CN104877960B - miR‑2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能 - Google Patents

Abstract

miR‑2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，属于细胞生物学技术领域，其特征在于：通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；采用茎环荧光定量RT‑PCR检测miR‑2400的表达量，采用EdU、PCNA免疫荧光、CCK‑8以及CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT‑PCR检测miR‑2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；以上结果表明miR‑2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

Description

miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能

技术领域

本发明涉及miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，属于细胞生物学技术领域。

背景技术

骨骼肌卫星细胞是肌组织的前体细胞、可塑性强，具有骨骼肌的许多重要生物特性，肌卫星细胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌细胞肥大、数目增多以及肌纤维转化的重要机制.骨骼肌卫星细胞增殖分化过程十分复杂，涉及到大量基因的表达及网络调控。研究证实，miRNA在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中发挥了关键性的调控作用(Luo et al.,2013)。因此研究miRNA在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中分子机制可为肌肉损伤修复、肌肉再生等其他领域学科研究提供重要的理论基础，在改良家畜肌肉品质的畜牧业生产领域中具有广阔的应用前景。本研究对牛的骨骼肌卫星细胞进行分离，建立其体外培养的方法，并诱导分化使其成为肌细胞，对骨骼肌细胞中的标志性分子肌球蛋白重链和结蛋白进行免疫荧光染色，以证明分离的骨骼肌卫星细胞的性质和纯度。肌球蛋白重链(Myosin heavychain,MHC)是肌球蛋白的组成成分之一，是构成骨骼肌纤维内粗肌丝的主要成分，是骨骼肌纤维中表达最多的蛋白，是肌肉分化的指标之一。结蛋白(Desmin)是肌组织中重要的中等径骨架纤维蛋白，其在肌肉形态的形成与维持、细胞之间的信息传递、肌细胞分化调控等多方面具有非常重要的意义，由于专一性地出现在肌肉细胞及肌细胞来源的肿瘤细胞里,在平滑肌、骨骼肌和心肌细胞中表达，在维持肌细胞的完整性以及肌小节之间的信息传递中发挥作用(Li et al.,1993)。所以目前认为它可以作为肌肉分化的指标,用于发育生物学的研究。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶[该酶是一种核糖核酸内切酶，属于RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(dsRNAs)，每个片段的3'端都有2个碱基突出。以上内容出自好搜百科http://baike.haosou.com/doc/5447817-5686185.html]加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体(pre-miRNA)并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA5＇端的磷酸基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA5＇端第一个碱基对U(尿苷)有强烈的倾向性，而对G(鸟苷)却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C(胞苷)。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。miR-2400是存在于牛体内的miRNA，在miRBase数据库中的基本信息如图1(http://www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl？terms＝miR-2400&submit＝Search)。miR-2400的茎环序列信息如图2。成熟miR-2400序列为：CCAGCACAGGCAGCUCGGACUGA，具体信息如图3，图中的参考文献：Glazov EA，Kongsuwan K，Assavalapsakul W，Horwood PF，Mitter N，Mahony TJ.Repertoire ofbovine miRNA and miRNA-like small regulatory RNAs expressed upon viralinfection.PLoS One.2009，27，4(7):e6349.doi:10.1371/journal.pone.0006349。该文献发现了miR-2400，但没有对其生物学功能进行报道。如何研究miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物学功能成为急需解决的一大难题？所以，发明miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能及其检测方法，验证miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能是必要的。

发明内容

为了研究miR-2400是否具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的难题，本发明提供了miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，该miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研究分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量，采用EdU(5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷)、PCNA(增殖细胞核抗原)免疫荧光、CCK-8(Cell Counting Kit-8，简称CCK-8)以及CCND2[G1/S-特异性周期蛋白-D2]和CDK6[周期蛋白依赖性激酶6]表达量的荧光定量RT-PCR检测miR-2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR-2400的表达量明显下降；EdU结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；PCNA免疫荧光结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCK-8检测结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR结果为miR-2400过表达后，与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显上升，转miR-2400抑制剂后与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显下降；以上所有结果均表明miR-2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能，其特征在于：通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研究分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量，采用EdU、PCNA免疫荧光、CCK-8以及CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测miR-2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR-2400的表达量明显下降；EdU结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；PCNA免疫荧光结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCK-8检测结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR结果为miR-2400过表达后，与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显上升，转miR-2400抑制剂后与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显下降；以上所有结果均表明miR-2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

所述的牛骨骼肌卫星细胞的体外分离培养的具体步骤：⑴取5-10克新生小牛腿部的骨骼肌组织，PBS磷酸盐缓冲液冲洗后将组织剪成糜状(约1立方毫米大小)，PBS磷酸盐缓冲液反复吹打，静置1分钟。吸出漂浮组织，1000转/分钟，离心10分钟，得肌糜沉淀物。⑵向组织沉淀物中添加50毫升0.2％的I型胶原酶，于37℃水浴摇床中轻摇(约100转/分)消化2小时。之后向消化液中加入40毫升的PBS磷酸盐缓冲液对I型胶原酶消化液进行稀释，吹匀后移入离心管，1000转/分钟，离心10分钟，去除I型胶原酶消化液，向沉淀中加入0.1％胰蛋白酶20毫升，37℃消化30分钟。向消化液中加入40毫升PBS对胰酶进行稀释，吹匀后移入离心管，1000转/分钟，离心10分钟。弃上清，向沉淀中加入PBS并吹匀，1000转/分钟，离心10分钟，重复3次。弃上清，得到含有骨骼肌卫星细胞的混合物。⑶用PBS磷酸盐缓冲液将第2步获得的混合物进行吹打重悬。重悬液用400目铜网过滤，收集滤液并移入离心管中，1000转/分钟，离心10分钟，得到骨骼肌卫星细胞的沉淀。⑷弃去离心管中的上清液，用骨骼肌卫星细胞生长培养液(高糖DMEM+20％胎牛血清+10％马血清)轻轻吹打细胞沉淀，并将其移入细胞培养瓶(经L-多聚赖氨酸处理过的细胞培养瓶，处理方法为以浓度为20-30微克每毫升的多聚赖氨酸，加入培养板或培养瓶且均匀覆盖瓶底部，放置在无菌操作台中过夜，使用前用双蒸水冲洗三遍即可接种细胞)。⑸将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂浓度的细胞培养箱中进行培养，培养1小时贴壁细胞为pp1，未贴壁细胞悬液加入同等体积PBS磷酸盐缓冲液并吹匀，1000转/分钟离心10分钟，弃上清，生长培养液重悬，将悬液移入新培养瓶中培养2小时，贴壁细胞为pp2，从pp2开始连续4天每隔24小时都向未贴壁的细胞悬液加入同等体积PBS磷酸盐缓冲液，吹匀，1000转/分钟，离心10分钟，弃上清，生长培养液重悬，分别记为pp3～pp6，pp1～pp5弃掉不用，pp6培养5d后换液，随后细胞生长和增殖，待细胞的汇合度达到90％时，进行细胞的传代培养。⑹待第⑸步分离培养的骨骼肌卫星细胞处于对数生长期时，将细胞以2×10⁴的密度传代至24孔细胞培养板，12小时待细胞贴壁后，向细胞培养孔中加入分化培养基(高糖DMEM(商品化细胞培养液)+2％马血清)进行骨骼肌卫星细胞的诱导分化，在诱导分化3天后，采用免疫荧光染色的方法鉴定骨骼肌卫星细胞中MHC和Desmin的表达情况。

所述的免疫荧光染色鉴定牛骨骼肌细胞的具体方法：⑴吸尽在24孔细胞培养板中的细胞生长培养液，用PBS磷酸盐缓冲液清洗2次。⑵于-20℃条件下，向24细胞培养孔中加入1毫升的甲醇(分析纯)，作用20分钟，使细胞固定。⑶去除甲醇，加入1毫升PBS磷酸盐缓冲液冲洗细胞，并去除PBS磷酸盐缓冲液。⑷用含5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和0.2％曲拉通X-100(TritonX-100，其作用为破坏细胞膜，使外源抗体分子进入细胞中)的PBS磷酸盐缓冲液孵育细胞1小时。⑸去除第4步的孵育液，用含5％牛血清白蛋白PBS磷酸盐缓冲液分别稀释MHC和Desmin的抗体分子。含5％牛血清白蛋白PBS磷酸盐缓冲液和抗体分子的体积比为100：1。将稀释后的抗体分子加入细胞培养孔里，覆盖于细胞表面即可。于37℃下孵育1小时。⑹.用滤纸吸去细胞表面的抗体分子，然后在每孔细胞中放入1毫升PBS磷酸盐缓冲液，轻轻摇晃(在摇床上进行)细胞培养板5分钟，以清洗细胞表面，之后去除PBS磷酸盐缓冲液。此清洗步骤连续进行三次。⑺去除PBS磷酸盐缓冲液，在每个细胞孔中分别加入Cy5(商品化的花氰染料5)标记的免疫球蛋白分子，其作用是该分子能够与MHC和Desmin的抗体分子结合，从而于荧光显微镜的激发下使MHC和Desmin在细胞中呈现出红色荧光。⑻用滤纸吸去细胞表面的Cy5标记的免疫球蛋白分子，然后在每孔细胞中放入1毫升PBS磷酸盐缓冲液，轻轻摇晃(在摇床上进行)细胞培养板5分钟，以清洗细胞表面，之后去除PBS磷酸盐缓中液。此清洗步骤连续进行三次。⑼向每孔加入300微升的细胞核的荧光染料DAPI(4,6-diamino-2-phenyl indole)，孵育细胞3分钟。⑽去除DAPI，然后在每孔细胞中放入1毫升PBS磷酸盐缓冲液，轻轻摇晃(在摇床上进行)细胞培养板5分钟，以清洗细胞表面，之后去除PBS磷酸盐缓中液。此清洗步骤连续进行三次。⑾去除PBS磷酸盐缓冲液，向细胞表面加入加抗荧光猝灭封片剂，其作用是保持细胞样品的荧光强度，使其可以更长时间的进行荧光观察。⑿将细胞样品置于倒置荧光显微镜下进行观察和拍照。牛骨骼肌卫星细胞的鉴定结果：采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况。

所述的牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量：选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至6孔板，用2％马血清诱导分化1天、2天、3天，收集细胞，检测miR-2400表达量。⑴茎环荧光定量RT-PCR检测方法：①RNA提取步骤：1)弃掉培养产生的旧的培养液，用预冷的PBS磷酸盐缓冲液清洗细胞表面2-3次。2)6孔细胞培养板每孔加入1毫升Trizol试剂(RNA提取试剂)，用枪头轻刮培养板以收集细胞。3)加入0.2毫升预冷的氯仿，冰上静置10分钟，4℃12000转/分钟离心10分钟。4)小心吸取上清液至新的焦磷酸二乙酯[DEPC]处理后的EP管中，加入500微升异丙醇。颠倒混匀冰上静置10分钟。4℃12000转/分钟离心15分钟。5)弃上清，75％乙醇清洗RNA沉淀，10000转/分钟离心5分钟，室温挥发乙醇以干燥RNA沉淀。6)根据沉淀的多少，加入20-50微升预热至65℃的DEPC水将其溶解。测定OD₂₆₀和OD₂₈₀数值，以检验RNA纯度及浓度；琼脂糖凝胶电泳鉴定其降解情况，凝胶成像仪记录电泳结果，-80℃保存留用。②反转录过程：提取的RNA和反转录试剂都置于冰上解冻，解冻后按照反转录说明书操作，其反应体系见表1，得到的cDNA(RNA反转录的产物)按照表2的反应体系进行实时定量PCR。

表1反转录体系

反转录反应条件如下：65℃5min冰上急冷。在上述PCR管中，继续加入：

反转录反应条件如下：50℃，50min，70℃，10min，冰上冷却，得到cDNA。

③PCR反应体系及步骤：以第②步获得的cDNA为摸板，采用荧光染料SYBR GreenⅠ[是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料]的方法进行实时定量PCR的检测。反应体系如表3所示。以18S基因为内参基因。应用ABI 7300System分析最后的PCR扩增实验数据。

表3PCR反应体系

反应条件：两步法PCR扩增标准程序：

Stage1：预变性阶段Reps：195℃30s

Stage2：反应阶段Reps：4095℃5s，60℃31s

所述的EdU检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响：选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至24孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48小时后EdU检测其增殖情况。(注意：此步骤所采用的细胞为体外培养的牛的骨骼肌卫星细胞，使其保持为分化能力而始终处于细胞的增殖状态)。⑴PEI法进行细胞转染的步骤：1)用不含双抗的生长培养基将牛骨骼肌卫星细胞接种至24孔细胞培养板中，至细胞融合率为70％左右时进行转染。2)试验分为1个实验组与1个对照组，每组三孔，即三次重复试验。实验组和对照组每孔添加1微克质粒和2微升PEI。3)取4个无菌的1.5毫升EP管，每管添加Opti-MEM孵育液各75微升。各取3微克质粒加入含有孵育液的EP管中，另外的2管分别添加6微升PEI。静置孵育5分钟。4)将含有PEI的75微升孵育液与含有质粒的75微升孵育液均匀混合，轻轻吹吸混匀(30～50次)后室温静置孵育15分钟。5)静置孵育时去除6孔板中的培养基，用无血清无双抗的DMEM培养基清洗细胞两遍，实验组与对照组每孔均加入450微升无血清无双抗的培养基。孵育结束后，将上述含有PEI和质粒复合物的Opti-MEM[商品化的细胞培养液]孵育液滴加至各组孔中，每孔50微升，轻晃混匀。6)于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4小时后换成牛骨骼肌卫星细胞生长的培养液继续培养并进行细胞增殖情况的检测。⑵细胞转染后进行EdU检测：①EdU步骤：1)EdU标记：用细胞培养基按5000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量10μM EdU培养基；每孔加入500微升10μM EdU培养基过夜孵育，弃培养基；PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟。2)细胞固定化：每孔加入250微升细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟；每孔加入250微升2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；每孔加入250微升PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；(加强)每孔加入250微升渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟，PBS清洗1次，5分钟。3)Apollo染色：每孔加入250微升的染色反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30分钟，弃染色反应液；加入250微升渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；(加强)每孔每次加入250微升甲醇清洗1～2次，每次5分钟，PBS清洗1次，每次5分钟。4)DNA染色：用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加250微升1×Hoechst33342反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入250微升PBS清洗1～3次。5)图像获取及分析：染色完成后即进行观测。(如果条件限制，避光4℃湿润保存待测，但不应该超过3天)。

所述的PCNA免疫荧光检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响：选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至24孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48h后免疫荧光检测细胞内PCNA的表达变化，从而检测骨骼肌卫星细胞增殖情况。(注意：此步骤所采用的细胞为体外培养的牛的骨骼肌卫星细胞，使其保持为分化能力而始终处于细胞的增殖状态)。PEI法进行细胞转染的方法与上文EdU检测细胞增殖时的转染方法相同。细胞转染后进行PCNA免疫荧光检测的方法与上文免疫荧光法鉴定牛骨骼肌卫星细胞的方法相同。

所述的CCK-8检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响：选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至24孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48小时后采用CCK-8法检测细胞增殖情况。①细胞增殖检测：1)在96孔板中培养转染细胞48小时。2)向每孔加入10微升的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。3)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5)如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10微升0.1M盐酸溶液或者1％w/v SDS[十二烷基磺酸钠]溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

所述的CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测：选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至6孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48h后采用荧光定量RT-PCR的方法检测增殖相关重要基因CCND2[G1/S-特异性周期蛋白-D2，该基因编码的蛋白质属于高度保守的周期蛋白家族，该家族成员的显著特征是贯穿细胞周期，其蛋白质丰度周期性地急剧改变。周期蛋白作为CDK(周期蛋白依赖性激酶)的调节因子。不同的周期蛋白表现出各自独特的表达及降解特性，这有助于每个有丝分裂事件在时间上的协调性，以上选自维基百科]和CDK6[周期蛋白依赖性激酶6，CDK6与cyclin D结合的复合物作用与G1期的R点，细胞通过R点后，就能进入S期，并继续运转，以上选自细胞生物学教材]的表达变化。荧光定量RT-PCR检测CCND2和CDK6表达量的方法和上文关于茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的方法相同。

本发明的有益效果为：miR-2400为一种牛中特异性表达的miRNA，其序列特征已经公布，但其生物功能未知，本研究发现miR-2400在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中表达量下降，说明其能够调控牛骨骼肌卫星细胞的增殖和分化，本研究通过实验证明miR-2400能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖，其可以作为研究牛骨骼肌卫星细胞发育的新的miRNA，对调解家畜肉质的生产具有一定的意义。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的miR-2400在miRBase数据库中的基本信息图。

图2为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的miR-2400的茎环序列信息图。

图3为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的成熟miR-2400序列具体信息图。

图4为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况图(放大倍数100倍)。

图5为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的EdU实验结果图。

图6为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量的实验结果图。

图7为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的PCNA免疫荧光检测结果图。

图8为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的CCK-8检测细胞增殖结果图。

图9为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的miR-2400过表达后与增殖相关基因CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测结果图。

图10为miR-2400显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的生物功能的转miR-2400抑制剂后与增殖相关基因CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测结果图。

图中，1.pcDNA3.1(+)，2.pcDNA3.1(+)-miR-2400，3.miR-2400-NC[无关序列对照]，4.miR-2400-I，5.The rate of EdU positive cells，6.MDSC[骨骼肌卫星细胞]-P，7.MDSC-D0，8.MDSC-D1，9.MDSC-D2，10.MDSC-D3，11.Relative expression of miR-2400，12.PCNA，13.DAPI，14.Merge，15.The rate of PCNA positive cells，16.Ctrl，17.Minic-NC，18.Minic[模拟物]，19.Inhibitor-NC，20.Inhibitor，21.Relative Absorbance，22.过表达miR-2400后增殖相关基因的表达量，23.转miR-2400抑制剂后增殖相关基因的表达量，a.CCND2，b.CDK6。

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例一

1.牛骨骼肌卫星细胞的体外分离培养的具体步骤：⑴取5-10克新生小牛腿部的骨骼肌组织，PBS磷酸盐缓冲液冲洗后将组织剪成糜状(约1立方毫米大小)，PBS磷酸盐缓冲液反复吹打，静置1分钟。吸出漂浮组织，1000转/分钟，离心10分钟，得肌糜沉淀物。⑵向组织沉淀物中添加50毫升0.2％的I型胶原酶，于37℃水浴摇床中轻摇(约100转/分)消化2小时。之后向消化液中加入40毫升的PBS磷酸盐缓冲液对I型胶原酶消化液进行稀释，吹匀后移入离心管，1000转/分钟，离心10分钟，去除I型胶原酶消化液，向沉淀中加入0.1％胰蛋白酶20毫升，37℃消化30分钟。向消化液中加入40毫升PBS对胰酶进行稀释，吹匀后移入离心管，1000转/分钟，离心10分钟。弃上清，向沉淀中加入PBS并吹匀，1000转/分钟，离心10分钟，重复3次。弃上清，得到含有骨骼肌卫星细胞的混合物。⑶用PBS磷酸盐缓冲液将第5步获得的混合物进行吹打重悬。重悬液用400目铜网过滤，收集滤液并移入离心管中，1000转/分钟，离心10分钟，得到骨骼肌卫星细胞的沉淀。⑷弃去离心管中的上清液，用骨骼肌卫星细胞生长培养液(高糖DMEM+20％胎牛血清+10％马血清)轻轻吹打细胞沉淀，并将其移入细胞培养瓶(经L-多聚赖氨酸处理过的细胞培养瓶，处理方法为以浓度为20-30微克每毫升的多聚赖氨酸，加入培养板或培养瓶且均匀覆盖瓶底部，放置在无菌操作台中过夜，使用前用双蒸水冲洗三遍即可接种细胞)。⑸将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂浓度的细胞培养箱中进行培养，培养1小时贴壁细胞为pp1，未贴壁细胞悬液加入同等体积PBS并吹匀，1000转/分钟离心10分钟，弃上清，生长培养液重悬，将悬液移入新培养瓶中培养2小时，贴壁细胞为pp2，从pp2开始连续4天每隔24小时都向未贴壁的细胞悬液加入同等体积PBS，吹匀，1000转/分钟，离心10分钟，弃上清，生长培养液重悬，分别记为pp3～pp6，pp1～pp5弃掉不用，pp6培养5天后换液，随后细胞生长和增殖，待细胞的汇合度达到90％时，进行细胞的传代培养。⑹待第⑸步分离培养的骨骼肌卫星细胞处于对数生长期时，将细胞以2×10⁴的密度传代至24孔细胞培养板，12小时待细胞贴壁后，向细胞培养孔中加入分化培养基(高糖DMEM+2％马血清)进行骨骼肌卫星细胞的诱导分化，在诱导分化3天后，采用免疫荧光染色的方法鉴骨骼肌卫星细胞中MHC和Desmin的表达情况。

2.免疫荧光染色鉴定牛骨骼肌细胞的具体方法：⑴吸尽在24孔细胞培养板中的细胞生长培养液，用PBS磷酸盐缓冲液清洗2次。⑵于-20℃条件下，向24细胞培养孔中加入1毫升的甲醇(分析纯)，作用20分钟，使细胞固定。⑶去除甲醇，加入1毫升PBS磷酸盐缓冲液冲洗细胞，并去除PBS磷酸盐缓冲液。⑷用含5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和0.2％曲拉通X-100(TritonX-100，其作用为破坏细胞膜，使外源抗体分子进入细胞中)的PBS磷酸盐缓冲液孵育细胞1小时。⑸去除第4步的孵育液，用含5％牛血清白蛋白PBS磷酸盐缓冲液稀分别稀释MHC和Desmin的抗体分子。含5％牛血清白蛋白PBS磷酸盐缓冲液和抗体分子的体积比为100：1。将稀释后的抗体分子加入细胞培养孔里，覆盖于细胞表面即可。于37℃下孵育1小时。⑹.用滤纸吸去细胞表面的抗体分子，然后在每孔细胞中放入1毫升PBS磷酸盐缓冲液，轻轻摇晃(在摇床上进行)细胞培养板5分钟，以清洗细胞表面，之后去除PBS磷酸盐缓冲液。此清洗步骤连续进行三次。⑺去除PBS磷酸盐缓冲液，在每个细胞孔中分别加入Cy5标记的免疫球蛋白分子，其作用是该分子能够与MHC和Desmin的抗体分子结合，从而于荧光显微镜的激发下使MHC和Desmin在细胞中呈现出红色荧光。⑻用滤纸吸去细胞表面的Cy5标记的免疫球蛋白分子，然后在每孔细胞中放入1毫升PBS磷酸盐缓冲液，轻轻摇晃(在摇床上进行)细胞培养板5分钟，以清洗细胞表面，之后去除PBS磷酸盐缓中液。此清洗步骤连续进行三次。⑼向每孔加入300微升的细胞核的荧光染料DAPI(4,6-diamino-2-phenylindole)，孵育细胞3分钟。⑽去除DAPI，然后在每孔细胞中放入1毫升PBS磷酸盐缓冲液，轻轻摇晃(在摇床上进行)细胞培养板5分钟，以清洗细胞表面，之后去除PBS磷酸盐缓中液。此清洗步骤连续进行三次。⑾去除PBS磷酸盐缓冲液，向细胞表面加入加抗荧光猝灭封片剂，其作是保持细胞样品的荧光强度，使其可以更长时间的进行荧光观察。⑿将细胞样品置于导致荧光显微镜下进行观察和拍照。

牛骨骼肌卫星细胞的鉴定结果：采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况。如下图4所示(放大倍数100倍)。结果表明，牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研究分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力。

3.牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量：选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至6孔板，用2％马血清诱导分化1天、2天、3天，收集细胞，检测miR-2400表达量。

⑴茎环荧光定量RT-PCR检测方法：

①RNA提取步骤：1)弃掉培养产生的旧的培养液，用预冷的PBS磷酸盐缓冲液清洗细胞表面2-3次。2)6孔细胞培养板每孔加入1毫升Trizol试剂(RNA提取试剂)，用枪头轻刮培养板以收集细胞。3)加入0.2毫升预冷的氯仿，冰上静置10分钟，4℃12000转每分钟离心10分钟。4)小心吸取上清液至新的DEPC处理后的EP管中，加入500微升异丙醇。颠倒混匀冰上静置10分钟。4℃12000转每分钟离心5分钟。5)弃上清，75％乙醇清洗RNA沉淀，10000转每分钟离心5分钟，室温挥发乙醇以干燥RNA沉淀。6)根据沉淀的多少，加入20-50微升预热至65℃的DEPC水将其溶解。测定OD₂₆₀和OD₂₈₀数值，以检验RNA纯度及浓度；琼脂糖凝胶电泳鉴定其降解情况，凝胶成像仪记录电泳结果，-80℃保存留用。

②反转录过程：提取的RNA和反转录试剂都至于冰上解冻，解冻后按照反转录说明书操作，其反应体系见表1，得到的cDNA(RNA反转录的产物)按照表2的反应体系进行实时定量PCR。

表1反转录体系

反转录反应条件如下：65℃5分钟冰上急冷。在上述PCR管中，继续加入：

反转录反应条件如下：50℃，50min，70℃，10min，冰上冷却，得到cDNA。

③PCR反应体系及步骤：以第②步获得的cDNA为摸板，采用荧光染料SYBR Green Ⅰ的方法进行实时定量PCR的检测。反应体系如表3所示。以18S基因为内参基因，。应用ABI7300System分析最后的PCR扩增实验数据。

表3PCR反应体系

反应条件：两步法PCR扩增标准程序：

Stage1：预变性阶段Reps：195℃30s

Stage2：反应阶段Reps：4095℃5s，60℃31s

⑵茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量的实验结果：实验结果如下图所示，在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR-2400的表达量明显下降。表明miR-2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用。

4.EdU检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，通过基于荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及药物的细胞增殖筛选实验(以上文字来自锐博生物公司网站http://www.ribobio.com/sitecn/product.aspx？id＝92)。

本研究采用EdU检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至24孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48h后EdU检测其增殖情况。(注意：此步骤所采用的细胞为体外培养的牛的骨骼肌卫星细胞，使其保持为分化能力而始终处于细胞的增殖状态)。

⑴PEI法进行细胞转染的步骤：1)用不含双抗的生长培养基将牛骨骼肌卫星细胞接种至24孔细胞培养板中，至细胞融合率为70％左右时进行转染。2)试验分为1个实验组与1个对照组，每组三孔，即三次重复试验。实验组和对照组每孔添加1微克质粒和2微升PEI。3)取4个无菌的1.5毫升EP管，每管添加Opti-MEM孵育液各75微升。各取2微克质粒加入含有孵育液的EP管中，另外的2管分别添加6微升PEI。静置孵育5分钟。4)将含有PEI的75微升孵育液与含有质粒的75微升孵育液均匀混合，轻轻吹吸混匀(30～50次)后室温静置孵育15分钟。5)静置孵育时去除6孔板中的培养基，用无血清无双抗的DMEM培养基清洗细胞两遍，实验组与对照组每孔均加入450微升无血清无双抗的培养基。孵育结束后，将上述含有PEI和质粒复合物的Opti-MEM孵育液滴加至各组孔中，每孔50微升，轻晃混匀。6)于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4小时后换成牛骨骼肌卫星细胞生长的培养液继续培养并进行细胞增殖情况的检测。

⑵细胞转染后进行EdU检测：

①EdU步骤：1)EdU标记：用细胞培养基按5000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量10μM EdU培养基；每孔加入500微升10μM EdU培养液过夜孵育，弃培养基；PBS清洗细胞1～2，每次5分钟。2)细胞固定化：每孔加入250微升细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟；每孔加入250微升2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；每孔加入250微升PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；(加强)每孔加入250微升渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟，PBS清洗1次，5分钟。3)Apollo染色：每孔加入250微升的染色反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30分钟，弃染色反应液；加入250微升渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；(加强)每孔每次加入250微升甲醇清洗1～2次，每次5分钟，PBS清洗1次，每次5分钟。4)DNA染色：用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加250微升1×Hoechst33342反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入250微升PBS清洗1～3次。5)图像获取及分析：染色完成后即进行观测。(如果条件限制，避光4℃湿润保存待测，但不应该超过3天)。

②EdU实验结果：EdU结果表明，miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低，证明miR-2400能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

5.PCNA免疫荧光检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen简称PCNA)只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内，研究发现PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。本研究采用PCNA免疫荧光检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至24孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48h后免疫荧光检测细胞内PCNA的表达变化，从而检测骨骼肌卫星细胞增殖情况。(注意：此步骤所采用的细胞为体外培养的牛的骨骼肌卫星细胞，使其保持为分化能力而始终处于细胞的增殖状态)。PEI法进行细胞转染的方法与上文EdU检测细胞增殖时的转染方法相同。细胞转染后进行PCNA免疫荧光检测的方法与上文免疫荧光法鉴定牛骨骼肌卫星细胞的方法相同。PCNA免疫荧光检测结果：PCNA免疫荧光结果表明，miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低，证明miR-2400能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

6.CCK-8检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

CCK-8试剂中含有WST–8:化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。以上文字来自好搜百科http://baike.haosou.com/doc/5336398-5571837.html。本研究采用CCK-8法检测miR-2400对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至24孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48小时后采用CCK-8法检测细胞增殖情况。

①细胞增殖检测：1)在96孔板中培养转染细胞48小时。2)向每孔加入10微升的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。3)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5)如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10微升0.1M HCl溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

②CCK-8检测细胞增殖结果：CCK-8检测结果表明，miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低，证明miR-2400能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

7.CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测

选取处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，将其进行细胞传代培养操作，传至6孔板，待细胞贴壁后，采用PEI法进行转染，pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-miR-2400(含有miR-2400的过表达载体)，miR-2400的抑制剂，48小时后采用荧光定量RT-PCR的方法检测增殖相关重要基因CCND2[G1/S-特异性周期蛋白-D2，该基因编码的蛋白质属于高度保守的周期蛋白家族，该家族成员的显著特征是贯穿细胞周期，其蛋白质丰度周期性地急剧改变。周期蛋白作为CDK(周期蛋白依赖性激酶)的调节因子。不同的周期蛋白表现出各自独特的表达及降解特性，这有助于每个有丝分裂事件在时间上的协调性，以上选自维基百科]和CDK6[周期蛋白依赖性激酶6，CDK6与cyclin D结合的复合物作用与G1期的R点，细胞通过R点后，就能进入S期，并继续运转，以上选自细胞生物学教材]的表达变化。荧光定量RT-PCR检测CCND2和CDK6表达量的方法和上文关于茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的方法相同。CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测结果表明：miR-2400过表达后，与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显上升，转miR-2400抑制剂后与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显下降。证明了miR-2400能够促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

Claims (1)

1.miR-2400用于促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖，其特征在于：通过对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养，采用含2％马血清的分化培养基诱导牛骨骼肌卫星细胞分化，在诱导分化3天后，荧光显微镜下观察到MHC和Desmin在牛骨骼肌卫星细胞中的表达情况；牛骨骼肌卫星细胞分化后，MHC和Desmin在细胞具有阳性表达信号，从而证明本研究分离培养的为牛骨骼肌卫星细胞，且具有分化为肌管的能力；在牛的骨骼肌卫星细胞分化过程中，采用茎环荧光定量RT-PCR检测miR-2400的表达量，采用EdU、PCNA免疫荧光、CCK-8以及CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR检测miR-2400对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中，随着分化天数和分化程度的增加，miR-2400的表达量明显下降；EdU结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；PCNA免疫荧光结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCK-8检测结果为miR-2400过表达后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显提高，转miR-2400抑制剂后，牛骨骼肌卫星细胞的增殖率明显降低；CCND2和CDK6表达量的荧光定量RT-PCR结果为miR-2400过表达后，与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显上升，转miR-2400抑制剂后与增殖相关的基因CCND2和CDK6表达量明显下降；以上所有结果均表明miR-2400在调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中具有一定的作用，能够显著促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。