CN101974530A

CN101974530A - 艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群

Info

Publication number: CN101974530A
Application number: CN 201010293220
Authority: CN
Inventors: 张华堂; 徐雯雯; 韩妙君; 陈玲; 郭彦
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2010-09-27
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明涉及艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群，属生物医学领域。本发明通过采用高通量的人miRNA芯片，比较未刺激、CD3/CD28磁珠刺激及PHA/IL-2刺激三种状态的CD4+T细胞miRNA表达差异，筛选得到艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群，该特异表达miRNA群共包含5个miRNA，由SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列组成。本特异表达miRNA群中的各miRNA所调控的靶基因均参与了造成不同生物学效应的显著功能(Gene Ontology，GO)和信号转导通路(pathway)，同时在信号转导网络(Signal-Net)和基因的调控网络(GeneRelNet)中处于关键结点或重要地位，并有望基于其中单个、多个或全部miRNA建立芯片、分子杂交和RT-PCR的方法检测样本中这些miRNA的表达水平，根据这些miRNA的表达水平诊断艾滋病及筛选抗艾滋细胞药物。

Description

艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群

技术领域：

本发明涉及艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群。具体的讲是在人microRNA组范围内筛选艾滋病相关miRNA，利用细胞模型和基因芯片技术相结合的方法建立的艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群，属生物医学领域。

技术背景：

microRNA(miRNA)是新近发现的一类约有18-24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，通过不完全互补的方式与编码蛋白mRNA的3’端非编码区结合，引起靶mRNA的降解、活性降低或翻译受抑，从而在转录后水平对基因表达进行调控。miRNA在细胞的个体发育、增殖、凋亡、分化和应激中扮演着重要的角色，与肿瘤、心脏病、糖尿病和艾滋病等多种疾病都有着密切联系，某些miRNA的产生过程与HIV-1(human immunodeficiency virus-type 1，人类免疫缺陷病毒)的生活周期相关联。因此推测在艾滋病的发生过程中，存在特征性的miRNA表达谱。

HIV-1天然的靶细胞CD4+T细胞的活化和增殖是HIV-1得以大量繁殖和广泛播散的先决条件，1996年Levine等人意外发现，经同时包被在磁珠上的CD3、CD28抗体(“CD3/CD28 beads”)刺激后，活化、增殖的CD4+T细胞，反而获得了既能抵抗感染又能清除病毒的能力——来自HIV-1感染者的CD4+T细胞活化后，能逐渐清除已感染的病毒，来自健康成人的CD4+T细胞活化后，能抵抗HIV-1而不被感染。我们以此特殊效应为基础，同时以高度易感并促进病毒增殖的PHA/IL-2活化细胞为反证，构建细胞模型并筛选出艾滋病相关的miRNA表达图谱，用以直接筛选安全有效的抗艾滋细胞药物。

发明内容：

本发明的目的在于提供艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群。

本发明采用高通量的人microRNA芯片，通过比较未刺激、CD3/CD28磁珠刺激及PHA/IL-2刺激三种状态的CD4+T细胞miRNA表达差异，筛选得到一组艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群，共包含5个miRNA，其部分或全部组合作为筛查抗艾滋细胞药物的标志；该群miRNA在CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1状态时高表达，miRNA群中的5个miRNA的名称及序列见表1；

表1抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群(共5个miRNA)

本发明中的特异表达miRNA群中的各miRNA所调控的靶基因均参与了造成不同生物学效应的显著功能(Gene Ontology，GO)和信号转导通路(pathway)，同时在信号转导网络(Signal-Net)和基因的调控网络(GeneRelNet)中处于关键结点或重要地位，因此最具有代表意义。

附图说明：

图1显示抵抗和清除状态(B)中特异高表达miRNA。

具体实施方式：

本发明通过采用高通量的人miRNA芯片，比较未刺激、CD3/CD28磁珠刺激(B)及PHA/IL-2刺激(P)三种状态的CD4+T细胞miRNA表达差异，筛选得到一组艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群，共包含5个miRNA。

具体步骤如下：

1.样本的选择和处理

3例样本取自云南昆明血液中心，均为健康人外周血浓缩白细胞。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用CD4+T Cell Isolation Kit II human试剂盒(Miltenyi公司)对PBMC进行磁珠阴性分选，获得静息状态的CD4+T细胞。使用6孔培养板每孔3ml微量培养体系在37℃、5％CO₂培养箱中对CD4+T细胞进行体外刺激培养，培养基为RPMI 1640完全培养液[RPMI 1640+10％FBS+0.1mol/L HEPES(上海生工生物公司)]。CD3/CD28磁珠刺激(B组)：按细胞磁珠1∶3的比例接种1×10⁶CD4+T细胞/孔(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，Invitrogen公司)，每2天换半液并传代，维持细胞密度为1～2×10⁶细胞/ml。PHA/IL-2刺激(P组)：接种2×10⁶CD4+T细胞/孔，加入5mg/ml植物血凝素(PHA)和100U/ml白介素-2(IL-2)进行刺激培养，每3天换半液补充PHA和IL-2。上述细胞刺激6天，连同未刺激(R组)的CD4+T细胞提取总RNA后作为基因芯片杂交的样本。

2.基因芯片杂交

2.1总RNA提取及纯化

采用mirVana RNA Isolation Kit(Applied Biosystem p/n AM1560)提取Total RNA。

2.2准备标记反应体系

样品标记及杂交所需要的试剂均包含在Agilent’s miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(p/n 5190-0456)中，具体的试剂目录如下所示：

Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP)

10×Calf Intestinal Phosphatase Buffer

T4RNA Ligase

10×T4RNA Ligase Buffer

Dimethyl sulfoxide(DMSO)

Nuclease-Free Water

Cyanine 3-pCp

10X GE Blocking Agent

2X Hi-RPM Hybridization Buffer

2.2.1去磷酸化：

2.2.1.1用1×TE(pH7.5)或DNase/RNase-free水将RNA样品稀释至50ng/μL。

2.2.1.2吸取上述稀释后的样品2μL至洁净的1.5mL离心管中，放置冰上备用。

2.2.1.3按下表所示的顺序配制去磷酸化混合液：

2.2.1.4取上述的混合液2μL至样品管中，总体积为4μL，枪头抽吸混匀。

2.2.1.5将上述4μL反应混合液置于37℃金属浴中或PCR仪中，保温30分钟。本步骤结束后，如不立即进行下面的反应，应将反应样品置于-80℃保存备用。

2.2.2样品变性：

2.2.2.1在每管样品中添加2.8μL 100％DMSO。

2.2.2.2将上述反应混合液置于100℃金属浴中加热5-10分钟。注意严格控制时间在上述范围内。

2.2.2.3上述反应结束后，将样品管迅速转入冰水浴中冷却，并立即进行下面的反应步骤。

2.2.3连接：

2.2.3.1将10×T4RNALigase Buffer置于37℃温育并间隔涡旋，直至沉淀全部溶解，然后将其冷却至室温备用。

2.2.3.2按下表配制连接反应混合液：

Components	Volume(μL)per reaction	Volume(μL)per 9reactions
			10×T4RNA Ligase Buffer	1.0	9.0
Cyanine3-pCp	3.0	27.0
			T4RNA Ligase	0.5	4.5
Total Volume	4.5	40.5

注意：上述的反应混合液应在使用前配制，配好后放在冰上，并在15分钟内使用。

2.2.3.3取4.5μL上面的反应混合液至样品管中，总体积为11.3μL，枪头抽头吸混匀，稍离心。

2.2.3.4置于16℃温育2小时。反应结束后，将样品置于真空浓缩仪中完全抽干备用。注意：样品一定要完全抽干以去除DMSO，将真空浓缩仪的温度设定在45℃-55℃以加快抽干时间。

2.3准备10×Blocking Agent：

2.3.1在冻干的10X×GE BlockingAgent管中加入125μLnuclease-free水，轻微涡旋，以使其完全溶解，必要时将其置于37℃温育4-5分钟。

2.3.2稍离心，放置备用。配制好的10X×GE Blocking Agent放置在-20℃保存2个月，每次融化使用时，注意涡旋混匀并离心。

2.4准备杂交样品：

2.4.1准备100℃的金属浴备用。

2.4.2将抽干的样品重新溶解在18μL nuclease-free水中。

2.4.3在每管中加入4.5μL配制好的10×GE Blocking Agent。

2.4.4在每管中加入22.5μL 2×Hi-RPM Hybridization Buffer，轻微涡旋混匀。

2.4.5将上述反应混合液放置在100℃金属浴中加热5分钟。

2.4.6反应结束后，迅速将其转至冰水浴中冷却5分钟。注意：冷却的时间不应超过15分钟。

2.4.7离心收集反应液并立即进行下面的步骤。

2.5准备杂交混合液：

2.5.1将合适的盖片正确放置在Agilent SureHyb chamber底座上。

2.5.2用移液器缓慢地将约45μL反应液吸至盖片上。注意：吸取反应液时，不要吸到沉淀，并尽量避免引入气泡。同时要避免枪头碰触盖片密封圈，以免破裂漏液。

2.5.3将芯片点样面(带有“Agilent”字样面)朝下缓慢放置在盖片上。

2.5.4组装SureHyb chamber，并拧紧。

2.5.5稍微晃动组装好的SureHyb chamber，以使里面所有的气泡能自由移动。

2.5.6将SureHyb chamber平衡放置在杂交炉的架子上，温度设定在55℃，转速为20rpm。

2.5.7杂交20小时。注意：在同一次实验中，要保持杂交时间一致。

2.6芯片洗涤的操作流程：

2.6.1在Gene Expression wash buffers中加入Triton X-102：

2.6.1.1从纸盒中取出试剂瓶，打开内外层的盖子。

2.6.1.2用移液器加入2mL 10％的Triton X-102。

2.6.1.3盖上盖子，上下颠倒混匀5-6次。

2.6.1.4装上龙头，并在瓶壁上标明“已经加入Triton X-102”。

注意：Wash 1和wash 2在使用前均应按照上述步骤加入Triton X-102。

2.6.2预热Gene Expression Wash Buffer 2：

2.6.2.1在无菌的试剂瓶中倒入1L的Gene Expression Wash Buffer 2。

2.6.2.2将试剂瓶放入37℃水浴中过夜。

2.6.2.3将slide-staining dish#3置于装水的碟子中，放置在37℃水浴中过夜。

2.6.3准备设备：

将实验中所有需要用到的碟子、架子和磁力棒，用Milli-Q水彻底清洗数次；尽量在每步的洗涤过程中使用同一个洗涤碟等器材。

2.6.4洗涤芯片：

2.6.4.1具体的洗涤时间和温度如下表所示：

	Dish	Wash Buffer	Temperature	Time
					Disassembly	1	GE Wash Buffer 1	Room temperature
1st wash	2	GE Wash Buffer 1	Room temperature	5minutes
					2nd wash	3	GE Wash Buffer 2	37℃	5minutes

2.6.4.2在slide-staining dish#1中注满Gene Expression Wash Buffer 1，于室温备用。

2.6.4.3将slide rack放置在slide-staining dish#2中，注入Gene Expression Wash Buffer 2以漫过slide rack。放入一个磁力棒，然后将dish放置在磁力搅拌器上。

2.6.4.4将37℃过夜预热的slide-staining dish#3放置在磁力搅拌器上，注入过夜预热的Gene Expression Wash Buffer 2，打开加热装置，使温度控制在37℃。

2.6.4.5从杂交炉中取出hybridization chamber assembly，小心取下芯片/盖片，左手轻置，芯片面朝上，浸入Gene Expression Wash Buffer 1中，右手用扁头镊子从贴有标签的一头取下盖片，使其掉入碟子中，而后迅速将芯片放入放置在slide-staining dish#2中的slide rack中。重复上述步骤，直到其他的芯片放置妥当。开启磁力搅拌器，中速搅拌5分钟。注意：磁力搅拌器的转速不应过快，以防磁力棒跳起损坏芯片。

2.6.4.6时间结束后，取出放有芯片的slide rack，吸水纸上轻轻控去上面沾染的液体，而后放入slide-staining dish #3中。开启磁力搅拌器，中速搅拌5分钟，注意控制温度在37℃。

2.6.4.7时间结束后，取出slide rack，吸水纸上轻轻控去上面沾染的液体，立即进行下面的步骤。注意：如芯片不能立即扫描，应置于暗中保存；进行下一轮的芯片洗涤时，要使用新的wash buffer。

2.7芯片扫描和数据获取：

2.7.1将芯片正确放置在slide holder中，点样面朝下放置，然后将其放入扫描仪中。

2.7.2打开Agilent Scan Control software，按下表设置扫描参数：

2.7.3设置成自动的文件名获取：前缀1是设备序列号，前缀2是芯片条码。

2.7.4确认扫描仪的状态为“ready”，点击“Scan Slot m-n”，确认芯片的放置位置。上述步骤确认无误后，开始芯片扫描并获取数据。

3.数据分析

3.1差异miRNA筛选

利用多重比较检验(RVM)的F检验进行3组样本的差异miRNA筛选，按照Pvalue＜0.01，FDR＜0.01筛选，得到差异表达miRNA。

3.2miRNA表达趋势分析

通过筛选得到3组样本的差异miRNA后，按照样本的逻辑顺序(P-R-B)，基于miRNA在每个样本下的表达值，对差异miRNA进行表达趋势的聚类，根据聚类结果将每种处理状态下特有的miRNA归类，筛选得到差异miRNA的表达趋势。

3.3特征表达miRNA群的确认

对在抵抗和清除病毒状态时(B中)呈现特异表达趋势的miRNA(见图1)，通过搜索Sanger数据库得到差异miRNA调控的所有靶基因，对上述靶基因进行功能(Gene Ontology，GO)和信号转导通路(pathway)的显著性分析，寻找具有显著功能并参与显著性信号转到通路的靶基因；同时在信号转导网络(Signal-Net)和基因的调控网络(GeneRelNet)中寻找处于关键结点和重要地位的靶基因，找出上述数据整合后得到的靶基因所对应的miRNA，最终筛选出具有代表意义的miRNA从而构建特征表达miRNA群(表1)。

本发明的特异表达miRNA群，有望基于其中单个、多个或全部miRNA建立芯片、分子杂交和RT-PCR的方法检测样本中这些miRNA的表达水平，根据这些miRNA的表达水平诊断艾滋病及筛选抗艾滋细胞药物。

Claims

1.一组艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群，其特征在于该特异表达miRNA群包含的miRNA名称分别为hsa-mir-130b、hsa-mir-18a、hsa-mir-19b、hsa-mir-34a、hsa-mir-363，其部分或全部组合作为筛查抗艾滋细胞药物的标志；该群miRNA在CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1状态时高表达。

2.权利要求1所述的艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达miRNA群，其特征在于5个miRNA由SEQ ID NO：1-5所示的核苷酸序列组成。