RU2665965C1 - Способ скрининга злокачественных новообразований у человека - Google Patents
Способ скрининга злокачественных новообразований у человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2665965C1 RU2665965C1 RU2017143427A RU2017143427A RU2665965C1 RU 2665965 C1 RU2665965 C1 RU 2665965C1 RU 2017143427 A RU2017143427 A RU 2017143427A RU 2017143427 A RU2017143427 A RU 2017143427A RU 2665965 C1 RU2665965 C1 RU 2665965C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lar
- frequency
- gene
- humans
- malignant neoplasms
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 101150095401 AURKA gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 101150032986 Lar gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 4
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 4
- 102000004000 Aurora Kinase A Human genes 0.000 description 3
- 108090000461 Aurora Kinase A Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000719121 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000857677 Homo sapiens Runt-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010008617 Cholecystitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- -1 Orange / Green Chemical compound 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101150050863 T gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002357 laparoscopic surgery Methods 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и эпигенетике, и предназначено для скрининга злокачественных новообразований у человека. Осуществляют забор периферической крови. Получают образцы суспензии, содержащие лимфоциты. В образцах суспензии определяют частоту нестимулированных лимфоцитов с асинхронной репликацией (ЛАР) гена AURKA. При частоте ЛАР гена AURKA, превышающей 28,0%, подтверждают обнаружение у человека злокачественного новообразования. Изобретение обеспечивает упрощение способа скрининга злокачественных новообразований у человека, сокращение времени исследования и его стоимости. 2 ил., 6 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и эпигенетике, и касается способа скрининга злокачественных новообразований у человека.
В настоящее время все большую актуальность приобретает диагностика онкологических заболеваний на основе биологических маркеров на уровне клеток, субклеточных структур и генома. Нормальное клеточное деление требует, чтобы геном реплицировался правильно, гарантируя тем самым, что геномная информация в неизмененном виде перешла из одного клеточного поколения в другое. Процесс ДНК репликации является жестко регулируемым и синхронизирован по всему геному. Нарушение времени репликации является важным компонентом в развитии опухоли и ранним эпигенетическим событием при канцерогенезе [Genome Research. 2012; 22(10): 1833-1844, Science. 2017; 355(6331): 1330-1334]. В немногочисленных зарубежных работах показано, что частота лимфоцитов с асинхронной репликацией (ЛАР) изученных генов у онкологических больных достоверно повышена по сравнению со здоровыми лицами [Genes, Chromosomes and Cancer. 1998; 22(3): 225-231, Genes, Chromosomes and Cancer. 2000; 27(3): 270-277, Cancer Genetics and Cytogenetics. 2003; 143(2): 133-139, Neoplasia. 2010; 12(8): 668-674] и увеличивается в процессе малигнизации заболеваний [Experimental Hematology. 2000; 28(2): 156-160, Journal of Cellular Biochemistry. 2013; 114(5): 1074-1083].
В России подобные работы не проводились.
Известен способ выявления рака и риска развития рака, основанный на определении уровня синхронности репликации аллелей генов в клетках, изолированных из жидкостей тела человека («Facile detection of cancer and cancer risk based on level of coordination between alleles» патент US 6803195 B1, 1999 г.).
Недостатком данного способа является применение его только для рака простаты и рака молочной железы.
Известен «Способ диагностики онкологических заболеваний» по патенту RU 2384845, в котором проводят исследование образца, взятого у пациента, на выявление онкологического маркера мРНК гена Т (Brachyury). Онкологическое заболевание диагностируют при обнаружении сильного генспецифического сигнала мРНК гена Т (Brachyury). Недостатком данного способа является отбор материала для анализа непосредственно из различных органов для выявления в них онкологического заболевания.
Известен «Способ дифференциальной диагностики заболеваний онкологического и неонкологического генеза» по патенту RU 2593015. Сущность способа состоит в том, что исследуют электрофоретическую подвижность эритроцитов и при ее снижении менее, чем на 49% от физиологической нормы, диагностируют заболевание неонкологического генеза. При снижении электрофоретической подвижности эритроцитов более чем на 50% от физиологической нормы диагностируют заболевание онкологического генеза, при физиологической норме, равной 1,75±0,04 мкм⋅см/В⋅с.
К недостаткам способа можно отнести диагностику злокачественных новообразований происходящих только из эпителиальных тканей.
Известен «Способ скрининга и мониторинга онкологических заболеваний» по патенту RU 2537263. Он включает забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК, амплификацию посредством множественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакцией с последующим анализом амплифицированных продуктов.
Недостатком способа является сложность интерпретации результатов, а также возможность загрязнения образцов посторонней ДНК и, как результат, ложноположительный ответ.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения выбран способ дифференциальной диагностики больных раком простаты, изложенный в статье Cytron S. et al. [Cytron S., Stepnov E., Bounkin I., Mashevich M, Dotan A., Avivi L. Epigenetic analyses in blood cells of men suspected of prostate cancer predict the outcome of biopsy better than serum PSA levels. // Clinical Epigenetics. 2011; 2(2): 383-388. DOI: 10.1007/s 13148-011-0029-3]. Диагностика рака простаты с применением рассматриваемого способа основана на анализе количества стимулированных фитогемагглютининином (ФГА) лимфоцитов периферической крови с асинхронной репликацией генов RB1 и AML1, выявляемых при помощи флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Способ реализуют в следующей последовательности:
1. У каждого пациента берут 5 мл периферической крови, из которой готовят клеточную культуру ФГА-стимулированных лимфоцитов.
2. Культуру инкубируют при +37°С в течение 72 ч, затем проводят гипотонизацию и фиксацию лимфоцитов. Полученную клеточную суспензию хранят при -20°С до приготовления препаратов для флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).
3. Используют два коммерческих молекулярных зонда фирмы Vysis (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) на гены RBI и AML1. In situ гибридизацию и пост-гибридизационную отмывку проводят согласно стандартному протоколу, рекомендованному фирмой-производителем. Готовые предметные стекла хранят при -20°С до момента анализа.
4. Препараты анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus ВН2, оснащенного тройным линейным фильтром (Chroma Technology, Brattleboro, VT, USA). Для каждого образца анализируют не менее 200 клеток, имеющих 2 отчетливых, хорошо определяемых флуоресцентных сигнала. Анализируемые флуоресцентные сигналы в клетках подразделяют на 2 категории: "S" - единичный сигнал, представляющий собой участок еще нереплицированной ДНК и "D" - двойной сигнал от реплицированного участка ДНК. Таким образом, часть клеток отражает одинаковый статус репликации: клетки с нереплицированными аллелями (SS - клетки) и клетки с реплицированными аллелями (DD - клетки); другая часть клеток отражает асинхронную репликацию - когда в клетке виден один сигнал одинарный, а второй двойной (SD - клетки). Для каждого гена рассчитывают частоту SD клеток, по отношению ко всей клеточной популяции, содержащей два сигнала (общее число SD, SS, и DD клеток). Статистическую достоверность различия между двумя клеточными популяциями определяют с помощью критерия Стьюдента (t-тест (Microsoft Excel)).
Недостатки способа.
1. Зависимость пролиферативной кинетики (митотического индекса и скорости пролиферации) от марки компонентов культуральной среды, времени культивирования и индивидуальных особенностей донора/больного может вносить ошибку в результаты.
2. Материалом для FISH-исследования является 72-часовая культура ФГА-стимулированных лимфоцитов, что увеличивает продолжительность исследования до 6 рабочих дней.
Технический результат предлагаемого решения заключается в создании возможности проведения скрининга злокачественных новообразований у человека, упрощение способа, сокращение времени исследования и его стоимости.
Сущность способа, включает забор периферической крови, получение образцов суспензий содержащих нестимулированные лимфоциты и анализ в них асинхронной репликации гена AURKA с помощью флуоресцентной in situ гибридизации - FISH. Если частота лимфоцитов с асинхронной репликацией - ЛАР гена AURKA превышает 28,0%, то это свидетельствует о наличии у человека злокачественного новообразования.
Перечень фигур.
Фиг. 1. Лимфоцит с нереплицированными аллелями гена AURKA: 1 - ядро клетки, 2 - флуоресцентные сигналы, показывающие нереплицированные аллели гена;
Фиг. 2. Лимфоцит с асинхронно реплицированными (ЛАР) аллелями гена AURKA: 1 - ядро клетки, 2 - флуоресцентный сигнал, показывающий нереплицированный аллель гена; 3 - флуоресцентный сигнал, показывающий реплицированный аллель гена.
Порядок реализации способа.
1. Образцы венозной крови (3 мл) забирают при помощи вакуумной системы, содержащей Li-гепарин в концентрации 12-30 ME на 1 мл крови. В центрифужную пробирку переносят 1 мл цельной крови, добавляют 9 мл теплого(+37°С) гипотонического раствора KCl (550 мг/110 мл) и помещают в термостат (+37°С) на 30 мин. После окончания гипотонизации пробирки центрифугируют (1000 об/мин) в течение 10 минут. Затем удаляют супернатант, оставив в пробирке около 0,3-0,5 мл. Осадок ресуспендируют и заливают (до 10 мл) свежеприготовленным фиксатором Карноя (3 части метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты), непрерывно перемешивая на шейкере. Далее центрифугируют (1000 об/мин) в течение 15 минут. Смену фиксатора с последующим центрифугированием и удалением супернатанта до 0,5 мл производят трижды. Пробирку с суспензией клеток в последнем фиксаторе заклеивают парафилмом и помещают в морозильную камеру (-20°С) для хранения и/или дальнейшего использования. Перед приготовлением препаратов пробирку вынимают из морозильной камеры, хорошо встряхивают и центрифугируют (1000 об/мин) 10 минут. Затем удаляют супернатант, оставив 0,3-0,5 мл, и непрерывно перемешивая на шейкере добавляют 2-9 капель свежеприготовленного фиксатора Карноя. Клеточную суспензию раскапывают по 15-30 мкл на охлажденные в морозильной камере (-20°С), предварительно очищенные предметные стекла на теплом термостолике (+30°С). Готовые препараты помещают в термостат (+37°С) на ночь для досушивания. На следующий день на предметное стекло наносят 100-150 мкл раствора РНК-азы (10 мкл раствора RNAse (10 мг/мл), 100 мкл 20×SSC (стандартный цитратный буфер) (рН 5.3) и 890 мкл бидистиллированной воды), закрывают покровным стеклом (22×50 мм) и, поместив во влажную камеру, убирают на 60 мин в термостат (+37°С). Затем стряхивают покровное стекло и отмывают препарат при комнатной температуре в фосфатном буфере (PBS) (рН 7.0-7.2) в течение 5 мин, далее - в растворе пепсина (85 мкл 37% (12N) HCl, 50 мкл рабочего 10% раствора пепсина, доведенного до 100 мл дистиллированной водой) в течение 12 мин на водяной бане при +37°С. Переносят препарат в стакан с PBS (рН 7.0-7.2) комнатной температуры на 5 мин. Далее отмывают в растворе MgCl2 (5 мл 1М MgCl2, 3 мл 37% формальдегида, доведенные до 100 мл PBS (рН 7.0-7.2)) при комнатной температуре в течение 10 мин. После чего отмывают в PBS (рН 7.0-7.2) 5 мин. Затем проводят дегидратацию препарата в серии спиртов (этанол) разной концентрации (70%, 85% и 96%) по 3 мин в каждом.
2. Препарат высушивают при комнатной температуре и используют коммерческий молекулярный зонд на ген AURKA согласно протоколу фирмы-производителя (Kreatech, Нидерланды).
3. Анализ препаратов проводят на флуоресцентном микроскопе Axiolmager А-2 (Carl Zeiss, Германия) с набором фильтров DAPI, Orange/Green, Gold (Vysis, США). Для каждого образца анализируют не менее 300 клеток, имеющих отчетливые хорошо определяемые флуоресцентные сигналы. Анализируемые флуоресцентные сигналы в клетках (фиг 1, фиг. 2) подразделяют на 2 категории: "S" - единичный сигнал, представляющий собой участок еще нереплицированной ДНК (фиг. 1 п. 2, фиг.2 п. 2) и "D" - двойной сигнал от реплицированного участка ДНК (фиг 2 п. 3). Таким образом, одна часть клеток имеет нереплицированные аллели гена AURKA (фиг. 1), другая часть клеток отражает асинхронную репликацию аллелей гена AURKA - когда в клетке виден один сигнал одинарный, а второй двойной (фиг. 2). Статистическую достоверность различия между двумя клеточными популяциями определяют с помощью критерия Стьюдента.
Примеры конкретного применения.
Пример №1. Больной А. 1941 год рождения. Находился на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом первично-множественный метахронный рак: рак прямой кишки cT2N0M0 IB, рак желудка pT3N0M0 IIA. Образец периферической крови взят перед операцией по поводу второй опухоли. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 38,3%, что свидетельствует о наличии у него злокачественного новообразования.
Пример №2. Больная Б. 1968 года рождения. Находилась на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом рак желудка cT4aN0M0. Образец периферической крови взят перед диагностической лапароскопией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 34,3%, что свидетельствует о наличии у нее злокачественного новообразования.
Пример №3. Больной В. 1961 года рождения. Находился на лечении в отделении лучевой и лекарственной терапии гемобластозов с диагнозом хронический лимфоцитарный лейкоз, подтвержденный имммунофенотипированием лимфоцитов. Образец периферической крови взят при постановке диагноза. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 47,7%, что свидетельствует о наличии у него злокачественного новообразования.
Пример №4. Больной Д. 1948 года рождения. Находился в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом рак желудка T4N0M0. Впоследствии, по результатам морфологического исследования операционного материала диагноз был пересмотрен: язва желудка. Образец периферической крови взят перед операцией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 26%, что свидетельствует об отсутствии у него злокачественного новообразования.
Пример №5. Больная Г. 1986 года рождения. Находилась на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом желчекаменная болезнь: хронический калькулезный холецистит. Образец периферической крови взят перед операцией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР теш. AURKA составила 21,2%, что свидетельствует об отсутствии у нее злокачественного новообразования.
Пример №6. Донор Е. 1977 года рождения. Клинически здоров. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA. Частота ЛАР гена AURKA составила 13,9%, что свидетельствует об отсутствии у него злокачественного новообразования.
Подтверждение достижения технического результата.
Всего обследовано 220 человек. В первую группу - 188 человек были включены больные хроническим лимфоцитарным лейкозом, больные лимфомой Ходжкина, больные раком желудка и больные с первично-множественными злокачественными новообразованиями различных локализаций (молочная железа, предстательная железа, щитовидная железа, легкие, желудочно-кишечный тракт, гортань, мочевой пузырь, почки, матка). Во вторую группу вошло 32 человека без злокачественных новообразований.
Среднегрупповые частоты ЛАР теш. AURKA составили 20,6±0,7% в группе лиц без злокачественных новообразований и 36,4±0,4% в группе онкологических больных. Проведенный анализ показал, что у 95% онкологических больных частота ЛАР превышала верхнюю границу 95% доверительного интервала 27,9% для группы лиц без злокачественных новообразований. Таким образом, чувствительность предлагаемого способа составила 95%., специфичность - 100%.
Предлагаемое изобретение обеспечивает при использовании следующий технический эффект:
- возможность проведения скрининг-диагностики злокачественных новообразований;
- по сравнению с прототипом предложенное изобретение снижает в 2 раза время для осуществления диагностического исследования и его трудоемкость;
- устраняет зависимость результата анализа от условий культивирования лимфоцитов;
- снижает в 4 раза экономические затраты на проведение исследования, так как для осуществления его по прототипу требуется наличие дополнительных реактивов и больший расход дорогостоящих ДНК-зондов;
- обеспечивает высокую чувствительность исследования - 95% и специфичность - 100%;
Статистическую обработку данных проводят с помощью стандартных методов статистического анализа с использованием компьютерной программы Microsoft Excel (2007). Оценку достоверности различий между двумя клеточными популяциями проводят по t-критерию. При сравнении межгрупповых показателей используют критерий Хи-квадрат.- Различия считаются статистически достоверными при t≥1,96 и χ2≥3,84, что соответствует р<0,05.
Claims (1)
- Способ скрининга злокачественных новообразований у человека, включающий забор периферической крови, получение образцов суспензии, содержащих лимфоциты, использование флуоресцентной in situ гибридизации, отличающийся тем, что в образцах суспензии определяют частоту нестимулированных лимфоцитов с асинхронной репликацией (ЛАР) гена AURKA и при частоте ЛАР гена AURKA, превышающей 28,0%, подтверждают обнаружение у человека злокачественного новообразования.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143427A RU2665965C1 (ru) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | Способ скрининга злокачественных новообразований у человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143427A RU2665965C1 (ru) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | Способ скрининга злокачественных новообразований у человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2665965C1 true RU2665965C1 (ru) | 2018-09-05 |
Family
ID=63459720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017143427A RU2665965C1 (ru) | 2017-12-12 | 2017-12-12 | Способ скрининга злокачественных новообразований у человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2665965C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2758079C2 (ru) * | 2021-05-19 | 2021-10-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Способ прогноза прогрессирования заболевания у больных раком желудочно-кишечного тракта после проведенного лечения |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6803195B1 (en) * | 1999-07-02 | 2004-10-12 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Facile detection of cancer and cancer risk based on level of coordination between alleles |
| WO2014047398A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | The General Hospital Corporation | Modulation of asymmetric proliferation |
-
2017
- 2017-12-12 RU RU2017143427A patent/RU2665965C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6803195B1 (en) * | 1999-07-02 | 2004-10-12 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Facile detection of cancer and cancer risk based on level of coordination between alleles |
| WO2014047398A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | The General Hospital Corporation | Modulation of asymmetric proliferation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CYTRON S. et al. Epigenetic analyses in blood cells of men suspected of prostate cancer predict the outcome of biopsy better than serum PSA levels. Clin Epigenetics. 2011 Aug; 2(2): 383-388. * |
| ПРЯХИН Е.А. и др. Электромагнитные поля и биологические системы: стресс и адаптация. Челябинск: Полиграф-Мастер, 2011, cтр.60. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2758079C2 (ru) * | 2021-05-19 | 2021-10-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Способ прогноза прогрессирования заболевания у больных раком желудочно-кишечного тракта после проведенного лечения |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2691404T3 (es) | Diagnóstico no invasivo del cáncer | |
| US7098008B2 (en) | Selected primers for detection of MAGE or GAGE genes for diagnosis of cancer and methods of use | |
| CN110129324A (zh) | 一种胃癌血清外泌体标志物hsa_circ_001477的提取和检测方法以及应用 | |
| CN109097477A (zh) | 一种用于乳腺癌诊断的circRNA标志物及其应用 | |
| CN109112216A (zh) | 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法 | |
| CN109055555A (zh) | 一种肺癌早期转移诊断标志物及其试剂盒和应用 | |
| CN111996249A (zh) | 癌症诊断和病程监控方法 | |
| CN107312865B (zh) | Loc100130111在制备骨肉瘤诊断产品、治疗药物中的用途 | |
| RU2665965C1 (ru) | Способ скрининга злокачественных новообразований у человека | |
| CN117568481A (zh) | 一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物及其应用 | |
| JP7187081B2 (ja) | 液体生検多重癌遺伝子バイオマーカーを用いた乳癌の早期診断および治療後のモニタリング方法 | |
| Chen et al. | cDNA microarray analysis and immunohistochemistry reveal a distinct molecular phenotype in serous endometrial cancer compared to endometrioid endometrial cancer | |
| CN106906288A (zh) | 检测白血病cdx2基因表达水平的引物和方法 | |
| CN115261476A (zh) | 筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途 | |
| CN106939354A (zh) | miRNA‑4530作为肺癌诊断标志物的应用 | |
| CN106282366A (zh) | 一种与前列腺癌相关的分子标记物及其应用 | |
| SK282091B6 (sk) | Spôsob imunomagnetického oddeľovania buniek | |
| CN107365859B (zh) | LncRNA作为诊治骨肉瘤的分子标志物 | |
| CN107151699A (zh) | 检测nup214‑abl1基因相对表达量的试剂盒和方法 | |
| RU2758079C2 (ru) | Способ прогноза прогрессирования заболевания у больных раком желудочно-кишечного тракта после проведенного лечения | |
| CN110004227A (zh) | 一种鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物 | |
| US20110229882A1 (en) | Diagnosing and monitoring response to treatment of solid organ tissue disease | |
| CN107475419A (zh) | Kndc1基因及其表达产物在卵巢癌检测中的应用 | |
| CN107012244A (zh) | miRNA‑6729‑5p作为肺癌诊断标志物的应用 | |
| CN110736834A (zh) | 基于高通量测序法筛查和诊断肝癌的方法、装置和系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201213 |