别置于研钵中，加入适量液氮迅速冰冻组织块，再研成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg粉末加入到盛有1ml Trizol试剂的1.5ml离心管中，充分混匀，之后依照实施例2中所述方法，使用实施例1筛选的三对引物(1#～3#)及内参引物(B2M)，分别对各样本进行RT-qPCR检测，根据Cq值获得GAS5的RNA的含量，即GAS5表达水平。
统计分析结果如图6。癌组织因其恶性增殖特性，通常相比癌旁正常组织具有更强的细胞生长活力。将癌旁组织GAS5的RNA丰度与癌组织对比分析，结果显示癌细胞中GAS5是显著下调的，且二者差异显著(t-test，**P<0.01)，这与癌组织的细胞活力更强的事实吻合，进一步证明了本试剂盒检测的准确性和广泛适用性。该实施例显示由本试剂盒提供的GAS5指标检测法不仅可以检测体外培养的细胞的生长活力，还可以检测活体组织中细胞的生长活力水平，且可以基于细胞生长活力检测来辅助判断区分癌与癌旁组织，适用性广泛。
应当注意的是，以上实验列举的仅仅是本发明的若干具体实例，显然，本发明还有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种GAS5基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atggtggagt ccaacttgcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
aggataacag gtctgcctgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ggacagttgt gtccccaagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
caagccgact ctccatacct 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
tgaagacagt tcctgtcata cctt 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
gcatgcttgc ttgttgtggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
agatgagtat gcctgccgtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
tcatccaatc caaatgcggc 20

Claims (6)

1.一种GAS5基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括GAS5基因检测引物、内参引物，
所述检测引物为GAS5 F#1+GAS5 R#1、GAS5 F#2+GAS5 R#2或GAS5 F#3+GAS5 R#3中的一组或三组：
GAS5 F#1：5’-ATGGTGGAGTCCAACTTGCC-3’；
GAS5 R#1：5’-AGGATAACAGGTCTGCCTGC-3’；
GAS5 F#2：5’-GGACAGTTGTGTCCCCAAGG-3’；
GAS5 R#2：5’-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3’；
GAS5 F#3：5’-TGAAGACAGTTCCTGTCATACCTT-3’；
GAS5 R#3：5’-GCATGCTTGCTTGTTGTGGT-3’；
内参引物B2M F：5’-AGA TGA GTA TGC CTG CCG TG-3’；B2M R：5’-TCA TCC AAT CCAAAT GCG GC-3’。
2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应液。
3.如权利要求2所述试剂盒，其特征在于所述反应液包含PCR扩增酶，盐溶液，SYBR-dNTP，待测样品的cDNA。
4.一种权利要求1所述GAS5基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测细胞生长活力中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以待测细胞样品的基因组cDNA为模板，在GAS5基因检测引物或内参引物的作用下，进行RT-qPCR反应，以正常样品为对照组，按照2^(ΔΔCq)计算相对丰度，若统计学显著，p<0.05且GAS5丰度低于正常对照组，则待测细胞样品的细胞活力高于对照组；若统计学显著，p<0.05且GAS5丰度高于正常对照组，则待测细胞样品的细胞活力低于对照组。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述待测细胞包括人胚胎肾细胞293T。
CN202011281377.0A 2020-11-16 2020-11-16 一种gas5基因的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用 Pending CN112322748A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011281377.0A CN112322748A (zh) 2020-11-16 2020-11-16 一种gas5基因的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011281377.0A CN112322748A (zh) 2020-11-16 2020-11-16 一种gas5基因的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112322748A true CN112322748A (zh) 2021-02-05

Family

ID=74317828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011281377.0A Pending CN112322748A (zh) 2020-11-16 2020-11-16 一种gas5基因的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112322748A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015781A (zh) * 2021-12-14 2022-02-08 浙江大学 一种LncRIM基因的检测试剂盒及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002182A (zh) * 2014-11-18 2015-10-28 南京医科大学眼科医院 LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用
US20160279110A1 (en) * 2015-03-26 2016-09-29 University Of Rochester Compositions and methods for treating cancer
US20170321277A1 (en) * 2014-12-01 2017-11-09 University Of South Florida Methods and compositions for diagnosis and management of diabetes and metabolic syndrome
CN107974500A (zh) * 2018-01-22 2018-05-01 常熟市第二人民医院 lncRNAGAS5作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用
CN110656176A (zh) * 2019-09-27 2020-01-07 浙江大学 一种pnck基因的pcr检测试剂盒及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105002182A (zh) * 2014-11-18 2015-10-28 南京医科大学眼科医院 LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用
US20170321277A1 (en) * 2014-12-01 2017-11-09 University Of South Florida Methods and compositions for diagnosis and management of diabetes and metabolic syndrome
US20160279110A1 (en) * 2015-03-26 2016-09-29 University Of Rochester Compositions and methods for treating cancer
CN107974500A (zh) * 2018-01-22 2018-05-01 常熟市第二人民医院 lncRNAGAS5作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用
CN110656176A (zh) * 2019-09-27 2020-01-07 浙江大学 一种pnck基因的pcr检测试剂盒及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANGPING LI ET AL.: ""Long non-coding RNA growth arrest-specific 5 (GAS5) acts as a tumor suppressor by promoting autophagy in breast cancer"", 《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》 *
Y LI ET AL.: ""LncRNA GAS5 affects epithelial-mesenchymal transition and invasion of breast cancer cells by regulating miR-216b"", 《EUROPEAN REVIEW FOR MEDICAL AND PHARMACOLOGICAL SCIENCES》 *
殷飞等: ""长链非编码 RNA GAS5 在乳腺癌组织中的表达水平及临床意义"", 《中国妇幼保健》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015781A (zh) * 2021-12-14 2022-02-08 浙江大学 一种LncRIM基因的检测试剂盒及其应用
CN114015781B (zh) * 2021-12-14 2024-01-05 浙江大学 一种LncRIM基因的检测试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014003053A1 (ja) 膵臓がんの検出方法及び検出用キット
CN101855348A (zh) 肝癌相关基因、以及肝癌风险的判定方法
CN112322748A (zh) 一种gas5基因的实时荧光定量pcr检测试剂盒及应用
CN110734979B (zh) Oc-stamp在作为评估多发性骨髓瘤患者预后风险标记物中的应用
CN110305953B (zh) 检测miRNA表达量的系统在制备区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎产品中的应用
CN111607658A (zh) 用于人类真菌感染检测的引物探针系统、试剂盒及检测方法
US9528161B2 (en) Materials and methods for quality-controlled two-color RT-QPCR diagnostic testing of formalin fixed embedded and/or fresh-frozen samples
RU2451937C2 (ru) Способ диагностики рака молочной железы по уровню рнк интерлейкинов il-8 и/или il-18 в плазме крови
CN103725787B (zh) 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒
CN110820051B (zh) 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用
CN113832232A (zh) 用于预测肺腺癌对含铂双药化疗反应性的生物标志物其及相关产品
CN109182514B (zh) 肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658和试剂盒及其应用
CN106755330A (zh) 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用
CN114164272B (zh) 一种brea2基因检测试剂盒及其应用
KR20130054492A (ko) 산모 혈액 내 세포 유리 태아 핵산 검출 방법
CN114015781B (zh) 一种LncRIM基因的检测试剂盒及其应用
CN114908171B (zh) 人HHIPL2 mRNA在非小细胞肺癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒
CN103740835B (zh) 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒
RU2806591C2 (ru) Способ диагностики острых лейкозов и наборы для его выполнения
CN117305452B (zh) 人SNRK mRNA在非小细胞肺癌诊断、靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒
RU2688189C1 (ru) Панель последовательностей олигонуклеотидов для определения мутации Q61R гена NRAS в опухолевых образованиях щитовидной железы
RU2819044C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя моракселлеза KPC (Moraxella bovis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
KR102131519B1 (ko) 간암 전이 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도
CN114134231B (zh) 一种基于ecDNA的脑胶质瘤基因标志物及其应用
KR102256747B1 (ko) 엑소좀 miR-125b를 포함하는 간암 전이 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210205

RJ01 Rejection of invention patent application after publication