CN105603113B - HIV-1早期感染相关的血清miRNA在制备试剂盒中的应用 - Google Patents

HIV-1早期感染相关的血清miRNA在制备试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法在HIV‑1感染早期检测中的应用。本发明涉及的miRNA分子包括hsa‑miR‑29a、hsa‑miR‑223、hsa‑miR‑27a、hsa‑miR‑19b、hsa‑miR‑151‑3p、hsa‑miR‑28‑5p、hsa‑miR‑766、hsa‑miR‑30a‑5p和hsa‑miR‑136*。用这9种血清miRNA作为分子靶标，建立了一种快速、敏感、特异的HIV‑1感染早期的检测方法。本发明涉及上述9种miRNA在病毒感染早期诊断中的用法及检测这9种miRNA所用的试剂盒。

Description

HIV-1早期感染相关的血清miRNA在制备试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法及其人类免疫缺陷(HIV-1)病毒早期感染检测中的应用。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起艾滋病(AIDS)由原来的吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散，疫情不仅严重地威胁我国人民健康，而且影响到经济发展和社会稳定。截止2011年底，我国存活艾滋病感染者和艾滋病人78万，每年新发HIV感染者4.8万人。早期发现和早期诊断艾滋病患者是减少传播机会、控制疫情的关键环节。
目前的实验室检测包括HIV抗体、病毒载量、CD4+T淋巴细胞、P24抗原检测等。HIV抗体检测阳性虽然是HIV感染的金标准，但是一般抗体在感染病毒后4周才逐渐出现，患者从感染HIV到血清HIV抗体阳性反应的窗口期由于病毒的大量复制，具有较强的传染性；应用RT-PCR技术检测窗口期血液中的病毒核酸虽然具有很高的灵敏度，但是HIV病毒具有高度的变异性，随着抗病毒治疗的推广，病毒变异和耐药株不断出现，使检测的敏感性受到了限制；P24抗原检测能够在窗口期检测到抗原，但易出现假阳性；CD4淋巴细胞水平随着感染的发展而逐渐下降，一般用于病程监测。因此，寻找新的诊断技术，既要简便快速又要敏感、特异，是缩短窗口期，实现早期诊断，治疗、预测和监测疾病进程的迫切任务。
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是约22个核苷酸长、单链、内源的非编码RNA，在转录后或翻译水平调节相关基因表达。最近研究表明血清miRNA不仅在肿瘤、心血管、代谢性等疾病，而且在病毒感染性疾病如肝炎的早期诊断中起着非常重要的作用，血清中成熟的miRNA分子具有高度的稳定性，而且在病毒血症消失后依然可以检测到。因此建立一种基于血清miRNA作为HIV感染的诊断标志物用于疾病的早期诊断及病程的监测具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种能够用于检测HIV-1病毒早期感染的新的血清miRNA标志物及其在制备制备HIV-1感染早期检测试剂盒中的应用。
本发明的第二目的是提供一种HIV-1感染早期检测试剂盒及其使用方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种HIV-1早期感染相关的血清miRNA标志物，所述的miRNA标志物为包括如下9种：
hsa-miR-29a(UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA)，其序列信息如SED ID NO.1所示，
hsa-miR-223(UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA)，其序列信息如SED ID NO.2所示，
hsa-miR-27a(UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC)，其序列信息如SED ID NO.3所示，
hsa-miR-19b(UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA)，其序列信息如SED ID NO.4所示，
hsa-miR-151-3p(CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG)，其序列信息如SED ID NO.5所，
hsa-miR-28-5p(AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG)，其序列信息如SED ID NO.6所示，
hsa-miR-766(ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC)，其序列信息如SED ID NO.7所示，
hsa-miR-30a-5p(UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG)，其序列信息如SED ID NO.8所示，
hsa-miR-136*(CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU)，其序列信息如SED ID NO.9所示。
上述9种血清miRNA标志物筛选方法分为以下步骤：
(一)低密度芯片用于检测患者血清miRNA的表达谱初步筛选，低密度芯片v3.0(TaqMan Low-density Array,TLDA)(Applied Biosystems,CA)包含A和B两种阵列，共能检测754种人的miRNA。每块array都包含3种内参和一种阴参。Array A上主要检测的是比较被关注的miRNA，Array B上主要是近期被发现的miRNA。具体方法如下：(1)核酸提取：收集HIV-1感染早期病人血清10份，每份以30μL混合，健康正常人血清10份，每份以30μL混合，将两组血清(每组300ul)用试剂盒NucleoSpin miRNA Plasma kit(Macherey-Nagel Gmbh&Co.KG,Germany)提取血清中的miRNA；(2)逆转录反应：提取的血清miRNA反转录采用TaqmanmiRNA Reverse Transcription Kit及RT引物均为ABI(Applied Biosystems,CA，USA)公司提供；(3)预扩增反应：为了提高TLDA检测的灵敏性，逆转录后的cDNA需要加一步预扩增，其中预扩增引物Megaplex PreAmp primer和试剂盒TaqMan PreAmp Master Mix,2x由ABI(Applied Biosystems,CA,USA)公司提供。(4)PCR反应：预扩增产物稀释后用于TLDA的PCR扩增，所用的试剂TaqMan Universal Master Mix,No AmpErase UNG和TLDA由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(5)数据分析：数据分析使用SDS RelativeQuantification Software version 2.3(Applied Biosystems)。CT值(Threshold cycle)大于等于40的为40(未检测出)。
(二)根据以上表达谱结果进行分析，初步选出与正常人血清表达谱比较有显著差异的血清miRNA做为候选基因做进一步验证，在这里我们设定三个标准：(1)Ct值<35的检测值是认为比较可靠的；(2)患者血清miRNA与正常人血清miRNA相比的比值变化达到3倍以上；(3)与疾病相关的有生物学意义的候选miRNA。具体方法如下：(1)核酸提取：验证的miRNA提取每份样品用200μl血清，同时每份待测血清中加入25fmol的cel-miR-238做为内参，提取试剂盒和方法同上(低密度芯片部分miRNA提取)。(2)逆转录及PCR反应：qRT-PCR所用的RT stem-loop引物，TaqMan miRNA逆转录试剂盒(Reverse Transcription Kit)，PCR引物和探针，TaqMan Universal PCR Master Mix(No AmpErase UNG)均由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(3)统计分析：对于荧光定量qRT-PCR所得到的Ct值用cel-miR-238的Ct值做内参校正，统计分析用SPSS v19.0(SPSS,Inc.,Chicago,USA)。P值<0.05认为是统计显著差异。
(三)诊断价值分析：接收者操作特性曲线(receiver operator characteristiccurve,ROC)分析候选miRNA基因的诊断价值，曲线下面积(area under curve,AUC)值和95％confidence interval(CI)来表示诊断的特异性和敏感性。多元对数回归分析(multiple logistic regression analysis)更进一步用于诊断价值的分析。结果筛选出9种miRNA可以作为HIV-1感染的早期诊断的分子靶标。具有比较好的敏感性和特异性及9种miRNA用于阳性判定的cutoff值如表1所示。
本发明还提供了上述血清miRNA标志物在制备HIV-1感染早期检测试剂盒中的应用。
进一步的，所述的试剂盒包括以下组分：(1)RNA提取试剂，以及cel-miR-238内参；(2)血清miRNA标志物的检测试剂，包括AMV反转录体系及反转录引物、PCR反应体系及引物；(3)阴性对照，灭菌去离子水。其中反转录反应体系、PCR反应体系和9种miRNA的引物探针从ABI公司购买；
进一步的，所述cel-miR-238内参，是人工合成的外源性的线虫的miRNA,其序列信息如uuuguacuccgaugccauucaga(SED ID NO.10)，因为是RNA，为了增加其稳定性，在U和C上做了甲基化修饰；
本发明还提供了一种HIV-1感染早期检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述血清miRNA标志物的检测试剂；所述的检测试剂包括AMV逆转录体系及反转录引物、PCR反应体系及引物、阴性对照，灭菌去离子水。
进一步的，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂，以及cel-miR-238内参是人工合成的外源性的线虫的miRNA,其序列信息如SED ID NO.10。
本发明还提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)血清miRNA提取：用RNA提取试剂盒从300μl待测血清标本中提取miRNA,在提取之前，在血清标本中加入25fmol的人工合成的cel-miR-238作为内参，用于从提取核酸开始的内参质控，提取试剂盒NucleoSpin miRNA Plasma kit(Macherey-Nagel Gmbh&Co.KG,Germany)，根据试剂盒说明书提取血清中的miRNA；
(2)AMV逆转录反应：1.67μl RNA加入3.33μl反转录混合试剂中(1.0μl9种miRNA特异性的反转录引物，购买自ABI公司，0.33μl反转录酶，0.5μl RT Buffer,0.063μl RNA酶抑制剂，0.5μldNTP和1.387μl DEPC水)；条件：16℃30min,42℃30min,然后85℃恒温5min；逆转录产物加28.9μl DEPC水稀释，保存于-20℃；阴性对照与样本cDNA制备同时进行,用DEPC水代替RNA；内参cel-miR-238cDNA制备与样本cDNA制备也同时进行，用cel-miR-238反转录引物代替9种特异性反转录引物；
(3)PCR反应如下：2.25μl稀释RT产物，2.5μl TaqMan Universal PCR Master Mix(No AmpErase UNG，购自ABI),0.25μl TaqMan miRNA PCR引物(购自ABI)；条件为：95℃10min,然后95℃15sec,60℃1min 40个循环；反应在荧光定量PCR仪器上进行；内参cel-miR-238PCR反应同时进行，用cel-miR-238PCR引物代替9种特异性PCR引物；
(3)结果判定：对于荧光定量qRT-PCR所得到的Ct值用cel-miR-238的Ct值做内参校正，差异表达使用公式2-ΔCt计算，结果以相对表达水平的log2形式呈现，其中：ΔCT＝Cttarget miRNA–Ctcel-miR-238,即目的miRNA的相对值(Log2 relative level)。判定结果用cutoff值，与给出的表1结果比较，ΔCT大于cutoff值判为标本检测阳性。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：通过检测HIV-1病毒感染相关的血清miRNA表达，可以对病毒感染做出早期诊断而且不依赖于病毒核酸的检测，具有快速、敏感、特异的特点，为临床疾病的早期诊断提供了一种新的检测方法和重要的实验依据。
附图说明
图1：qRT-PCR检测HIV-1感染血清及正常对照血清中hsa-miR-29a、hsa-miR-223、hsa-miR-27a、hsa-miR-19b、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-766、hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-136*的表达水平(**表示p<0.01)。
图2：ROC曲线评价hsa-miR-29a、hsa-miR-223、hsa-miR-27a、hsa-miR-19b、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-766、hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-136*在HIV-1早期感染中的诊断价值。
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例1：血清miRNA提取
收集HIV-1感染早期病人血清10份，健康正常人血清10份，每份样品取30μl血清，充分混匀后成为一个混合样品，取300μl用于miRNA的提取，在提取之前加入25fmol的人工合成的外源性的线虫的miRNA,cel-miR-238(Takara Biotechnology Co,Dalian,China)作为内参。(1)加入90μl Lysis Buffer MLP,震荡5秒，室温下放置3分钟；加入30μL ProteinPrecipitation Buffer MPP，涡旋混匀，室温放置1分钟后11000g，离心3分钟，取上清置一新管中；(2)加入400μL异丙醇，涡旋混匀后将液体移入过滤柱中，室温静置2分钟11000g，离心30秒钟；(3)加入100μL wash l于过滤柱中，11000g离心30秒，弃过滤液。加入700μL wash2于过滤柱中，11000g离心30秒，弃过滤液。加入250μL wash 2，11000g离心2分钟，弃过滤液。离心1分钟，彻底除残留液。(4)加入30μL去RNA酶的水，室温下静置1分钟，然后11000g离心1分钟，收集血清miRNA。
实施例2：血清miRNA差异表达检测
血清miRNA表达谱所用低密度芯片(TLDA)是人的miRNA Panel A+B(AppliedBiosystems,USA),能检测754种人的miRNAs。(1)首先需要做逆转录，逆转录试剂盒和RT引物均为ABI(Applied Biosystems,USA)公司提供。步骤如下：50ng RNA样品加入4.5μl反转录混合试剂中，包括0.8μl反转录引物(Megaplex RT Primer Pools A+B)(10x)，1.5μlMultiScribe Reverse Transcriptase(50U/μl)反转录酶，0.8μl RT Buffer(10x),0.9μlMgCl2(25mM),0.1μl RNA酶抑制剂(20U/μl)和0.2μl水(Nuclease-free water)。反应体系配好后置于冰上孵育5分钟后在PCR扩增仪中扩增，条件为：16℃2min,42℃1min,50℃1sec,40个循环，然后85℃恒温5min。cDNA保存于-20℃。(2)为了提高TLDA检测的灵敏性，逆转录后的cDNA需要加一步预扩增，其中Megaplex PreAmp primer和TaqMan PreAmp MasterMix,2x由ABI(Applied Biosystems,USA)公司提供。反应体系：2.5μl RT产物加入22.5μl预扩增混合液中(12.5μl TaqMan PreAmp Master Mix,2.5μl Mageplex PreAmp Primers,7.5μl Nuclease-free water)。反应体系配好后置于冰上孵育5分钟后在PCR扩增仪中以下列条件扩增：95℃10min；55℃2min；72℃2min孵育后以95℃15sec；60℃4min进行12个循环，然后99.9℃恒温10min结束。预扩增产物加入75μl 0.1x TE(pH 8.0)稀释后保存于-20℃。(3)稀释的预扩增产物用于低密度芯片的扩增，所用的试剂TaqMan Universal MasterMix,No AmpErase UNG和TaqMan MicroRNA Array由ABI(Applied Biosystems,USA)公司提供。PCR反应体系如下：450μl TaqMan Universal Master Mix,No AmpErase UNG,9μl稀释后的预扩增产物，441μl Nuclease-free water。体系充分混合后，每次分装100μl与阵列(TaqMan MicroRNA Array)的加样舱里。密封好Array,置于ABI公司的荧光定量7900PCR仪器上进行扩增。在仪器上选择TLDA模式进行扩增。数据分析使用SDS RelativeQuantification Software version 2.3(Applied Biosystems)。CT值(Threshold cycle)大于等于40的为40(未检测出)。
结果显示，与正常对照血清miRNA表达谱相比，HIV-1感染的血清miRNA有差异性表达上调的有273个miRNA，下调的有24个miRNA。在这里我们设定三个标准从中选出我们的候选基因做进一步验证：(1)Ct值<35的检测值是认为比较可靠的；(2)患者血清miRNA与正常人血清miRNA相比的比值变化达到3倍以上；(3)与疾病相关的有生物学意义的候选miRNA。其中可以选出若干miRNA。
实施例3：血清差异表达的候选miRNA的验证
根据低密度芯片结果选出候选基因miRNA,分别用荧光定量qRT-PCR的方法验证HIV-1感染和正常人血清样本。验证实例选用165份血清，其中128份为HIV-1感染血清，37份为健康对照血清。miRNA提取每份样品用200μl血清，提取试剂盒和方法同上(低密度芯片部分RNA提取)。qRT-PCR所用的RT stem-loop引物，TaqMan miRNA逆转录试剂盒(ReverseTranscription Kit)，PCR引物和探针，TaqMan Universal PCR Master Mix(No AmpEraseUNG)均由ABI(Applied Biosystems,USA)公司提供。采用人工合成的cel-miR-238作为内参标准品。每份样本都做了三个重复，差异表达水平用公式2-ΔCt计算，结果以相对表达水平的log2形式呈现，其中：ΔCT＝Cttarget miRNA–Ctcel-miR-238,即目的miRNA的相对值(Log2relativelevel)。统计分析用SPSS v19.0(SPSS,Inc.,Chicago,USA)。组间比较用t检验，P值<0.05认为是统计显著差异。结果如图1表明在HIV-1感染组中如下9种miRNA：
hsa-miR-29a UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA、
hsa-miR-223UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA、
hsa-miR-27aUUCACAGUGGCUAAGUUCCGC、
hsa-miR-19b UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA、
hsa-miR-151-3p CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG、
hsa-miR-28-5pAAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG、
hsa-miR-766ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC、
hsa-miR-30a-5pUGUAAACAUCCUCGACUGGAAG、
hsa-miR-136*CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU
显示显著增高(**表示p<0.01)。ROC曲线评价hsa-miR-29a、hsa-miR-223、hsa-miR-27a、hsa-miR-19b、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-766、hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-136*在HIV-1早期感染诊断中具有很好的特异性和敏感性(图2)。表1为9种miRNA各自的cutoff值及用于HIV-1感染诊断的敏感性和特异性。
表1:用于HIV-1早期感染诊断的9种miRNA的敏感性和特异性及cutoff值
实施例4：HIV-1感染早期检测试剂盒及其使用方法
应用qRT-PCR原理，制备一种基于血清miRNA标志物的HIV-1早期感染检测试剂盒，试剂盒的组成部分为AMV反转录体系、PCR反应体系、cel-miR-238内参、阴性质控品和9种血清miRNA(hsa-miR-29a、hsa-miR-223、hsa-miR-27a、hsa-miR-19b、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-766、hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-136*)特异性引物探针(包括逆转录引物和PCR引物探针，均购自ABI公司)具体步骤同以上试剂盒使用步骤：
(1)核酸提取：300μl待测血清加入25fmol cel-miR-238内参核酸提取miRNA,提取试剂盒NucleoSpin miRNA Plasma kit(Macherey-Nagel Gmbh&Co.KG,Germany)，根据试剂盒说明书提取血清中的miRNA；
(2)逆转录体系如下：1.67μl RNA加入3.33μl反转录混合试剂中(1.0μl反转录引物，0.33μl反转录酶，0.5μl RT Buffer,0.063μl RNA酶抑制剂,0.05μl dNTP和1.387μlDEPC水)。条件：16℃30min,42℃30min,然后85℃恒温5min。逆转录产物加28.9μl DEPC水稀释，保存于-20℃。阴性对照与样本cDNA制备同时进行,用DEPC水代替RNA。内参cel-miR-238cDNA制备与样本cDNA制备也同时进行，用cel-miR-238反转录引物代替9种特异性反转录引物；
(3)PCR反应体系如下：2.25μl稀释RT产物，2.5μl TaqMan Universal PCR MasterMix(No AmpErase UNG),0.25μl TaqMan miRNA Assay primer。条件为：95℃10min,然后95℃15sec,60℃1min 40个循环。反应在荧光定量PCR仪器上进行。内参cel-miR-238的PCR反应与样本PCR反应也同时进行，用cel-miR-238特异性引物代替9种特异性PCR引物；
(4)结果判定：对于荧光定量qRT-PCR所得到的Ct值用cel-miR-238的Ct值做内参校正，差异表达使用公式2-ΔCt计算，结果以相对表达水平的log2形式呈现，其中：ΔCT＝Cttarget miRNA–Ctcel-miR-238,即目的miRNA的相对值(Log2relative level)。判定结果用cutoff值，与表1结果比较ΔCT大于cutoff值判为标本检测阳性。

Claims (5)

1.血清中miRNA标志物在制备HIV-1感染早期检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述miRNA标志物由以下所述miRNA组成：
hsa-miR-29a，其序列信息如SED ID NO.1所示，
hsa-miR-223，其序列信息如SED ID NO.2所示，
hsa-miR-27a，其序列信息如SED ID NO.3所示，
hsa-miR-19b，其序列信息如SED ID NO.4所示，
hsa-miR-151-3p，其序列信息如SED ID NO.5所示，
hsa-miR-28-5p，其序列信息如SED ID NO.6所示，
hsa-miR-766，其序列信息如SED ID NO.7所示，
hsa-miR-30a-5p，其序列信息如SED ID NO.8所示，
和hsa-miR-136*，其序列信息如SED ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括以下组分：(1)RNA提取试剂，以及cel-miR-238内参；(2)血清miRNA标志物的检测试剂，包括AMV反转录体系及反转录引物、PCR反应体系及引物；(3)阴性对照，灭菌去离子水。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述cel-miR-238内参，是人工合成的外源性的线虫的miRNA,其序列信息如SED ID NO.10所示。
4.一种HIV-1感染早期检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2所述血清miRNA标志物的检测试剂；所述的检测试剂包括AMV逆转录体系及反转录引物、PCR反应体系及引物、阴性对照，灭菌去离子水。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂，以及cel-miR-238内参是人工合成的外源性的线虫的miRNA,其序列信息如SED ID NO.10所示。
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