CN106906288A - 检测白血病cdx2基因表达水平的引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测CDX2基因相对表达量的引物、探针和检测方法,其中扩增覆盖CDX2基因的上下游引物和探针分别是CDX2‑F、CDX2‑R、CDX2‑Probe,检测内参基因Abl用上下游引物和探针分别是Abl‑F、Abl‑R、Abl‑Probe。所述检测试剂和方法具有精度高,结果便于判读。且特异性好,灵敏度高,操作简便。有助于临床上白血病的早期诊断及微小残留病灶(MRD)的监测,对于及时干预治疗、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种临床检验用途的基因检测方法和分子检测引物,采用探针实时荧光定量PCR技术,能够对人类白血病中的CDX2表达水平进行检测,可有效的节约检测时间,提高检测精度。
背景技术
白血病是一类造血干细胞发育异常的恶性克隆性疾病,随着我国经济的发展,环境污染的加剧及生活方式的改变,白血病的发生率呈现升高的趋势,尤其是在35岁以下中青年人群及儿童中白血病的发病率和死亡率居高不下。白血病的预后一般较差,没有较好的预防和控制措施,病死率高。目前认为,白血病微小残留病灶(minimal residualdisease,MRD)是白血病复发及治疗失败的根本原因。MRD作为独立的预后因素,不仅对评价化疗的疗效、监测白血病复发的意义重大,在指导危险分层后的个体化治疗中亦发挥重要作用。
尾侧型同源盒基因CDX2(caudal-related homeodomin transcription factor2,CDX2)基因是CDX基因家族的一员,作为一种原癌基因,CDX2全长共22kb,定位于13号染色体q12.13,由2个内含子和3个外显子构成,其下游表达的CDX2蛋白通过螺旋环螺旋形式与相应的DNA区域结合,共含有311个单个氨基酸,作为转录因子来调控DNA的表达。正常情况下,CDX2在胎儿期广泛表达,在整个成人期则仅在肠道腺上皮中表达。研究证实CDX2的异常表达与肠化生Barrett食管及胃癌的发生、发展及预后有关,并具有抑制结肠肿瘤的作用。CDX2并不局限于在消化道表达,在泌尿生殖、妇科、头颈部等也显示不同程度的表达。近年来的研究发现CDX2基因参与了干细胞自我更新和白血病转化,通过影响HOX基因表达调控促成白血病的发生,是与白血病发生、发展密切相关的致白血病基因,在大多数的AML、ALL患者中CDX2有不同程度的异常表达。
在实际应用中,用于检测CDX2表达的方法主要为免疫组化,尽管该法原理简单,但是试验过程过于繁琐,需要的试剂种类繁多,且试验结果需要经验丰富的专家来判读,判读结果存在较大的主观性,一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题,才促使我们探索新的方法来检测CDX2表达水平。
实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测,反应CDX2在组织中的初始含量,试验节约了大量的检测时间,还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR Green I染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料,特异性不如双探针杂交法以及Taqman法,必须通过观察溶解曲线来判断其特异性;而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于CDX2基因检测。
发明内容
本发明设计了利用内参/目的基因用引物、探针序列,用荧光定量PCR技术检测CDX2基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例,优化PCR的反应体系和反应条件,并以正常人的CDX2表达量作为参照,开发了一种新型的CDX2基因表达水平检测方法。用于白血病辅助诊断及MRD监测的检验方法,主要包括红细胞裂解液;TRIzol;氯仿;异丙醇;无水乙醇;QIAGEN RNeasy FFPE Kit。
本发明提供了一种检测CDX2基因相对表达量的引物和探针,包括:扩增覆盖CDX2基因的上下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe,检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe;其碱基序列为:
CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT
CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA
CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA
Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
本发明还提供了一种检测CDX2基因相对表达量的方法,其包括如下步骤:
(1)提取血液中的总RNA;
(2)将RNA反转为cDNA;
(3)利用CDX2基因扩增的上下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe,检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe对步骤(2)中的cDNA分别进行扩增;
其中检测CDX2基因的引物和探针,分别为:
CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT
CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA
CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA
检测Abl内参基因的引物和探针,分别为:
Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
进一步的,还包括阳性对照品的扩增和阴性对照品的扩增。
本发明还提供一种检测CDX2基因相对表达量的试剂盒,包括PCR反应液,其特征在于,所述PCR反应液包括CDX2基因扩增的上、下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe,检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe;
其中检测CDX2基因的引物和探针,分别为:
CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT
CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA
CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA
检测Abl内参基因的引物和探针,分别为:
Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
进一步的还包括红细胞裂解液、TRIzol;氯仿;异丙醇;无水乙醇等试剂、逆转录试剂试剂及阳性对照品和阴性对照品。
本发明的有益效果:本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针,利用双标准曲线的方法,分别构建内参基因ABL和CDX2目的基因的定量标准曲线,检测受测者体内CDX2的相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的△△CT法,该试剂方法和试剂盒具有精度高,结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化,使实验条件达到最佳,从而省去了繁琐的条件摸索环节,大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好,灵敏度高,操作简便。有助于临床上白血病的早期诊断及微小残留病灶(MRD)的监测,对于及时干预治疗、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
附图说明
图1是灵敏度检测结果图。
图2是阴性样品的结果图。
图3是阳性样品的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应当注意的是,实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
本发明用于辅助临床上白血病(leukemia)的早期诊断、早期预防及高危人群筛选的方法。主要包括以下试剂:红细胞裂解液;TRIzol;氯仿;异丙醇;无水乙醇;QIAGENRNeasy FFPE Kit。
检测体系PCR反应液:THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO,QPS-101)、检测目的基因用上下游引物CDX2-F,CDX2-R,探针为CDX2-Probe,检测内参基因Abl用引物为Abl-F,Abl-R,探针为Abl-Probe以及阳性对照品和阴性对照品。
其中检测CDX2基因的引物和探针,分别为:
CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT
CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA
CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA
检测Abl内参基因的引物和探针,分别为:
Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA
阳性对照品:含CDX2基因组的溶液;
阴性对照品:不含CDX2基因组的溶液。
所述上游引物定位于该基因第一外显子,下游引物定位于第二两个外显子,探针跨越第一、第二两个外显子,对目的基因的扩增及检测具有极高的特异性;此外这段引物的PCR产物长度为146bp,片段长度小,探针法检测可得到较好的结果。
实施例2
本发明方法的操作流程:
(1)抽提血液中的总RNA:在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液,取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min;1500rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞;再次加入0.5ml红细胞裂解液,1500rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞;向细胞中加入1mlTRIzol,反复吹打直至沉淀完全溶解,室温静止5min;加入0.2ml氯仿,震荡均匀;14000rpm4℃离心10min,吸取上清层转移至另一新的离心管中;加入等体积的异丙醇,上下充分混匀,室温静置10min;14000rpm 4℃离心10min,弃上清,加入75%乙醇1ml,轻轻上下颠倒洗涤管壁;14000rpm 4℃离心5min,弃乙醇;室温干燥10-15min,加入20ulRNase-free水溶解沉淀。
(2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书,将RNA反转为cDNA。
(3)试剂配置:按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL,每人份23μL分装:
X=23μL反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照);
(4)加样:加入检测体系PCR反应液中2μL cDNA;阳性对照和阴性对照直接加2μL阳性对照品和阴性对照品;空白对照加2μL生理盐水或不加任何物质。
(5)检测:检测在实时荧光PCR仪上进行,可用仪器包括ABI7300,7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件:95℃预变性1min;95℃15s,58℃35sec40个循环,荧光信号于58℃35sec时采集。
(6)结果判断:将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上,系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。
1)内参阳性时,检测结果才认为有效;
2)阳性判断标准:Ct<36,为阳性;35≤Ct≤38,为疑似阳性,需要再次验
证;Ct>38,为阴性。
实施例3本发明灵敏度检测
以质粒浓度为100、10、1copies/μL作为模板进行实验,每个浓度重复10次,同时设置一个空白对照。结果发现本发明的检测下线为10copies,具体见表1和图1。
表1本发明灵敏度检测结果
实施例4采用本发明所述检测方法检测健康人群标本
取待检的健康体检样品20例,按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性,阴性,空白对照,内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样品,每个样本2次重复,一份阳性对照,一份阴性对照和一份空白对照,检测时间仅为100分钟。20例筛查样本中所有样本的abl均起线,但CDX2未有标本出现起线。结果如表2所示,样品1的检测结果图见图2。
表2 20例健康体检样本CDX2mRNA表达水平
实施例5采用本发明所述检测方法检测临床标本
取待检的临床样品20例,按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性,阴性,空白对照,内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样品,每个样本2次重复,一份阳性对照,一份阴性对照和一份空白对照,检测时间仅为100分钟。20例筛查样本中所有样本的abl均起线,其中有6例出现CDX2阳性表达。实验结果如下表3所示,样品3的检测结果见图3。
表3 20例临床样本CDX2mRNA表达水平
SEQUENCE LISTING
<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测白血病CDX2基因表达水平的引物和方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaacctgtgc gagtggat 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgatgtagcg actgtagtga 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagtccctcg gcagccaagt ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatacgaagg gagggtgtac ca 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcggccagg gtgttgaa 18
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgcttctgat ggcaagctct acgtctcct 29
Claims (3)
1.检测CDX2基因相对表达量的引物和探针,其特征在于,包括:扩增覆盖CDX2基因的上下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe,检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe;其碱基序列为:
CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT
CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA
CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA
Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
2.一种检测CDX2基因相对表达量的方法,其包括如下步骤:
(1)提取血液中的总RNA;
(2)将RNA反转为cDNA;
(3)利用CDX2基因扩增的上下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe,检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe对步骤(2)中的cDNA分别进行扩增;
其中检测CDX2基因的引物和探针,分别为:
CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT
CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA
CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA
检测Abl内参基因的引物和探针,分别为:
Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,还包括阳性对照品的扩增和阴性对照品的扩增。
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