WO2024062867A1 - 対象のがん罹患の可能性を分析する方法 - Google Patents

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友美 安東
美津子 石原
良威 佐野
拓也 宮川
幸二 橋本
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株式会社 東芝
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to a method of analyzing the possibility of a subject suffering from cancer.
  • miRNA is a single-stranded nucleic acid of about 17 to 25 bases, and has been shown to have the function of regulating gene expression. It has been reported that its type and expression level change from the initial stage in various diseases. For example, in cancer patients, various miRNA levels are used as cancer markers, and are known to increase or decrease compared to healthy individuals.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method that can more easily detect cancer at an early stage.
  • the method for analyzing the possibility of developing cancer includes counting the number of types of RNA in a sample derived from a subject for types of RNA in which sequence variations based on RNA editing exist compared to a reference sequence. and determining the possibility of the subject suffering from cancer using the obtained number of types of RNA as an index.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a first embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the first embodiment.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of the second embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a further example of the second embodiment.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the third embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of the fourth embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of the fourth embodiment.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the fourth embodiment.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the fifth embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of the fifth embodiment.
  • FIG. 11 is a diagram showing a further example of the fifth embodiment.
  • FIG. 12 is a diagram showing a further example of the fifth embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of Example 1.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of Example 2.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of Example 3.
  • the analysis method according to the embodiment of the present application provides knowledge that can distinguish between cancer patients and non-cancer patients by clarifying how sequence variations based on RNA editing exist in RNA groups. It was achieved by what I learned. This discovery makes it possible to qualitatively, rather than quantitatively, analyze the possibility of a subject developing cancer. Thereby, it is possible to detect cancer at an early stage more easily and at a lower cost. For example, since there is no need to quantify genes, there is no need to ensure quantitative performance.
  • the analysis method is a dramatic and technological method based on a very original discovery.
  • This embodiment is a method for analyzing the possibility of a subject suffering from cancer.
  • the analysis method involves counting the number of RNA types in a sample derived from the subject, that is, the number of types, in which there is sequence variation due to RNA editing compared to a reference sequence, and counting the number of types obtained. This includes determining the possibility of the subject suffering from cancer using this as an indicator.
  • RNA editing is a mechanism in animals and plants that replaces the base sequence of RNA transcribed from DNA or RNA that is being transcribed, or inserts or deletes one to several bases. It is considered to be one of the post-transcriptional modifications of RNA, and has been reported to be involved in the control of various biological processes.
  • a typical example of RNA editing will be explained using FIG. 2. That is, typical examples of RNA editing are (1) A-to-I RNA editing, (2) C-to-U RNA editing, (3) insertion of one to several bases, and (4) one to several bases. deletion (deletion), etc.
  • A-to-I RNA editing (adenosin to inosin editing) is RNA editing by ADAR enzyme.
  • RNA editing cytidine to uridine editing
  • C-to-U RNA editing is the substitution of cytidine (C) with uridine (U).
  • the reference sequence may be any sequence that has not undergone sequence variation due to RNA editing, and may be, for example, a corresponding wild-type sequence.
  • Information on wild-type sequences can be obtained, for example, from gene banks according to the type of RNA, databases that collect all genetic data such as Ensembl or NCBI, and information about specific types of RNA such as miRBase, which is a miRNA database. You can use or refer to the collected database, and if the information is updated, you can refer to the latest information as desired.
  • the reference sequence may be a specific full-length RNA, a partial sequence of a specific RNA, or a combination thereof.
  • Samples derived from a subject include cells, tissues, and/or fluids collected from a subject, mixtures thereof, and processed products obtained by appropriately processing them.
  • the sample may be, for example, serum or plasma, or other body fluids, such as blood, leukocyte interstitial fluid, urine, stool, sweat, saliva, oral mucosa, nasal mucosa, nasal mucus, pharynx. It may be mucous membrane, sputum, digestive fluid, gastric juice, lymph fluid, spinal fluid, tear fluid, breast milk, amniotic fluid, semen, vaginal fluid, or a mixture thereof.
  • the sample may be a tissue, a cell, a mixture thereof, or the like.
  • the samples may also be freshly taken from a subject, cultured, preserved in a desired procedure, or their supernatant obtained after maintaining them in a desired liquid. It is preferable to use body fluids such as blood, serum, and plasma as samples from the subject because they are easy to collect.
  • RNA extraction method may be performed by a method known per se, for example, it is also possible to use a commercially available kit.
  • the subject is the animal that is subjected to analysis in this method, that is, the animal that provides the sample.
  • the subject may be an animal with some disease or a healthy animal.
  • the target may be an animal that may be suffering from cancer or an animal that has suffered from cancer in the past, especially an animal that may be suffering from breast cancer. , or may be an animal that has suffered from breast cancer in the past.
  • the subject is a human.
  • the target may be another animal.
  • Other animals are, for example, mammals, such as primates such as monkeys, rodents such as mice, rats, or guinea pigs, companion animals such as dogs, cats, or rabbits, domestic animals such as horses, cows, or pigs, Or, it includes animals belonging to exhibition animals, etc.
  • RNA with sequence variations rather than measuring the expression level or copy number of a specific RNA species, the analysis method does not measure the expression level or copy number of a specific RNA species. The number of types of RNA having a sequence, that is, having sequence variations is counted.
  • the number of types can be counted by, for example, comprehensively examining and counting RNA in a specific category, or by setting a specific or arbitrary RNA population and comprehensively examining and counting them.
  • the number of RNA molecules included in the RNA population may be a number registered in a database to be used, or may be arbitrarily selected from there.
  • miRBase currently has 38,589 pre-miRNAs and 4,860 miRNAs registered for 271 biological species. Of these, 1917 pre-miRNAs and 2654 miRNAs have been registered in the human genome. These numbers may be the number of RNA molecules contained in the RNA population, but are not limited thereto.
  • RNA may be, for example, about 17 bases to about 25 bases in length in the case of miRNA, but is not limited thereto.
  • it may be, for example, about 60 base pairs to about 70 base pairs.
  • the length of RNA may be, for example, 17 to 25 bases in the case of miRNA, but is not limited thereto.
  • it may be, for example, 60 to 70 base pairs.
  • RNA to be counted may be any RNA species that may have sequence variation due to RNA editing, such as RNA, mRNA, ncRNA (non-coding RNA), housekeeping ncRNA, tRNA, small ncRNA, miRNA, piRNA, It may be tsRNA, IncRNA, etc. These RNAs may be counted comprehensively, several categories may be counted in a mixed state, or RNAs of a specific category may be counted. For example, when counting a specific category of RNA, it may be mRNA, tRNA, small ncRNA, miRNA, piRNA, tsRNA, etc., and for example, it may be a mixture of at least two of these categories.
  • RNA such a specific category of RNA may be, for example, miRNA.
  • the number of RNA types distributed in an RNA group is counted, rather than the expression level or copy number of a specific RNA type, and based on the obtained number of types, the cancer incidence of the target is determined. The probability can be determined.
  • a site that is less likely to be affected for example, a highly conserved sequence, or a sequence that is or contains a highly conserved site, may be selected.
  • positions 1 to 10 of the 5' end which is called the seed sequence, generally have a low probability of single nucleotide polymorphisms and low sequence variability, making it highly useful. It can be said.
  • Analyzing the possibility of a subject suffering from cancer means, for example, determining whether there is a possibility that the subject has cancer, or determining whether the subject is likely to have cancer or not. It may be possible to determine whether the target is low or to identify whether the subject is a cancer patient or a non-cancer patient. According to the first embodiment, it is possible to mechanically and/or automatically determine the probability that a subject is suffering from cancer based on objective comparison criteria. For example, a method for analyzing the possibility that a subject is suffering from cancer can be rephrased as, for example, a method for acquiring information regarding the possibility that a subject is suffering from cancer.
  • the acquired information can be used by a doctor, for example, for medical purposes to determine, or diagnose, the medical condition or health condition of a human being. If such a "judgment” or “diagnosis” by a doctor is defined as "determination of the presence or absence of a target cancer group in a subject," then this embodiment is a medical examination by a "doctor” for medical purposes. It can also be said to be an ⁇ analytical method that assists'' in ⁇ determining whether or not a subject has cancer.''
  • the determination can be made that if the number of types is greater than a preset threshold, there is a high possibility that the subject is suffering from cancer.
  • the number of types is smaller than a preset threshold, it may be determined that the possibility that the subject is suffering from cancer is low.
  • the threshold value is set by matching the population RNA and the reference sequence, and comparing the results obtained using samples derived from non-cancer patients and the results obtained using samples derived from representative cancer patients. It may be determined by comparing in advance.
  • cancer includes any stage of cancer; for example, a state in which cancer remains within the organ of origin, a state in which cancer has spread to surrounding tissues, and a state in which cancer has spread to lymph nodes. This includes states in which cancer has metastasized, and states in which cancer has spread to distant organs.
  • breast cancer refers to a malignant tumor (neoplasm) formed in mammary gland tissue.
  • breast cancer includes what is commonly referred to as “breast cancer” or “breast cancer.”
  • breast cancer according to embodiments also includes any type of breast cancer, including lobular or ductal carcinoma.
  • Breast cancer according to embodiments also includes, for example, epithelial tumors, non-epithelial tumors, and malignant phyllodes tumors that are both epithelial and non-epithelial.
  • cancers include breast cancer, colon cancer, lung cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, sarcoma, prostate cancer, bile duct cancer, bladder cancer, and esophageal cancer. , liver cancer, brain tumor, and kidney cancer.
  • the method of this embodiment is not a quantitative test but a qualitative test, so there is no need to ensure quantitative performance, so it is excellent in time and economic efficiency for clinical development.
  • serum or plasma which can be easily collected during health checkups, as a sample. Therefore, for example, using serum collected from a subject, it is possible to comprehensively, ie, universally detect cancer as primary screening during a health checkup. Cancer can be detected early.
  • serum, plasma, etc. the physical and economic burden on the subject can be greatly reduced compared to cytodiagnosis, etc., and the procedure is easy, so it is less burdensome on the examiner.
  • the second embodiment is a method for analyzing the possibility of a subject suffering from cancer.
  • the analysis method also counts the number of types in a sample from a subject, for example, a non-cancer control. .
  • the number of types from the subject and the number of types from the non-cancer control are compared to determine the possibility of the subject suffering from cancer.
  • the control may be, for example, a healthy subject.
  • a healthy individual may be at least an individual who is not suffering from cancer.
  • the healthy body is preferably a healthy individual without any disease or abnormality.
  • the individual selected as a control may be a different individual from the subject analyzed by this method, and is preferably an individual belonging to the same species, ie, a human if the subject is a human.
  • the physical conditions such as age, gender, height and weight, or the number of controls are not particularly limited, but the physical conditions may be the same or similar to those of the subjects tested by this analysis method. preferable.
  • samples derived from the subject may be collected over time, and the test results obtained when the subject is a healthy subject may be used as a control, a non-cancer person, or a non-cancer control.
  • FIG. 3 An example of the analysis method according to the second embodiment will be conceptually explained using FIG. 3.
  • miRNA as a specific category of RNA is selected and counted for humans
  • FIG. 3 also conceptually shows an example of a general quantitative test as a comparative example (FIG. 3, S31(f), S32A(g), S32B(h)).
  • a sample (a) from a subject and a sample (f) from a non-cancer control subject are prepared (S31).
  • specific categories of RNA contained in these samples as a population, count the number of types of RNA in samples derived from subjects and non-cancer controls for the types of RNA that have sequence variations due to RNA editing ( S32A(b), (b1), (b2)).
  • the population miRNA is obtained by comprehensively classifying and analyzing miRNAs present in serum, and counting the types of RNAs in which sequence variations based on RNA editing exist.
  • the criterion in this case is that a subject is identified as having a high possibility of suffering from cancer if there are sequence variations based on RNA editing in more types of miRNA than in non-cancer controls.
  • miR-1 is secreted into serum as 3 copies, miR-2 as 2 copies, miR-3 as 6 copies, miR-4 as 0 copies, and miR-5 as 2 copies.
  • S32A(b1) RNA editing was observed in two copies of miR-3 (each marked with an x).
  • miR-3 there is only one type of RNA, ie, miR-3, in which a sequence variation based on RNA editing exists in a sample derived from a non-cancer patient.
  • the results of a simulation assuming that the subject was a cancer patient are shown.
  • RNA editing was observed in 2 copies of miR-1, 1 copy of miR-2, 3 copies of miR-3, and 1 copy of miR-4 (each marked with an x). Therefore, there are four types of RNA, miR-1 to miR-4, in which sequence variations occur due to RNA editing in samples derived from subjects. In comparison, there are 4 types in the subjects compared to 1 type in the control subjects, which is a large number of types. Based on this result, the subject is identified as having a high possibility of suffering from cancer.
  • the analysis method is a qualitative test, and is based solely on RNA editing without taking into account the sequence, target, function, and phenotype of each type of miRNA included in the population miRNA used here. By determining whether there is a mutation or not, and comparing the number of mutations between non-cancer controls and the subject, we can determine the probability that the subject has cancer. can be determined.
  • counting the number of types of RNA in which sequence variations based on RNA editing exist can be used to calculate the mutation frequency in cancer tissue and the secretion of miRNA into serum, for example, as shown in S32B. It can be said that it includes both quantity and information.
  • information such as information that the amount of miRNA secreted into serum is low in normal cells and high in cancer cells (S32B(h)), mutation frequency in cancer tissues, etc.
  • the information (S32B(i)) multiplied by the information that it is low in normal cells and high in cancer cells is the number of miRNA types in which mutations are detected in miRNA in serum, and in normal cells (less x less), cancer In cells, it becomes (many ⁇ many) (S32B(c)). This emphasizes the results, making them easier to see. In addition, it can be a qualitative test that uses the number of particles as an indicator instead of the concentration.
  • the number of types is counted (S41), and the number of types obtained is compared with the number of types obtained from the sample derived from the control, and based on the results, the possibility of the subject suffering from cancer is determined. It may also include determining (S42).
  • the miRNA that becomes the population can be created by using any known miRNA database, or by creating an original database using a known discovery tool, and then selecting any type of miRNA included in those databases. It may be arbitrarily selected, designed and/or set from among the following. Examples of miRNA databases may be miRNABase, Rfam, miRIAD, dbDEMC, etc. Examples of discovery tools may be miRscan, miRNAFold, miRDeep, miRanalyzer, ChIPBase, sRNAbench, etc. Alternatively, it may be arbitrarily selected from an miRNA database in which sequences that can cause mutations based on RNA editing, such as MiREDiBase (miRNA Editing Database), are registered. The number of miRNAs included in the population may be, for example, 300 or more, 400 or more, 500 or more, or 600 or more.
  • the second embodiment is based on the inventors' discovery that it is possible to separate nucleic acids from body fluids that can be collected in a minimally invasive manner, and to use the sequence variations to distinguish between healthy individuals and cancer patients.
  • it is a qualitative test rather than a quantitative test there is no need to ensure quantitative performance, so it is excellent in time and economic efficiency for clinical development.
  • using serum collected from a subject it is possible to comprehensively, ie, universally detect cancer as primary screening during a health checkup.
  • FIG. 5 shows a third embodiment of a method for analyzing the possibility of a subject suffering from cancer.
  • the method includes three steps: a sample data acquisition step (S51), a feature extraction step (S52), and a disease determination step (S53).
  • S51 information regarding sequence variation from the reference sequence is acquired from the body fluid obtained from the subject
  • S52 information regarding sequence variations from a reference sequence is information regarding RNA contained in body fluids.
  • S52 the number of types of RNA in which sequence variation exists is counted (S52).
  • the disease determination step the possibility of cancer disease is determined using the number of types of RNA in which sequence variation exists as an index.
  • this disease determination step may be a step in which it is determined whether the subject is a cancer patient or a non-cancer patient using the index.
  • serum or plasma which can be easily collected during health checkups, as a sample. Therefore, for example, using serum collected from a subject, it is possible to comprehensively, ie, universally detect cancer as primary screening during a health checkup. This allows cancer to be detected early.
  • serum, plasma, etc. the physical and economic burden on the subject can be greatly reduced compared to cytodiagnosis, etc., and the procedure is easy, so it is less burdensome on the examiner.
  • serum or plasma contains a stable RNA concentration, for example, miRNA concentration, more accurate tests can be performed.
  • FIG. 6 shows a fourth embodiment of a method for analyzing the possibility of a subject suffering from cancer.
  • the analysis method includes four steps. First, RNA contained in a sample derived from a subject is classified based on the homology of its sequence to a reference sequence (S61). Next, a group of representative sequences having the same sequence in the RNA population classified with respect to each reference sequence is determined (S62). Each sequence of the representative sequence group is compared with the corresponding reference sequence to detect sequence variations (S63). Furthermore, the number of types of representative sequences having sequence variations is counted (S64). This method can also be used as a method to detect sequence variation.
  • the method for detecting sequence variation is to classify RNA contained in a sample derived from a subject based on the homology of its sequence to a reference sequence, and to identify representative sequences that have the same sequence in the RNA population classified for each reference sequence.
  • the method may comprise determining a group, comparing each sequence of the representative sequence group to a corresponding reference sequence, and detecting each sequence variation.
  • it may also be a method of detecting a sequence variation that can be identified, together with sequence information of the representative sequence, to indicate that a specific representative sequence has undergone sequence variation compared to a corresponding reference sequence.
  • Classifying by RNA sequence homology means creating multiple groups by classifying highly homologous sequences into one group for the sequence of a specific part of the RNA from which information is to be obtained. At that time, a reference sequence (a known sequence obtained from a database) is used as a standard sequence for the group. Classification by homology can be performed, for example, by using next generation sequencing (NGS), qPCR, Sanger, microarrays for RNA detection, hybridization, and the like. Alternatively, it may be performed by using a combination of at least two of these methods.
  • NGS next generation sequencing
  • qPCR qPCR
  • Sanger qPCR
  • microarrays for RNA detection hybridization
  • hybridization hybridization
  • FIG. 7 images of an example of comprehensive analysis of miRNA using a next-generation sequencer are shown in Figures 7 to 11.
  • the samples used were serum collected from 30 healthy subjects, 24 breast cancer cases, 18 lung cancer cases, 24 colon cancer cases, 24 uterine cancer cases, 24 stomach cancer cases, 24 pancreatic cancer cases, 24 prostate cancer cases, 24 ovarian cancer cases, 24 kidney cancer cases, 24 brain tumor cases, 13 cervical cancer cases, 24 bile duct cancer cases, 24 esophageal cancer cases, 24 bladder cancer cases, 24 sarcoma cases, and 3 liver cases.
  • the analyzed miRNAs were has-let-7a-2-3p, has-let-7a-3p, has-let-7a-5p, has-let-7b-3p, has-let-7b-5p, has-let-7c-3p, has-let-7c-5p, has-let-7d-3p, has-let-7d-5p, has-let-7e-3p, has-let-7e-5p, has-let-7f-3p, has-let-7f-5p, has-let-7g-3p, has-let- 7g-5p, has-let-7i-3p, has-let-7i-5p, has-miR-100-3p, has-miR-100-5p, has-miR-101-3p, has-miR-101-5p, has-miR-103a-2p, has-miR-103a-3p, has-miR-103b, has-miR-105-3p, has-miR-103-5p, has-miR-106a-3p, has-
  • FIG. 7(b) shows a portion of the results.
  • Column A lists the names of miRNAs, and columns C, D, E, etc. list data for 30 cases of healthy individuals and patients with each type of cancer. This shows that the RNA contained in the samples derived from the subjects has been classified according to their sequence homology.
  • the sequences with sequence variations selected from each population were defined as a candidate list.
  • the table in Figure 8 (c) is a portion of the data from Figure 7 (b), and the presence or absence of mutations is determined for the types of miRNAs included in the miRNA mutation candidate list created in advance for five healthy subjects and six cancer patients.
  • miRNA_mutant_1, miRNA_mutant_2, miRNA_mutant_3, miRNA_mutant_4, miRNA_mutant_5, miRNA_mutant_6, and miRNA_mutant_7 are shown as part of the miRNA mutation candidates. "1" is entered for those with mutations, and "0" for those without mutations, and the number of types of miRNA with mutations in the entire mutation list is counted. If the number of types of miRNA mutations detected is equal to or exceeds a predetermined threshold value or a threshold value determined as needed, it is determined that the patient is highly likely to be a cancer patient.
  • the threshold value may be determined by pre-analyzing and comparing samples derived from cancer patients and non-cancer patients, and each time a sample derived from a subject is analyzed, may be determined by analyzing and comparing information from other sources.
  • examples of threshold values include, but are not limited to, 2, 3, 5, 10, 23, 25, 26, or 30.
  • the number of types of miRNA used as markers may be set to the maximum value.
  • the threshold value may be determined depending on the technique and type of RNA used in the analysis method.
  • the method of this embodiment is a qualitative test rather than a quantitative test, there is no need to ensure quantitative performance, so it is excellent in time and economic efficiency for clinical development. Furthermore, for example, using serum collected from a subject, it is possible to comprehensively, ie, universally detect cancer as primary screening during a health checkup.
  • serum or plasma which can be easily collected during health checkups, as a sample. Therefore, cancer can be detected early.
  • serum, plasma, etc. the physical and economic burden on the subject can be greatly reduced compared to cytodiagnosis, etc., and the procedure is easy, so it is less burdensome on the examiner.
  • serum or plasma contains a stable RNA concentration, for example, miRNA concentration, more accurate tests can be performed.
  • the fifth embodiment is a method of setting a threshold value used to determine that a person is likely to be suffering from cancer.
  • the threshold value setting method includes four steps (FIG. 9). First, RNA contained in samples derived from a subject or a cancer patient and a sample derived from a non-cancer patient is classified based on the homology of the sequence to a reference sequence (S91). Next, in the RNA population classified with respect to each reference sequence, representative sequence groups having the same sequence are determined (S92). For the sample derived from the subject or cancer patient and the sample derived from the control, each sequence of the representative sequence group and each corresponding reference sequence are compared, and sequence variation is detected (S93).
  • the number of types of representative sequences having sequence variations is counted (S94).
  • the number of types of representative sequences counted is compared between the subject or cancer-affected person and the control, and a threshold value that separates the subject or cancer-affected person from the control is determined (S95).
  • FIGS. 10 to 12 show an example of setting the threshold when miRNA is an example of RNA.
  • FIG. 10 shows an example of comparing 24 types of miRNA between samples derived from cancer patients and healthy controls.
  • 24 cases of cancer 24 cases of prostate cancer, 24 cases of ovarian cancer, 24 cases of kidney cancer, 24 cases of brain tumor, 13 cases of cervical cancer, 24 cases of bile duct cancer, 24 cases of esophageal cancer, 24 cases of bladder cancer, There were 24 cases of sarcoma and 3 cases of liver disease.
  • FIGS. 10(a), 11(a), and 12(a) are graphs showing the types of representative sequences in controls and the number of representative sequences in cancer patients. Specifically, the number of representative sequences with editing-based sequence variations in miRNAs derived from healthy individuals and the number of representative sequences with editing-based sequence variations in miRNAs derived from cancer patients are shown. The number of representative sequences derived from cancer patients is shown classified into cancer stages 0, 1, 2, 3, and 4. Data is also shown for cancer patients for whom there is no information on recurrence.
  • FIG. 10 24 types of miRNAs that are thought to have mutations that have a high contribution rate to determining whether or not someone is suffering from cancer are used as representative sequences.
  • FIG. 11 310 types of miRNAs for which NGS data showed the presence of mutations based on RNA editing were used as representative sequences.
  • FIG. 12 611 types of miRNAs having mutations based on RNA editing that have already been reported on the database were used as representative sequences. For each case, the number of representative sequences with sequence variation in miRNAs derived from healthy individuals and miRNAs derived from cancer patients is plotted in Figures 10(a), 11(a), and 12(a). .
  • FIG. 10(b) shows the results of verifying that the threshold value 3 is effective. In the verification, the threshold value was set to 3, and experiments were actually conducted on all cancer patients and all healthy individuals to determine whether or not they had cancer.
  • the threshold value was set to 3
  • experiments were actually conducted on all cancer patients and all healthy individuals to determine whether or not they had cancer.
  • the cancer patient group 292 samples were determined to be positive, and 54 samples were determined to be negative.
  • 1 sample was determined to be positive and 29 samples were determined to be negative.
  • FIG. 11(b) shows the results of verifying that the threshold value 28 is effective. In the verification, the threshold value was set to 28, and experiments were actually conducted on all cancer patients and all healthy individuals to determine whether or not they had cancer.
  • the cancer patient group 266 samples were determined to be positive, and 80 samples were determined to be negative.
  • the healthy group 3 samples were determined to be positive, and 27 samples were determined to be negative.
  • the threshold value can be set to 23.
  • FIG. 12(b) shows the results of verifying that the threshold value 23 is effective. In the verification, the threshold value was set to 23, and experiments were actually conducted on all cancer patients and all healthy people, and the presence or absence of cancer was determined. In the cancer patient group, 293 samples were determined to be positive, and 53 samples were determined to be negative. In the healthy group, 5 samples were determined to be positive, and 25 samples were determined to be negative.
  • the fifth embodiment it is possible to provide a threshold value that can be used in the method of analyzing the possibility of a subject suffering from cancer according to the first to fourth embodiments.
  • Sequence variation based on RNA editing can be used as a marker for distinguishing between healthy individuals and cancer-affected individuals.
  • the marker in the sixth embodiment is the number of types of RNA in a sample derived from a subject, in which sequence variations based on RNA editing exist compared to a reference sequence. In other words, it is the number of representative sequences with sequence variation in the sample derived from the subject.
  • RNA to be detected from serum for example, miRNA can be used, but there is no limit to the number and combination of miRNAs.
  • the sequence variation of the selected miRNA the number of types in which sequence variation occurred in the subject, i.e., the target, is counted, and the number is used to distinguish between healthy subjects and cancer patients.
  • ADAR1 is an enzyme that converts adenosine (A) in double-stranded RNA to inosine by hydrolytic deamination. Since the structure of inosine is similar to guanosine (G), one of the components of DNA, it is recognized as guanosine during translation. In other words, in terms of gene sequence, it results in a phenotype equivalent to the A to G mutation. Alternatively, a C to U conversion is also known, but this is not limited to these. It is also possible to limit the position on the gene where sequence variation occurs to a specific location.
  • a site where diversity has been shown to exist as SNPs due to the race of the test subjects, etc. is a possible method of limitation in which it is not considered as a sequence variation caused by cancer, since it is known in advance that a certain percentage of test subjects have the variation.
  • the areas where sequence variation occurs biologically or is unlikely to occur are known, it is possible to limit the areas of particular interest depending on the likelihood of occurrence and the reason for it, but this is not limited to this.
  • the process of determining the number of sequence variations of miRNA in body fluids mainly involves (i) collecting a sample from a subject, (ii) extracting miRNA from the sample, (iii) sequencing the target miRNA, and (iv) determining the type of miRNA. (V) detecting the presence or absence of sequence variation within each type of miRNA, and typical methods thereof are described below, but are not limited to these. Furthermore, it is preferable that the disease determination step of identifying the presence or absence of cancer based on the number of sequence variations consists of (VI) setting a threshold value (VII) comparing the size with the threshold value, and a typical method is described below. However, it is not limited to these.
  • Sample collection from the subject The samples used for measurement are collected from the subject and are not particularly limited, and include, for example, blood, serum, plasma, white blood cells, urine, digestive juices, saliva, Gastric fluid, sweat, tears, nasal mucus, semen, vaginal fluid, amniotic fluid, milk, lymph fluid, tissue, oral mucosa, sputum, etc. can be used.
  • the sample is subjected to treatments such as centrifugation, precipitation, extraction and/or separation to render it suitable for nucleic acid amplification. Further, if the collected sample is suitable for nucleic acid amplification as it is, the collected sample may be used as a specimen.
  • Nucleic acid extraction can be performed using commercially available nucleic acid extraction kits such as NucleoSpin (registered trademark) miRNA Plasma (manufactured by Takara Bio), Quick-cfRNA Serum & Plasma Kit (Zymo), but is not limited to these.
  • NucleoSpin registered trademark
  • miRNA Plasma manufactured by Takara Bio
  • Zymo Quick-cfRNA Serum & Plasma Kit
  • a single molecule sequencer such as MiSeq or NextSeq550 manufactured by Illumina, or a single molecule sequencer manufactured by Pacific Biosciences can be used, but is not limited thereto.
  • a single molecule sequencer such as MiSeq or NextSeq550 manufactured by Illumina, or a single molecule sequencer manufactured by Pacific Biosciences can be used, but is not limited thereto.
  • By performing alignment using, for example, the human genome sequence as a reference it is possible to classify sequences according to the type of miRNA. BWA, bowtie, bowtie2, etc. can be used for alignment, but are not limited thereto.
  • primers are designed according to the type of miRNA and the sequence is determined. Alternatively, if the sequence before and after the sequence variation has been determined, by designing a primer specific to the sequence after the sequence variation, if the sequence can be decoded with that primer, it can be determined that the sequence variation has occurred. You can also. In that case, qPCR method, digital PCR method, etc. can be used. Alternatively, a microarray provided with probes specific for sequence variations can also be used.
  • the threshold can be set, for example, by using a ROC (receiver operating characteristic test) curve, or by considering the effects of false positives and false negatives. There are methods to take these factors into consideration, but they are not limited to these methods and may vary depending on the design of the inspection.
  • the ROC curve plots sensitivity on the X-axis (1-specificity) and sensitivity on the Y-axis, and an ideal test (100% sensitivity, 100% specificity) would be located in the upper left corner.
  • the usefulness of a test can be evaluated by the area under the curve (AUC).
  • the threshold is set using the Youden Index, which selects the threshold that maximizes (sensitivity + specificity), and the distance from the upper left corner of the ROC curve ((1-sensitivity) 2 + (1-specificity) 2 ).
  • Youden Index which selects the threshold that maximizes (sensitivity + specificity), and the distance from the upper left corner of the ROC curve ((1-sensitivity) 2 + (1-specificity) 2 ).
  • There are two types of methods for selecting the threshold value that minimizes When setting thresholds using these methods, false positives and false negatives are generally of equal importance.
  • the threshold value can be set with greater consideration given to the weighting of false negatives relative to false positives.
  • statistical software such as EZR (Bone Marrow Transplantation 2013: 48, 452-458) or JMP can be used.
  • Example 1 Discrimination using sequence variations in serum nucleic acids between cancer patients and healthy individuals as an index is described below.
  • the number of samples was 30 serum samples from healthy individuals and 346 samples from cancer patients.
  • the breakdown of cancer patient samples was 24 breast cancer samples, 24 colorectal cancer samples, 24 gastric cancer samples, 18 lung cancer samples, 24 ovarian cancer samples, 24 pancreatic cancer samples, 24 biliary tract cancer samples, 24 esophageal cancer samples, 3 liver cancer samples, and brain tumor samples.
  • the nucleic acid sequence in the serum was determined by next-generation sequencer analysis. miRNA was extracted from 300 ⁇ L of all serum using miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen). Extracted miRNA was performed using QIAseq miRNA Library Kit (Qiagen) and QIAseq miRNA NGS 96 Index IL (Qiagen) according to the protocol.
  • the index used uses a molecular barcode technology called UMI, which eliminates the effects of PCR duplication and amplification bias caused by gene amplification associated with library preparation, and enables more accurate sequencing.
  • NGS analysis was performed using NextSeq500 (single-end, 75 bp), and more than 10 million reads of data were obtained for all samples.
  • a FASTQ file with UMI removed was obtained using the extract command of UMI-tools (Genome Res. (2017) 27(3):491-499. PMID: 28100584).
  • miRBase Release 22 As a sequence classification according to the type of miRNA, annotation was performed for miRBase Release 22. In addition, the sequence of miRBase Release 22 was set as a wild type, that is, a sequence in which no sequence variation occurred. We particularly focused on the 10 bp of the 5' end of miRNA as a candidate for sequence variation. A region called a Seed sequence exists at about 7 bp from the 2nd to 8th bases from the 5' end of miRNA.
  • This region is considered to be important for miRNA to exert its function, and the occurrence of sequence variations dependent on an individual's genetic information is thought to be low.
  • ADAR1 A-to-I RNA editing enzyme
  • Sequences in which A-to-I mutations can be introduced into miRNAs are compiled in a database (MiREDiBase [cited]), and when we obtained a list of mutations that met the conditions, there were 611 types of sequence variation candidates for 388 types of miRNA. Sequence information for the miRNA of interest was extracted from the annotation results of the NGS analysis results, and each sample was analyzed to see if there were any sequence variations that matched the database.
  • the ROC (receiver operating characteristic) curve plots sensitivity on the x-axis (1 - specificity) and sensitivity on the y-axis; in an ideal test (100% sensitivity, 100% specificity) It will be located in the upper left corner.
  • the usefulness of the test can be evaluated by the area under the curve (AUC).
  • AUC area under the curve
  • the AUC value was 0.887 (95% confidence interval 0.841-0.934).
  • the sensitivity was 84.7%
  • specificity was 83.3%
  • positive predictive value was 98. .3% (FIG. 13(c)), showing high discrimination performance and demonstrating high performance as a discrimination system for cancer and healthy people.
  • Example 2 The following describes a method for identifying sequences using sequence variation in serum nucleic acids between cancer patients and healthy individuals as an indicator, in situations where there is no prior information on sequences where sequence variation occurs.
  • the NGS analysis data described in Example 1 is used. Instead of using prior data as candidates for sequence variation, we used actual NGS sequence information in which sequence variation was detected.
  • NGS sequence variation uses the miRBase Release 22 sequence as a wild type, that is, a sequence in which no sequence variation has occurred, and comprehensively detects miRNAs with sequence variations and variation patterns in a population aligned to the same miRNA. I used it.
  • VCF file miRNAs with sequence variations and their variation patterns were output. At this time, as in Example 1, we focused on the 10 bp of the 5' end of miRNA, and were able to select 310 types of sequence variation candidates. The results are shown in FIG.
  • the AUC value was 0.854 (95% confidence interval 0.802-0.906).
  • the sensitivity is 76.9%
  • the specificity is 90.0%
  • the positive predictive value is 98. .9% (FIG. 14(c)), showing high discrimination performance, indicating that it is a high-performance discrimination system for cancer and healthy people.
  • Example 3 Among the methods for identifying cancer patients and healthy individuals using sequence variations in serum nucleic acids as indicators, methods using selected markers are described below.
  • the NGS analysis data described in Example 1 is used.
  • the AUC value was 0.953 (95% confidence interval 0.931- 0.976).
  • the results are shown in FIG.
  • the sensitivity is 84.4%
  • specificity is 96.7%
  • positive predictive value is 99. .7% ( Figure 15(c))
  • Figure 15(c) showed high discrimination performance even when verified using a limited number of miRNAs, indicating high performance as a system for distinguishing between cancer and healthy individuals.
  • RNA that have sequence variation due to RNA editing compared to a reference sequence
  • count the number of types of RNA in a sample derived from the subject and calculate the number of types of RNA obtained.
  • a method for analyzing the possibility of a subject suffering from cancer including determining the possibility of the subject suffering from cancer using an index.
  • the sample derived from the subject is a body fluid
  • the counting and determination are the following steps: a sample data acquisition step of acquiring information regarding sequence variation from a reference sequence from the body fluid; a feature extraction step of counting the number of types of RNA in which the sequence variation exists;
  • the method for analysis according to [1] comprising a disease determination step of identifying the possibility of cancer disease using the number of types of RNA in which the sequence variation exists as an index.
  • the method according to [1] or [2] further comprising comparing the number of RNA types from the subject and the number of RNA types obtained from a sample derived from a non-cancer person.
  • RNA types from the subject is greater than the number of RNA types from non-cancer individuals, the subject is identified as having a high possibility of having cancer, and If the number of RNA types from a non-cancer person is less than or equal to the number of RNA types from a non-cancer person, the subject is identified as having a low possibility of suffering from cancer, [3] The method described in. [5] The method according to any one of [2] to [4], wherein the body fluid is blood, serum, or plasma. [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the RNA is miRNA, mRNA, tRNA, or piRNA.
  • RNA is miRNA.
  • sequence variation is caused by RNA editing.
  • sequence variation is caused by an RNA editing enzyme.
  • sequence variation is a base substitution.
  • RNA contained in a sample derived from a subject according to the homology of its sequence to a reference sequence Determining a representative sequence group having the same sequence in the RNA population classified with respect to each reference sequence; Comparing each sequence of the representative sequence group with the corresponding reference sequence to detect sequence variation, and counting the number of types of representative sequences having the sequence variation;
  • a method of analyzing a subject's likelihood of developing cancer including: [12] The cancer is breast cancer, colon cancer, lung cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, sarcoma, prostate cancer, bile duct cancer, bladder cancer, or esophagus cancer.
  • each representative sequence group having the same sequence in the RNA population classified according to the sequence Determining each representative sequence group having the same sequence in the RNA population classified according to the sequence; Comparing each sequence of the representative sequence group with each corresponding reference sequence for a sample derived from the subject or cancer patient and a sample derived from the control, and detecting each sequence variation; counting the number of types of representative sequences having the sequence variation, and comparing the number of types of representative sequences counted between the subject or cancer patient and the control; The method for analyzing the possibility of a subject suffering from cancer according to [1] to [12], further comprising determining a threshold that separates the method from a control.
  • RNA contained in a sample derived from a subject according to the homology of its sequence to a reference sequence Determining a representative sequence group having the same sequence in the RNA population classified with respect to each reference sequence; A method for detecting sequence variation comprising: comparing each sequence of the representative sequence group with a corresponding reference sequence to detect each sequence variation; and counting the number of types of sequence variation.
  • the method according to [17] in which it is possible to identify, together with sequence information of the representative sequence, that sequence variation has occurred in a specific representative sequence compared to the corresponding reference sequence.

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Abstract

実施形態のがん罹患の可能性を分析する方法は、参照配列に比較して、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象に由来する試料中の当該ＲＮＡの種類数をカウントすること、得られた当該ＲＮＡの種類数を指標にして当該対象のがん罹患の可能性を判断することを含む。

Description

対象のがん罹患の可能性を分析する方法
　本発明の実施形態は、対象のがん罹患の可能性を分析する方法に関する。
　採取が容易な体液から分離される核酸を解析することでがん罹患者と健常者を識別する系が知られている。例えば、広く検証されている系は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を用いた識別系である。ｍｉＲＮＡは、１７～２５塩基程度の一本鎖核酸であり、遺伝子発現を調節する機能を持つことが明らかにされている。その種類や発現量は、種々の疾患において、初期の段階から変化していることが報告されている。例えば、がん患者では、種々のｍｉＲＮＡ量が、がんマーカーとして使用されており、健常者と比較して増加、或いは減少していることが知られている。これらの知見は、被験者ががんか否かを知るための手段として、被検者から採取された試料中の目的とするｍｉＲＮＡを定量的に調べることを提案している。
特開２０２０－２０２７６８号
　本発明が解決しようとする課題は、より簡便に、早期段階のがんを検出することが可能な方法を提供することである。
　実施形態のがん罹患の可能性を分析する方法は、参照配列に比較して、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象に由来する試料中の当該ＲＮＡの種類数をカウントすること、得られた当該ＲＮＡの種類数を指標にして当該対象のがん罹患の可能性を判断することを含む。
図１は、第１の実施形態を示すスキーム図である。 図２は、第１の実施形態の１例について説明する図である。 図３は、第２の実施形態の１例を示すスキーム図である。 図４は、第２の実施形態の更なる１例を示すスキーム図である。 図５は、第３の実施形態を示すスキーム図である。 図６は、第４の実施形態の１例を示すスキーム図である。 図７は、第４の実施形態の１例を示す図である。 図８は、第４の実施形態の１例を示す図である。 図９は、第５の実施形態を示すスキーム図である。 図１０は、第５の実施形態の１例を示す図である。 図１１は、第５の実施形態の更なる例を示す図である。 図１２は、第５の実施形態の更なる例を示す図である。 図１３は、例１の結果を示す図である。 図１４は、例２の結果を示す図である。 図１５は、例３の結果を示す図である。
実施形態
　以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
　（第１の実施形態）
　本願の実施形態に係る分析方法は、ＲＮＡ編集に基づく配列変動がＲＮＡ群においてどのように存在しているのかを明らかにすることによって、がん罹患者と非がん者とを識別できる知見を得たことにより達成されたものである。この発見により、対象のがん罹患の可能性を定量ではなく、定性的に分析することが可能になる。それによって、より簡便に、ひいては、より安価に、早期段階でがんを発見することが可能である。例えば、遺伝子を定量する必要がないので、定量性能を担保する必要がない。当該分析方法は、非常に独創的な発見に基づいた飛躍的且つ画期的な方法である。
　第１の実施形態について、図１を用いて説明する。この実施形態は、対象のがん罹患の可能性を分析する方法である。当該分析方法は、参照配列に比較して、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象に由来する試料中のその数、即ち、種類数をカウントすること、得られた種類数を指標にして当該対象のがん罹患の可能性を判定することを含む。
　ＲＮＡ編集（RNA editing）とは、ＤＮＡから転写されたＲＮＡ、又は転写中のＲＮＡの塩基配列を置換したり、１～数塩基を挿入したり、削除したりする、動植物における機構である。ＲＮＡ転写後の修飾の１つとも考えられており、様々な生体プロセスの制御に係わっていることが報告されている。図２を用いて、代表的なＲＮＡ編集の例について説明する。即ち、代表的なＲＮＡ編集の例は、（１）Ａ－ｔｏ－Ｉ　ＲＮＡ編集、（２）Ｃ－ｔｏ－Ｕ　ＲＮＡ編集、（３）１～数塩基の挿入、（４）１～数塩基の削除（欠失）などである。Ａ－ｔｏ－Ｉ　ＲＮＡ編集（adenosin to inosin editing）は、ＡＤＡＲ酵素によるＲＮＡ編集である。アデノシン（Ａ）のアミノ基を加水分解し、イノシン（Ｉ）に置換するものであり、翻訳時には、化学構造が類似しているグアノシン（Ｇ）として認識される。Ｃ－ｔｏ－Ｕ　ＲＮＡ編集（cytidine to uridine editing）は、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）に置換されるものである。当該分析方法においては、ＲＮＡ編集の機序は問わず、参照配列に照らして、配列変動が存在するＲＮＡについて、試料中の種類数がカウントされればよい。
　参照配列は、ＲＮＡ編集による配列変動が発生していない配列であればよく、例えば、対応する野生型の配列であり得る。野生型の配列の情報は、例えば、ＲＮＡの種類に応じた遺伝子バンク、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ又はＮＣＢＩなどの全ての遺伝子データが集まるデータベースや、ｍｉＲＮＡのデータベースであるｍｉＲＢａｓｅなど特定の種類のＲＮＡの情報を収集しているデータベースを利用しても、参照してもよく、また情報の更新があれば所望に応じて最新の情報を参照し得る。また、参照配列は、特定の全長ＲＮＡであっても、特定のＲＮＡの部分配列であっても、その組み合わせであってもよい。
　対象由来の試料とは、対象から採取された細胞、組織及び／又は液体、或いは、それらの混合物、それらを適切に処理することにより得られた処理物等を含む。試料が体液である場合、例えば、血清又は血漿であってよく、或いはその他の体液、例えば、血液、白血球間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、鼻腔内粘膜、鼻水、咽頭粘膜、喀痰、消化液、胃液、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液、膣液又はそれらの混合物等であってもよい。或いは、試料は、組織若しくは細胞、又はそれらの混合物等であってもよい。また試料は、対象から採取された直後のもの、培養されたもの、所望の手続きで保存されたもの、或いはそれらを所望の液体中に維持した後に得られるその上清であってもよい。採取が容易であるので、血液、血清及び血漿などの体液を対象由来の試料とすることは好ましい。
　試料についてのＲＮＡに関する情報は、試料からＲＮＡを抽出した後に行われ得る。ＲＮＡの抽出方法は、それ自身公知の方法により行われてよく、例えば、市販のキットを使用することも可能である。
　対象は、本方法において分析に供される動物、即ち、試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、がんに罹患している可能性がある動物、或いは過去にがんに罹患したことのある動物等であってもよく、特に、乳がんに罹患している可能性がある動物、或いは過去に乳がんに罹患したことのある動物等であってもよい。対象はヒトであることが好ましい。
　或いは、対象は他の動物であってもよい。他の動物は、例えば哺乳動物であり、例えば、サル等の霊長類、マウス、ラット又はモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ又はウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ又はブタ等の家畜動物、或いは展示動物等に属する動物を含む。
　当該分析方法では、対象に由来する試料中に含まれる母集団ＲＮＡのうち、何種類のＲＮＡが、ＲＮＡ編集に基づく配列変動を有しているのか、種類数をカウントし、得られた種類数を指標にして対象のがん罹患の可能性を判断する。当該分析方法においては、配列変動を有するＲＮＡについて、特定のＲＮＡ種の発現量やコピー数を量るのではなく、対象からの試料に含まれるＲＮＡのうち、ＲＮＡ編集によって、参照配列とは異なる配列を有する、即ち、配列変動を有するＲＮＡが何種類あるのか、その数をカウントする。詳しくは後述するが、種類数のカウントは、例えば、特定のカテゴリーのＲＮＡを網羅的に調べ、カウントしてもよく、特定又は任意のＲＮＡ母集団を設定し、それらについて網羅的に調べてカウントしてもよい。例えば、ＲＮＡ母集団に含まれるＲＮＡ分子の数は、例えば、使用するデータベースに登録される数としても、或いは、そこから任意に選択してもよい。例えば、現時点のｍｉＲＢａｓｅには、２７１の生物種に対して３８５８９のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが、４８６０のｍｉＲＮＡが登録されている。そのうち、ヒトゲノムは、１９１７のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、２６５４のｍｉＲＮＡが登録されている。これらの数をＲＮＡ母集団に含まれるＲＮＡ分子の数とし得るが、これらに限定されるものではない。例えば、特定のＲＮＡ母集団を形成する場合、例えば、対象とするｍｉＲＮＡの数を制限する方法であれば、発現量が単純に多いものから選ぶ方法や、検体間で発現量のばらつきの小さいものから選ぶ、あるいは変異の比率の高いものから選ぶ、検体間の変異の比率のばらつきが小さいものから選ぶなどの基準が考えられるが、これらに限定されるものではない。また、ＲＮＡの長さは、例えば、ｍｉＲＮＡであれば、約１７塩基長～約２５塩基長であり得るが、これらに限定されるものではない。またＰｒｅ－ｍｉＲＮＡであれば、例えば、約６０塩基対～約７０塩基対であり得る。ＲＮＡの長さは、例えば、ｍｉＲＮＡであれば、１７塩基長～２５塩基長であり得るが、これらに限定されるものではない。またＰｒｅ－ｍｉＲＮＡであれば、例えば、６０塩基対～７０塩基対であり得る。
　カウントされるＲＮＡは、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在し得るＲＮＡ種であればよく、例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ（non-coding RNA）、ハウスキーピング　ｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、スモールｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｓＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡなどであってもよい。これらのＲＮＡは、カテゴリー包括的にカウントされてもよく、幾つかのカテゴリーが混合している状態でカウントされてもよく、特定のカテゴリーのＲＮＡについてカウントされてもよい。例えば、特定のカテゴリーのＲＮＡをカウントする場合には、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、スモールｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｓＲＮＡなどであってよく、例えば、それらのうちの少なくとも２カテゴリーの混合物であってもよい。或いは、そのような特定のカテゴリーのＲＮＡは、例えば、ｍｉＲＮＡであってよい。配列変動を有するＲＮＡについて、特定のＲＮＡ種の発現量やコピー数ではなく、ＲＮＡ群に分布しているＲＮＡの種類の数をカウントし、得られた種類数に基づいて対象のがん罹患の可能性の高さが判断され得る。
　ＲＮＡ編集による配列変動をより精度よく追跡するためには、転写以前の核酸、例えば、ゲノム上で起こり得る配列変動や多様性、例えば、多型、変異、置換、欠失、挿入などの頻度が低く、影響が出にくい部位、例えば、高度に保存された配列、又は高度に保存された部位の配列若しくはそれを含む配列を選択してもよい。例えば、ｍｉＲＮＡであれば、シード配列を称される５’末端の１位～１０位には、一般的に一塩基多型などの存在確率が低く、配列変動性が低いため高い有用性があるといえる。
　対象のがん罹患の可能性を分析するとは、例えば、対象ががんを罹患している可能性があるのか否かを判定すること、対象ががんを罹患している可能性が高い又は低いことを判定すること、対象ががん罹患者であるのか、非がん者であるのかを識別することなどであってもよい。第１の実施形態によれば、対象ががんに罹患している可能性の高さを客観的な比較基準に基づいて機械的及び／又は自動的に決定することが可能である。例えば、対象のがん罹患の可能性を分析する方法は、例えば「対象ががんに罹患している可能性に関する情報を取得する方法」との言い換えることが可能である。取得された情報は、例えば、医師が医療目的で「対象」である人間の病状や健康状態等について判断、即ち、診断するために利用することが可能である。このような医師による「判断」、即ち「診断」を「対象における標的がん群の罹患の有無の判定」であるとすれば、当該実施形態は、「医師」によるこのような医療目的での「対象におけるがんの罹患の有無の判定」を「補助する分析方法」であるともいえる。
　例えば、判定は、予め設定した閾値よりも大きい数の種類数があった場合に、対象ががんを罹患している可能性が高いとすることができる。或いは、予め設定した閾値よりも小さい数の種類数があった場合に、対象ががんを罹患している可能性が低いとすることもできる。閾値の設定は、母集団ＲＮＡ及び参照配列を対応させて、非がん者に由来する試料を用いてえられた結果と代表的ながん罹患者に由来する試料を用いて得られた結果とを予め比較することにより決定されてもよい。
　本明細書においてがんは、何れの病期のものも含み、例えば、発生母地の臓器内にがんが留まった状態、更に周辺の組織までがんが及んだ状態、更にリンパ節へがんが転移した状態、及び更に離れた臓器へのがんの転移がある状態等を含む。また本明細書において乳がんは、乳腺組織に形成される悪性腫瘍（新生物）をいう。例えば、乳がんは、一般に「乳癌」又は「乳がん」と称されるものも含む。また、実施形態に従う乳がんは、何れの種類の乳がんも含み、例えば乳腺小葉がん又は乳管がんを含む。また、実施形態に従う乳がんは、例えば上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、並びに上皮性及び非上皮性の両方からなる悪性葉状腫瘍を含む。
　例えば、がんは、乳がん、大腸がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮がん、卵巣がん、肉腫、前立腺がん、胆管がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、腎臓がんからなる群から選択される少なくとも一種のがんであり得る。
　本実施形態の方法は、定量試験ではなく、定性試験であることで定量性能を担保する必要がないので、臨床開発の時間的経済的効率に優れている。
　例えば、健康診断等で容易に採取できる血清または血漿を試料として用いることが可能である。そのため、例えば、対象から採取された血清を用いて、健康診断時のがんの一次スクリーニングとして、包括的に、即ち、ユニバーサルに検出することが可能である。がんを早期に発見することができる。血清または血漿等を用いることで、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。
　（第２の実施形態）
　第２の実施形態は、対象のがん罹患の可能性を分析する方法である。当該分析方法は、対象からの試料について第１の実施例に示したように種類数をカウントするのに加えて、対象、例えば、非がん対照からの試料についても同様に種類数をカウントする。得られた種類数を指標にして、この実施形態において、対象からの種類数と非がん対照からの種類数とを比較することで、当該対象のがん罹患の可能性を判断する。
　対照は、例えば、健常体であり得る。健常体とは、少なくともがんに罹患していない個体であってよい。健常体は、疾患や異常を有さない健康な個体であることが好ましい。対照として選択される個体は、本方法で分析される対象とは別の個体であってもよく、同じ種に属する個体、即ち対象がヒトであればヒトであることが好ましい。また、対照の年齢、性別及び身長体重等の身体的条件又は人数は特に限定されるものではないが、身体的条件は、本分析方法で検査を受ける対象のものと同じ又は類似であることが好ましい。或いは、経時的に対象由来の試料を採取し、対象が、健常体である場合の検査結果を対照、非がん者若しくは非がん対照として使用してもよい。
　図３を用いて、第２の実施形態としての当該分析方法の１例について概念的に説明する。第２の実施形態の１例として、ヒトを対象として、ＲＮＡは、特定のカテゴリーとしてのｍｉＲＮＡを選択し、カウントする例を示している（図３、Ｓ３１（ａ）、Ｓ３２Ａ、Ｓ３２Ｂ）。ここでは、対象は対象者、対照は非がん対照者、母集団ＲＮＡは母集団ｍｉＲＮＡと表している。また図３には、比較例として一般的な定量試験の１例についても概念的に示した（図３、Ｓ３１（ｆ）、Ｓ３２Ａ（ｇ）、Ｓ３２Ｂ（ｈ））。
　まず、最初に、対象者からの試料（ａ）と非がん対照者からの試料（ｆ）を準備する（Ｓ３１）。これらの試料に含まれる特定のカテゴリーのＲＮＡを母集団として、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象者と非がん対照者に由来する試料中の種類数をカウントする（Ｓ３２Ａ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２））。この例では、母集団ｍｉＲＮＡは、血清中に存在するｍｉＲＮＡを網羅的に分類して分析し、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類をカウントした例を示す。母集団ｍｉＲＮＡのうちの５種類、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２、ｍｉＲ－３、ｍｉＲ－４及びｍｉＲ－５を代表的に図３に示し、他の画分については省略している（Ｓ３２Ａ（ｂ））。この場合の判定基準は、非がん対照者よりも多くの種類のｍｉＲＮＡにＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在した場合に、対象者はがんに罹患している可能性が高いと識別する。
　以下、便宜的にコピー数にまで言及してシミュレーションする。非がん者の試料においては、ｍｉＲ－１は３コピー、ｍｉＲ－２が２コピー、ｍｉＲ－３が６コピー、ｍｉＲ－４が０コピー、ｍｉＲ－５が２コピーとして、血清中に分泌しているとする（Ｓ３２Ａ（ｂ１））。そのうちのｍｉＲ－３の２コピーにＲＮＡ編集が見られている（それぞれｘ印）。この場合、非がん者由来の試料におけるＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡは、１種類、即ちｍｉＲ－３のみである。これに対して、対象者ががん罹患者であったことを仮定してシミュレーションした結果を示す。対象者では、ｍｉＲ－１は１２コピー、ｍｉＲ－２が９コピー、ｍｉＲ－３が１０コピー、ｍｉＲ－４が５コピー、ｍｉＲ－５が９コピーとして、血清中に分泌している（Ｓ３２Ａ（ｂ２））。そのうちのｍｉＲ－１の２コピー、ｍｉＲ－２の１コピー、ｍｉＲ－３の３コピー、ｍｉＲ－４の１コピーにＲＮＡ編集が見られる（それぞれｘ印）。従って、対象者由来の試料におけるＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡは、ｍｉＲ－１～ｍｉＲ－４の４種類である。比較すると、対照者の１種類に比べて、対象者は４種類であり、種類数が多い。この結果から、対象者はがんに罹患している可能性が高いと識別される。
　当該分析方法は、定性試験であり、ここで使用される母集団ｍｉＲＮＡに含まれる各種類のｍｉＲＮＡの配列、標的、機能及び表現型などの特性は、一切考慮することなく、単にＲＮＡ編集に基づく変異があるのか、もしくはないのか、を判定し、且つその種類について、非がん対照者と対象者との間で数を比較することによって、対象者の「がん」である可能性の高低を判定することができる。
　これに対して、一般的に知られる特定の種類のｍｉＲＮＡをがんマーカーとして使用し、対象の「がん」の可能性の高低を判定する場合には、定量試験が行われている。即ち、図３（ｇ）に示すように、対象者からの試料（ａ）と非がん対照者からの試料（ｆ）を準備し
（Ｓ３１）、その後、非がん者の試料に含まれる特定のｍｉＲＮＡ（ここでは便宜的にｍｉＲ－０と示している）の発現量（Ｓ３２Ａ（ｇ１））と、対象者の試料に含まれる対応するｍｉＲＮＡ（ここでは、ｍｉＲ－０）の発現量（Ｓ３２Ａ（ｇ２））とを比較する。そして、比較の結果、例えば、対象者からの試料のｍｉＲ－０が対照者よりもその量が多い場合に、対象者は「がん」である可能性が高いと判定される。
　本実施形態の分析方法において、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類数をカウントすることは、例えば、Ｓ３２Ｂに示すように、がん組織中の変異頻度と血清中へのｍｉＲＮＡの分泌量との両方の情報を含んでいるともいえる。言い換えると、一般的に定量試験の場合、例えば、血清中へのｍｉＲＮＡの分泌量が、正常細胞で少なく、がん細胞で多いという情報（Ｓ３２Ｂ（ｈ））、がん組織中の変異頻度が正常細胞で少なく、がん細胞で多いという情報（Ｓ３２Ｂ（ｉ））を掛け合わせた情報が血清中のｍｉＲＮＡで変異が検出されるｍｉＲＮＡの種類数、正常細胞では（少ない×少ない）、がん細胞では（多い×多い）となる（Ｓ３２Ｂ（ｃ））。これにより、結果が強調されることにより、より見やすい結果となり得る。また、濃度ではなく個数を指標とした定性試験となり得る。
　上述のような第２の実施形態は、図４のスキーム図に示しているように、参照配列に比較し、ＲＮＡ変種に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象に由来する試料中の種類数をカウントする（Ｓ４１）ことと、得られた種類数と、対照に由来する試料から得られた種類数とを比較して、その結果を基に当該対象のがん罹患の可能性を判断する（Ｓ４２）ことを備えていてもよい。
　母集団となるｍｉＲＮＡは、それ自体公知の何れのｍｉＲＮＡのデータベースを利用して、或いは公知の発見ツールなどを利用して独自にデータベースを作製した後に、それらのデータベースに含まれる任意の種類のｍｉＲＮＡから任意に選択、設計及び／又は設定すればよい。ｍｉＲＮＡのデータベースの例は、ｍｉＲＮＡＢａｓｅ，Ｒｆａｍ、ｍｉＲＩＡＤ、ｄｂＤＥＭＣなどであってもよい。発見ツールの例は、ｍｉＲｓｃａｎ、ｍｉＲＮＡＦｏｌｄ、ｍｉＲＤｅｅｐ、ｍｉＲａｎａｌｙｚｅｒ、ＣｈＩＰＢａｓｅ、ｓＲＮＡｂｅｎｃｈなどであってもよい。或いは、ＭｉＲＥＤｉＢａｓｅ（ｍｉＲＮＡ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　Ｄａｔａｂａｓｅ）などのＲＮＡ編集に基づく変異を起こし得る配列が登録されているｍｉＲＮＡのデータベースから任意に選択されてもよい。母集団に含まれるｍｉＲＮＡの数は、例えば、３００種以上、４００種類以上、５００種類以上、６００種類以上であってよい。
　第２の実施形態は、本発明者らが、低侵襲に採取できる体液から核酸を分離し、その配列変動を利用して健常者とがん罹患者を識別できることを見出したことに基づく。言い換えると、第２の実施形態により、低侵襲に採取できる体液から核酸を分離し、その配列変動を利用して健常者とがん罹患者を識別することが可能である。また、定量試験ではなく、定性試験であることで定量性能を担保する必要がないので、臨床開発の時間的経済的効率に優れている。また例えば、対象から採取された血清を用いて、健康診断時のがんの一次スクリーニングとして、包括的に、即ち、ユニバーサルに検出することが可能である。
　（第３の実施形態）
　第３の実施形態である対象のがん罹患の可能性を分析する方法を図５に示した。当該方法は、３つの工程、試料データ取得工程（Ｓ５１）と、特徴抽出工程（Ｓ５２）と、罹患判定工程（Ｓ５３）とを備える。試料データ取得工程では、参照配列からの配列変動に関する情報を、対象から得られた体液から取得する（Ｓ５１）。参照配列から配列変動に関する情報とは、体液中に含まれるＲＮＡについての情報である。特徴抽出工程では、配列変動が存在するＲＮＡの種類数をカウントする（Ｓ５２）。罹患判定工程では、配列変動が存在するＲＮＡの種類数を指標として、がん罹患の有無の可能性を決定する。或いは、この罹患判定工程は、当該指標を用いて、対象が、がん罹患者であるのか、非がん者であるのかを識別される工程であってもよい。
　本実施形態の方法が、定量試験ではなく、定性試験であることで定量性能を担保する必要がないので、臨床開発の時間的経済的効率に優れている。
　例えば、健康診断等で容易に採取できる血清または血漿を試料として用いることが可能である。そのため、例えば、対象から採取された血清を用いて、健康診断時のがんの一次スクリーニングとして、包括的に、即ち、ユニバーサルに検出することが可能である。これによりがんを早期に発見することができる。血清または血漿等を用いることで、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。また、血清又は血漿は、そこに含まれるＲＮＡ濃度、例えば、ｍｉＲＮＡ濃度が安定しているため、より正確な検査を行うことが可能である。
　（第４の実施形態）
　第４の実施形態である対象のがん罹患の可能性を分析する方法を図６に示す。当該分析方法は、４つの工程を含む。まず、対象に由来する試料に含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって分類する（Ｓ６１）。次に、各参照配列に対して分類されたＲＮＡ集団で同一の配列をもつ代表配列群を決定する（Ｓ６２）。代表配列群の各配列を対応する参照配列と比較し、配列変動をそれぞれ検出する（Ｓ６３）。更に、配列変動を有する当該代表配列の種類数をカウントする（Ｓ６４）。この方法はまた、配列変動を検出する方法として使用され得る。配列変動を検出する方法は、対象に由来する試料に含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって分類すること、各参照配列に対して分類されたＲＮＡ集団で同一の配列をもつ代表配列群を決定すること、代表配列群の各配列を対応する参照配列と比較し、配列変動をそれぞれ検出すること、を備え得る。更に、特定の代表配列が、対応する参照配列に比較して配列変動が生じていることを、当該代表配列の配列情報と共に識別可能な配列変動を検出する方法でもあり得る。
　ＲＮＡ配列の相同性によって分類するとは、情報を得ようとするＲＮＡの特定の部位の配列について、相同性の高い配列同士を１グループに分類することにより、複数のグループを作るということである。その際に、参照配列（データベースから入手した既知の配列）をグループの基準の配列として使用する。相同性による分類は、例えば、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）、ｑＰＣＲ、サンガー、ＲＮＡ検出用のマイクロアレイ、及びハイブリダイゼーションなどを使用することによって行われ得る。或いはこれらの手法を少なくとも２つ組み合わせて使用することにより行われてもよい。
　例えば、ｍｉＲＮＡについて、次世代シーケンサーを使用して網羅的に分析する例のイメージを図７～図１１に示す。図７（ａ）に示すように、試料は、健常者３０例、乳がん２４例、肺がん１８例、大腸がん２４例、子宮がん２４例、胃がん２４例、すい臓がん２４例、前立腺癌２４例、卵巣癌２４例、腎臓がん２４例、脳腫瘍２４例、子宮頸がん１３例、胆管がん２４例、食道がん２４例、膀胱がん２４例、肉腫２４例及び肝臓肝３例から採取した血清を用いた。図７（ｂ）に示すように、分析したｍｉＲＮＡは、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｃ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｃ－５ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｄ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｆ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈａｓ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０３ａ－２ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０３ｂ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０３－５ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０６ａ－５ｐ、ｈａｓ－ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐを含む２６５４種類である。まず、これらのｍｉＲＮＡについて、健常者及びがん罹患者について１例ずつ、次世代シーケンサーにより定量した。図７（ｂ）には、その結果の一部分を示している。ｍｉＲＮＡの名前をカラムＡに、カラムＣ、Ｄ、Ｅ…と、３０例の健常者、各がんの罹患者データを並べて示している。これは、対象に由来する試料に含まれるRNAが、その配列の相同性によって、分類された状態である。
　次に、分類された集団それぞれ（＝各miRNA、例えばAGCTAGCT）で参照配列に対して配列変動を持つかどうかを決定するために、分類された各集団の代表配列群（= AGCTAGCT（野生型）あるいは変異型AGCTGGCTあるいはAGCTAGTT）のうち、参照配列に対して配列変動を持つ配列（＝変異型AGCTGGCTあるいはAGCTAGTT）を１つあるいは複数選んだ。各集団から選ばれた配列変動を持つ配列を候補リストと定めた。すなわち、候補リストは集団名と配列変動を持つ配列情報から成る。候補リストと同一の集団に選ばれた配列変動を持つ配列と同一の配列（＝AGCTGGCTあるいはAGCTAGTT）を持つ場合に、その候補に対して変異を持つと判定した。図８（ｃ）の表は、図７（ｂ）からのデータの一部分であり、５例の健常者と６例のがん罹患者について、予め作製されたｍｉＲＮＡ変異候補リストに含まれる種類のｍｉＲＮＡについて変異の有無を決定する。図８（ｃ）においては、ｍｉＲＮＡ＿ｍｕｔａｎｔ＿１、ｍｉＲＮＡ＿ｍｕｔａｎｔ＿２、ｍｉＲＮＡ＿ｍｕｔａｎｔ＿３、ｍｉＲＮＡ＿ｍｕｔａｎｔ＿４、ｍｉＲＮＡ＿ｍｕｔａｎｔ＿５、ｍｉＲＮＡ＿ｍｕｔａｎｔ＿６、ｍｉＲＮＡ＿ｍｕｔａｎｔ＿７がｍｉＲＮＡ変異候補の一部分として示されている。変異があるものは「１」、変異のないものは「０」を入力し、変異リスト全体で変異が存在したｍｉＲＮＡの種類数をカウントする。予め決定された閾値又は随時決定される閾値以上のｍｉＲＮＡ変異検出種類数であった場合に、がん罹患者である可能性が高いと判断される。
　閾値の決定は、がん罹患者に由来する試料と非がん者に由来する試料とを予め分析及び比較することにより決定してもよく、対象に由来する試料を分析する度に、非がん者に由来するからの情報を分析し、比較することによって決定してもよい。例えば、閾値の例は、２、３、５、１０、２３、２５、２６又は３０などであるが、これに限定されるものではない。マーカーとして使用するｍｉＲＮＡの種類数を最大値としてもよい。例えば、閾値は、当該分析方法において使用される手法とＲＮＡの種類によって決定されてもよい。
　本実施形態の方法が、定量試験ではなく、定性試験であることで定量性能を担保する必要がないので、臨床開発の時間的経済的効率に優れている。また例えば、対象から採取された血清を用いて、健康診断時のがんの一次スクリーニングとして、包括的に、即ち、ユニバーサルに検出することが可能である。
　例えば、健康診断等で容易に採取できる血清または血漿を試料として用いることが可能である。そのため、がんを早期に発見することができる。血清または血漿等を用いることで、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。また、血清又は血漿は、そこに含まれるＲＮＡ濃度、例えば、ｍｉＲＮＡ濃度が安定しているため、より正確な検査を行うことが可能である。
　（第５の実施形態）
　第５の実施形態は、がん罹患者である可能性が高いと判断するために使用される閾値を設定する方法である。当該閾値設定方法は、４つの工程を含む（図９）。まず、対象又はがん罹患者に由来する試料と非がん者に由来する試料について、それぞれ含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって、それぞれ分類する（Ｓ９１）。次に、各々の参照配列に対して分類されたＲＮＡ集団において、同一の配列をもつ代表配列群を、それぞれ決定する（Ｓ９２）。対象又はがん罹患者に由来する試料と対照に由来する試料とについて、代表配列群の各配列と各対応する参照配列とをそれぞれ比較し、配列変動をそれぞれ検出する（Ｓ９３）。検出結果を基に、配列変動を有する代表配列の種類数をカウントする（Ｓ９４）。対象又はがん罹患者と対照との間で、カウントされた代表配列の種類数を比較し、対象又はがん罹患者と対照とを分ける閾値を決定する（Ｓ９５）。
　当該閾値を設定する方法を、ｍｉＲＮＡをＲＮＡの１例とした場合について、閾値を設定するイメージとして図１０～１２に示す。図１０には、２４種類のｍｉＲＮＡについて、がん罹患者に由来する試料と対照としての健常者とを比較する１例を示した。この例において、健常者の数は、３０例とした（ｎ＝３０）。がん罹患者の数は、３４６例であり（ｎ＝３４６）、がん種の内訳は、乳がん２４例、肺がん１８例、大腸がん２４例、子宮がん２４例、胃がん２４例、すい臓がん２４例、前立腺癌２４例、卵巣癌２４例、腎臓がん２４例、脳腫瘍２４例、子宮頸がん１３例、胆管がん２４例、食道がん２４例、膀胱がん２４例、肉腫２４例及び肝臓肝３例である。
　図１０（ａ）、図１１（ａ）及び図１２（ａ）には、対照における代表配列の種類とがん罹患者における代表配列の数を示すグラフに示している。具体的には、健常者由来のｍｉＲＮＡにおける編集に基づく配列変動のありの代表配列の数、がん罹患者由来のｍｉＲＮＡにおける編集に基づく配列変動のありの代表配列の数を示している。がん罹患者由来の代表配列の数については、がんのステージ０、１、２、３、４毎に分類して示している。更にがん罹患者のうち、再発情報のないものについてもデータとして示している。
　図１０では、がん罹患の有無の判断への寄与率の高い変異であると考えられる２４種類のｍｉＲＮＡを代表配列とした。図１１では、ＮＧＳデータでＲＮＡ編集に基づく変異の存在が示された３１０種類のｍｉＲＮＡを代表配列とした。図１２では、データベース上で既に報告されているＲＮＡ編集に基づく変異を有する６１１種類のｍｉＲＮＡを代表配列とした。それぞれの場合について、健常者由来のｍｉＲＮＡとがん罹患者由来のｍｉＲＮＡにおける配列変動ありの代表配列の数を図１０（ａ）、図１１（ａ）及び図１２（ａ）にプロットしている。
　図１０に示すように、２４種類の代表配列を使用する場合には、配列変動ありの代表配列の数、即ち、変異検出数（グラフ縦軸）において、健常者とがん罹患者とを分ける閾値は３と設定できる。図１０（ｂ）には、閾値３が有効であることを検証した結果を示す。検証では、閾値を３として、がん罹患者全体と健常者全体について、実際に実験を行ってがん罹患の有無を判定した。がん患者群においては、陽性と判定される試料は２９２例、陰性と判定される試料は５４例であった。健常者群においては、陽性と判定される試料は１例、陰性と判定される試料は２９例であった。図１０（ｃ）に示すように、このような設定では、対象のがん罹患の可能性を分析する方法の性能は、感度８４．４％、特異度９６．７％、陽性的中率９９．７％となり、実用に値することが検証によって明らかになっている。
　図１１に示すように、３１０種類の代表配列を使用する場合には、配列変動ありの代表配列の数、即ち、変異検出数（グラフ縦軸）において、健常者とがん罹患者とを分ける閾値は２８と設定できる。図１１（ｂ）には、閾値２８が有効であることを検証した結果を示す。検証では、閾値を２８として、がん罹患者全体と健常者全体について、実際に実験を行って、がん罹患の有無を判定した。がん患者群においては、陽性と判定される試料は２６６例、陰性と判定される試料は８０例であった。健常者群においては、陽性と判定される試料は３例、陰性と判定される試料は２７例であった。図１１（ｃ）に示すように、このような設定では、対象のがん罹患の可能性を分析する方法の性能は、感度７６．９％、特異度９０．０％、陽性的中率９８．９％となり、実用に値することが検証によって明らかになっている。
　図１２に示すように、６１１種類の代表配列を使用する場合には、配列変動ありの代表配列の数、即ち、変異検出数（グラフ縦軸）において、健常者とがん罹患者とを分ける閾値は２３と設定できる。図１２（ｂ）には、閾値２３が有効であることを検証した結果を示す。検証では、閾値を２３として、がん罹患者全体と健常者全体について、実際に実験を行い、がん罹患の有無を判定した。がん患者群においては、陽性と判定される試料は２９３例、陰性と判定される試料は５３例であった。健常者群においては、陽性と判定される試料は５例、陰性と判定される試料は２５例であった。図１２（ｃ）に示すように、このような設定では、対象のがん罹患の可能性を分析する方法の性能は、感度８４．７％、特異度８３．３％、陽性的中率９８．３％となり、実用に値することが検証によって明らかになっている。
　第５の実施形態によれば、第１～第４の実施形態の対象のがん罹患の可能性を分析する方法において使用できる閾値を提供することが可能である。
　（第６の実施形態）
　健常者とがん罹患者を識別するためのマーカーとして、ＲＮＡ編集に基づく配列変動を利用することが可能である。第６の実施形態であるマーカーは、参照配列に比較して、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象に由来する試料中の種類数である。言い換えると、対象に由来する試料中の配列変動のある代表配列の数である。
　血清から検出されるＲＮＡとしては、例えばｍｉＲＮＡを用いることができるが、その個数と組み合わせに制限はない。選択したｍｉＲＮＡの配列変動について、被験者、即ち、対象の配列変動が発生した種類数をカウントし、その個数を用いて健常者とがん罹患者を識別する。
　配列変動の要因として、Ａ－ｔｏ－Ｉ　ＲＮＡ編集酵素ＡＤＡＲ１によるＡからＧへの変異が候補として挙げられる。ＡＤＡＲ１は二本鎖ＲＮＡのアデノシン（Ａ）を加水分解的脱アミノ化反応によりイノシンへと変換する酵素である。イノシンの構造はＤＮＡの構成因子の１つであるグアノシン（Ｇ）と類似しているため、翻訳時にグアノシンと認識される。すなわち、遺伝子配列的にはＡからＧへの変異と同等の表現型となる。あるいは、ＣからＵへの変換も知られているが、これらに限定はしない。配列変動が発生する遺伝子上の位置を特定の個所に限定することも考えられる。例えば、ＳＮＰｓとして検査対象の人種などで多様性が存在することが示されている部位は、検査対象者の一定割合がその変動を有することが事前にわかっていることとなるため、がんによって発生する配列変動としてみなさないといった限定方法が考えられる。あるいは生物学的に配列変動が発生する領域あるいは発生しにくい領域が明らかになっている場合には、発生のしやすさとその理由に応じて特に注目する領域を限定することが考えられるが、これに限定されない。
　ｍｉＲＮＡの体液中の配列変動数を決定する工程は、主に（ｉ）被験者からの試料採取、（ｉｉ）試料からのｍｉＲＮＡの抽出、（ｉｉｉ）標的ｍｉＲＮＡの配列解読（ｉＶ）ｍｉＲＮＡの種類に応じた配列の分類（Ｖ）ｍｉＲＮＡの各種類内での配列変動の有無の検出、から成ることが好ましく、その代表的な手法を下記に記すが、これらに限定されない。さらに続いて配列変動数に基づいたがん罹患有無の識別をする罹患判定工程は（VI）閾値の設定（VII）閾値との大小比較、から成ることが好ましく、その代表的な手法を下記に記すが、これらに限定されない。
（ｉ）被験者からの試料採取
　測定に用いる試料は、被検者から採取されるものであり、特に限定されるものではなく、例えば、血液、血清、血漿、白血球、尿、消化液、唾液、胃液、汗、涙、鼻水、精液、膣液、羊水、乳汁、リンパ液、組織、口腔内粘膜、喀痰などを用いることができる。試料は、遠心、沈殿、抽出および／または分離などの処理を行い、核酸の増幅に適切である状態にする。また、採取された試料が、そのままで核酸の増幅に適切である場合には、採取された試料を検体として使用してよい。
（ｉｉ）試料からのｍｉＲＮＡの抽出
　核酸の抽出は、これらに限定されないが、市販の核酸抽出キットである、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　ｍｉＲＮＡ　Ｐｌａｓｍａ（タカラバイオ製）、Ｑｕｉｃｋ－ｃｆＲＮＡ　Ｓｅｒｕｍ　＆　Ｐｌａｓｍａ　Ｋｉｔ（ザイモリサーチ製）、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ キット（キアゲン製）、ｍｉＲＶａｎａ　ＰＡＲＩＳ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ　ＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｎｏｒｇｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製)、ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）　ＳＰ　Ｋｉｔ(和光純薬)、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）などを利用して実行することができる。また、キットによらず、試料をバッファーで希釈した上で、８０～１００℃の加熱処理後に遠心分離して上清を得る、という簡便な方法を使うこともできる。
　（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡの配列解読（ｉＶ）ｍｉＲＮＡの種類に応じた配列の分類、および（Ｖ）ｍｉＲＮＡの各種類内での配列変動の有無の検出
　体液中に存在するｍｉＲＮＡの配列を測定する方法として、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いて、体液中のｍｉＲＮＡを網羅的に配列解読する方法がある。あるいは、ターゲットとなるｍｉＲＮＡのみを特異的に増幅可能なプライマーを用いて増幅しサンガーシーケンス法で配列を確認する方法も用いることができるがこれらに限定されない。
　次世代シーケンサーを使用する場合、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製ＭｉＳｅｑやＮｅｘｔＳｅｑ５５０など、あるいはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製などの１分子シーケンサーなどを使用できるがこれに限定されない。リファレンスとして例えばヒトゲノム配列を用いてアライメントを実施することでｍｉＲＮＡの種類に応じた配列の分類が可能である。アライメントにはＢＷＡやｂｏｗｔｉｅ，　ｂｏｗｔｉｅ２などを使用できるがこれに限定されない。
　サンガーシーケンス法を使用する場合、ｍｉＲＮＡの種類に応じたプライマーを設計し配列を決定する。あるいは配列変動の変動前後における配列が決定できている場合、配列変動後の配列に特異的なプライマーを設計することで、そのプライマーで配列が解読できた場合に、配列変動が発生していたと判断することもできる。その場合には、ｑＰＣＲ法やデジタルＰＣＲ法などを利用することができる。あるいは、配列変動に特異的なプローブを付与したマイクロアレイを利用することもできる。
　（VI）閾値の設定、（VII）閾値との大小比較
　閾値の設定は、例えばＲＯＣ（受信者動作特性試験、ｒｅｃｅｉｖｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を用いて設定する方法や、偽陽性や偽陰性の影響を考慮して設定する方法などがあるが、これらに限定されず検査の設計によって異なると考えられる。
　ＲＯＣ曲線は、Ｘ軸に（１－特異度）、Ｙ軸に感度をプロットするもので、理想的な検査（感度１００％、特異度１００％）では左上隅に位置することになる。ＲＯＣ曲線の下の面積（ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）によって検査の有用性を評価できる。閾値の設定はＹｏｕｄｅｎ　Ｉｎｄｅｘと呼ばれる、（感度＋特異度）を最大にする閾値を選択する方法と、ＲＯＣ曲線の左上隅からの距離（（１－感度）２＋（１－特異度）２）が最小になる閾値を選択する方法の２種類がある。これらの手法で閾値を設定する場合、偽陽性と偽陰性の重要度が同等である場合が一般的である。一方、例えばがんが早期であれば治療法が確立されており、陽性者を確実に発見することが重要ながん種の場合、偽陽性よりも偽陰性を低くすることが重要であると考えることができる。その場合には偽陽性に対する偽陰性の重みづけを大きく考えて閾値を設定することができる。このような閾値の設定にはＥＺＲ（Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　２０１３：　４８，　４５２－４５８）やＪＭＰなどの統計ソフトを利用することができる。
　（実施例１）
　がん罹患者と健常者の血清中核酸の配列変動を指標とした識別について以下に示す。
　検体数は健常者血清３０検体とがん罹患者検体３４６検体とした。がん罹患者検体の内訳は、乳がん２４検体、大腸がん２４、胃がん２４、肺がん１８、卵巣がん２４、膵臓がん２４、胆道がん２４、食道がん２４、肝臓がん３、脳腫瘍２４、膀胱がん２４、前立腺がん２４、肉腫２４、子宮がん２４、腎臓がん２４、子宮頸がん１３であった。
　血清中の核酸配列は、次世代シーケンサー解析により決定した。すべての血清３００μＬから、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍｉＲＮＡを抽出した。抽出したｍｉＲＮＡはＱＩＡｓｅｑ　ｍｉＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＱＩＡｓｅｑ　ｍｉＲＮＡ　ＮＧＳ　９６　Ｉｎｄｅｘ　ＩＬ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロトコルに従って実施した。
　使用したインデックスにはＵＭＩと呼ばれる分子バーコード技術が用いられており、ライブラリ調整に伴う遺伝子増幅によるＰＣＲ　Ｄｕｐｌｉｃａｔｅや増幅バイアスの影響を排除でき、より正確な配列決定が可能である。ＮＧＳ解析はＮｅｘｔＳｅｑ５００（シングルエンド、７５ｂｐ）を用いて実施し、全検体について１０００万リード以上のデータを得た。ＵＭＩ－ｔｏｏｌｓ（Genome Res. (2017) 27(3):491-499.　PMID: 28100584）のｅｘｔｒａｃｔコマンドを利用し、ＵＭＩを除去したＦＡＳＴＱファイルを得た。
　さらにリード品質によるＱＣを実施した。ｍｉＲＮＡの種類に応じた配列の分類として、ｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　２２に対するアノテーションを実施した。また、ｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　２２の配列を野生型、すなわち配列変動が発生していない配列とした。配列変動の候補として、特にｍｉＲＮＡの５’末端側１０ｂｐに着目した。ｍｉＲＮＡの５’末端から２～８塩基目の７ｂｐ程度には、Ｓｅｅｄ配列と呼ばれる領域が存在する。
　この領域はｍｉＲＮＡがその機能を発揮するために重要とされている領域で、個人の遺伝子情報に依存した配列変動の発生率が低いと考えられる。配列変動の候補としてＡ－ｔｏ－Ｉ　ＲＮＡ編集酵素ＡＤＡＲ１によるＡからＧへの変異に注目した。ｍｉＲＮＡに対するＡ－ｔｏ－Ｉ変異が導入されうる配列はデータベース（ＭｉＲＥＤｉＢａｓｅ[引用]）としてまとめられており、条件を満たす変異のリストを入手したところ３８８種類のｍｉＲＮＡに対して６１１種類の配列変動候補が存在した。ＮＧＳ解析結果のアノテーション結果から、注目するｍｉＲＮＡの配列情報を抽出し、データベースと一致する配列変動が存在するかどうかを各検体について解析した。
　各検体について６１１種類の配列変動候補のうち何種類で配列変動が発生したかをカウントし、その合計数を各検体の配列変動種類数として以降の解析に用いた。各検体の種別（がん／健常者）と配列変動種類数を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣ値を算出した。結果を図１３に示す。
　ＲＯＣ（受信者動作特性試験、receiver operating characteristic）曲線は、Ｘ軸に（１－特異度）、Ｙ軸に感度をプロットするもので、理想的な検査（感度１００％、特異度１００％）では左上隅に位置することになる。ＲＯＣ曲線の下の面積（ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）によって検査の有用性を評価できる。その結果、ＡＵＣ値は０．８８７（９５％信頼区間　０．８４１－０．９３４）であった。６１１種類の配列変動候補のうち２３種類以上で配列変動を有した場合にがんであると判断する閾値を設定した場合、感度は８４．７％、特異度８３．３％、陽性的中率９８．３％となり（図１３（ｃ））、高い識別性能を示し、がんと健常者の識別系として高性能であることが示された。
　（実施例２）
　がん罹患者と健常者の血清中核酸の配列変動を指標とした識別のうち、事前に配列変動が起きる配列の情報がない状況で実施する手法について以下に示す。実施例１に記載したＮＧＳ解析データを用いる。配列変動の候補として事前データを用いずに、実際のＮＧＳの配列情報において配列変動が検出されたものを利用した。ＮＧＳの配列変動はｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　２２の配列を野生型、すなわち配列変動が発生していない配列とし、同じｍｉＲＮＡにアライメントされた集団中で配列変動が発生しているｍｉＲＮＡと変動様式を網羅的に検出し利用した。あるいは、ＶＣＦファイルを出力することで配列変動が発生しているｍｉＲＮＡとその変動様式を出力した。この際、実施例１と同様にｍｉＲＮＡの５’末端側１０ｂｐに着目したところ、３１０種類の配列変動候補が選別できた。結果を図１４に示す。
　実施例１と同様に配列変動が存在するかどうかを各検体について解析したところ、ＡＵＣ値は０．８５４（９５％信頼区間　０．８０２－０．９０６）であった。３１０種類の配列変動候補のうち２８種類以上で配列変動を有した場合にがんであると判断する閾値を設定した場合、感度は７６．９％、特異度９０．０％、陽性的中率９８．９％となり（図１４（ｃ））、高い識別性能を示し、がんと健常者の識別系として高性能であることが示された。
　（実施例３）
　がん罹患者と健常者の血清中核酸の配列変動を指標とした識別のうち、選別したマーカーを利用して実施する手法について以下に示す。実施例１に記載したＮＧＳ解析データを用いる。実施例１、実施例２でがんと健常者の識別に特に寄与していた２４種類に限定して同様の解析を実施したところ、ＡＵＣ値は０．９５３（９５％信頼区間　０．９３１－０．９７６）であった。結果を図１１に示す。２４種類の配列変動候補のうち３種類以上で配列変動を有した場合にがんであると判断する閾値を設定した場合、感度は８４．４％、特異度９６．７％、陽性的中率９９．７％となり（図１５（ｃ））、限定したｍｉＲＮＡを用いて検証した場合にも高い識別性能を示し、がんと健常者の識別系として高性能であることが示された。
　本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
　以下に、本願発明の実施態様を付記する。
［１］　参照配列に比較して、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象に由来する試料中の当該ＲＮＡの種類数をカウントすること、得られた当該ＲＮＡの種類数を指標にして当該対象のがん罹患の可能性を判定することを含む、対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
［２］　前記対象に由来する試料が体液であり、前記カウントすること及び判定することが以下の工程：
当該体液から、参照配列からの配列変動に関する情報を取得する試料データ取得工程と、
当該配列変動が存在するＲＮＡの種類数をカウントする特徴抽出工程と、
当該配列変動が存在するＲＮＡの種類数を指標として、がん罹患の可能性を識別する罹患判定工程と
を具備する、［１］に記載の分析する方法。
［３］　当該対象からの当該ＲＮＡ種類数と、非がん者に由来する試料から得た当該ＲＮＡ種類数とを比較することを更に含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　当該対象からの当該ＲＮＡ種類数が、非がん者からの当該ＲＮＡ種類数よりも多い場合に、当該対象ががんに罹患している可能性が高いと識別し、当該対象からの当該ＲＮＡ種類数が、非がん者からの当該ＲＮＡ種類数よりも少ないか、又は同等である場合に、当該対象ががんに罹患している可能性が低いと識別する、［３］に記載の方法。
［５］　前記体液が、血液、血清又は血漿である、［２］～［４］の何れか１項に記載の方法。
［６］　前記ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｐｉＲＮＡである、［１］～［５］の何れか１項に記載の方法。
［７］　前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、［１］～［５］の何れか１項に記載の方法。
［８］　前記配列変動が、ＲＮＡ編集によって生じる、［１］～［７］の何れか１項に記載の方法。
［９］　前記配列変動が、ＲＮＡ編集酵素によって生じる、［１］～［７］の何れか１項に記載の方法。
［１０］　前記配列変動が、塩基の置換である、［１］～［９］の何れか１項に記載の方法。
［１１］　対象に由来する試料に含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって分類すること、
各参照配列に対して分類された、ＲＮＡ集団において同一の配列をもつ代表配列群を決定すること、
当該代表配列群の各配列を対応する参照配列と比較し、配列変動をそれぞれ検出すること、及び
当該配列変動を有する代表配列の種類数をカウントすること、
を含む、対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
［１２］　当該がんが、乳がん、大腸がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮がん、卵巣がん、肉腫、前立腺がん、胆管がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、腎臓がんからなる群から選択される少なくとも一種のがんである、［１］～［１１］の何れか１項に記載の方法。
［１３］　対象又はがん罹患者に由来する試料と、非がん者に由来する試料とについて、それぞれに含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって、それぞれ分類すること
各々の当該参照配列に対して分類されたＲＮＡ集団において、同一の配列をもつ代表配列群を、それぞれ決定すること、
当該対象又はがん罹患者に由来する試料と、当該対照に由来する試料とについて、当該代表配列群の各配列と各対応する参照配列とをそれぞれ比較し、当該配列変動をそれぞれ検出すること、
当該配列変動を有する代表配列の種類数をカウントすること、及び
前記対象又はがん罹患者と前記対照との間で、カウントされた代表配列の種類数を比較し、対象又はがん罹患者と対照とを分ける閾値を決定すること
を更に備える、［１］～［１２］に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
［１４］　当該閾値が、がん罹患者群における配列変動について得られる数の方が、非がん者群から得られる数よりも大きい、［１］～［１２］に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
［１５］　閾値は２以上の整数である、［１］～［１２］に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
［１６］　当該閾値は、そこにおいて使用される手法とＲＮＡの種類によって決定される［１］～［１２］に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
［１７］　対象に由来する試料に含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって分類すること、
各参照配列に対して分類された、ＲＮＡ集団において同一の配列をもつ代表配列群を決定すること、
当該代表配列群の各配列を対応する参照配列と比較し、配列変動をそれぞれ検出すること、及び
当該配列変動の種類数をカウントすること
を備える配列変動を検出する方法。
［１８］　特定の代表配列が、対応する参照配列に比較して配列変動が生じていることを、当該代表配列の配列情報と共に識別可能な［１７］に記載の方法。
［１９］　ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、サンガー、マイクロアレイ及びハイブリダイゼーションからなる群より少なくとも１手法が選択されて使用される［１］～［１８］の何れか１項に記載の方法。

Claims (20)

  1. 　参照配列に比較して、ＲＮＡ編集に基づく配列変動が存在するＲＮＡの種類について、対象に由来する試料中の当該ＲＮＡの種類数をカウントすること、得られた当該ＲＮＡの種類数を指標にして当該対象のがん罹患の可能性を判定することを含む、対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
  2. 　前記対象に由来する試料が体液であり、前記カウントすること及び判定することが以下の工程：
    当該体液から、参照配列からの配列変動に関する情報を取得する試料データ取得工程と、
    当該配列変動が存在するＲＮＡの種類数をカウントする特徴抽出工程と、
    当該配列変動が存在するＲＮＡの種類数を指標として、がん罹患の可能性を識別する罹患判定工程と
    を具備する、請求項１に記載の分析する方法。
  3. 　当該対象からの当該ＲＮＡ種類数と、非がん者に由来する試料から得た当該ＲＮＡ種類数とを比較することを更に含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 　当該対象からの当該ＲＮＡ種類数が、非がん者からの当該ＲＮＡ種類数よりも多い場合に、当該対象ががんに罹患している可能性が高いと識別し、当該対象からの当該ＲＮＡ種類数が、非がん者からの当該ＲＮＡ種類数よりも少ないか、又は同等である場合に、当該対象ががんに罹患している可能性が低いと識別する、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記体液が、血液、血清又は血漿である、請求項２に記載の方法。
  6. 　前記ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｐｉＲＮＡである、請求項１、２及び５の何れか１項に記載の方法。
  7. 　前記ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｐｉＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
  8. 　前記ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｐｉＲＮＡである、請求項４項に記載の方法。
  9. 　前記配列変動が、ＲＮＡ編集酵素によって生じる、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記配列変動が、塩基の置換である、請求項１に記載の方法。
  11. 　対象に由来する試料に含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって分類すること、
    各参照配列に対して分類された、ＲＮＡ集団において同一の配列をもつ代表配列群を決定すること、
    当該代表配列群の各配列を対応する参照配列と比較し、配列変動をそれぞれ検出すること、及び
    当該配列変動を有する当該代表配列の種類数をカウントすること
    を含む、対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
  12. 　前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡであり、当該がんが、乳がん、大腸がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮がん、卵巣がん、肉腫、前立腺がん、胆管がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、腎臓がんからなる群から選択される少なくとも一種のがんである、請求項１、２及び５の何れか１項に記載の方法。
  13. 　対象又はがん罹患者に由来する試料と、非がん者に由来する試料とについて、それぞれに含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって、それぞれ分類すること
    各々の当該参照配列に対して分類されたＲＮＡ集団において、同一の配列をもつ代表配列群を、それぞれ決定すること、
    前記対象又はがん罹患者に由来する試料と、前記対照に由来する試料について、当該代表配列群の各配列と、対応する当該参照配列とを、それぞれ比較し、当該配列変動をそれぞれ検出すること、
    当該配列変動を有する代表配列の種類数をカウントすること、及び
    前記対象又はがん罹患者と前記対照との間で、カウントされた当該代表配列の種類数を比較し、対象又はがん罹患者と対照とを分ける閾値を決定すること
    を更に備える、請求項１に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
  14. 　前記指標として判定することが、
    　対象又はがん罹患者に由来する試料と、非がん者に由来する試料とについて、それぞれに含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって、それぞれ分類すること
    各々の当該参照配列に対して分類されたＲＮＡ集団において、同一の配列をもつ代表配列群を、それぞれ決定すること、
    前記対象又はがん罹患者に由来する試料と、前記対照に由来する試料について、当該代表配列群の各配列と対応する当該参照配列とをそれぞれ比較し、当該配列変動をそれぞれ検出すること、
    当該配列変動を有する代表配列の種類数をカウントすること、及び
    前記対象又はがん罹患者と前記対照との間で、カウントされた当該代表配列の種類数を比較し、対象又はがん罹患者と対照とを分ける閾値を決定すること
    により設定される閾値との比較によって行われ、
    当該閾値が、がん罹患者群における配列変動について得られる数の方が、非がん者群から得られる数よりも大きい、請求項１に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
  15. 　当該閾値は２以上の整数である、請求項１４に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
  16. 　当該閾値は、そこにおいて使用される手法とＲＮＡの種類によって決定される請求項１４に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
  17. 　ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、サンガー、マイクロアレイ及びハイブリダイゼーションからなる群より少なくとも１手法が選択されて使用される請求項１４に記載の対象のがん罹患の可能性を分析する方法。
  18. 　対象に由来する試料に含まれるＲＮＡをその配列の参照配列に対する相同性によって分類すること、
    各参照配列に対して分類された、ＲＮＡ集団において同一の配列をもつ代表配列群を決定すること、
    代表配列群の各配列を対応する参照配列と比較し、配列変動をそれぞれ検出すること、及び
    配列変動の種類数をカウントすること
    を備える配列変動を検出する方法。
  19. 　特定の代表配列が、対応する参照配列に比較して配列変動が生じていることを、当該代表配列の配列情報と共に識別可能な請求項１８に記載の配列変動を検出する方法。
  20. 　ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、サンガー、マイクロアレイ及びハイブリダイゼーションからなる群より少なくとも１手法が選択されて使用される請求項１９に記載の配列変動を検出する方法。
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