CN107974500A - lncRNAGAS5作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及lncRNA GAS5作为早期年龄相关黄斑变性（age‑related macular degeneration，AMD）诊断标志物中的应用。通过基因芯片检测早期AMD患者及对照组患者之间lncRNAs的表达差异，从所有差异表达的lncRNAs中选取生长停滞特异性转录本5（the growth arrest specific 5，GAS5）进行进一步验证，扩大临床样本量，通过荧光定量PCR的方法进行循环lncRNA的表达，比较差异lncRNA在AMD患者及对照组中的含量，验证其作为诊断标志物的可行性。ROC曲线分析显示：GAS5的曲线下面积（AUC）为89.6%，这说明GAS5可以作为早期年龄相关黄斑变性诊断标志物。

Description

lncRNAGAS5作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及医学的临床诊断技术领域，具体地说，是lncRNA作为早期年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是常见的眼部疾病，是老年人失明的主要原因。目前临床上主要采取抗血管内皮生长因子(VEGF)或抗血管生成剂治疗新生血管性AMD，但这些治疗复发率高，且有导致中风可能等严重的副作用。此外，拮抗剂已显示在部分AMD患者中无效。因此，早期干预AMD，使之停留在疾病早期能使患者视功能预后显著提高。然而，除了眼部检查外，目前尚缺乏早期AMD的特异性生物标记物，因此需通过进一步研究探寻潜在的相关标记物，用于临床早期AMD的诊断和治疗。

随着近年来科技的不断进步，基因测序让研究者们发现越来越多的非编码RNA(ncRNA)，并且随着研究的深入，发现其在生物中具有重要功能。非编码RNA依据长度可分为短链非编码RNA和长链非编码RNA(lncRNA)。ncRNA中收到广泛关注的包括lncRNA 和微小核苷核酸(microribonucleicacids，miRNAs)。长链非编码RNA一般与细胞的分化和复杂有机体的发育有关。非编码RNA广泛存在于生物体中，是一类不编码蛋白质但具有功能的 RNA分子，其在生物体的生命活动中起着重要的的调控作用，可通过参与转录调控、RNA 的剪切和修饰、mRNA的稳定和翻译、蛋白质的稳定和转运、染色体的形成和结构稳定、细胞的发育等方面来调控生物体的胚胎发育、组织分化、器官形成等基本的生命活动，并参与某些疾病(如肿瘤、神经性疾病、牛皮癣等)的致病机制过程。此外，lncRNA可以作为诊断标记物在诸多疾病中发挥作用。已有研究表明其参与AMD的发生发展，因其作为一个生物学标志物，是可以衡量的客观指标，并可被有效测量，故在AMD的诊断、治疗及预后等方面具有良好的应用前景。

发明内容

发明目的：针对现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种早期年龄相关黄斑变性诊断的标志物。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物在制备检测早期年龄相关黄斑变性早期诊断试剂或试剂盒方面的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种年龄相关黄斑变性早期诊断试剂盒。

技术方案：为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，所述标志物为循环lncRNA标志物，所述循环lncRNA标志物为GAS5。

其中，上述GAS5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，上述年龄相关黄斑变性为早期老年黄斑变性。

本发明所述的年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物在制备检测早期年龄相关黄斑变性早期诊断试剂或试剂盒方面的应用。

其中，上述检测为血浆检测。

其中，上述诊断试剂或试剂盒包括：对GAS5具有检测特异性的探针、基因芯片或PCR 引物。

其中，上述年龄相关黄斑变性为早期干性老年黄斑变性。

本发明内容还包括一种年龄相关黄斑变性早期诊断试剂盒，其包括所述的标志物。

其中，上述试剂盒还包括PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

有益效果：相对于现有技术，本发明的优点在于：本发明通过lncRNA表达芯片检测早期AMD患者及对照组之间lncRNA的表达差异，从所有差异表达的lncRNA中选取3个进行验证，然后扩大样本，通过荧光定量PCR的方法进行特异lncRNA的表达，比较差异lncRNA 在AMD患者及对照组中的含量，最终验证得出GAS5作为诊断标志物的可行性。通过ROC 曲线分析显示：GAS5的AUC为89.6％，这说明GAS5可以作为早期年龄相关黄斑变性诊断标志物。

附图说明

图1为干性AMD的眼底照，OCT及FFA结果；

图2为差异lncRNAs表达聚类分析，图2A为所有差异lncRNAs的聚类分析结果，图2B为图2A的局部放大图，其中显示了GAS5表达在聚类分析中具有显著性差异。

图3为AMD患者及对照组血浆中AC064875.2，GAS5及SLC26A4-AS1表达含量；

图4为GAS5作为早期AMD诊断中的ROC曲线分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1早期AMD患者lncRNA表达谱芯片及表达验证分析

第一部分 表达谱芯片分析

一、材料与方法

本研究的数据来源于Gene Expression Omnibus(GEO)公共在线数据库,其网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GEO accession为GSE50195，此数据共有17个样本，其中有7个对照样本，9个早期AMD样本。

二、数据分析

1、差异lncRNA筛选

首先结合GSE50195数据的芯片平台(GPL17629)，为下载的数据加上基因标记(gene symbol)及蛋白质分类(ProteinClasses)信息。然后应用生物信息学中常规软件R软件中limma包来筛选7个正常健康对照样本和9个早期AMD样本的差异基因，以7个对照的样本为对照组。筛选差异基因的条件为：pValue<0.01，|logFC|>0.5。得到差异基因热图(heatmap) 如图2所示。

我们总共得到266个差异lncRNA，其中上调基因94个，下调基因172个，。表1是差异lncRNA的前十个。而对lncRNA的分析显示，共发现共计64个lncRNAs表达在二组之间有显著差异性，其中36个升高，28个降低，GAS5为其中之一(聚类分析结果见图 2)，在早期AMD样本组织中显著降低。

表1差异lncRNAs表达(01.diff/diffSig.xls)

第二部分 差异循环lncRNAs的验证研究

一、材料与方法

1、研究对象

所有的研究对象均来自2015年1月～2015年12月于常熟市第二人民医院眼科就诊的患者，均签署知情同意书。

1.1临床样本选择

1.1.1实验组

纳入标准：通过眼底照相(funds photography,FP)，光学相干断层扫描(opticalcoherence tomography,OCT)，荧光血管造影((fluorescein fundus angiography,FFA)检查，结合视力改变，诊断为早期AMD的患者。早期AMD入选标准如下：

(1)视力无显著影响，所有患者中心视力均>0.4。

(2)眼底表现：可见黄斑区色素紊乱，中心凹反光不清，有散在的玻璃疣。

(3)OCT：可见小丘状中强反射隆起的病灶，伴有或不伴有RPE反射带和视网膜内外节发射带异常。

(4)眼底荧光血管造影：呈现透见荧光时，表现视网膜色素上皮萎缩，色素沉着处可有遮蔽荧光，有花边状或网状新生血管。

图1为干性AMD的眼底照(A)，OCT(B)及FFA(C)结果。

排除标准：

(1)未签署知情同意书；

(2)高度近视，近期活动性结膜炎，角膜炎，葡萄膜炎；

(3)患有黄斑裂孔，黄斑水肿，视网膜血管阻塞，中心性浆液性脉络膜视网膜病变等眼底疾病；

(4)合并感染，高血压，糖尿病，肿瘤，阿兹海默病，脑卒中，自身免疫系统疾病等器质性疾病；

(5)其他原因的无法完成相关检查和研究的。

1.1.2对照组

纳入标准：

(1)签署知情同意书；

(2)通过眼底照相(fundus photography，FP)，光学相干断层扫描(opticalcoherence tomography，OCT)，荧光血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)检查，排除年龄相关性黄斑变性的门诊病人。

(3)与实验组病人年龄、性别匹配。

排除标准：

(1)未签署知情同意书；

(2)高度近视，近期活动性结膜炎，角膜炎，葡萄膜炎；

(3)患有黄斑裂孔，黄斑水肿，视网膜血管阻塞，中心性浆液性脉络膜视网膜病变等眼底疾病；

(4)合并感染，高血压，糖尿病，肿瘤，阿兹海默病，脑卒中，自身免疫系统疾病等器质性疾病；

(5)其他原因的无法完成相关检查和研究的。

1.2纳入对象一般情况

在扩大样本的对照研究中，共125位参与者(65例实验组及60例对照组样本)纳入了研究。实验组中65例，共计72只眼患有早期AMD，对照组共60人，均为健康志愿者。二组之间年龄及性别无统计学差异(P>0.05)。

表8

	实验组	对照组	P
				N	65	60
眼(人)	72(65)	60
				男/女	38/27	36/24	0.503
年龄	56.5±9.8	53.7±8.6	0.09

2、主要实验设备与试剂

表9

3、研究方法

3.1标本采集，存储及运输

研究对象抽取全血2ml，置于5ml EDTA抗凝真空管内保存，混匀，防止凝血。将样本分装，400～500μl/管，放入-80℃冰箱。

3.2RNA分离和鉴定

3.2.1引物的合成与设计：所有引物均使用Primer5.0软件设计，根据一般引物设计的原则选择自己所需要的引物对。然后将所选择的引物进行同源性比较分析 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，为每一个基因选择特异的引物对，我们选择了差异最显著的3个lncRNAs进行了进一步验证，即GAS5、AC064875.2及SLC26A4-AS1这3个 lncRNAs。

本研究中GAS5的特异性引物序列为：

forward 5’-TCGGCTTGACTACACTGTGT-3’,

reverse 5’-GGAGGCTGAGGATCACTTGA-3’，

AC064875.2的特异性引物序列为：

forward 5’-GGCTCCTTCCAGCAATGAC-3’，

reverse 5’-CGCATTTCTGCTGTTGCACT-3’，

SLC26A4-AS1的特异性引物序列为：

forward 5’-GGAGGAGCTGGAGCTATCCT-3’，

reverse 5’-CCATTTTGTTCTGCCCCAGC-3’。

上述引物序列由美国Invitrogen公司合成。

3.2.2PCR反应：使用血液总RNA纯化试剂盒(Reagent,Invitrogen 15596)按照说明书步骤提取血浆中总RNA，260/280nm吸光度下测定RNA，均在1.8～2.0之间。使用PrimeScript RT Reagent Kit，Takara，RR047A完成反转录获得cDNA模板，使用荧光定量PCR试剂盒(Premix Ex TagTMⅡ，Takara:RR820A)在7500fast实时荧光定量聚合酶链反应机(美国Applied Biosystems公司)中，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参照分别使用 GAS5、AC064875.2以及SLC26A4-AS1的特异性引物序列分别构建20μl的反应体系进行PCR 反应。GAS5、AC064875.2以及SLC26A4-AS1三者的PCR反应体系和反应条件如下：

(1)反转录获得cDNA模板，使用试剂盒为PrimeScript反转试剂盒，货号：PrimeScript RT Reagent Kit，Takara，RR047A：

1)总RNA的提取：使用血液总RNA纯化试剂盒(Reagent，Invitrogen15596)按照说明书步骤提取血浆中总RNA，260/280nm吸光度下测定RNA，均在1.8～2.0之间；

2)清除基因组DNA(10μl体系)：

在PCR仪中42℃运行2min，将产物放在冰上；

3)反转录反应体系(20μl体系)：

反应条件：37℃，5min：85℃，5s；4℃保存，反应所得为cDNA模板。

(2)荧光定量PCR反应体系(20μl体系)

反应试剂盒购自Takara公司，货号：Premix Ex TagTMⅡ，Takara:RR820A

SYBR(2×)10μl

PCR forward Primer(10μM)0.4μl

PCR reverse Primer(10μM)0.4μl

无菌水7.2μl

cDNA模板2μl；

该PCR forward Primer、PCR reverse Primer分别对应于GAS5、AC064875.2以及SLC26A4-AS1的特异性引物。

PCR条件：在50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min条件下循环45次。所有引物均购自美国Invitrogen公司。

4.统计学处理

根据实验设计分别采取两独立样本t检验(Independent sample t test)进行统计学分析，逐对平均数差异检验(LSD)以及q检验法进行组间差异比较，利用SPSS19.0软件进行上述统计学分析，图中数据为平均值±标准差(mean±SD)，接受者操作特性曲线(Receiver Operating Characteristic，ROC)用于特异度及敏感度的分析，P<0.05被认为具有统计学意义。每组实验重复三次，取平均值进行计算处理。

5.结果

5.1差异循环lncRNAs在AMD患者及对照组的表达

选取65例早期AMD患者及60例对照组，在所有的表达芯片筛选出的差异表达lncRNA 中，考虑到差异性最大的lncRNAs具有潜在最大的作用机制，也具有可能的生物标记物潜力，本研究中我们选择了差异最显著的3个lncRNAs进行了进一步验证，即GAS5、AC064875.2 及SLC26A4-AS1这3个lncRNAs。

通过上述3.2中的实时荧光定量PCR反应，我们发现与对照组相比GAS5的表达显著降低，而AC064875.2及SLC26A4-AS1无显著性差异。(图3)。

5.2GAS5为早期AMD分子标志物的检验效能分析

我们进一步通过ROC分析了差异表达的lncRNA作为早期AMD诊断标志物的可能性。经过ROC曲线分析，我们发现，GAS5可以作为早期AMD的诊断标志物。结果显示GAS5 的ROC曲线下面积(areas under curve，AUC)为89.6％。当GAS5含量≥11.2，敏感度为81.2％，特异度为90.3％(图4)。

6.讨论

lncRNA表达谱芯片研究中，对早期AMD患者及对照组视网膜及脉络膜组织的差异研究发现，以差异变化幅度≥2倍以上者作为标准发现，共检测得到266个差异基因，上调基因94 个，下调基因172个，这提示早期AMD患者中lncRNA的含量在疾病的发生发展中产生了一定的变化。为进行进一步研究，我们拟扩大样本量，通过RT-PCR的方法对纳入样本的血浆进行分析，对芯片检测结果进行验证。本研究中，差异性最显著的为GAS5、AC064875.2 及SLC26A4-AS1，通过荧光定量PCR的方法进行循环lncRNA的表达，比较差异所选择的lncRNAs在AMD患者及对照组中的含量，验证其作为诊断标志物的可行性。分析结果显示，仅有GAS5与芯片结果一致，而其他两个lncRNAs含量在二组之间未见显著差异。这可能与芯片及RT-PCR的检测原理具有差异性有关，也与两个研究所选择的样本具有差异有关。通过进一步的研究GAS5在扩大样本研究中的表达的ROC曲线分析结果显示：GAS5的AUC (曲线下面积，反映的是诊断效能)为89.6％，这说明GAS5可以作为早期年龄相关黄斑变性诊断标志物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 常熟市第二人民医院

<120> lncRNA GAS5作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 656

<212> DNA

<213> 生长停滞特异性转录本5(the growth arrest specific 5)

<400> 1

ggggctttcg aggtaggagt cgactcctgt gaggtatggt gctgggtgcg gatgcagtgt 60

ggctctggat agcaccttat ggacagttgt gtccccaagg aaggatgaga atagctactg 120

aagtcctaaa gagcaagcct aactcaagcc attggcacac aggcattaga cagaaagctg 180

gaagttgaaa tggtggagtc caacttgcct ggaccagctt aatggttctg ctcctggtaa 240

cgtttttatc catggatgac ttgcttgggt aaggacatga agacagttcc tgtcatacct 300

tttaaaggta tggagagtcg gcttgactac actgtgtgga gcaagtttta aagaagcaaa 360

ggactcagaa ttcatgattg aagaaatgca ggcagacctg ttatcctaaa ctagggtttt 420

taatgaccac aacaagcaag catgcagctt actgcttgaa agggtcttgc ctcacccaag 480

ctagagtgca gtggcctttg aagcttacta cagcctcaaa cttctgggct caagtgatcc 540

tcagcctccc agtggtcttt gtagactgcc tgatggagtc tcatggcaca agaagattaa 600

aacagtgtct ccaattttaa taaatttttg caatccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 656

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> GAS5的特异性上游引物(Artificial Sequence)

<400> 2

tcggcttgac tacactgtgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> GAS5的特异性下游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaggctgag gatcacttga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> AC064875.2的特异性上游引物(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctccttcc agcaatgac 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> AC064875.2的特异性下游引物(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcatttctg ctgttgcact 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> SLC26A4-AS1的特异性上游引物(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaggagctg gagctatcct 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> SLC26A4-AS1的特异性下游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

ccattttgtt ctgccccagc 20

Claims (9)

1.一种年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，其特征在于，所述标志物为循环lncRNA标志物，所述循环lncRNA标志物为GAS5。

2.根据权利要求1所述的年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，其特征在于，所述GAS5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，其特征在于，所述年龄相关黄斑变性为早期老年黄斑变性。

4.权利要求1所述的年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物在制备检测早期年龄相关黄斑变性早期诊断试剂或试剂盒方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测为血浆检测。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒包括：对GAS5具有检测特异性的探针、基因芯片或PCR引物。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述年龄相关黄斑变性为早期干性老年黄斑变性。

8.一种年龄相关黄斑变性早期诊断试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的标志物。

9.根据权利要求8所示的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。