TW201625797A - 評估罹患大腸直腸癌風險的方法及標誌物 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種自人類個體所取得之血液檢體中評估罹患大腸直腸癌風險的方法以及標誌物。評估方法包括以下步驟：由血液檢體中檢測第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸之表現量；以及根據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險。其中，第一微核醣核酸是miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128、或miR-223，第二微核醣核酸是miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145、或miR-155。而當第一微核醣核酸為miR-128時，第二微核醣核酸是miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。

Description

評估罹患大腸直腸癌風險的方法及標誌物
本案係關於一種評估個體罹患大腸直腸癌風險的方法及標誌物。
微核醣核酸(micro-ribonucleic acid,microRNA)，又稱miRNA、mi-RNA、微RNA或微小RNA。微核醣核酸主要藉由降解訊息核醣核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)或抑制轉譯的機制，以調控生物體內的基因表現。其在動植物的生長發育、細胞的分化凋亡、及人類疾病(如腫瘤)等過程中皆發揮重要的調控作用。而微核醣核酸的特殊功能與腫瘤發病機制密切相關，使其在腫瘤分類和預測方面皆具有重要的價值。透過測定miRNA除了可以實現精確的腫瘤分型以外，亦可掌握腫瘤個體差異，進而準確且有效地用藥。
大腸直腸癌(Colorectal cancer,CRC)，是前四大致命癌症。全球各地每年大約有70萬人死於這種癌症。癌症初期(尚未轉移前)較可能透過手術切除而治癒。然而，大腸直腸癌的症狀常常因不明顯而被忽略，例如血便或排便異常等，大腸直腸癌病患經常在癌症末期(已轉移)才被診斷出來。因此，大腸直腸癌的早期診斷相當重要，若能及早發現罹患大腸直腸癌，則接受治療後痊癒的機會將遠高於癌症已蔓延的末期。
目前評估罹患大腸直腸癌之風險常見的方法是利用各類內視鏡或斷層掃描的儀器進行檢查，或是糞便檢體潛血反應(Fecal occult blood test,FOBT)等。其中斷層掃描較易因影像解析度的問題導致結果不精確，而內視鏡為一項侵入式檢查，仍有其風險，而以糞便潛血檢查而言，雖然成本低廉且操作容易，但準確性(accuracy)卻不高。目前已有搭配免疫化 學法的糞便潛血檢查，可避免因病患飲食的原因而造成的偽陰性、偽陽性誤差，但其準確性仍有相當大的改善空間。另外，目前雖有癌症胚胎抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)作為罹患大腸直腸癌之風險的檢查，但由於人類個體內的正常粘膜細胞發生病變或產生腺癌都可能引起癌症胚胎抗原的過度表現，並不限定於大腸直腸癌。另外，癌症胚胎抗原對於早期大腸癌的敏感度只有約20~40%，但在大腸直腸癌晚期、復發或轉移之病人會有較高的敏感度因此，癌症胚胎抗原通常用來作為手術後追蹤的參考，而非用於評估罹患大腸直腸癌的風險。
因此，目前在評估罹患大腸直腸癌之風險的方法，其評估結 果不是準確性低，就是需以侵入性的方式檢查，亟需有新穎的評估罹患大腸直腸癌之風險的方法，以達到可藉由非侵入性的方式檢測，並達到高靈敏度的目的。
有鑑於先前技術之不足，發明人經研發後得本發明。本發明之目的概略為提供一種自人類個體之血液檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法以及標誌物，以達到可藉由非侵入性的方式檢測，並可達到高靈敏度的目的。其中，該標誌物係為血液檢體中的特定之微核醣核酸的組合，藉由檢測特定組合之微核醣核酸的表現量，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
本發明提供一種自一人類個體所取得之一血液檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：由該血液檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量；以及根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
在本說明書中所使用之「微核醣核酸(microRNA)」一詞意指生物體(本實施例以人類個體為例)內可自行合成的小片段核醣核酸，長度約為22鹼基對(base pairs)。微核醣核酸屬於非蛋白編碼核醣核酸(non-coding RNA)，亦即，微核醣核酸不會續行轉譯(translation)作用而 產生對應之蛋白質(protein)。然而，微核醣核酸仍具有調控基因表現的功能，例如調控生物體的細胞生長、細胞分化、細胞凋亡、癌症形成等。
而微核醣核酸調控基因表現的方式通常透過與訊息核醣核 酸(messenger RNA，或稱mRNA)互補(complementary)結合(binding)，進而導致訊息核醣核酸的降解或抑制轉譯作用。另外，微核醣核酸的相關研究亦指出微核醣核酸與人類癌症病理機制有關，例如特定的微核醣核酸可調控與特定癌症相關的基因表現。因此，在不同癌症病患的體內，其所對應之微核醣核酸的表現量亦不相同。而本實施例即利用核醣核酸之特性，進而發展出一種評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險的方法，即藉由量測人類個體內特定微核醣核酸之表現量，並據此評估該人類個體罹患大腸直腸癌的風險，其具體實施方式於後詳述之。
在本說明書中所使用之「微核醣核酸之表現量」一詞意指人 類個體內該微核醣核酸的含量，且本實施例係指「血液檢體」中該微核醣核酸的含量。
在本說明書中所使用之「血液檢體」一詞包含全血、血漿、 與血清。
本發明另提供一種用於自一人類個體所取得之一血液檢體 中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險之標誌物，標誌物包括一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸，且第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例在至少一罹患大腸直腸癌之患者所取得之血液檢體中與一對照血液檢體中具有顯著差異。
在本說明書中所使用之「標誌物」一詞意指可作為評估人類 個體罹患大腸直腸癌風險的生物標的(Biomarker)。而在本說明書中，則是指特定微核醣核酸的組合，亦即第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸的組合。具體而言，第一微核醣核酸係選自由miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所組成之群組，且當第一微核醣核酸為miR-128時，第二微核醣核酸是miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、 miR-31或miR-145。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-221，且第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-15a，且第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139或miR-31。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-191，且第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-128，且第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139或miR-31。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-92a，且第二微核醣核酸為miR-10b或miR-100。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-24，且第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126或miR-139。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-18a，且第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a或miR-31。
在本發明之一實施例中，第一微核醣核酸為miR-223，且第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR126、miR-139、miR-31或miR-145。
在本發明之一實施例中，評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險的步驟為當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。
在本發明之一實施例中，根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，包括依據miR-221與miR-10b之表現量的第一比例、miR-92a與miR-10b之表現量的第二比例、miR-15a與miR-10b之表現量的第三比例、miR-24與miR-10b之表現量的第四比例、以及miR-18a與miR-10b之表現量的第五比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
本發明又提供一種自一人類個體所取得之一血液檢體中評 估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：由血液檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量，其中，第一微核醣核酸係選自由miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223所組成之群組，且第二微核醣核酸係選自由miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所組成之群組，且當第一微核醣核酸為miR-128時，第二微核醣核酸是miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145；依據第二微核醣核酸的表現量評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，且當miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的表現量小於一濃度閾值，或當miR-126、miR-145或miR-155的表現量大於一濃度閾值，並評估為高風險；以及當miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的表現量大於一濃度閾值，或當miR-126、miR-145或miR-155的表現量小於一濃度閾值，則再依據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
其中，第一微核醣核酸及一第二微核醣核酸的類型可參考前 述。而在本說明書中所使用之「濃度閾值」一詞意指從評估對象的血液檢體中評估該些第一核醣核酸或第二微核醣核酸表現量的參考值。具體而言，本實施例是藉由量測血液檢體中的第二微核醣核酸的含量，若miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的濃度小於一參考值，即本發明所稱之濃度閾值，即評估為高風險；或是miR-126、miR-145或miR-155的濃度大於一參考值(濃度閾值)，亦可評估為高風險。而未被評估為高風險者，則再依據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險。本評估方法即是藉由大腸直腸癌患者與健康的個體中的微核醣核酸表現量的差異，以建立出本評估方法。
本發明再提供一種用於自一人類個體所取得之一血液檢體 中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險之標誌物，該標誌物包括：一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸，且該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例在至少一罹患大腸直腸癌之患者所取得之血液檢體中 與一對照血液檢體中具有顯著差異；其中，該第一微核醣核酸係選自由miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所組成之群組，並且當第一微核醣核酸為miR-128時，第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
綜上所述，依據本發明之評估方法及標誌物，其係根據第一 微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，對於非侵入性的檢測方式、高靈敏度及高準確性的評估結果，提供了顯著的功效。
S10~S34‧‧‧步驟
圖1為本發明一實施例之評估方法的流程示意圖。
圖2為本發明另一實施例之評估方法的流程示意圖。
以下將配合圖式說明本發明之實施例與實驗例，惟相關文義說明可參照前述，於此不再贅述。
本發明提供一種自一人類個體所取得之一血液檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌(CRC)風險的方法，在本實施例中，將前述方法簡稱為評估方法，並將接受評估測試的人類個體稱為評估對象。本發明之評估方法是透過檢測評估對象的血液檢體，以評估罹患大腸直腸癌的風險。
本實施例可透過收取評估對象的血液檢體，在抽取評估對象的血液(全血，Whole Blood)後，將其置於具有抗凝劑的收集管中，或在適當溫度下靜置適當時間(例如室溫下靜置30分鐘)待全血凝固後，於離心後取其上清液，可分別取得血漿或血清，以進行後續偵測。
圖1為本發明第一實施例之評估方法的流程示意圖，請參考圖1所示。本實施例之評估方法包括以下步驟：由血液檢體中檢測一第一 微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量(步驟S10)；以及根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險(步驟S20)。
其中，第一微核醣核酸與第二微核醣核酸可以分別為多個微 核醣核酸所組合成的群組，例如第一微核醣核酸係選自由miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223所組成之群組，而第二微核醣核酸係選自由miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所組成之群組。整理如表一所示：
其中，當第一微核醣核酸為miR-128時，較佳的，第二微核醣核酸是miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
於步驟S10中，係透過檢測血液檢體中上述第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸的表現量。較佳的，可藉由微陣列生物晶片(microarray)或定量聚合酶鏈鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)的技術以檢測第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸的表現量。以微陣列生物晶片而言，可透過於一微陣列生物晶片區分為二區域，分別設置可對應於上表之第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸的核酸探針(nucleotide probe)。抑或是，於一微陣列生物晶片設置可對應於上表之第一微核醣核酸群組的核酸探針，並於另一微陣列生物晶片設置可對應於上表之第二微核醣核酸群組的核酸探針，以二片微陣列生物晶片進行檢測。以定量聚合酶鏈鎖反應而言，則可透過設計出可偵測前述之各第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的引子(primer)及核酸探針，並透過定量聚合酶鏈鎖反應以檢測各個第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的表現量。
另外，第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸群組所包含的 各個微核醣核酸的序列，可於miRBase的線上資料庫已公開的微核醣核酸序列中查詢，並可依據該些序列設計對應之引子(primer)及核酸探針，對應之引子(primer)及核酸探針亦可直接自美商應用生命系統(Applied Biosystem)公司之網站輸入對應之索引編號(Accession No.)後購得，如後實驗例一中所說明的。
本實施例之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸表現量是以 經由定量聚合酶鏈鎖反應所得到Cq值換算為核酸片段濃度(以copies/μl為單位)為例說明。Cq值(quantification cycle，亦稱threshold cycle)即指在定量聚合酶鏈鎖反應的過程中，核酸片段的生成量大於閾值門檻(threshold value)時所對應的循環數值(cycle number)。而本發明所屬技術領域具有通常知識之人均可明瞭，在定量聚合酶鏈鎖反應中核酸片段的起始濃度的對數值與其Cq值為線性關係，故由未知樣本中所測得之Cq值，與由標準樣本所建立之樣本濃度-Cq值曲線(copy number-Cq value standard curve)比對後，即可推算出該未知樣本中待測核酸片段的濃度。因此，將兩個待測核酸片段miRNAX以及miRNAY樣本經定量聚合酶鏈鎖反應所得的CqX、CqY值相減後取以二為底的指數運算，亦可換算出這兩個待測核酸片段樣本的起始濃度的比例，換算公式則如下所示：
其中，miRX代表miRNAX的起始濃度，miRY代表miRNAY的起始濃度，CqX為miRNAX經定量聚合酶鏈鎖反應所測得的Cq值，CqY為miRNAY經定量聚合酶鏈鎖反應所測得的Cq值。
另外，本實施例中進行的定量聚合酶鏈鎖反應係以兩階段(two-step)定量聚合酶鏈鎖反應為例說明，即先將總RNA(total RNA)反轉錄(reverse transcription)成互補去氧核醣核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA)後，再以互補去氧核醣核酸為模板(template)進行定量聚合酶鏈鎖反應。詳細而言，將自前述評估對象所取得之血液檢體經高速離心後，取其上清液以進行總RNA的萃取。接著，將萃取出的總RNA以前述之第一核醣核酸群組及第二核醣核酸群組所對應之引子的混合物進行反轉錄反應，以取得互補去氧核醣核酸。再以互補去氧核醣核酸為 模板，並分別以前述之第一核醣核酸群組及第二核醣核酸群組所對應之引子，進行定量聚合酶鏈鎖反應，以取得前述各個第一核醣核酸及各個第二核醣核酸的Cq值後以前述公式進行換算，以作為本實施例之表現量的比例。
而本發明所述技術領域具有通常知識者均應明瞭，目前定量 聚合酶鏈鎖反應的偵測，其係將超過40個循環(cycles)的訊號(Cq>40)均認定為低可信度。因此本實施例依TaqMan® MicroRNA Assays Protocol，將定量聚合酶鏈鎖反應的循環數設定為40，故Cq值最大則為40。
透過定量聚合酶鏈鎖反應以檢測各個第一微核醣核酸及各 個第二微核醣核酸的表現量後，於步驟S20中，根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。 當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。需說明的是，本實施例所述第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例可以為第一核醣核酸的表現量與第二核醣核酸的表現量相除所得比值(以下以「第一核醣核酸/第二核醣核酸」稱之)，例如miR-221/miR-10b之比值；或是第二核醣核酸的表現量與第一核醣核酸的表現量相除所得比值(以下以「第二核醣核酸/第一核醣核酸」稱之)，例如miR-10b/miR-221之比值，本發明並不限制。而針對不同第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的比例組合所對應之檢測閾值範圍，及其適用之比例組合方式為第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸，皆記載於表二。因此，可以依據表二記載之內容以評估該評估對象罹患大腸直腸癌的風險程度。
在本說明書中所使用之「檢測閾值(threshold)」一詞意指 評估人類個體罹患大腸直腸癌的參考值。檢測閾值位於一較佳的數值範圍內，換言之，其非為一定值。隨著檢測閥值改變，其檢測敏感度與特異性亦會隨之改變。本發明所屬技術領域具有通常知識者亦可明瞭不同第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的搭配組合所對應之檢測閾值會有所變化。以下將具體說明各種第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的組合所適用之檢測閾值及其較佳範圍。
如表二所示，於本實施例中，當第一微核醣核酸與第二微核 醣核酸之表現量的比例(即前述第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸的比值)大於該檢測閾值者評估為高風險，小於該檢測閾值者評估為低風險。或者，當第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例(即前述第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸的比值)大於該檢測閾值範圍者評估為高風險，落於該檢測閾值範圍內者評估為中風險，小於該檢測閾值範圍者評估為低風險。
舉例而言，在定量聚合酶鏈鎖反應後，將miR-221(第一微 核醣核酸)的濃度與miR-10b(第二微核醣核酸)的濃度相除後(分母為miR-10b)可得到一比值，或是將miR-221及miR-10b經定量聚合酶鏈鎖反 應所得之Cq值以前述公式(1)換算為比值，並將比值與表二進行比對。若比值大於30.47，會評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值小於30.47，則評估為低風險者。而若是使用檢測閾值範圍的方式進行評估，則若比值大於37.04，評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在25.36~37.04之間(包含等於25.36、37.04)，則評估為中風險者；若比值小於25.36，則評估為低風險者。
需說明的是，雖然上述實施例係以當第一微核醣核酸與第二 微核醣核酸之表現量的比例(即前述第一微核醣核酸/第二微核醣核酸或第二微核醣核酸/第一微核醣核酸的比值)大於表二所列出之對應檢測閾值評估為高風險；然本領域具有通常知識者亦當明瞭，若將分子分母互換後之比值與互換前之比值兩者間僅為倒數關係，而以此進行評估時所使用的對應檢測閾值則可將原本之檢測閾值進行倒數換算而得出，且此時評估方式則轉換為將小於該對應之檢測閾值之評估對象評估為高風險。並且，其檢驗效果(受試者操作曲線下面積、敏感度及特異性)均不因此而發生變化。
舉例而言，若以miR-221/miR-10b之比值進行評估，則如上 表二中所顯示的係當miR-221/miR-10b之比值大於37.04則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在25.36~37.04之間(包含等於25.36、37.04)，則評估為中風險者；若比值小於25.36，則評估為低風險者。而若以miR-10b/miR-221之比值進行評估，則對應之檢測閾值範圍轉換為0.027(約是37.04之倒數)至0.039(約是25.36之倒數)，且當miR-10b/miR-221之比值小於0.027則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在0.027~0.039之間(包含等於0.027、0.039)，則評估為中風險者；若比值大於0.039，則評估為低風險者。同樣地，若以miR-92a/miR-10b之比值進行評估，則如上表二中所顯示的係當miR-92a/miR-10b之比值大於438.8則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在234.5~438.8之間(包含等於234.5、438.8)，則評估為中風險者；若比值小於234.5，則評估為低風險者。而若以miR-10b/miR-92a之比值進行評估，則對應之檢測閾值範圍轉換為0.002(約是438.8之倒數)至0.004(約是234.5之倒數)，且當miR-10b/miR-92a之比值小於0.002則評估為罹患大腸直腸癌的高風險者；若比值落在0.002 ~0.004之間(包含等於0.002、0.004)，則評估為中風險者；若比值大於0.004，則評估為低風險者。
本實施例之評估方法，包括表一所示之第一微核醣核酸群組 及第二微核醣核酸群組的微核醣核酸種類，以及表二所示之閾值範圍，是分別收集215位確診罹患大腸直腸癌及173位健康之人類個體的血液檢體，並由其血液檢體中微核醣核酸的含量，經發明人費心計算歸納出表示中之第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸群組的微核醣核酸種類，以及取得相對應之檢測閾值範圍。其檢驗效果(敏感度及特異性)則如以下實驗例二所示。
由於血液檢體中的總核醣核酸含量極低，絕對定量模板 (template)濃度並不準確。而一般微核醣核酸的偵測方法皆須透過聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大微核醣核酸的濃度後，再續行定量的試驗。但其仍存在的問題是，血液檢體中的核酸片段濃度，即用於聚合酶鏈鎖反應的模板(template)濃度，會因採樣時間不同與實驗操作取樣等因素而有很大的誤差，故難以控制每一批次的血液檢體皆在相同的基準。因此，僅使用聚合酶鏈鎖反應(PCR)相關的測量方法所建立的評估方法，亦有相當大的誤差。 因此，本發明第一實施例所示之評估方法係透過第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例計算，在第一微核醣核酸之表現量與第二微核醣核酸之表現量相除的計算過程中，即可排除模板(template)濃度不同所導致的差異，故所建立之評估方法可降低因每次採樣的血液檢體的差異而造成檢測誤差的問題。
於第一實施例所示的評估方法中，較佳的，若係於第一微核 醣核酸群組中，選取miR-221作為檢測標的，且於第二微核醣核酸群組中選取miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145作為檢測標的，並比對第一微核醣核酸與第二微核醣核酸表現量之比例，亦即比對miR-221/miR-10b、miR-221/miR-100、miR-221/miR-29a、miR-221/miR-126、miR-221/miR-139、miR-221/miR-31、或miR-221/miR-145的比值，可具有較佳的評估效果。
另外，本實施例亦提供其他具有較佳評估效果的組合，如下 所列。於第一微核醣核酸群組中，選取miR-15a作為檢測標的，且於第二微核醣核酸群組中選取miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139或miR-31作為檢測標的，並比對miR-15a/miR-10b、miR-15a/miR-100、miR-15a/miR-29a、miR-15a/miR-126、miR-15a/miR-139、或miR-15a/miR-31的比值。
在第一微核醣核酸群組中選取miR-191作為檢測標的，且 於第二微核醣核酸群組中選取miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145作為檢測標的，並比對miR-191/miR-10b、miR-191/miR-100、miR-191/miR-29a、miR-191/miR-126、miR-191/miR-139、miR-191/miR-31、或miR-191/miR-145的比值。
在第一微核醣核酸群組中選取miR-128作為檢測標的，且 於第二微核醣核酸群組中選取miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139或miR-31作為檢測標的，並比對miR-128/miR-10b、miR-128/miR-100、miR-128/miR-29a、miR-128/miR-126、miR-128/miR-139、或miR-128/miR-31的比值。
在第一微核醣核酸群組中選取miR-92a作為檢測標的，且於 第二微核醣核酸群組中選取miR-10b或miR-100作為檢測標的，並miR-92a/miR-10b、或miR-92a/miR-100的比值。
在第一微核醣核酸群組中選取miR-24作為檢測標的，且於 第二微核醣核酸群組中選取miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126或miR-139作為檢測標的，並比對miR-24/miR-10b、miR-24/miR-100、miR-24/miR-29a、miR-24/miR-126、或miR-24/miR-139比值。
在第一微核醣核酸群組中選取miR-18a作為檢測標的，且於 第二微核醣核酸群組中選取miR-10b、miR-100、miR-29a或miR-31作為檢測標的，並比對miR-18a/miR-10b、miR-18a/miR-100、miR-18a/miR-29a、或miR-18a/miR-31比值。
在第一微核醣核酸群組中選取miR-223作為檢測標的，且 於第二微核醣核酸群組中選取miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、或miR-145作為檢測標的，並比對miR-223/miR-10b、 miR-223/miR-100、miR-223/miR-29a、miR-223/miR-126、miR-223/miR-139、miR-223/miR-31、或miR-223/miR-145比值。
在上述組合中，第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量 的比例所得之診斷準確度(area under curve，AUC)大於單獨使用第一微核醣核酸或單獨使用第二微核醣核酸之診斷準確度。
圖2為本發明第二實施例之評估方法的流程示意圖，請參考 圖2所示。本實施例之評估方法包括以下步驟：由血液檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量(步驟S10)；依據第二微核醣核酸的表現量評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，判斷miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的表現量是否小於一濃度閾值；及判斷miR-126、miR-145或miR-155的表現量是否大於一濃度閾值(步驟S30)。其中，各個第二微核醣核酸所對應之濃度閾值列於表三，將於後續詳述之。
若步驟S30的結果為「是」，亦即當miR-10b、miR-100、 miR-29a、miR-139、或miR-31的表現量小於其所對應之濃度閾值，或是當miR-126、miR-145或miR-155的表現量大於其所對應之濃度閾值，則評估為高風險(步驟S32)；若為「否」，則未被評估為高風險。經前述步驟未被評估為高風險者(亦即當miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的表現量大於濃度閾值，或miR-126、miR-145或miR-155的表現量小於濃度閾值)，則進入步驟S34，依據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。其中，第一微核醣核酸與第二微核醣核酸皆為多個微核醣核酸所組合成的群組，而其詳細內容可參考表一所列之第一微核醣核酸群組及第二微核醣核酸群組。
在本實施例中，亦先檢測微核醣核酸的表現量(步驟S10)， 接著，先藉由第二微核醣核酸的表現量先評估罹患大腸直腸癌的風險(步驟S30)。具體而言，經發明人費心計算並歸納出，確診為罹患大腸直腸癌的病患相較於健康的人類個體，其miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、miR-31的表現量較低，而miR-126、miR-145或miR-155的表現量較高，亦即較健康的人類個體高。因此，本實施例的步驟S30先藉由判斷第二微 核醣核酸群組中miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的表現是否小於對應的濃度閾值，當小於濃度閾值時，則表示miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31為被抑制其表現的狀態，則可評估為罹患大腸直腸癌的高風險者(步驟S32)。或是，可藉由判斷第二微核醣核酸群組中miR-126、miR-145或miR-155的表現是否大於對應的濃度閾值，則表示miR-126、miR-145或miR-155為高表現的狀態，同樣可評估為罹患大腸直腸癌的高風險者(步驟S32)。而未被評估為高風險者，則進入步驟S34。
而本實施例所稱之「濃度閾值」是核酸片段的濃度(copies/ μl)的參考值，其中，第二微核醣核酸miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所使用之對應的預設值如下表三所示。當然，在其他實施例中，使用其他第一微核醣核酸時，其對應之濃度閾值自為不同，故本發明不以此為限。步驟S30係利用第二微核醣核酸的表現量是否大於或小於對應的濃度閾值來評估個體罹患大腸直腸癌的風險程度。
表三所列之評估依據係以較佳濃度閾值為例說明，當然，在其他實施例中，亦可於濃度閾值範圍中選取評估濃度閾值的參考值，本發明不以此為限。
藉由表三先初步篩選罹患大腸直腸癌的高風險者，再選取未 被評估為高風險者進步驟S34，依據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險。舉例而言，於步驟S10中以miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155對應之引子進行定量聚合酶鏈鎖反應，若其結果為miR-10b的濃度為50copies/μl、miR-100的濃度為30copies/μl、miR-29a的濃度為550copies/μl、miR-139的濃度為100copies/μl、miR-31的濃度為25copies/μl，其皆大於各自所對應的濃度閾值，且miR-126的濃度為850copies/μl、miR-145的濃度為125copies/μl、miR-155的濃度為5copies/μl，其皆小於濃度閾值，故進一步進行步驟S34的評估步驟。亦即，分別計算miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223(第一微核醣核酸)之表現量與miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155(第二微核醣核酸)之表現量比例後，再與表二所示閾值範圍進行比對，以評估罹患大腸直腸癌的風險。而步驟S34的細節內容，可參考第一實施例之步驟S20，於此不加贅述。
舉例而言，在第二實施例中，於步驟S30中可先判斷第二 微核醣核酸之miR-10b是否小於32.14copies/μl，若「是」，則評估為高風險。而若miR-10b大於32.14copies/μl，則進入步驟S34。接著，可藉由計算miR-221/miR-10b、miR-92a/miR-10b、miR-15a/miR-10b、miR-24/miR-10b、miR-18a/miR-10b、miR-191/miR-10b、miR-128/miR-10b、miR-223/miR-10b的比例，並依據表二以進一步評估該評估對象罹患大腸直腸癌的風險，其結果如實驗例五所示。
承上，本實施例先於步驟S30將第二微核醣核酸之表現量 大於或小於其所對應之濃度閾值者，評估為高風險(即一般醫療檢驗領域所稱之「陽性，positive」者)。接著，再於步驟S34，將未被評估為高風險者(即一般醫療檢驗領域所稱之「陰性，negative」者)，以比例計算及其對應之評估方式進行二次評估，可避免僅以第二微核醣核酸進行評估所可能存在的「偽陰性，false negative」的情形。其中，「偽陰性」係指罹患有大腸直腸癌卻未被檢測出來的情形，此為醫療檢驗單位所極力避免的情形。
此外，本發明的第三實施例亦同時提供一種用於自人類個體 所取得之血液檢體中評估個體罹患大腸直腸癌風險之標誌物。該標誌物包括：第一微核醣核酸以及第二微核醣核酸，且第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例在罹患大腸直腸癌之患者所取得之血液檢體中與對照血液檢體中具有顯著差異。本實施例中的第一微核醣核酸群組與第二微核醣核酸群組與第一實施例中相同，如表一中所示。
本發明第三實施例之標誌物，用於評估個體罹患大腸直腸癌 之風險，其操作步驟及效果與第一實施例相同，藉由採檢罹患大腸直腸癌患者的血液檢體與健康人類個體的血液檢體，並檢測該些血液檢體中如表一所示之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，其細節步驟可參考第一實施例，在此不再贅述。而由檢測結果可發現罹患大腸直腸癌患者相較於健康人類個體的血液檢體，具有至少一種第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例具有顯著差異。亦即，本實施例所稱之「對照血液檢體」係指健康人類個體的血液檢體，作為與罹患大腸直腸癌之患者的比對基礎。
承上所述，依據本發明之評估方法及標誌物，其係根據第一 微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估人類個體罹患大腸直腸癌之風險，對於非侵入性、及高準確性的目的，提供了顯著的功效。
本評估方法是透過收集215位罹患大腸直腸癌病患及173位健康之人類個體的血液檢體，並分析其各種微核醣核酸表現量，以找出可作為評估罹患大腸直腸癌的標誌物(如表一所列之微核醣核酸)，或稱生物標的，以及該些標誌物所對應的檢測閾值(如表二所示)。換言之，藉由該些標誌物及其對應之檢測閾值以建立出本評估方法。以下先以實驗例一係確認本評估方法可用於評估人類個體罹患大腸直腸癌的風險，而並於後續實驗例證實其具有較佳的評估效果。
實驗例一：本評估方法可用於評估人類個體罹患大腸直腸癌的風險
評估對象與血液檢體
本實驗例係自台灣長庚醫院(Chang Gung Memorial Hospital in Taiwan)收集215位罹患大腸直腸癌病患及173位健康之人類個體的血 液檢體，並分析如表一所示之各種微核醣核酸表現量。癌症是根據2009年美國癌症聯合委員會分期標準第7版(2009 American Joint Committee on Cancer staging criteria，7th edition)進行判定，同時記錄其臨床病理因子，包括年齡、性別、和癌症胚胎抗原檢查(Carcinoembryonic Antigen,CEA)結果。對於樣品的採集，則收取大腸直腸癌病患所捐贈之血液檢體，且採集該些血液檢體前該些病患並未進行任何治療。針對健康對照組，則均從桃園長庚醫院之健康檢查中心所取得。參加者接受了大腸鏡(colonoscopy)檢查，並且鏡檢結果均為無瘤、良性病理增生(pathologically approved hyperplasia)或小於10毫米之管狀腺瘤(tubular adenoma)等陰性結果，同時亦記錄其癌症胚胎抗原檢查(Carcinoembryonic Antigen,CEA)結果。所有的病患和健康者均以書面方式提供告知同意，且本研究係經長庚醫院的審查委員會審核通過。
本實驗例係使用癌症胚胎抗原檢查(CEA)的檢測套組，如 ADVIA Centaur Analyzer®(WI,USA)套組。具體而言，抽取評估對象的血液(全血)後，將其置於具有抗凝劑EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)的收集管中，並於轉速2000g離心10分鐘後取其上清液，即取得血漿，並將其分裝後，以供後續實驗。而在實驗尚未進行的期間，可將處理後的血液檢體保存於-80℃備用。
萃取微核醣核酸(Extraction of microRNA)
在本實驗例中，係以核醣核酸萃取套組miRNeasy Mini Kit(QIAGEN,CA,USA)萃取血漿中的總核醣核酸(Total RNA)，其包括微核醣核酸(microRNA)。首先，去除有溶血(hemolysis)情形的血漿後，並取300μL血漿(未有溶血情形)置入miRNeasy Mini Kit所附的收集管中。並依據miRNeasy Mini Kit所檢附的操作方法添加緩衝液，最後以30μL的去RNA酶水(RNase-free water)流洗，以取得約30μL的總核醣核酸及微核醣核酸溶液，並可將其置於-80℃備用。
反轉錄反應(Reverse transcription PCR,RT-PCR)
接著，本實驗例係以TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems,Foster City,CA)進行反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR)。以前述萃取之總核醣核酸及微核醣核酸為模板(template)，並反轉錄形成互補去氧核醣核酸(cDNA)。本實驗例於反轉錄聚合酶連鎖反應中所使用的引子(primer)與後續定量聚合酶連鎖反應所使用的引子與探針(probe)均由美商應用生命系統(Applied Biosystem)公司之網站(http：//bioinfo.appliedbiosystems.com/genome-database/mirna.html)輸入對應之索引編號(Accession No.)後購得。本實驗例中所使用之第一與第二微核醣核酸的反轉錄聚合酶連鎖反應中所使用的引子與定量聚合酶連鎖反應所使用的引子與探針所對應之索引編號如下表四所示：
接著，再依據TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit所提 供的操作方法，將由上述方式購得之引子與總核醣核酸及微核醣核酸(模板)及其他反應試劑混合後，進行反轉錄反應。其中，反轉錄的反應步驟：以16℃處理30分鐘；再以20℃處理30秒，42℃處理30秒，50℃處理1秒，並重複50個循環；最後，再以70℃處理10分鐘，以取得互補去氧核醣核酸(cDNA)。
定量聚合酶連鎖反應(Quantitative-PCR)
本實驗例係以TaqMan Human MiRNA Assay(Applied Biosystems,Foster City,CA)套組進行定量聚合酶連鎖反應(qPCR)。首先，將前述取得之互補去氧核醣核酸(cDNA)作為定量聚合酶鏈鎖反應的模板，並分別依據表四所示之索引編號至美商應用生命系統公司之網站所購得之引子添加對應的引子及探針，並依TaqMan® MicroRNA Assays Protocol(2006年版，型號(Part Number)4364031，Rev.B)設定定量聚合酶連鎖反應所需各項參數，以檢測對應之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸，進而取得對應之微核醣核酸於評估對象的血液檢體中的濃度(copies/μl)或Cq值。
表五顯示本實驗例中所收集之6位確診罹患大腸直腸癌及6 位健康之人類個體的血液檢體的檢測結果。其中，「樣本編號」欄位中，「N」表示為正常組，即健康之人類個體的血液檢體的檢測結果；「CRC」表示為大腸直腸癌組，即確診罹患大腸直腸癌之病患的血液檢體的檢測結果。而本實驗例各取6位作為正常組或大腸直腸癌組，分別1~6表示之。本實驗例依據前述步驟分別取得評估對象(N1~N6及CRC1~CRC6)之血液檢體中的第一微核醣核酸(miR-221、miR-92a)及第二微核醣核酸(miR-10b) 的濃度後，便可根據第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，評估個體罹患大腸直腸癌的風險。
依據表二所示可知，當第一微核醣核酸為miR-221，而第二 微核醣核酸為miR-10b時，其檢測閾值為30.47，故若miR-221/miR-10b的比值大於30.47則可評估為高風險，一般臨床檢測可稱為陽性。若miR-221/miR-10b的比值小於30.47則可評估為低風險，一般臨床檢測可稱為陰性。另外，第一微核醣核酸為miR-92a，而第二微核醣核酸為miR-10b時，其檢測閾值為329.4，故若miR-92a/miR-10b的比值大於329.4則可評估為高風險，比值小於329.4則可評估為低風險。而由表四可知，正常組(N1~N6)之miR-221/miR-10b的比值皆小於25.36，且miR-92a/miR-10b的比值皆小於200，故評估為低風險。而大腸直腸癌組(CRC1~CRC6)之miR-221/miR-10b的比值皆大於40，且miR-92a/miR-10b的比值皆大於1200，可評估為高風險。因此，由實驗例一所示之結果可證實本評估方法確實可用於評估人類個體罹患大腸直腸癌的風險。
實驗例二：本評估方法與癌症胚胎抗原檢查進行評估的效果比較
在實驗例二中，係以實驗例一中所收集的173位健康之人類個體及215位確診罹患大腸直腸癌的血液檢體，並依據實驗例一的採樣方法及表現量的測量方法，檢測血液檢體中如表一所列之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的濃度(表現量)。
接著，依據表二以第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的組合比例，以及各血液樣本來源所代表之個體是健康對照組或是大腸直腸癌患者以PASW Statistics 18.0軟體繪製接受者操作特徵曲線(Receiver operating characteristic curve,ROC curve)並計算出接受者操作特徵曲線下的面積(Area Under the ROC curve，AUC)，以取得對應之Youden Index做為檢測閾值，而該點係代表其特異性(specificity)及敏感度(sensitivity)之和為最大值。ROC曲線下的面積(Area Under the ROC curve,AUC)，其可用於衡量所用之評估方法正確鑑定的概率，而可用來確定檢驗的有效性，故亦可稱為診斷準確度，以下係以AUC值稱之。實驗例二之信賴區間(confidence interval)設定在95%，而所得之p值小於0.05代表統計上有顯著差異。
同樣的，以相同的數據處理方法，直接將第一微核醣核酸及 第二微核醣核酸的濃度以PASW Statistics 18.0軟體計算接受者操作特徵曲線(ROC curve)，並取得對應之AUC值及其p值，並藉由比對AUC值，以評估本評估方法的有效性。於本實驗例以及後續之實驗例中，除有特別說明者外，其所顯示的AUC值之p值均小於0.05。
在本實驗例中，以表二所示之檢測閾值為基準，第一微核醣 核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例大於檢測閾值者則判定為陽性(positive,P)，而小於檢測閾值的最高值者則判定為陰性(negative,N)。舉例而言，miR-221/miR-10b的比值大於30.47者，判定為陽性，而小於30.47者，則判定為陰性。接著，在判定陽性的血液檢體中，若來自於「215位確診罹患大腸直腸癌」的血液檢體，則為「真陽性(true positive,TP)」，若來自於「173位健康之人類個體」的血液檢體，則為「偽陽性(false positive,FP)」。同理，在判定陰性的血液檢體中，若來自於「173位健康之人類個體」的血液檢體，則為「真陰性(true negative,TN)」，若來自於「215位確診罹患大腸直腸癌」的血液檢體，則為「偽陰性(false negative,FN)」。將前述「真陽性(TP)」、「偽陽性(FP)」、「真陰性(TN)」、「偽陰性(FN)」的數量，計算出如表六所示之各個第一微核醣核酸及第二微核醣核酸之組合的敏感度(sensitivity)及特異性(specificity)。其中，敏感度係指「TP/(TP+FP)」，即判定為陽性(P)的樣本中，已確診為大腸直腸癌的真陽性(TP)，而特異性係指「TN/(TN+FN)」，即判定為陰性(N)的樣本中，來自於健康的人類個體樣本的真陰性(TN)。
依據本實驗例之上述實驗方法使用表二中所示第一微核醣 核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例進行評估之AUC值、檢測閾值、敏感度及特異性如下所示。表中所列之AUC值均有統計上顯著意義(p<0.05)。同時，表六中所列之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，在大腸直腸癌患者的血液檢體與健康正常組的血液檢體之比例(癌症患者/健康者之倍數)經統計後其p值均小於0.05，故顯示表六中所列之第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之表現量的比例，在大腸直腸癌患 者的血液檢體與健康正常組的血液檢體中具有顯著差異。
此外，將實驗例一所收集之血液樣本進行癌症胚胎抗原檢查 發現，癌症胚胎抗原檢查的敏感度及特異性分別為23.7%及99.4%。由於癌症胚胎抗原檢查係用於監測大腸直腸癌病患術後的恢復情形，故雖癌症胚胎抗原檢查的特異性相當高(99.4%)，但卻無法兼顧其敏感度(23.7%)，亦即，偽陰性的情形高。而由上表可得知，上述第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的任意組合，其敏感度皆大於癌症胚胎抗原檢查的敏感度。且使用miR-221/miR-10b、miR-221/miR-126、miR-221/miR-139、miR-221/miR-31、miR-221/miR-145、miR-92a/miR-10b、miR-92a/miR-100、miR-92a/miR-139、miR-92a/miR-31、miR-92a/miR-145、miR-15a/miR-10b、miR-15a/miR-100、miR-15a/miR-126、miR-15a/miR-139、miR-15a/miR-31、miR-24/miR-10b、miR-24/miR-29a、miR-24/miR-126、miR-24/miR-139、miR-24/miR-31、miR-24/miR-145、miR-18a/miR-10b、miR-18a/miR-100、miR-18a/miR-31、miR-18a/miR-145、miR-18a/miR-155、miR-191/miR-10b、miR-191/miR-139、miR-191/miR-31、miR-191/miR-145、miR-128/miR-10b、miR-128/miR-29a、miR-223/miR-10b、miR-223/miR-31、miR-223/miR-155等組別之比例評估個體罹患大腸直腸癌的風險，其敏感度與特異性皆可大於60%，相較於使用癌症胚胎抗原檢查方法，更可兼顧其敏感度及特異性。 因此，第一實施例之評估方法相較於癌症胚胎抗原檢查方法，能克服癌症胚胎抗原檢查所常見的偽陰性情形，故第一實施例之評估方法可更為有效地評估個體罹患大腸直腸癌的風險。
實驗例三：本評估方法與使用單一微核醣核酸進行評估的效果比較
實驗例三中，其實驗流程與數據計算整理皆可參照前述實驗例二。在本實驗例中，相較於使用單一微核醣核酸(第一微核醣核酸或第二微核醣核酸)的表現量進行評估，使用表二中所示之第一微核醣核酸與 第二微核醣核酸之表現量的比例會有較為良好的效果。舉例而言，如表七所示的，miR-221/miR-10b、miR-221/miR-100、miR-221/miR-29a、miR-221/miR-126、miR-221/miR-139、miR-221/miR-31及miR-221/miR-145所得之AUC值(診斷準確度)大於單獨使用第一微核醣核酸(miR-221)或單獨使用第二微核醣核酸(miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145)的AUC值(診斷準確度)。而其他第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的組合具有較佳的評估效果，可直接參考表七所示，於此不加贅述。
上述實驗結果顯示，使用如表七所示之第一微核醣核酸與第 二微核醣核酸之表現量的比例來評估人類個體罹患直腸大腸癌風險，相較於單獨使用對應之第一微核醣核酸(miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128、miR-223)或單獨使用對應之第二微核醣核酸(miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145)，來得更為有效。
實驗例四：表一所示之第一及第二微核醣核酸於不同檢體之表現變化量之比較
實驗例四係比較表二所示之第一微核醣核酸及第二微核醣核酸分別在組織檢體及血液檢體中的含量。實驗例三與實驗例一相同，收集215位確診罹患大腸直腸癌者(大腸直腸癌組)及173位健康之人類個體(正常組)的血液檢體進行分析。而組織檢體部分，則是收集81位確診罹患大腸直腸癌者(大腸直腸癌組)的經手術癌化組織檢體及同一患者非病灶組織(正常組)的大腸組織檢體進行分析。並依據實驗例一的操作步驟，針對組織檢體及血液檢體進行萃取微核醣核酸、反轉錄反應及定量聚合酶連鎖反應，以取得各第一微核醣核酸及第二微核醣核酸的表現量。
接著，分別計算不同檢體中，同一微核醣核酸(如miR-221) 於大腸直腸癌組與正常組之表現量的比值，並以正常組作為分母，以取得相較於正常組的倍數(Fold)。因此，若大腸直腸癌組與正常組的表現量相同，則比值為1；若大腸直腸癌組的表現量較高，比值大於1；或正常組的表現量較高，則比值介於0~1之間。其他細節操作步驟可參考前述，於此不加贅述。
由表八可知，表一所示的第一與第二微核醣核酸，在不同類 型的檢體中，其表現改變程度不一樣，且於某一種檢體中其改變倍數有統計上差異者，亦不必然在其他種檢體中有統計上之差異(例如miR-126、miR-139、miR-145、miR-155)。因此，適用於針對組織檢體來評估個體罹患大腸直腸癌風險的微核醣核酸，不必然就適用於血液檢體中。
此外，若將表一中所示之各微核醣核酸，即便於血液檢體 中，其表現改變程度亦非均有統計上差異。所以若是僅用表一中所列之各微核醣核酸的表現改變程度，亦非均能有效評估個體罹患大腸直腸癌的風 險。相較之下，如表六所示，本發明第一實施例之評估方式，利用第一微核醣核酸及第二微核醣核酸表現量之比例的方法，即能將原本無法單一適用於血液檢體中的微核醣核酸，轉化為能夠作為有效評估之標的。
實驗例五：第二實施例之評估方法可減少偽陰性的錯誤評估
以第二實施例的評估方法來評估個體罹患大腸直腸癌的風險時，即先以第二微核醣核酸的表現量評估後，再以比例計算的方式評估罹患大腸直腸癌的風險，相較於直接使用對應之第二微核醣核酸來評估(即表九「第一微核醣核酸/第二微核醣核酸」欄位未顯示內容者)，可降低其偽陰性。其結果如下表九所示。
由上表可知，以第二實施例的評估方法來評估個體罹患大腸 直腸癌的風險時，其敏感度相較於直接使用對應之第二微核醣核酸來得高，故顯示其可有效降低單純使用第二微核醣核酸所產生之偽陰性。此外，值得一提的是，在實驗例三中計算表七中所列之各第二微核醣核酸的AUC值後，發現miR-10b、miR-100、miR-29a以及miR-31的AUC值其p值均小於0.05，而miR-126、miR-139以及miR-145的AUC值其p值均大於0.05；另外，以實驗例二相同實驗流程與數據計算整理後發現，miR-155的AUC值(為0.574)其p值亦小於0.05。前述結果顯示，相較於單純只使用在血液檢體中的miR-10b、miR-100、miR-29a或miR-31的表現量來評估個體罹患大腸直腸癌的風險，單純只使用在血液檢體中的miR-126、miR-139或miR-145的表現量來評估個體罹患大腸直腸癌的風險較不準確，其有可能是因為在血液檢體中的miR-126、miR-139或miR-145的表現量相較於miR-10b、miR-100、miR-29a或miR-31，在健康者以及罹患大腸直腸癌者之間的差異較小，因此單純只使用血液檢體中miR-126、miR-139或miR-145的表現量較不易區分健康者和罹患大腸直腸癌者。但如表九中所示，當使用第二實施例之評估方法時，是使用第二微核醣核酸後接續使用第一微核醣核酸與第二微核醣核酸的比例，由於第一微核醣核酸與第二微核醣核酸之比例的AUC值(對應之AUC值可參考表六)的p值皆小於0.05，代表表九中所示的該些組合能顯著地提升對於健康者與罹患大腸直腸癌者的鑑別力，藉此，該些組合也顯著地降低使用單一微核醣核酸所導致的偽陰性。
實驗例六：合併使用miR-221/miR-10b、miR-92a/miR-10b、miR-15a/miR-10b、miR-24/miR-10b、miR-18a/miR-10b來評估個體罹患大腸直腸癌之風險
本實驗例中所使用的血液檢體之收集與採樣、各微核醣核酸之萃取、反轉錄反應及定量聚合酶連鎖反應、各微核醣核酸表現量比例之計算，其所使用之材料及實驗方式如同實驗例一中所述。
本實驗例之操作步驟如下：檢測血液檢體中之miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a與miR-10b之表現量，並進一步計算miR-221與miR-10b之表現量的第一比例、miR-92a與miR-10b之表現量的第二比例、miR-15a與miR-10b之表現量的第三比例、miR-24與miR-10b之表現量的第四比例、miR-18a與miR-10b之表現量的第五比例。接著，分別判斷第一比例、第二比例、第三比例、第四比例與第五比例是否大於其所對應之檢測閾值(如表二所示)。若當第一比例、第二比例、第三比例、第四比例與第五比例中任何三者大於其對應之檢測閾值，則評估為高風險(步驟S54)，反之，評估為低風險。
經上述步驟之評估方式的其敏感度及特異性可分別維持在75%及85%以上(敏感度為75.8%，特異性為85.0%)。故相較於表二中所列出使用單一個第一微核糖核酸與第二微核糖核酸表現量的比例進行評估，本實驗例中所採用的方式，可以在維持其特異性的情況下，同時保持對大腸直腸癌樣本的良好敏感度。故本實驗例之評估方法，更能有效地評估個體罹患大腸直腸癌的風險。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包括於後附之申請專利範圍中。
S10~S20‧‧‧步驟

Claims (14)

  1. 一種自一人類個體所取得之一血液檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：由該血液檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量；以及根據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例，以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險，其中，該第一微核醣核酸係選自由miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所組成之群組，並且當該第一微核醣核酸為miR-128時，該第二微核醣核酸是miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險的步驟為當該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-221，且該第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-15a，且該第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139或miR-31。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-191，且該第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-128，且該第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139或miR-31。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-92a，且該第二微核醣核酸為miR-10b或miR-100。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-24，且該第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126或miR-139。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-18a，且該第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、或miR-31。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一微核醣核酸為miR-223，且該第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR126、miR-139、miR-31或miR-145。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中根據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例，包括依據miR-221與miR-10b之表現量的第一比例、miR-92a與miR-10b之表現量的第二比例、miR-15a與miR-10b之表現量的第三比例、miR-24與miR-10b之表現量的第四比例、以及miR-18a與miR-10b之表現量的第五比例，以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
  12. 一種自一人類個體所取得之一血液檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險的方法，包括以下步驟：由該血液檢體中檢測一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸之表現量，其中，該第一微核醣核酸係選自由miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所組成之群組，且當第該一微核醣核酸為miR-128時，該第二微核醣核酸是miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145；依據該第二微核醣核酸的表現量評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險，且當miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的表現量小於一濃度閾值，或當miR-126、miR-145或miR-155的表現量大於一濃度閾值，評估為高風險；以及 當miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-139、或miR-31的表現量大於一濃度閾值，或當miR-126、miR-145或miR-155的表現量小於一濃度閾值，則再依據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該依據該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例以評估該人類個體罹患大腸直腸癌之風險的步驟為該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例大於一檢測閾值，評估為高風險。
  14. 一種用於自一人類個體所取得之一血液檢體中評估該人類個體罹患大腸直腸癌風險之標誌物，該標誌物包括：一第一微核醣核酸以及一第二微核醣核酸，且該第一微核醣核酸與該第二微核醣核酸之表現量的比例在至少一罹患大腸直腸癌之患者所取得之血液檢體中與一對照血液檢體中具有顯著差異；其中，該第一微核醣核酸係選自由miR-221、miR-92a、miR-15a、miR-24、miR-18a、miR-191、miR-128及miR-223所組成之群組，且該第二微核醣核酸係選自由miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31、miR-145及miR-155所組成之群組，並且當第一微核醣核酸為miR-128時，第二微核醣核酸為miR-10b、miR-100、miR-29a、miR-126、miR-139、miR-31或miR-145。
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