WO2023063049A1

WO2023063049A1 - がん検出のためのバイオマーカーセットの作製方法

Info

Publication number: WO2023063049A1
Application number: PCT/JP2022/035459
Authority: WO
Inventors: 奈央子山口
Original assignee: 富士フイルム株式会社
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2022-09-22
Publication date: 2023-04-20
Also published as: CN117957331A

Abstract

本発明は、一度のがん検診で、複数の臓器のがんの有無を、従来よりも精度高く、診断することができるバイオマーカーセットの作製方法の提供を目的とし、組織型の情報に基づいて、がんの種類別に収集された複数のＤＮＡメチル化度データを１以上のグループに分類する分類工程と、分類された全てのグループから任意に１つの所定のグループを選択し、所定のグループと他のグループとの間で二群間比較を行い、両グループとの間に有意差があると認められるグループのＤＮＡ位置、及びその位置における両グループのメチル化状態の情報を抽出する抽出工程と、有意差が認められた両グループの情報の中から、所定の条件を満たすものを、所定のグループが属するがん種のバイオマーカーとして選択する選択工程と、を有するバイオマーカーセットの選択方法を提供する。

Description

がん検出のためのバイオマーカーセットの作製方法

　本発明は、がん検診で使用するバイオマーカーセットを作製する方法に関する。特に、血液や排泄物等の生体試料から、一度に複数種の臓器のがんについて、がんの疑いが有るか否か（がん組織の有無）を、がん種を区別して、診断するためのバイオマーカーセットを作製する方法に関する。

　一般的に、がんの有無の確定診断には、段階的な検査が必要とされる。まず、がん検診によりがんの疑いがあるか否かを診断し、がんの疑いがあると診断された場合に精密検査が実施され、がんの有無の確定診断が行われる。がんは、早期発見、早期治療を開始すれば、完治する可能性や生存率を高めることができるため、精密検査の要否を診断するがん検診は、非常に重要視されている。しかし、がん検診には、検出対象のがんによって異なる様々な問題がある。
　例えば、がんの検出対象が、膵がんや肝がん等の場合は、エビデンス（科学的根拠）が確立されているスクリーニング検査が未だ存在しないため、推奨検診が存在しないという問題がある。また、厚生労働省が指針で検診を勧める５つのがん、即ち、胃がん、大腸がん、肺がん、乳がん及び子宮頸がん（対策型検診）の場合は、内視鏡検査、胸部Ｘ線検査（マンモグラフィーを含む）が推奨されているが、これらの検査は、時間的制約、経済的負担、身体的・精神的な負担が大きいため、受診が敬遠される傾向にある。

　このような問題を解決することができる技術として、リキッドバイオプシー（liquid biopsy）が注目されている。リキッドバイオプシーとは、採取時に被検者の身体への負担が少ない低侵襲性の液体試料（血液や排泄物等）を用いて、がん細胞由来の物質（ＤＮＡ）を検出する技術である。この技術では、バイオマーカーと呼ばれるものが使用される。がん細胞由来の物質が客観的に測定され、評価される特性値であり、疾患の有無や、進行状況等を把握するための指標として使用される。現在、バイオマーカーとして、様々なものが提案され、実用化に向けて研究開発が進められているが、その中の一つに、特定のＤＮＡのメチル化状態（頻度）を利用する方法がある。

　ＤＮＡのメチル化は遺伝子発現制御に大きく関与し、がんの発生に関連して、特定のメチル化部位のメチル化又は脱メチル化が生じることが知られている。そのため、検査対象のがんの発生に特異的なメチル化部位や、そのメチル化部位におけるメチル化状態が明らかであれば、被検者由来の液体試料から抽出されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）中のがん細胞由来の物質（ＤＮＡ）を検出することができる。
　また、がんの種類や、組織型、被検者の性別、年齢、人種及びがん以外に罹患している疾患の有無等の特徴により、ＤＮＡのメチル化及び／又は脱メチル化が生じるメチル化部位（ＣＧ配列）の位置、及びそれら部位のメチル化状態、即ち、メチル化パターンが異なるため、各がんの種類や特徴と、メチル化パターンとの間にある相関関係が既知であれば、それら情報に基づいて、各がんの種類や特徴に特異的なバイオマーカーを作成することができる。

　例えば、特許文献１では、特定のがん種と、そのＤＮＡのメチル状態とが予め紐づけられている既知のデータに基づき、バイオマーカーを作製する方法が開示されている。

特表２０１９－５２１６７３号公報

　しかし、特許文献１に記載のバイオマーカーの作製方法は、がん種とＤＮＡメチル化状態を紐づける既知のデータがない場合、使用することができない。このような場合、研究者らは、バイオマーカー指標部位として、広範囲のゲノム領域の中から、１～数千か所のメチル部位を選定したり、メチル化状態の計測方法や閾値を検討して、ＤＮＡのメチル化状態を決定する必要がある。また、広範囲なゲノム領域、及びバラエティに富んだＤＮＡメチル化パターンの中から、被検者全員に共通して変化するバイオマーカー指標部位を選択し、決定しなければならない。つまり、バイオマーカーを獲得するために、非常に煩雑な手間やコストがかかるという問題がある。

　また、各臓器のがんに特異的なバイオマーカーを選択し、選択された複数のバイオマーカーを組み合わせてバイオマーカーセットとして使用すれば、複数の臓器のがんの有無（がんの疑いが有るか否か）を一度の検査で調べることができるが、同一臓器のがんであっても内部にＤＮＡメチル化パターンが異なる複数の患者群が存在することにより、精度及び感度が十分でない実状がある。つまり、通常、所定の臓器のがんに特異的なＤＮＡメチル化パターンをいくつか選択して、バイオマーカーを作製するが、被験者（患者）群の中に、その選択されたＤＮＡメチル化パターンと異なるパターンを有する者が含まれていた場合、バイオマーカー（及びバイオマーカーセット）の精度及び感度が被験者（又は被験者群）によって悪くなる可能性があるという問題がある。

　そこで、本発明は、このような課題を解決するために、ＤＮＡメチル化パターンが異なる複数の患者群由来の生体試料が存在していても、一度のがん検診で、複数種の臓器のがんの有無（即ち、がんの疑いが有るかないか）を、従来よりも精度（及び感度）高く、診断することができるバイオマーカーセットを容易に作製することができる方法を提供することを目的とする。

［１］　診断対象として複数種類の臓器のがんを含む、がん検診に使用するためのバイオマーカーセットを作製する方法であって、
　前記診断対象のがんに罹患した患者由来の生体試料から取得された既知の複数のＤＮＡメチル化度データであって、前記がんの種類別に、（１）全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置、（２）前記メチル化部位のメチル化度、及び（３）組織型の情報を含む、複数のＤＮＡメチル化度データを収集する収集工程と、
　前記組織型の情報に基づいて、前記がんの種類別に収集された前記複数のＤＮＡメチル化度データを１以上のグループに分類する分類工程と、
　分類された全てのグループから任意に１つの所定のグループを選択し、前記所定のグループと
他のグループとの間で二群間比較を行い、両グループとの間に有意差があると認められたＤＮＡ位置、及びその位置における両グループのメチル化状態の情報を抽出する抽出工程と、
　有意差が認められた両グループの前記情報の中から、所定の条件を満たすものを、所定のグループが属するがん種のバイオマーカーとして選択する選択工程と、
　分類された全てのグループについて、前記バイオマーカーが選択されるまで、前記抽出工程及び選択工程を繰り返し、選択された全てのバイオマーカーから構成されるバイオマーカーセットを作製する工程と
を有し、
　前記組織型情報は、少なくとも１種類以上の前記がんの前記ＤＮＡメチル化度データに含まれるバイオマーカーセットの選択方法。

［２］前記分類工程において、前記複数のＤＮＡメチル化度データが２以上の組織型の情報を有する場合は、前記複数のＤＮＡメチル化度データを２以上のグループに分類し、前記組織型情報を１つだけ有する、又は前記組織型情報を有さない場合は、１つのグループとして分類する［１］に記載の方法。
［３］前記抽出工程において、前記有意差の判定は、（１）統計的検定におけるｐ値、又は（２）前記メチル化度分布の中央値若しくは平均値の差に基づいて実施される［１］又は［２］に記載の方法。

［４］前記診断対象に卵巣がん、肺がん、及び肝がんを含み、
　前記収集工程で収集された前記組織型の情報が、前記卵巣がんの組織型である漿液性がん、明細胞がん、類内膜がん及び粘液性がん、前記肺がんの組織型である腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、小細胞がん、前記肝がんの組織型である肝細胞がん及び肝内胆管がんである［１］～［３］のいずれかに記載の方法。

［５］診断対象として複数種類の臓器のがんを含む、がん検診に使用するためのバイオマーカーセットを作製するバイオマーカーセットの作製方法であって、
　前記診断対象のがんに罹患した患者由来の生体試料から取得された既知の複数のＤＮＡメチル化度データであって、前記がんの種類別に、（１）全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置、（２）前記メチル化部位のメチル化度、及び（３）がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報を含む、複数のＤＮＡメチル化度データを収集する収集工程と、
　前記がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報に基づいて、前記がんの種類別に収集された前記複数のＤＮＡメチル化度データを１以上のグループに分類する分類工程と、
　分類された全てのグループから任意に１つの所定のグループを選択し、前記所定のグループと
他のグループとの間で二群間比較を行い、両グループとの間に有意差があると認められたＤＮＡ位置、及びその位置における両グループのメチル化状態の情報を抽出する抽出工程と、
　有意差が認められた両グループの前記情報の中から、所定の条件を満たすものを、所定のグループが属するがん種のバイオマーカーとして選択する選択工程と、
　分類された全てのグループについて、前記バイオマーカーが選択されるまで、前記抽出工程及び選択工程を繰り返し、選択された全てのバイオマーカーから構成されるバイオマーカーセットを作製する工程と
を有し、
　前記がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報は、少なくとも１種類以上の前記がんの前記ＤＮＡメチル化度データに含まれるバイオマーカーセットの選択方法。

［６］前記分類工程において、前記複数のＤＮＡメチル化度データががん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報を有する場合は、前記複数のＤＮＡメチル化度データを２以上のグループに分類し、前記がん以外の疾患の罹患の有無の情報を有さない場合は、１つのグループとして分類する［５］に記載の方法。
［７］前記抽出工程において、前記有意差の判定は、（１）統計的検定におけるｐ値、又は（２）前記メチル化度分布の中央値若しくは平均値の差に基づいて実施される［５］又は［６］に記載の方法。

［８］前記収集工程で収集された前記がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報は、前記肝がんと相関性が高い肝硬変の罹患の有無、及び慢性肝炎の罹患の有無である［５］～［７］のいずれかに記載の方法。

　本発明によれば、ＤＮＡメチル化パターンが異なる複数の患者群由来の生体試料が存在していても、一度のがん検診で複数種の臓器のがんの有無（即ち、がんの疑いが有るかないか）を臓器別に精度（及び感度）高く診断することができるバイオマーカーセットを容易に作製することができる。
　また、１度の検査で複数種のがん組織ＤＮＡの有無を精度高く検出することができるため、被検者の時間的制約、経済的負担、身体的・精神的な負担を小さくさせることができる。

本発明の実施形態１に係るバイオマーカーセットの作製方法の一例を示すフローチャート図である。実施形態１のバイオマーカー選択工程において、二群間を比較する方法の一例を説明するための図である。実施形態１のバイオマーカー選択工程において、二群間を比較する方法の一例を説明するための図である。本発明の実施形態２に係るバイオマーカーセットの作製方法の一例を示すフローチャート図である。実施例１及び比較例１で選択したバイオマーカーセットの性能評価の結果（正答率）を示す図である。実施例２及び比較例１で選択したバイオマーカーセットの性能評価の結果（正答率）を示す図である。実施例３及び比較例２で選択したバイオマーカーセットの性能評価の結果（正答率）を示す図である。本発明で用いられる用語「メチル化度」を説明するために使用する図である。

　以下に、添付の図面に示す公的な実施形態に基づいて、本発明のバイオマーカーの選択方法を詳細に説明する。

（用語の説明）
　本明細書において、「バイオマーカー」とは、被検者から採取した生体試料中に含まれるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のデータを分析することにより、そのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）内に含まれる複数の種類の臓器（及び器官）のがん組織由来ＤＮＡを定量化し、被検者のがん罹患の有無を評価するスクリーニング検査に使用されるものであって、特定のがんに相関のあるメチル化部位及びその部位におけるＤＮＡのメチル化度を指す。特定のがんの存在の有無を決定するために、１以上のバイオマーカーが使用される。
　本発明に用いられる「バイオマーカーセット」とは、複数種類のがんの存在の有無を決定するために、各がん種を検出する１以上のバイオマーカーを組み合わせたものをいう。

　ここで、本明細書で用いられる「バイオマーカー」を使用する「がん罹患の有無を評価するスクリーニング検査」とは、被検者から採取した生体試料中に含まれるセルフリーＤＮＡについて、例えば、次世代シーケンサーを用いる場合には、各シーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンスデータ（複数のメチル化部位及びそれら部位におけるメチル化状態）を含む、複数のシーケンシングリードを取得し、
　複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいてメチル化パターンを計算することであって、そのメチル化パターンが前記連続核酸配列に対応するゲノム領域およびゲノム領域内の１つ以上のモチーフ（即ち、大体５～２０塩基対の生物学的に意味のある塩基配列パターン）のメチル化状態を含み、
　前記メチル化パターンを、１以上のバイオマーカー（即ち、複数のメチル化部位とそれらのメチル化状態）のそれぞれと比較して１つ以上の尤度スコアを計算することであって、前記１つ以上のバイオマーカーのそれぞれが特定のがん組織ＤＮＡと相関し、それぞれのバイオマーカーが少なくとも１つの所定のメチル化部位とそれら部位のメチル化状態を含み、且つ、
　前記１つ以上の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、前記シーケンシングリードを、がん組織を含むとして評価することを含み、
　前記複数のシーケンシングリードにおける「がん組織」を含むシーケンシングリードの数に基づいて、前記生体試料中の特定のがん組織を定量評価することを含む方法を指す。
　また、本明細書で用いられる「バイオマーカー」を使用する「がん罹患の有無を評価するスクリーニング検査」は、上記次世代シーケンサーによる検査に限定されず、例えば、被検者から採取した生体試料中に含まれるセルフリーＤＮＡについて、マイクロアレイ等の方法を用いて複数のメチル化部位のメチル化度を直接的に獲得し、所定の１以上の各メチル化部位においてメチル化度が、予め定められた所定のがん組織に相関性のある閾値を上回る／下回る場合には、生体試料中に上記所定のがん組織ＤＮＡ（所定のメチル化状態にあるＤＮＡ）を含むとして評価する方法を指す。
　また、がん種別に異なるバイオマーカーからなるバイオマーカーセットを使用することにより、一度に複数種の臓器のがんについて、がんの有無（即ち、がんの疑いが有るかないか）を調べることができる検査をいう。

　本明細書で用いられる用語「メチル化部位」とは、グアニン残基に隣接するシトシン残基（ＣｐＧ部位）であって、メチル化され得るものを指す。
　本明細書で用いられる用語「メチル化パターン」とは、所定の生理学的組成に特有のＤＮＡのメチル化パターンを指し、少なくとも１以上のメチル化部位の組み合わせ及びそれらの部位のメチル化度を指す。

　本発明で用いられる用語「メチル化度」とは、（複数又は同一の細胞由来の）複数のＤＮＡに共通のメチル化部位（CpG部位）の位置において、全ＤＮＡのうち、メチル化されているＤＮＡの割合をいう。図７に示すように、ＤＮＡが３コピーある場合、CpG部位［１］～［４］のメチル化度は、それぞれ、CpG部位［１］は１００％、CpG部位［２］は０％、CpG部位［３］及び［４］は６６．７％となる。
　本発明で用いられる用語「メチル化状態」とは、所定のメチル化部位において、ある群のメチル化度分布が高いか（メチル化）、ないしは低いか（非メチル化）の情報のことをいう。

　本明細書で用いられる「検出対象のがん」は、早期発見、早期治療し、適切な治療を行うことを目的として推奨される初期検査（精密検査の必要性の有無を判定する検査）において対象となる臓器のがん（診断対象）を指す。例えば、舌、食道、肺、胃腸、膵臓、腎臓、肝臓、乳房、前立腺、子宮、膀胱、卵巣、血液、及び脳等のがん性細胞もしくは、それらに由来するがん性細胞が挙げられる。がんには、腫瘍細胞から構成される腫瘍が含まれていてもよい。
　本発明のバイオマーカーセットが検出する対象の臓器のがんは、少なくとも２種以上であれば、特に限定されないが、５個以上が好ましく、１０個以上がより好ましい。

　本明細書で用いられる用語「精度」とは、がんが存在する受診者を正しく陽性と判定し、がんでない者を正しく陰性と判定する正確さの程度をいう。
　本明細書で用いられる用語「感度」とは、検診受診時に発見可能ながんが存在する者の中で検診により発見された者の割合をいう。

　本明細書で用いられる用語「生体試料」とは、被検者の身体から採取した試料のことであって、具体的には、被検者から採取され、１以上の臓器（器官）との接触を有する血液、皮膚、毛髪、唾液、口腔粘液、腟粘液、汗、涙、上皮組織、尿、精液、精漿、前立腺液、排泄物、生検、腹水、脳脊髄液、リンパ液、及び組織抽出物試料または生検試料を指す。

［実施形態１］
　図１は本発明の実施形態１に係るバイオマーカーセットの作製方法の一例のフローチャートを概念的に示したものである。

（ＤＮＡメチル化度データ収集工程）
　図１に示すように、まず、公的に入手可能なデータベースを利用して、各種がんに罹患した患者（及び健常者）のサンプルを取得し、そのサンプルから、検出対象のがん組織（及び正常な組織）のＤＮＡメチル化度データを収集する（ステップＳ１０）。ＤＮＡメチル化度データは、少なくとも３種類の情報、即ち、（１）全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置、（２）前記メチル化部位のメチル化度、及び（３）組織型の情報を含む。

　患者（又は健常者）のサンプル数は、各がん組織（又は正常な組織）について、それぞれ、少なくとも５あれば、特に限定されず、１００以上であれば、好ましく、２００以上であれば、より好ましい。

　「全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置」とは、マイクロアレイや全ゲノムシーケンス等のゲノムワイドな計測、即ち、ゲノムの全ての領域の網羅的な計測で得られる数万～数百万のシトシン塩基の位置を指し、例えば、イルミナ社のマイクロアレイ Infinium Human Methylation 450、WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequencing）、RRBS（Reduced Representation of Bisulfite Sequencing）等で計測される全てのシトシン残基の位置を指す。

　組織型についての情報は、サンプルに付随する情報から取得する。一般的に、サンプルには、患者の性別や年齢、がんのステージや組織型の情報が添えられている。組織型とは、がん細胞の形状やがん細胞が集まった組織の状態からがんを分類したものである。この組織型の情報は、複数の検出対象（臓器）のがんのうち、少なくとも１種類のがんについて取得できれば、特に限定されないが、好ましくは、検出対象の全ての種類のがんの組織型の情報を収集することが好ましい。
　例えば、検査対象が、肝がんであれば、組織型として、肝細胞がん（HCC）、肝内胆管がん（ICC）、及びHCCとICCの混合型のがんが挙げられる。また、検査対象が、肺がんであれば、組織型として、扁平上皮がん、肺腺がん、肺大細胞がん、及び非小細胞がんが挙げられる。また、検査対象が、卵巣がんであれば、組織型として、漿液性がん、明細胞がん、類内膜がん、及び粘液性がんが挙げられる。

　公的なデータベースとしては、WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequencing）、RRBS（Reduced Representation of Bisulfite Sequencing）、及びアレイに基づくＤＮＡメチル化度データを含むものであれば特に限定されず、例えば、2006年から米国で開始された大型がんゲノムプロジェクトTCGA（The Cancer Genome Atlas）で解析されたデータや、NCBI（National Center for Biotechnology Information）で公開されている、ＤＮＡのメチル化に関連する論文の付属としてGEO（Gene Expression Omnibus）に登録されたマイクロアレイデータ等を利用することができる。メチル化度は、０（非メチル化）～１（完全メチル化）の値で示される。
　なお、ＤＮＡメチル化度データの収集は、公的なデータベースからの収集に限定されず、独自にがん患者から生体試料を取得し、マイクロアレイ解析を行うことにより構築した独自のデータベースを利用してもよい。

（データ分類工程）
　次いで、先の工程で取得したＤＮＡメチル化度データの「組織型」の情報に基づいて、がん種別に収集された複数のＤＮＡメチル化度データを１以上のグループに分類する（ステップＳ１２）。
　より具体的に言えば、「組織型」の情報を有するがん種の複数のＤＮＡメチル化度データは、組織型別に細分化して１以上のグループに分類され、「組織型」の情報を有するがん種の複数のＤＮＡメチル化度データ、及び正常な細胞の複数のＤＮＡメチル化度データは、分類分けを行わず、１グループとして扱う。

　このような分類をすることで、ＤＮＡメチル化パターンが異なる複数の患者群由来の生体試料が存在していても、一度のがん検診で、複数種の臓器のがんの有無（即ち、がんの疑いが有るかないか）を、従来よりも精度高く、診断することができるバイオマーカーセットを容易に作製することができる。より具体的に言えば、複数種の臓器のがんの有無の検査を調べる一度のがん検診において、ＤＮＡメチル化度データに「組織型」の情報を有するがん種の組織ＤＮＡを精度高く検出できるバイオマーカーを獲得することができるだけでなく、ＤＮＡメチル化度データに「組織型」の情報を有さないがん種の組織ＤＮＡについても、従来よりも同程度以上に精度高く検出できるバイオマーカーを容易に獲得することができる。

（バイオマーカー選択工程）
　次いで、分類工程で分類された１以上のグループの中から任意に１つのグループを選択し、（ステップＳ１４）、選択されたグループと、残りのグループ（他のグループ）との二群間比較を、両グループ共通のＤＮＡの位置で行う（ステップＳ１６）。

　この比較により、統計的に有意差が認められるＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における両グループのメチル化状態（即ち、メチル化／非メチル化を示すメチル化度）を抽出する。ここで有意差が認められたＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における両グループのメチル化状態であれば、両グループを区別して判別することができると見なされる。

　次いで、有意差が大きい順に、少なくとも１個のＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における、選択されたグループのメチル化状態を、分類工程で分類された１以上のグループの中から選択されたグループが属するがん種（臓器）を検出するバイオマーカーとして選択する（ステップＳ１８）。
　選択するバイオマーカーの数値範囲は、下限は、生体ノイズや計測ノイズを考慮して冗長性があるように決定し、上限は、選択されたグループのサンプル数を考慮して決定することが好ましく、一般的に、選択されたグループのバイオマーカー数は、選択されたグループのサンプル数を超えないように選択する。
　ここで選択されるバイオマーカーの数は、１個以上であれば限定されないが、５個～１００個であれば好ましく、１０個～３０個であれば、より好ましい。

　ここで、ステップＳ１６における二群間比較の方法を説明する。
（１）統計的仮説検定を利用した方法
　例えば、Ａ群（例えば、２００人分）のＤＮＡメチル化度データと、Ｂ群（例えば、１００人分）のＤＮＡメチル化度データの間に有意差があるか否かを検定する場合に、両群に共通するＤＮＡの位置において、Ａ群のメチル化度の分布と、Ｂ群のメチル化度の分布を比較する。両分布の乖離は、統計検定を用いて判定することができる。まず、図２Ａに示すように、予め、分布を可視化し、分布の形状に合わせて適した検定方法［１］～［３］を選択する。
［１］分布が正規分布と見做せる場合であって、２つの分布の分散が等しい時は、スチューデントのｔ検定を選択する。
［２］分布が正規分布と見做せる場合であって、２つの分布の分散が等しくない時は、ウェルチのｔ検定を選択する。
［３］分布が正規分布と見做せない場合は、マン・ホイットニーのＵ検定を選択する。
　これら検定により、ｐ値が０．０５以下である場合、２つのメチル化度分布は乖離している、即ち、有意差が認められると判定され、Ａ群とＢ群は、区別して判別することができるとみなされる。

　本実施形態においては、このような比較を行った結果、統計的に有意差が認められたＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における両グループのメチル化状態（即ち、メチル化／非メチル化を示すメチル化度）をｐ値が小さい順に並べる。

　次いで、ｐ値が小さい順に、少なくとも１個のＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における、選択されたグループのメチル化状態を、分類工程で分類された１以上のグループの中から選択されたグループが属するがん種（臓器）を検出するバイオマーカーとして選択する（ステップＳ１８）。

　例えば、分類工程において、収集した全てのメチル化度データがＡ～Ｄのグループに分類され、Ａ～Ｄのグループの中から、任意にＡグループが選択された場合、Ａ×（Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）の組み合わせで二群間比較を実施すると（図２Ａでは、Ｂ＋Ｃ＋Ｄが、図中の「Ｂ群」に該当）、両グループを区別して判別することができると見なされるｐ値≦０．０５のＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における両グループのメチル化状態の情報が得られる。
　次いで、取得された情報の中から、ｐ値が小さい順に、１個以上のＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における、選択されたＡグループのメチル化状態の情報を選択し、これら情報を、Ａグループが属するがん種（臓器）の組織ＤＮＡを検出するバイオマーカーとして選択される。

　なお、上記二群間比較は、Ａ×Ｂ、Ａ×Ｃ、及びＡ×Ｄの組み合わせで実施されてもよい。この場合、両グループを区別して判別することができると見なされるｐ値≦０．０５のＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における両グループ（即ち、Ａ及びＢ、Ａ及びＣ、Ａ及びＤ）のメチル化状態の情報がそれぞれ得られる。
　次いで、取得されたメチル化状態の情報の中から、ｐ値の最大値（Ａ×Ｂ、Ａ×Ｃ、Ａ×Ｄの最大値）が小さい順に、１個以上のＤＮＡの位置、及びそのＤＮＡ位置における、選択されたＡグループのメチル化状態の情報を選択し、これら情報を、Ａグループが属するがん種（臓器）の組織ＤＮＡを検出するバイオマーカーとして選択される。ただし、Ａグループが属するがん種に属するグループ、即ち、がん種が同じグループについては、必ずしも二群間比較を実施する必要はない。

（２）代表値を利用した方法
　また、Ａ群及びＢ群の両分布の乖離を、メチル化度の分布の代表値を用いる方法を用いて判定することができる。まず、両群のメチル化度分布の代表値（中央値または平均値）を算出し、両群の算出値に、少なくとも３０％以上の乖離がある場合、両群のメチル化度分布は乖離している、即ち、有意差が認められると判定され、Ａ群とＢ群は、区別して判別することができるとみなされる。
　例えば、まず初めに、図２Ｂに示すように、Ａ群とＢ群のＤＮＡメチル化度データの間に有意差があるか否かを検定する場合に、両群に共通するＤＮＡの位置において、Ａ群のメチル化度分布（例えば、２００人分）の中央値と、Ｂ群のメチル化分布（例えば、１００人分）の中央値を算出する。両群の中央値を比較し、少なくとも３０％以上の乖離がある場合、両群のメチル化度分布は乖離していると判定され、Ａ群とＢ群は、区別して判別することができると見なされる。
。同様に、Ａ群及びＢ群のメチル化度分布の平均値を算出、比較し、少なくとも３０％以上の乖離がある場合、２つのメチル化度分布は乖離していると判定することができる。
　図２Ｂにおいて、例えば、分類工程において、収集した全てのメチル化度データがＡ～Ｄのグループに分類され、Ａ～Ｄのグループの中から、任意にＡグループが選択された場合は、Ｂ＋Ｃ＋Ｄが、図中の「Ｂ群」に該当する。

　上述したように、１つのグループに基づくバイオマーカーの選択を完了すると、ステップＳ１４において、複数のグループから、全てのグループの選択が完了しているか否か、即ち、全てのグループのバイオマーカーの選択作業が完了しているか否かを判定し（ステップＳ２０）、完了している場合は、次の工程（ステップＳ２２）に進み、完了されていない場合は、完了されるまで、バイオマーカーを選択する工程（ステップＳ１４～Ｓ２０）を繰り返す。

（バイオマーカーセットの作製）
　全てのグループのバイオマーカーの選択作業が完了すれば、各グループにおいて、選択されたバイオマーカーを全て使用するバイオマーカーセットを作製する（ステップＳ２２）。
　バイオマーカーセットを構成するバイオマーカー数は、２個以上であれば特に限定されないが、１０個～１０００個であれば好ましく、３０個～３００個であればより好ましい。
　がん種間でバイオマーカーの数は、同じであっても異なっていてもよいが、グループ間でバイオマーカーの数が同程度であることが好ましい。
　グループ間におけるバイオマーカー数の差は、特に限定されないが、選択したバイオマーカーの個数の±０％～±３００％であれば好ましく、±０％～±５０％であればより好ましい。

　上述したように、本実施形態１の方法で作製されたバイオマーカーセットは、被検者から採取した生体試料中に含まれるセルフリーＤＮＡに、がん組織ＤＮＡが存在するか否かを臓器別に従来と同程度または従来よりも高精度に検出することができる。
　また、さらに、生体試料中に含まれるセルフリーＤＮＡのメチル化パターンが、本実施形態１の方法で選択されたバイオマーカーのメチル化パターンと一致するか否かの検査を行えば、いずれの組織型に属する臓器のがんであるのかを判定することも可能である。
　また、１度の検査で複数種のがん組織ＤＮＡの有無を検出することができるため、被検者の時間的制約、経済的負担、身体的・精神的な負担を小さくさせることができる。

［実施形態２］
　実施形態１においては、「組織型」の情報に基づいて、各検出対象のがんについて収集されたＤＮＡメチル化度データを分類したがこれに限定されず、「がん以外の疾患の罹患の有無」に基づいて分類することもできる。
　図３に示す実施形態２のバイオマーカーセットの作製方法は、図１に示す実施形態１のバイオマーカーセットの作製方法と、データ分類工程（ステップＳ１２Ａ）以外は、同様の工程を有するものであるので、同一の工程には、同一の参照符号を付し、その説明は省略する。

　ＤＮＡメチル化度データ収集工程（ステップＳ１０）において、「組織型」の情報の代わりに、「がん以外の疾患の罹患の有無」の情報を取得する。
　がん以外の疾患の罹患の有無の情報は、サンプルに付随する情報から取得する。複数の検出対象（臓器）のがんのうち、検出対象の少なくとも１種類のがんのサンプルに付随するがん以外の疾患の有無の情報について取得できれば、特に限定されないが、好ましくは、検出対象の全ての種類のがんのサンプルに付随するがん以外の疾患の有無の情報を収集することが好ましい。例えば、検出対象が臓器Ａ～Ｄのがんである場合、少なくとも臓器Ａの患者由来のサンプルに付随するがん以外の疾患の有無の情報を取得できれば、特に限定されない。
　また、検出対象のがんに相関性のある「がん以外の疾患の罹患の有無」の情報を２以上収集することが好ましい。例えば、臓器Ａのがん患者由来のサンプルに付随するがん以外の疾患数は、特に限定されないが、２以上であることが好ましい。

　「がん以外の疾患」としては、サンプルに付属する情報として提供されている疾患であれば、特に限定されないが、各種がんに相関性があるものが好ましい。相関性がある疾患の例としては、以下のようなものが挙げられる。

　検出対象のがんが、「肝がん」である場合は、がんを除く疾患として、肝硬変、慢性肝炎、アルコール性肝障害、薬剤性肝障害が挙げられる。
　検出対象が、「大腸がん」である場合は、がん以外の疾患として、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、薬剤性大腸炎が挙げられる。
　検出対象が、「膵がん」である場合は、がん以外の疾患として、慢性膵炎が挙げられる。
　検出対象が、「肺がん」である場合は、がん以外の疾患として、慢性閉塞性肺疾患が挙げられる。
　検出対象が、「卵巣がん」である場合は、がん以外の疾患として、付属器炎が挙げられる。

　次いで、分類工程（ステップＳ１２Ａ）において、「組織型」の代わりに、「がん以外の疾患の罹患の有無」で分類を行う。
　複数のＤＮＡメチル化度データががん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報を有する場合、複数のＤＮＡメチル化度データを２以上のグループに分類し、がん以外の疾患の罹患の有無の情報を有さない場合は、１つのグループとして分類することができる。

　このような分類をすることで、ＤＮＡメチル化パターンが異なる複数の患者群由来の生体試料が存在していても、一度のがん検診で、複数種の臓器のがんの有無（即ち、がんの疑いが有るかないか）を、従来よりも精度高く、診断することができるバイオマーカーセットを容易に作製することができる。より具体的に言えば、複数種の臓器のがんの有無の検査を調べる一度のがん検診において、ＤＮＡメチル化度データに「がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無」の情報を有するがん種の組織ＤＮＡを精度高く検出できるバイオマーカーを獲得することができるだけでなく、ＤＮＡメチル化度データに「がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無」の情報を有さないがん種の組織ＤＮＡについても、従来よりも同程度以上に精度高く検出できるバイオマーカーを容易に獲得することができる。

　上述したように、本実施形態２の方法で作成されたバイオマーカーセットは、被検者から採取した生体試料中に含まれるセルフリーＤＮＡに、がん組織ＤＮＡが存在するか否かを臓器別に従来よりも同程度または高精度に検出することができる。
　また、１度の検査で複数種のがん組織ＤＮＡの有無を精度高く検出することができるため、被検者の時間的制約、経済的負担、身体的・精神的な負担を小さくさせることができる。

　以上、本発明について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

［実施例１］
（メチル化度データの収集工程）
　表１に示すように、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、（５）卵巣がん組織、及び（６）非がん組織（正常白血球）それぞれに由来するＤＮＡメチル化度データ（サンプル）を、TCGA及び／またはNCBIのGEOから収集した。ＤＮＡメチル化度データは、「全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置」、「メチル化部位のメチル化度」、及び卵巣がんの組織型の情報からなる。各発生臓器のがん組織ＤＮＡ（１）～（５）は、各がん患者、非がん組織ＤＮＡ（６）は、健常者に由来するサンプルである。
　なお、収取されたデータは何れも、イルミナ社のマイクロアレイ Infinium Human Methylation 450を用いて測定されたものである。本マイクロアレイは、約４５万ヵ所のシトシンのメチル化度を測定することができるものである。本実施例において、ＤＮＡメチル化度データの「全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置」、「そのメチル化部位のメチル化度」は、Infinium Human Methylation 450で計測された全てのシトシン塩基、及びそれらシトシン塩基のメチル化度を使用した。

（データ分類工程）
　次いで、（５）卵巣がんのサンプルデータについては、組織型の情報に基づいて、（５）卵巣がん組織ＤＮＡのサンプルを、漿液性がんと明細胞がんと類内膜がんと粘液性がんにさらに細分化して分類し、その他のがんについては、分類はしなかった。その結果、発生臓器のがん組織ＤＮＡ等（１）～（６）の群を、合計９つのＡ～Ｉの群（グループ）に細分化した。各群のサンプル数は表１に示すとおりである。
　各群のＤＮＡメチル化データ（サンプル）はランダムに二等分し、一方のサンプル群は、バイオマーカーの選択及びそのセットの作製と、作製したバイオマーカーセットの性能評価のために使用する機械学習モデルの教師データとして使用し、他方のサンプル群は、作製したバイオマーカーの性能評価に使用した。

（バイオマーカーの選択工程、及びバイオマーカーセットの作製工程）
　次いで、Ａ群とそれ以外の群（Ｂ～Ｉ群）とを区別して判別することができる「ＤＮＡの位置及びメチル化度」を抽出するために、各群共通のＤＮＡ位置におけるメチル化度分布を作成した。即ち、収集されたＤＮＡの所定の位置におけるＡ群のメチル化度分布、Ｂ群のメチル化度分布・・・Ｉ群のメチル化度を収集されたＤＮＡの全ての位置において作成した。いずれのメチル化度分布も正規分布とみなすことができ、全ての分布の分散が等しいと判断することができたため、バイオマーカーの選択には、スチューデントのｔ検定を用いた。
　続いて、大腸がん群のサンプル（Ａ）を、他臓器のがん群及び正常白血球群のサンプル（Ｂ～Ｉ）と区別可能なバイオマーカーを選択するため、Ａ群と、区別すべき他の各サンプルとの間で（即ち、Ａ群と、Ｂ群＋Ｃ群＋・・・Ｉ群との間で）、「二群の平均値に差はない」という帰無仮説に対するｐ値をＤＮＡの全ての位置において算出した。
　算出されたｐ値、ｐ値≦０．０５を満たす「ＤＮＡの位置及びメチル化度」中からｐ値の小さい順に１４個の「ＤＮＡの位置及びその位置におけるメチル化度（Ａ群のメチル化度）」を選択し、それらをＡ群が属する大腸がん組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択した。
　なお、ｐ値の算出にはＲ言語と呼ばれる統計解析向けのプログラミング言語、およびＲ言語のt.test関数を用いた。

　Ａ群と同様に、他の群（Ｂ～Ｉ）においても、ｐ値をＤＮＡの全ての位置において算出し、ｐ値≦０．０５を満たす「ＤＮＡの位置及びメチル化度」中からｐ値の小さい順に１４個の「ＤＮＡの位置及びその位置におけるメチル化度」を選択し、それらを各群が属するがん組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択した。Ａ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＡ群のメチル化度」は、大腸がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｂ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＢ群のメチル化度」は、膵がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｃ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＣ群のメチル化度」は、肝がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｄ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＤ群のメチル化度」は、肺がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｅ～Ｈ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＥ～Ｈ群のメチル化度」は、卵巣がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｉ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＩ群のメチル化度」は、正常白血球のＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択される。
　このように選択された１４個／群×９群=１２６個のバイオマーカーを、複数種類の臓器のがんの有無を１度に検査するバイオマーカーセットとして作製した。

（バイオマーカーセットの性能評価）
　まず、機械学習モデルＳＶＭに、バイオマーカーの選択に使用したサンプル群（即ち、１２６個のバイオマーカーの選択に使用されたメチル化度データ群）を学習させた後、バイオマーカーの選択に使用していないサンプル群の各メチル化度データが、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、及び（５）卵巣がん組織のうち、どの臓器のがん組織ＤＮＡに由来するものか推定した（学習と推定にはR言語、およびR言語のライブラリe1071中のｓｖｍ関数を用いた）。性能評価は、推定された各がん種の正答率で示した。
　実施例１で選択したバイオマーカーセットの正答率は、大腸がんで８８％、膵がんで８１％、肝がんで８５％、肺がんで８４％、卵巣がんで８６％であった（図４参照）。

［実施例２］
（メチル化度データの収集工程）
　実施例１と同様に、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、（５）卵巣がん組織、及び（６）非がん組織（正常白血球）それぞれに由来するＤＮＡメチル化度データ（サンプル）を、TCGA及び／またはNCBIのGEOから収集した（表２参照）。ＤＮＡメチル化度データは、全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置、そのメチル化部位のメチル化度、及び（３）肝がん、（４）肺がん、及び（５）卵巣がんの組織型の情報からなる。実施例１と同様に、ＤＮＡメチル化度データのゲノム領域、及びそのゲノム領域のメチル化状態は、Infinium Human Methylation 450で計測された全てのシトシン塩基、及びそれらシトシン塩基のメチル化度を使用した。

（データ分類工程）
　次いで、（３）肝がん、（４）肺がん、及び（５）卵巣がんのサンプルデータについては、組織型の情報に基づいて、（３）肝がん組織ＤＮＡのサンプルをさらに肝細胞がんと肝内胆管がんに、（４）肺がん組織ＤＮＡのサンプルをさらに腺がんと扁平上皮がんに、（５）卵巣がん組織ＤＮＡのサンプルを漿液性がんと明細胞がんと類内膜がんと粘液性がんに細分化して分類した。一方、組織型の情報を有さないその他のがんについては、分類しなかった。その結果、発生臓器のがん組織ＤＮＡ（１）～（６）の群を、合計１１のＡ～Ｋの群に細分化した。各群のサンプル数は表２に示すとおりである。
　各群のＤＮＡメチル化データ（サンプル）はランダムに二等分し、一方のサンプル群は、バイオマーカーの選択及びそのセットの作製と、作製したバイオマーカーセットの性能評価のために使用する機械学習モデルの教師データとして使用し、他方のサンプル群は、作製したバイオマーカーの性能評価に使用した。

（バイオマーカーの選択工程、及びバイオマーカーセットの作製工程）
　実施例１と同様に、収集したＤＮＡメチル化データから、１群に対し、１２個のバイオマーカーを選択した。Ａ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＡ群のメチル化度」は、大腸がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｂ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＢ群のメチル化度」は、膵がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｃ群及びＤ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＣ及びＤ群のメチル化度」は、肝がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｅ群及びＦ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＥ及びＦ群のメチル化度」は、肺がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｇ～Ｊ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＧ～Ｊ群のメチル化度」は、卵巣がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｋ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＫ群のメチル化度」は、正常白血球ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択される。
　また、１２個／群×１１群=１３２個のバイオマーカーを、多種類の臓器のがんの有無を１度に検査するバイオマーカーセットとして作製した。

（バイオマーカーセットの性能評価）
　実施例１と同様に、機械学習モデルＳＶＭに、バイオマーカーの選択に使用したサンプル群（即ち、１３２個のバイオマーカーの選択に使用されたメチル化度データ群）を学習させた後、バイオマーカーの選択に使用していないサンプル群の各メチル化度データが、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、及び（５）卵巣がん組織のうち、どの臓器のがん組織ＤＮＡに由来するものか推定した。性能評価は、実施例１と同様に、推定された各がん種の正答率で示した。
　実施例２で選択したバイオマーカーセットの正答率は、大腸がんで８９％、膵がんで８３％、肝がんで８８％、肺がんで８７％、卵巣がんで８９％であった（図５参照）。

［比較例１］
（メチル化度データの収集工程／データ分類工程）
　メチル化度データの収集において、いずれのがん種においても組織型の情報を取得しなかったこと以外、全て実施例１及び２と同様にメチル化度データの収集工程及びデータ分類工程を実施した。その結果、発生臓器のがん組織ＤＮＡ（１）～（６）の群は、細分化されることなく、合計６つのＡ～Ｆの群に分類された。各群Ａ～Ｆのサンプル数は表３に示すとおりである。

（バイオマーカーの選択工程、及びバイオマーカーセットの作製工程）
　実施例１と同様に、収集したＤＮＡメチル化データから、１群に対し、２２個のバイオマーカーを選択した。また、２２個／群×６群=１３２個のバイオマーカーを、多種類の臓器のがんの有無を１度に検査するバイオマーカーセットとして作製した。

（バイオマーカーセットの性能評価）
　実施例１と同様に、機械学習モデルＳＶＭに、バイオマーカーの選択に使用したサンプル群（即ち、１３２個のバイオマーカーの選択に使用されたメチル化度データ群）を学習させた後、バイオマーカーの選択に使用していないサンプル群の各メチル化度データが、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、及び（５）卵巣がん組織のうち、どの臓器のがん組織ＤＮＡに由来するものか推定した。性能評価は、実施例１及び２と同様に、推定された各がん種の正答率で示した。
　比較例１で選択したバイオマーカーセットの正答率は、大腸がんで８８％、膵がんで８１％、肝がんで８３％、肺がんで７６％、卵巣がんで７２％であった（図４及び５参照）。

（実施例１と比較例１の対比）
　図４は、実施例１と比較例１で選択したバイオマーカーセットの性能評価の結果（正答率）を比較したものである。実施例１のバイオマーカーセットは、１４個／群×９群=１２６個のバイオマーカーからなり、比較例１のバイオマーカーセットは、２２個／群×６群=１３２個のバイオマーカーからなる。
　図４から、実施例１で選択したバイオマーカーセットは、比較例１よりもバイオマーカー数が少ないにもかかわらず、各がん種において、比較例１と同程度以上の正答率が得られていることがわかる。
　従って、少なくとも１つの臓器のがん種のサンプルデータ（メチル化度データ群）を、組織型の情報に基づいて分類を行った後に選択されたバイオマーカーからなるバイオマーカーセットは、組織型の情報に基づいて分類を行うことなく選択されたバイオマーカーからなるバイオマーカーセットよりも高精度に各種臓器のがんを検出することができることがわかる。

（実施例２と比較例１の対比）
　図５は、実施例２と比較例１で選択したバイオマーカーセットの性能評価の結果（正答率）を比較したものである。実施例２のバイオマーカーセットは、１２個／群×１１群=１３２個のバイオマーカーからなり、比較例１のバイオマーカーセットは、２２個／群×６群=１３２個のバイオマーカーからなるため、いずれも同数のバイオマーカーからなる。
　図５から、実施例２で選択したバイオマーカーセットは、比較例１を選択したバイオマーカーセットよりも、全てのがん種において、高い正答率が得られていることがわかる。
　従って、少なくとも１つの臓器のがん種のサンプルデータ（メチル化度データ群）を、組織型の情報に基づいて分類を行った後に選択されたバイオマーカーからなるバイオマーカーセットは、組織型の情報に基づいて分類を行わずに選択されたバイオマーカーからなるバイオマーカーセットよりも高精度に各種臓器のがんを検出することができることがわかる。
　また、組織型の情報を有さない臓器のがんについても、精度高く、がん組織ＤＮＡを検出することができ、がんの有無を診断することができることがわかる。

［実施例３］
（メチル化度データの収集工程）
　表４に示すように、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、（５）卵巣がん組織、及び（６）非がん組織（正常白血球）それぞれに由来するＤＮＡメチル化度データ（サンプル）を、TCGA及び／またはNCBIのGEOから収集した。ＤＮＡメチル化度データは、全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置、そのメチル化部位のメチル化度、（３）肝がんに相関性のある肝硬変及び慢性肝炎の罹患の有無の情報からなる。各発生臓器のがん組織ＤＮＡ（１）～（５）は、各がん患者に由来するサンプル、非がん組織ＤＮＡ（６）は、健常者に由来するサンプルである。
　なお、何れのデータも、メチル化度の測定はイルミナ社のマイクロアレイInfinium Human Methylation 450を用いて行われている。本マイクロアレイは、約４５万ヵ所のシトシンのメチル化度を測定することができる。実施例１と同様に、ＤＮＡメチル化度データの「全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置」及び「そのメチル化部位のメチル化度」、は、Infinium Human Methylation 450で計測された全てのシトシン塩基、及びそれらシトシン塩基のメチル化度を使用した。

（データ分類工程）
　次いで、肝硬変及び慢性肝炎の罹患の有無の情報に基づいて、（３）肝がん組織ＤＮＡのサンプルを、さらに、肝硬変罹患、慢性肝炎罹患、いずれに罹患なしに細分化して分類した。一方、肝硬変等の罹患の有無についての情報を有さないその他のがんについては、分類しなかった。その結果、発生臓器のがん組織ＤＮＡ（１）～（６）の群を、合計８つの群Ａ～Ｈに細分化した。各群のサンプル数は表４に示すとおりである。
　各群のＤＮＡメチル化データ（サンプル）はランダムに二等分し、一方のサンプル群は、バイオマーカーの選択及びそのセットの作製と、作製したバイオマーカーセットの性能評価のために使用する機械学習モデルの教師データとして使用し、他方のサンプル群は、作製したバイオマーカーの性能評価に使用した。

（バイオマーカーの選択工程、及びバイオマーカーセットの作製工程）
　実施例１と同様に、収集したＤＮＡメチル化データから、１群に対し、１２個のバイオマーカーを選択した。Ａ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＡ群のメチル化度」は、大腸がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｂ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＢ群のメチル化度」は、膵がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｃ群からＥ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＣ及びＥ群のメチル化度」は、肝がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｆ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＦ群のメチル化度」は、肺がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｇ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＧ群のメチル化度」は、卵巣がんの組織ＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択され、Ｈ群で選択された「ＤＮＡの位置及びＨ群のメチル化度」は、正常白血球のＤＮＡの存在の有無を検出するバイオマーカーとして選択される。
　また、１２個／群×８群=９６個のバイオマーカーを、多種類の臓器のがんの有無を１度に検査するバイオマーカーセットとして作製した。

（バイオマーカーセットの性能評価）
　実施例１と同様に、機械学習モデルＳＶＭに、バイオマーカーの選択に使用したサンプル群（即ち、９６個のバイオマーカーの選択に使用されたメチル化度データ群）を学習させた後、バイオマーカーの選択に使用していないサンプル群の各メチル化度データが、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、及び（５）卵巣がん組織のうち、どの臓器のがん組織ＤＮＡに由来するものか推定した。性能評価は、実施例１と同様に、推定された各がん種の正答率で示した。
　実施例３で選択したバイオマーカーセットの正答率は、大腸がんで８８％、膵がんで８３％、肝がんで９０％、肺がんで８５％、卵巣がんで８４％であった（図６参照）。
［比較例２］

（メチル化度データの収集工程／データ分類工程）
　メチル化度データの収集において、いずれのがん種においても肝がんに相関性のある肝硬変及び慢性肝炎の罹患の有無の情報を取得しなかったこと以外、全て実施例３と同様にメチル化度データの収集工程及びデータ分類工程を実施した。その結果、発生臓器のがん組織ＤＮＡ（１）～（６）の群は、細分化されることなく、合計６つのＡ～Ｆの群に分類された。各群Ａ～Ｆのサンプル数は表５に示すとおりである。

　（バイオマーカーの選択工程、及びバイオマーカーセットの作製工程）
実施例３（即ち、実施例１）と同様に、収集したＤＮＡメチル化データから、１群に対し、２２個のバイオマーカーを選択した。また、１６個／群×６群=９６個のバイオマーカーを、多種類の臓器のがんの有無を１度に検査するバイオマーカーセットとして作製した。

（バイオマーカーセットの性能評価）
　実施例１と同様に、機械学習モデルＳＶＭに、バイオマーカーの選択に使用したサンプル群（即ち、９６個のバイオマーカーの選択に使用されたメチル化度データ群）を学習させた後、バイオマーカーの選択に使用していないサンプル群の各メチル化度データが、（１）大腸がん組織、（２）膵がん組織、（３）肝がん組織、（４）肺がん組織、及び（５）卵巣がん組織のうち、どの臓器のがん組織ＤＮＡに由来するものか推定した。性能評価は、実施例１及び２と同様に、推定された各がん種の正答率で示した。
　比較例２で選択したバイオマーカーセットの正答率は、大腸がんで８３％、膵がんで８１％、肝がんで８２％、肺がんで８６％、卵巣がんで８４％であった（図６参照）。

（実施例３と比較例２の対比）
　図６は、実施例３と比較例２で選択したバイオマーカーセットの性能評価の結果（正答率）を比較したものである。実施例３のバイオマーカーセットは、１２個／群×８群=９６個のバイオマーカーからなり、比較例２のバイオマーカーセットは、１６個／群×６群=９６個のバイオマーカーからなるため、いずれも同数のバイオマーカーからなる。
　図６から、実施例３で選択したバイオマーカーセットは、各がん種において、比較例２で選択したバイオマーカーセットと同等以上の正答率が得られていることがわかる。
　従って、少なくとも１つの臓器のがん種のサンプルデータ（メチル化度データ群）を、肝がんに相関性のある肝硬変及び慢性肝炎の罹患の有無の情報に基づいて分類を行った後に選択されたバイオマーカーからなるバイオマーカーセットは、肝硬変等の情報に基づいて分類を行わずに選択されたバイオマーカーからなるバイオマーカーセットと高精度に各種臓器のがんを検出することができることがわかった。
　また、大腸がんや、膵がんのように、がん以外の疾患の有無の情報を有さない臓器のがんについても、精度高く、がん組織ＤＮＡを検出することができ、がんの有無を診断することができることがわかった。

　本発明で設計されたバイオマーカーセットは、がん検診に使用することが可能である。

Claims

　診断対象として複数種類の臓器のがんを含む、がん検診に使用するためのバイオマーカーセットを作製する方法であって、
　前記診断対象のがんに罹患した患者由来の生体試料から取得された既知の複数のＤＮＡメチル化度データであって、前記がんの種類別に、（１）全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置、（２）前記メチル化部位のメチル化度、及び（３）組織型の情報を含む、複数のＤＮＡメチル化度データを収集する収集工程と、
　前記組織型の情報に基づいて、前記がんの種類別に収集された前記複数のＤＮＡメチル化度データを１以上のグループに分類する分類工程と、
　分類された全てのグループから任意に１つの所定のグループを選択し、前記所定のグループと
他のグループとの間で二群間比較を行い、両グループとの間に有意差があると認められたＤＮＡ位置、及びその位置における両グループのメチル化状態の情報を抽出する抽出工程と、
　有意差が認められた両グループの前記情報の中から、所定の条件を満たすものを、所定のグループが属するがん種のバイオマーカーとして選択する選択工程と、
　分類された全てのグループについて、前記バイオマーカーが選択されるまで、前記抽出工程及び選択工程を繰り返し、選択された全てのバイオマーカーから構成されるバイオマーカーセットを作製する工程と
を有し、
　前記組織型情報は、少なくとも１種類以上の前記がんの前記ＤＮＡメチル化度データに含まれるバイオマーカーセットの選択方法。
　前記分類工程において、前記複数のＤＮＡメチル化度データが２以上の組織型の情報を有する場合は、前記複数のＤＮＡメチル化度データを２以上のグループに分類し、前記組織型情報を１つだけ有する、又は前記組織型情報を有さない場合は、１つのグループとして分類する請求項１に記載の方法。
　前記抽出工程において、前記有意差の判定は、（１）統計的検定におけるｐ値、又は（２）前記メチル化度分布の中央値若しくは平均値の差に基づいて実施される請求項１に記載の方法。
　前記診断対象に卵巣がん、肺がん、及び肝がんを含み、
　前記収集工程で収集された前記組織型の情報が、前記卵巣がんの組織型である漿液性がん、明細胞がん、類内膜がん及び粘液性がん、前記肺がんの組織型である腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、小細胞がん、前記肝がんの組織型である肝細胞がん及び肝内胆管がんである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
　診断対象として複数種類の臓器のがんを含む、がん検診に使用するためのバイオマーカーセットを作製するバイオマーカーセットの作製方法であって、
　前記診断対象のがんに罹患した患者由来の生体試料から取得された既知の複数のＤＮＡメチル化度データであって、前記がんの種類別に、（１）全ゲノム領域における１以上のメチル化部位の位置、（２）前記メチル化部位のメチル化度、及び（３）がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報を含む、複数のＤＮＡメチル化度データを収集する収集工程と、
　前記がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報に基づいて、前記がんの種類別に収集された前記複数のＤＮＡメチル化度データを１以上のグループに分類する分類工程と、
　分類された全てのグループから任意に１つの所定のグループを選択し、前記所定のグループと
他のグループとの間で二群間比較を行い、両グループとの間に有意差があると認められたＤＮＡ位置、及びその位置における両グループのメチル化状態の情報を抽出する抽出工程と、
　有意差が認められた両グループの前記情報の中から、所定の条件を満たすものを、所定のグループが属するがん種のバイオマーカーとして選択する選択工程と、
　分類された全てのグループについて、前記バイオマーカーが選択されるまで、前記抽出工程及び選択工程を繰り返し、選択された全てのバイオマーカーから構成されるバイオマーカーセットを作製する工程と
を有し、
　前記がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報は、少なくとも１種類以上の前記がんの前記ＤＮＡメチル化度データに含まれるバイオマーカーセットの選択方法。
　前記分類工程において、前記複数のＤＮＡメチル化度データががん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報を有する場合は、前記複数のＤＮＡメチル化度データを２以上のグループに分類し、前記がん以外の疾患の罹患の有無の情報を有さない場合は、１つのグループとして分類する請求項５に記載の方法。
　前記抽出工程において、前記有意差の判定は、（１）統計的検定におけるｐ値、又は（２）前記メチル化度分布の中央値若しくは平均値の差に基づいて実施される請求項５に記載の方法。
　前記診断対象に肝がんを含み、
　前記収集工程で収集された前記がん以外の１種類以上の疾患の罹患の有無の情報は、前記肝がんと相関性が高い肝硬変の罹患の有無、及び慢性肝炎の罹患の有無である請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。