TW202018094A - 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法 - Google Patents

泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202018094A
TW202018094A TW107140464A TW107140464A TW202018094A TW 202018094 A TW202018094 A TW 202018094A TW 107140464 A TW107140464 A TW 107140464A TW 107140464 A TW107140464 A TW 107140464A TW 202018094 A TW202018094 A TW 202018094A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
mir
epithelial cancer
urinary epithelial
subject
seq
Prior art date
Application number
TW107140464A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI690597B (zh
Inventor
馬念涵
陳建隆
林楨桓
李安倫
黃秋錦
張兆祥
Original Assignee
國立中央大學
張煥禎
台達電子工業股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國立中央大學, 張煥禎, 台達電子工業股份有限公司 filed Critical 國立中央大學
Priority to TW107140464A priority Critical patent/TWI690597B/zh
Priority to CN201910299262.5A priority patent/CN111187836B/zh
Priority to US16/460,546 priority patent/US11098371B2/en
Application granted granted Critical
Publication of TWI690597B publication Critical patent/TWI690597B/zh
Publication of TW202018094A publication Critical patent/TW202018094A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一種泌尿上皮癌的檢測套組，包含至少一檢測微型核糖核酸的引物或探針，微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487和其組合所組成之群組。一種泌尿上皮癌的檢測方法，包含測量受試者的樣本中的微型核糖核酸表現量，微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487和其組合所組成之群組；以及評估受試者罹患泌尿上皮癌的風險。

Description

泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法
本揭示內容係關於癌症相關的微型核糖微酸之檢測套組及檢測方法。
微型核糖核酸(miRNA)是一種內源性長度約19到25個核苷酸的非編碼RNA分子，其主要通過轉錄後抑制或誘導信使核糖核酸(mRNA)的降解來調節靶基因的表達。癌症中微型核糖核酸(miRNA)的特定的表現型式可以視為一種生物指標，有利於腫瘤的診斷、分類、分期以及預後之評估。從各種生物體液樣本中檢測微型核糖核酸，可作為許多類型的癌症的非侵入式診斷的標記。
泌尿上皮癌(Urothelial carcinoma，UC)係發生在尿路上皮之惡性腫瘤之總稱。泌尿上皮癌之發生部位係遍及尿路整體，包含腎盂、輸尿管、膀胱及尿道。泌尿上皮癌係由病變的泌尿上皮細胞所衍生而成，因此也稱為移行上皮細胞癌(Transitional cell carcinoma，TCC)。泌尿上皮癌一般好發於男性、膀胱、老年(60-70歲)，但近年來，上泌尿道泌尿上皮癌(腎盂癌、輸尿管癌，upper urinary tract UC,UUC)也有增加趨勢，而且女性族群也日漸增加。
目前關於泌尿上皮癌的診斷，除了病史詢問、理學檢查外，最重要的就是尿液檢驗、尿液細胞學檢查和泌尿道影像檢查(包含：超音波、靜脈顯影劑泌尿道攝影、腹部及骨盆腔電腦斷層或核磁共振)。此外，對於高度懷疑的患者，侵入性的泌尿道內視鏡檢查(包含膀胱鏡及輸尿管鏡)也是必要的，腫瘤的確診則需要進一步切片經病理顯微鏡檢查後，才能確定腫瘤的種類與惡性程度。泌尿上皮癌的初期症狀不明顯，主要是以血尿和腰痛來表現，且確診時癌症往往已較晚期，而且目前沒有適當的腫瘤標記供診斷和追蹤治療之用，造成罹病較晚發現和死亡率較高。
有鑑於此，本揭示內容提供了一種檢測泌尿上皮癌的檢測套組和檢測方法，有助於泌尿上皮癌的診斷和追蹤治療。
本揭示內容之一態樣為提供一種用於泌尿上皮癌(Urothelial carcinoma，UC)的檢測套組，包含：至少一檢測微型核糖核酸(miRNA)的引物或探針，微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487，和其組合所組成之群組。
本揭示內容之另一態樣為提供一種泌尿上皮癌的檢測方法，包含：測量受試者的樣本中的微型核糖核酸表 現量，微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487，和其組合所組成之群組；以及評估受試者罹患泌尿上皮癌的風險。
100‧‧‧方法
102、104、106、108、110、112‧‧‧步驟
200‧‧‧方法
202、204、206、208、210‧‧‧步驟
第1圖根據本揭示內容之一些實驗例，篩選用於檢測泌尿上皮癌的微型核糖核酸的流程。
第2A圖為根據本揭示內容之一些實驗例，顯示在非泌尿上皮癌之受試者和泌尿上皮癌病人的樣品中的miR-155/miR-150比值。
第2B圖為根據本揭示內容之一些實驗例，顯示在非泌尿上皮癌之受試者和泌尿上皮癌病人的樣品中的miR-378/miR-150的比值。
第2C圖為根據本揭示內容之一些實驗例，顯示在非泌尿上皮癌之受試者和泌尿上皮癌病人的樣品中的miR-636/miR-150的比值。
第2D圖為根據本揭示內容之一些實驗例，顯示在非泌尿上皮癌之受試者和泌尿上皮癌病人的樣品中的miR-150/miR-210的比值。
第2E圖為根據本揭示內容之一些實驗例，顯示在非泌尿上皮癌之受試者和泌尿上皮癌病人的樣品中的miR-19b-1/miR-378的比值。
第3A圖為根據本揭示內容之一些實驗例之接受者操作 特徵曲線(receiver-operating-characteristic curve，ROC)曲線。
第3B圖為根據本揭示內容之一些實驗例，顯示非泌尿上皮癌之受試者和泌尿上皮癌病人的風險相關的評分。
第3C圖為根據本揭示內容的一些實驗例，顯示miRNA之組合用於檢測泌尿上皮癌的敏感性和特異度。
第4圖為根據本揭示內容之一些實施方式，泌尿上皮癌之檢測方法的流程。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。
在本說明書和所附的請求項中，單數的「一」和「該」包括至少一個或是一個以上的指示物，除非內容另有明確的規定。還應注意的，用語「或」，一般上在運用時其意義包括「和/或」，除非內容另有明確的規定。
泌尿上皮癌在一般人的發生率並不高，但是在接受透析治療(洗腎)的病人卻相當常見，復發的比率也較高。此外，值得注意的是，在國外以腎臟細胞癌較多，但在台灣卻以泌尿道上皮細胞癌為主。
泌尿上皮癌基本的治療是做患側的腎臟輸尿管全切除手術，目前此項手術大都採用微創手術(腹腔鏡手術或達文西機器手臂輔助手術)，可以比傳統開刀手術有更好的傷口外觀，較少的流血，較少的疼痛，及較快的恢復期。只要一發現血尿立刻求診沒有延誤的話，病人的五年存活率可達九成。若是病人有特殊狀況，例如只剩下一個腎臟或是另一側無癌症的腎臟功能也極度不佳，而預期施行標準的腎臟全切除手術之後會馬上洗腎的話，則可以視情況做局部切除手術而保留腎臟。此外此癌症對於化學治療及放射治療也有不錯的反應。因此也會在手術前後結合以上兩項的治療，使癌症的治療達到最好的效果。例如第三期或第四期的病人，會先施行化學治療使腫瘤範圍縮小後再施行手術，如此會有機會得到更佳的完全治癒率。
因此，如果能越早發現泌尿上皮癌，便愈能提升病人的存活率。
本揭示內容的一些實驗例為分析泌尿道上皮細胞癌發生率高的接受透析治療之病人，來進行長期的追蹤研究，包括病人的臨床表現，生化、血液及影像學檢查，微型核糖核酸於血液尿液及組織的變化，疾病和腫瘤的發生和進展，以及治療的追蹤和評估，並分析確認微型核糖核酸在其中所扮演的角色。
請參見第1圖，繪示篩選與泌尿上皮癌相關的微型核糖核酸的流程圖。
方法100起始於步驟102，收集接受透析治療病 人的血漿樣品。由於這群病人有高的泌尿上皮癌發生率，因此比較這群病人中，無泌尿上皮癌病人和有泌尿上皮癌病人的微型核糖核酸表現量的差異。
之後，步驟104為從血漿樣品中萃取總微型核糖核酸。微型核糖核酸在人類的組織與細胞樣本中非常穩定，不易被降解，在許多體液中如血液、唾液、尿液等樣本都可以偵測得到微型核糖核酸。本揭示內容的一些實驗例係從病人的血液樣本中分離出血漿(plasma)，之後檢測血漿中的微型核糖核酸。
之後步驟106為將總微型核糖核酸反轉錄為互補的去氧核糖核酸(cDNA)。
之後步驟108為進行微型核糖核酸陣列實驗，將反轉錄的cDNA以微型核糖核酸晶片檢測，檢測晶片所涵蓋的可檢測微型核糖核酸之表現。例如，TaqMan® Array Human MicroRNA A Cards v2.0晶片可用於檢測近三千種人類微型核糖核酸之表現。
之後，步驟110為資料分析和挑選候選基因。由微型核糖核酸陣列實驗的結果，可以挑出在無泌尿上皮癌病人和有泌尿上皮癌病人之間，表現量有明顯差異的特定的微型核糖核酸。例如，有些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌病人的樣品中表現量較高，另一些特定的微型核糖核酸在泌尿上皮癌病人的樣品中表現量較低；這些特定的微型核糖核酸可做為檢測泌尿上皮癌的候選基因。
之後，方法100的步驟112為驗證候選基因。進一步地再對這些候選基因做驗證，例如進行即時PCR定量實驗，量測這些個別的候選基因在非泌尿上皮癌受試者和泌尿上皮癌病人之間的表現量。另外，也用新的受試者群的樣品再做驗證。
在本揭示內容中，利用接收者操作特徵曲線(ROC curve)獲得檢測泌尿上皮癌之特異性和準確度。例如：利用「prism」這套軟體繪製接收者操作特徵曲線，輸入的資料為正規化後的微型核糖核酸的表現量；在計算部分皆使用預設值進行，接著挑選概似比(likelihood ratio)最大情況下相對應的值當作閥值(cut off)，藉由閥值進而得出靈敏度與特異性以及準確度。
此外，在一些實驗例中，還包含測試不同的微型核糖核酸之組合，對於各個微型核糖核酸的表現量做數值運算，並以多元邏輯回歸分析方式(例如：羅吉斯回歸分析)，建立模型公式，以用於評估泌尿上皮癌的風險。
實驗例
病人檢體收集
病人檢體來自壢新醫院接受長期透析(規則透析超過3個月)的病人，選擇100人進行為期3年的追蹤研究，包括基礎的微型核糖核酸分析，每年追蹤至研究結束；並配合病人的臨床表現，每月定期的生化血液檢驗，每半年的免疫學檢查，和每年的放射影像檢查，以進一步分析微型核糖核酸與泌尿上皮癌的相關性。此外，對於已經發現腫瘤的病人，則分析微型核糖核酸之表現和抗體在有無腫瘤的病人之 間的差異，判斷是否可以作為篩選診斷腫瘤的生物標記，於腫瘤治療的過程中，是否可以作為治療效果及預後評估的工具，並用於治療後的追蹤標記。
以常規的方式，萃取病人的血漿檢體中的總微型核糖核酸(total miRNA)，並且反轉錄為互補去氧核糖核酸(cDNA)。
進行反轉錄與微型核糖核酸陣列
確認由檢體萃取的總微型核糖核酸的品質合乎標準之後，進行微型核糖核酸陣列的實驗。陣列的實驗的步驟包括：取用檢體總微型核糖核酸樣本600奈克(nanogram，ng)，按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptase原廠所提供的步驟進行反轉錄(Reverse Transcription RT)，接著將反轉錄的產物(RT product，即cDNA)，依照TaqMan® Array Human MicroRNA A Cards v2.0原廠所提供的步驟進行微型核糖核酸陣列的實驗。
資料分析及確認候選基因
資料的正規化共使用了兩種方法，第一種是用RNU6(U6 small nuclear RNA)作正規化，這個方式是利用微型核糖核酸陣列中的RNU6的CT值當作參考點，透過2-△CT這一個公式轉換成表現量，其中的△CT為「目標微型核糖核酸的CT值減去RNU6的CT值」。第二種方法是利用微型核糖核酸陣列中，所有被偵測到的微型核糖核酸的CT值的平均當作參考點，透過2-△CT這一個公式轉換成表 現量，其中的△CT為「目標微型核糖核酸的CT值減去平均的CT值」。
接著再把得到數據用R語言做叢集(cluster)分析以及計算倍率。利用R語言中的「gplots」套件的「plot」函式繪製。橫軸(x axis)擺放的是倍率或是差異，倍率或是差異的計算是採用各組平均的方式進行，利用得泌尿上皮癌(UC)的組當作實驗組，沒有得泌尿上皮癌(non UC)當作控制組，將實驗組(UC)的數據除以控制組(non UC)的數據，即可得到倍率或是差異。縱軸(y axis)擺放的是T檢定後經過-log10處理的P值，T檢定是使用R語言預設的「t.test」函式進行。
在一實驗例中，8個接受透析治療之病人的樣品進行微型核糖核酸陣列實驗，其中4個病人罹患泌尿上皮癌，4個病人沒有罹患此癌症。下表一為這8個病人的特徵表。
Figure 107140464-A0101-12-0009-1
Figure 107140464-A0101-12-0010-2
分析以上8個病人的微型核糖核酸陣列的資料後，挑選出8個微型核糖核酸基因：miR-19b-1、miR-183、miR-636、miR-155、miR-378、miR-487a、miR-150、和miR-210。參見下表二，這些基因的表現量上的差異之分析可分為三種類型，其中專有的表現(Unique)指的是只在泌尿上皮癌病人(UC)或非泌尿上皮癌病人(non-UC)表現的微型核糖核酸；單變數分析(Single analysis)指透過U6-snRNA正規化後在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人(non-UC)之間在表現量上有顯著差異的微型核糖核酸；比值分析(Ratio analysis)指透過U6-snRNA正規化後的二個微型核糖核酸的組合之數據在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人之間有顯著差異。
Figure 107140464-A0101-12-0010-3
為了進一步驗證初步篩選的結果，再用新的受試者做驗證。收集了52個受試者之樣品，分離出血漿。之後萃取血漿中的總微型核糖核酸，並且進行反轉錄。之後量測在反轉錄後的樣品中，上述8個微型核糖核酸的表現量，所用的檢驗試劑為Taqmen miRNA assay(美商應用生命系統(Applied Biosystems))。
下表三為這52個病人的特徵表。
Figure 107140464-A0101-12-0011-4
之後由上表三的病人群組中的樣品，進行Real-time PCR，得到的前述8種微型核糖核酸表現量數據。將這些表現量數據進行運算，更確認一些miRNA的比值(二種RNA的表現量的比值，例如：miR-155/miR-150)，在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病 人有差異。這些特定的微型核糖核酸表現量的比值，會有助於用於評估泌尿上皮癌的風險。
下表四示出一些在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人呈現差異的微型核糖核酸比值，其中，這些微型核糖核酸比值的接受者操作特徵曲線的曲線下面積至少大於0.6。
Figure 107140464-A0101-12-0012-5
請參看第2A圖至第2E圖，分別顯示上述表三中的五種微型核糖核酸的比值在非泌尿上皮癌受試者和泌尿上皮癌病人的數值分佈情形，其中「*」和「**」記號表示在兩群受試者之間，微型核糖核酸的比值的差異為顯著的， 其中「˙」表示離群值，「*」表示P值小於0.05，「**」表示P值小於0.01。
參看第2A圖，顯示miR-155/miR-150比值，在泌尿上皮癌之受試者顯著高於在非泌尿上皮癌受試者。
參看第2B圖，顯示miR-378/miR-150比值，在泌尿上皮癌之受試者顯著高於在非泌尿上皮癌受試者。
參看第2C圖，顯示miR-636/miR-150比值，在泌尿上皮癌之受試者顯著高於在非泌尿上皮癌受試者。
參看第2D圖，顯示miR-150/miR-210比值，在泌尿上皮癌之受試者顯著低於在非泌尿上皮癌受試者。
參看第2E圖，顯示miR-19b-1/miR-378比值，在泌尿上皮癌之受試者顯著低於非泌尿上皮癌受試者。
接下來，還利用這些特定的微型核糖核酸的表現量比值，利用多元邏輯回歸分析，例如：羅吉斯回歸分析(Logistic regression)，建立檢測泌尿上皮癌的模型公式，如下所示：Logit P=-4.762+(2.852 * miR-155/miR-150)+(0.337 * miR-378/miR-150)+(1.276 * miR-636/miR-150)+(1.578 * miR19b-1/miR-378)
參看第3A圖，其為上述表三之病人群組的數據，利用上述模型公式，繪製得出的ROC曲線圖。ROC曲線圖中的曲線下面積(AUC)越接近於1，代表靈敏度和特異性越高。第3C圖顯示曲線下面積(AUC)為0.882，因此本揭示內容之模型公式具有極高的準確度。
參看第3B圖，顯示以上述模型公式所得到的評分(Signature score)，在泌尿上皮癌受試者非常顯著地高於在非泌尿上皮癌之受試者。
參看第3C圖，顯示運用上述模型公式，檢測泌尿上皮癌的敏感性為80%，特異性為83.7%。
因此，由上述的實驗結果可知，本揭示內容中，以miR-19b-1、miR-183、miR-636、miR-155、miR-378、和miR-150、mir-210、或miR-487的表現量，可作為泌尿上皮癌的檢測標記，因為這些微型核糖核酸的表現量與泌尿上皮癌呈顯著相關。並且，例如可利用這些微型核糖核酸表現量的組合，或是可利用兩個微型核糖核酸的比值，因為這些數據在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌病人之間呈現差異。
在本揭示內容中，利用miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-19b-1/miR-378這些比值，代入模型公式所得出的評分，在泌尿上皮癌病人和非泌尿上皮癌受試者之間具有更顯著的差異。
因此，本揭示內容提供了以miR-19b-1、miR-183、miR-636、miR-155、miR-378、和miR-150、mir-210、或miR-487作為泌尿上皮癌的檢測標記，因此可用於開發檢測泌尿上皮癌的套組和方法。之後，對於懷疑有泌尿上皮癌可能性的病人，可以檢測這些微型核糖核酸的表現量，或是用於追蹤已接受治療的病人，以判斷治療的效果 或評估腫瘤是否復發。
在本揭示內容的一些實施方式中，泌尿上皮癌的檢測套組包含：檢測微型核糖核酸的引物或探針，微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487，和其組合所組成之群組。
在一些實施方式中的檢測套組，所檢測的微型核糖核酸為選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、和miR-487所組成之群組中的至少二者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、或此八個微型核糖核酸。
在一些實施方式中的檢測套組，所檢測的微型核糖核酸為miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、和miR-378。
在一些實施方式中的檢測套組，所檢測的微型核糖核酸為miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、和miR-378。
在一些實施方式中的檢測套組，可用於檢測泌尿上皮癌，例如：腎盂癌、輸尿管癌、膀胱癌及尿道癌。
在一些實施方式中，引物或探針特異性地與欲檢測的微型核糖核酸結合，其中miR-19b-1的序列為SEQ ID NO：1，miR-636的序列為SEQ ID NO：2，miR-150的序列為SEQ ID NO：3，miR-155的序列為SEQ ID NO：4，miR-183的序列為SEQ ID NO：5，miR-378的序列為SEQ ID NO：6，miR210的序列為SEQ ID NO：7，miR-487的序列為SEQ ID NO：8。
在一些實施方式中之所檢測的序列，其中miR-19b-1為hsa-miR-19b-3p；miR-636為hsa-miR-636；miR-150為hsa-miR-150-5p；miR-155為hsa-miR-155-5p；miR-183為hsa-miR-183-5p；miR-378為hsa-miR-378a-5p；miR-210為hsa-miR-210-3p；miR-487為hsa-miR-487a-3p。
在一些實施方式中的檢測套組，套組可能為試劑盒的型式，並且更包括PCR反應的常用試劑，如緩衝液，dNTP、MgCl2、純水和Tag酶等。還可以含有標準品/或對照品。
在一些實施方式中的檢測套組，其中的探針或引子可能固定於固體載體，例如晶片。
在本揭示內容的一些實施方式中，泌尿上皮癌的檢測方法，包含：測量受試者的樣本中的微型核糖核酸表現量，微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487、和其組合所組成之群組。
在一些實施方式中，更包含評估受試者罹患泌尿上皮癌的風險。
在本揭示內容的一些實施方式中，提出了製備用於泌尿上皮癌的檢測套組在檢測泌尿上皮癌的用途，包含：測量受試者的樣本中的微型核糖核酸表現量，微型核糖核酸選自 miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487、和其組合所組成之群組。
請參看第4圖，為根據一實施方式之檢測泌尿上皮癌的方法之流程。方法200首先為步驟202，收集受試者的檢體。檢體類型可能例如為血液、血清、或血漿、尿液、唾液、或腹水液等。之後步驟202為萃取檢體中的總微型核糖核酸。步驟206為進行反轉錄，將總微型糖核酸反轉錄為互補的去氧核糖核酸。
方法200的步驟208為進行PCR反應(例如：real-time PCR)，檢測微型核糖核酸選自miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487，或其組合的表現量。
之後方法200的步驟210為評估受試者罹患泌尿上皮癌的風險。由於所檢測的微型核糖核酸的表現量為泌尿上皮癌的標記，因此可用於評估受試者罹患此癌症的可能性高或低。
在一些實施方式中的檢測方法，所檢測的微型核糖核酸為miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487中的至少二者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、或此八個微型核糖核酸。
在一些實施方式中的檢測方法，所檢測的微型核糖核酸為miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、和miR-378。
在一些實施方式中的檢測方法，所檢測的微型核糖核酸為miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、和miR-378。
在一些實施方式中的檢測方法，可用於檢測泌尿上皮癌，例如：腎盂癌、輸尿管癌、膀胱癌及尿道癌。
在一些實施方式中的檢測方法，其中測量受試者的樣本中的微型核糖核酸表現量包含：加入與所述微型核糖核酸的反轉錄產物會特異性結合之探針或引子；以及進行PCR反應。
在一些實施方式的檢測方法，評估受試者罹患泌尿上皮癌的風險包括根據微型核糖核酸之表現量計算受試者的評分。
在一些實施方式的檢測方法，計算評分的方式包含經由量測到的微型核糖核酸表現量，經過計算，得出受試者的風險相關的評分，根據此評分可以決定受試者的罹癌風險。
在一些實施方式中，計算評分係利用兩種微型核糖核酸之表現量的比值。
在一些實施方式中，計算評分係利用多組微型核糖核酸之表現量的比值。
在一些實施方式中，利用miR-150/miR-155、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、或miR-19b-1/miR-378的值來計算罹病風險的評分。例如：以表現量比值分析計算，miR-150/miR-155的值<7.930 時，表示此受試者有罹患泌尿上皮癌風險，且轉換分數設定為1分；miR-150/miR-378的值<7.145時，表示此受試者有罹患泌尿上皮癌風險，且轉換分數設定為1分；miR-150/miR-183的值<181.4時，表示此受試者有罹患泌尿上皮癌風險，且轉換分數設定為1分；miR-19b-1-1/miR-183的值<1.627時，表示此受試者有罹患泌尿上皮癌風險，且轉換分數設定為1分。之後，受試者的總轉換分數越高，即代表罹患泌尿上皮癌的可能性越高。
在一些實施方式中，計算受試者的評分包含計算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-150/miR-210、miR-19b-1/miR-378、或miR-210/miR-183。
在一些實施方式中，其中計算受試者的評分包含計算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-19b-1/miR-378、和miR-210/miR-183。
在一些實施方式中，其中計算受試者的評分更包括以一公式得到評分值，其中此公式為：Logit P=-4.762+(2.852 * miR-155/miR-150)+(0.337 * miR-378/miR-150)+(1.276 * miR-636/miR-150)+(1.578 * miR19b-1/miR-378)
在一些實施方式的檢測方法，其中的受試者為罹患泌尿上皮癌風險較高的人，例如接受透析治療之病人。
在一些實施方式中，如果受試者的風險相關的評 分為正值，例如高於0、高於0.5、高於1、或更高，代表受試者有較高的罹患泌尿上皮癌的風險；如果受試者的風險相關的評分低於-2、低於-3、低於-4、低於-5、或更低，代表受試者有較低的罹患泌尿上皮癌的風險。
在一些實施方式的檢測方法，其中樣本為血液、血清、或血漿、尿液、唾液、或腹水液。
在一些實施方式中，與檢測單獨的微型核糖核酸相比，檢測由較多的微型核糖核酸組成的群組更能提高泌尿上皮癌診斷的靈敏度和特異性。
本揭示內容的實施方式可以幫助有罹患泌尿上皮癌風險的受試者，例如接受透析治療的病患，可以更好監控或是預測癌症。相較於傳統的腫瘤標誌物，體液(例如血漿)中的微型核糖核酸作為泌尿上皮癌的標誌物，具有穩定性好、非侵入性或微創易獲取、靈敏性和特異性高的優點。本揭示內容所提供的套組和檢測方法在泌尿上皮癌的診斷及追蹤具有高的臨床應用價值。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 國立中央大學，壢新醫院，台達電子工業股份有限公司
<120> 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
Figure 107140464-A0101-12-0022-6
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
Figure 107140464-A0101-12-0022-7
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
Figure 107140464-A0101-12-0022-8
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
Figure 107140464-A0101-12-0022-9
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
Figure 107140464-A0101-12-0023-10
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
Figure 107140464-A0101-12-0023-11
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
Figure 107140464-A0101-12-0023-12
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
Figure 107140464-A0101-12-0023-13
200‧‧‧方法
202、204、206、208、210‧‧‧步驟

Claims (11)

  1. 一種泌尿上皮癌的檢測套組，包含至少一檢測微型核糖核酸的引物或探針，所述微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487、和其組合所組成之群組。
  2. 如請求項1所述之套組，其中所述微型核糖核酸為該miR-19b-1、該miR-636、該miR-150、該miR-155、和該miR-378。
  3. 如請求項1所述之套組，其中該miR-19b-1的序列為SEQ ID NO：1，該miR-636的序列為SEQ ID NO：2，該miR-150的序列為SEQ ID NO：3，該miR-155的序列為SEQ ID NO：4，該miR-183的序列為SEQ ID NO：5，該miR-378的序列為SEQ ID NO：6該miR-210的序列為SEQ ID NO：7，該miR-487的序列為SEQ ID NO：8。
  4. 一種泌尿上皮癌的檢測方法，包含：測量一受試者的一樣本中的微型核糖核酸表現量，所述微型核糖核酸選自由miR-19b-1、miR-636、miR-150、miR-155、miR-183、miR-378、mir-210、miR-487、和其組合所組成之群組；以及評估該受試者罹患泌尿上皮癌的風險。
  5. 如請求項4所述之方法，其中所述微型核糖微酸為該miR-19b-1、該miR-636、該miR-150、該 miR-155、和該miR-378。
  6. 如請求項4所述之方法，其中測量該受試者的該樣本中的微型核糖核酸表現量包含：加入與所述微型核糖核酸的反轉錄產物會特異性結合之探針或引子；以及進行PCR反應。
  7. 如請求項4所述之方法，其中評估該受試者罹患泌尿上皮癌的風險包括根據所述微型核糖核酸之表現量計算該受試者的一評分。
  8. 如請求項7所述之方法，其中計算該受試者的該評分包含計算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-150/miR-210、miR-19b-1/miR-378、或miR-210/miR-183。
  9. 如請求項7所述之方法，其中計算該受試者的該評分包含計算miR-155/miR-150、miR-378/miR-150、miR-636/miR-150、miR-19b-1/miR-378、和miR-210/miR-183。
  10. 如請求項9所述之方法，其中計算該受試者的該評分更包括以一公式得到該評分值，其中該公式為：Logit P=-4.762+(2.852 * miR-155/miR-150)+ (0.337 * miR-378/miR-150)+(1.276 * miR-636/miR-150)+(1.578 * miR19b-1/miR-378)
  11. 如請求項4所述之方法，其中該受試者為接受透析治療之病人。
TW107140464A 2018-11-14 2018-11-14 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法 TWI690597B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW107140464A TWI690597B (zh) 2018-11-14 2018-11-14 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法
CN201910299262.5A CN111187836B (zh) 2018-11-14 2019-04-15 泌尿上皮癌的检测套组及微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌检测套组中的应用
US16/460,546 US11098371B2 (en) 2018-11-14 2019-07-02 Method for treating urothelial carcinoma

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW107140464A TWI690597B (zh) 2018-11-14 2018-11-14 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TWI690597B TWI690597B (zh) 2020-04-11
TW202018094A true TW202018094A (zh) 2020-05-16

Family

ID=70550975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107140464A TWI690597B (zh) 2018-11-14 2018-11-14 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11098371B2 (zh)
CN (1) CN111187836B (zh)
TW (1) TWI690597B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2794142A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 The Ohio State University Materials and methods related to modulation of mismatch repair and genomic stability by mir-155
CN103476947A (zh) * 2011-03-02 2013-12-25 格路福生物制药公司 寡聚体的增强的生物分布
DK3408382T3 (da) * 2016-01-27 2022-06-20 Oncorus Inc Onkolytiske virale vektorer og anvendelser deraf
WO2017156349A1 (en) * 2016-03-10 2017-09-14 Cold Genesys, Inc. Methods of treating solid or lymphatic tumors by combination therapy

Also Published As

Publication number Publication date
CN111187836B (zh) 2024-03-01
US20200149113A1 (en) 2020-05-14
TWI690597B (zh) 2020-04-11
CN111187836A (zh) 2020-05-22
US11098371B2 (en) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110484624B (zh) 一种基于外周血的胃癌生物标志物及其检测方法和应用
WO2017054325A1 (zh) 乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒
CN109576370A (zh) 用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒
CN114277143B (zh) 外泌体arpc5、cda等在肺癌诊断中的应用
CN113337613A (zh) 一种与肝癌相关的血清外泌体tsRNA标志物、探针及其应用
AU2021378868A1 (en) Panel of mirna biomarkers for diagnosis of ovarian cancer, method for in vitro diagnosis of ovarian cancer, uses of panel of mirna biomarkers for in vitro diagnosis of ovarian cancer and test for in vitro diagnosis of ovarian cancer
CN117165688A (zh) 用于尿路上皮癌的标志物及其应用
CN111455053B (zh) 用于结直肠腺瘤诊断的外泌体rna分子标记物组合及其应用
TW201625797A (zh) 評估罹患大腸直腸癌風險的方法及標誌物
CN112501294A (zh) 一种结直肠癌生物标志物及其应用
CN106987633A (zh) 一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒
TWI690597B (zh) 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法
WO2020134950A1 (zh) 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒
CN108424962A (zh) 系膜增生性肾小球肾炎的miRNA检测标志物及其诊断试剂盒
CN108424960B (zh) 一种LncRNA作为深静脉血栓形成诊断标志物的应用
CN107858425A (zh) miRNA‑4741作为原发性肝癌诊断标志物的应用及检测方法
CN114746551A (zh) 大肠癌诊断用标志物、辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌治疗药物、大肠癌的治疗方法、大肠癌的诊断方法
CN111718991A (zh) 血浆miRNA分子标志物在诊断代谢综合征中的应用
CN109988834A (zh) 血浆外泌体分子标志物has-miR-219a-5p及应用
CN112877435B (zh) 口腔鳞癌生物标志物及其应用
TWI718474B (zh) 評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法及其套組
CN116287252B (zh) 长链非编码rna apcdd1l-dt在制备检测胰腺癌的产品中的应用
RU2823255C1 (ru) Способ прогнозирования рецидива рака щитовидной железы после радикального хирургического вмешательства
TWI626314B (zh) 評估罹患大腸直腸癌風險的方法
CN116121245B (zh) 小分子rna及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用