CN106198692A - 检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法 - Google Patents

检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106198692A
CN106198692A CN201610784180.6A CN201610784180A CN106198692A CN 106198692 A CN106198692 A CN 106198692A CN 201610784180 A CN201610784180 A CN 201610784180A CN 106198692 A CN106198692 A CN 106198692A
Authority
CN
China
Prior art keywords
casein
beta
minutes
measured
bovis seu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610784180.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106198692B (zh
Inventor
刘宇
陈伟
陈云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Original Assignee
Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd filed Critical Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Priority to CN201610784180.6A priority Critical patent/CN106198692B/zh
Publication of CN106198692A publication Critical patent/CN106198692A/zh
Priority to PCT/CN2017/095900 priority patent/WO2018040846A1/zh
Priority to AU2017232143A priority patent/AU2017232143B2/en
Priority to NZ735717A priority patent/NZ735717B2/en
Application granted granted Critical
Publication of CN106198692B publication Critical patent/CN106198692B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Dairy Products (AREA)

Abstract

本发明提出了一种检测牛乳中A1 β‑酪蛋白及A2 β‑酪蛋白的方法。所述方法包括：(1)将待测样品依次进行加热、离心、冷冻及解冻，以便得到待测储备液；(2)将所述待测储备液进行预处理，以便得到待测液，其中，所述预处理包括将所述待测储备液与预处理液进行混合；以及(3)利用毛细管电泳法对所述待测液进行检测，以便确定牛乳中是否含有A1 β‑酪蛋白及A2 β‑酪蛋白。利用本发明的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1 β‑酪蛋白及A2 β‑酪蛋白，且操作简便、快速。

Description

检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法
技术领域
本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法。
背景技术
牛奶中蛋白质主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，酪蛋白又分为β-酪蛋白、α-酪蛋白，κ-酪蛋白三种，其中β-酪蛋白约占蛋白总量的30％，β-酪蛋白有两种主要的变异型，即A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。既含有A1β-酪蛋白又含有A2β-酪蛋白的牛乳为A1/A2型牛奶，只含有A2β-酪蛋白的牛奶为A2型牛奶，只含有A1β-酪蛋白的牛奶为A1型牛奶。
母乳中的β-酪蛋白与A2β-酪蛋白在结构和消化特点方面更为接近，而与A1型则相对差异较大。但是，目前发表的数据显示，若由于缺乏母乳而需使用配方奶喂养的婴儿，如采用不含A1β-酪蛋白的配方奶以及对年龄稍大的婴儿采用不含A1β-酪蛋白的奶制品可能有助于降低多种不良作用或反应的风险，由此可见，A2β-酪蛋白是自然亲和的牛奶蛋白质，有助于婴幼儿的长远健康。
由于不是所有的奶牛都能产出只含有纯净A2β-酪蛋白而不含有A1β-酪蛋白的牛奶，现今，西方的奶牛中只有约30％的奶牛是纯正的A2奶牛，由其所产的牛奶只含有100％纯净的A2β-酪蛋白。
然而，对于牛奶中A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的检测方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法。利用该方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前的鉴定手段主要集中于基因手段。然而，该方法操作复杂，检测成本较高。
有鉴于此，发明人经过大量实验发现，通过采用毛细管电泳法对牛奶进行检测，从而能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
为此，本发明提出了一种检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将所述牛乳依次进行加热、离心、冷冻及解冻，以便得到待测储备液；(2)将所述待测储备液进行预处理，以便得到待测液，其中，所述预处理包括将所述待测储备液与预处理液进行混合；以及(3)利用毛细管电泳法对所述待测液进行检测，以便确定所述牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。
发明人发现，利用毛细管电泳法能够确定牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，例如仅存在A1β-酪蛋白或A2β-酪蛋白，或者同时存在A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。然而，由于牛奶中含有脂肪，脂肪可以很好的吸附于毛细管内壁表面而导致毛细管内部无法形成双电层，最终无法实现蛋白的有效分离，同时脂肪还容易导致毛细管阻塞而影响分离。此外，牛奶中的酪蛋白主要是以胶束的形式存在的，若直接进行毛细管电泳，各类型的酪蛋白之间无法分离，导致检测失败。为此，发明人经过大量实验发现，先将牛奶进行离心处理，以充分除去脂肪，避免脂肪对后续检测的影响。进一步地，离心之前，将牛奶进行加热，除脂肪效果较好。接着，通过将离心后的牛奶进行冷冻及解冻，以破坏酪蛋白胶束结构，从而游离出β-酪蛋白，以便于后续检测。进一步地，利用预处理液使酪蛋白胶束进一步分离，以充分游离出β-酪蛋白。由此，根据本发明实施例检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
根据本发明的实施例，上述检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述加热是将所述牛乳加热至40～70℃。由此，以提高乳脂肪去除率。
根据本发明的实施例，所述离心是在1500～10000r/min下进行5～40分钟。由此，以充分除去乳脂肪。
根据本发明的实施例，所述冷冻是在-30～-40℃下进行5～60分钟。由此，以破坏酪蛋白胶束结构。
根据本发明的实施例，所述预处理液含有：30mmol/L的磷酸二氢钠；0.1质量％的羟丙基甲基纤维素；7mol/L的尿素；以及0.05质量％二硫苏糖醇，利用0.1mol/L的NaOH溶液调节所述预处理液的pH值至8.0。由此，以进一步破坏酪蛋白胶束结构。
根据本发明的实施例，利用未涂层毛细管对所述待测液进行所述检测。由此，以降低检测成本。
根据本发明的实施例，步骤(3)包括：将所述未涂层毛细管进行活化处理，并利用动 态涂层试剂将活化后的未涂层毛细管进行涂层处理，得到具有动态涂层的毛细管；以及利用所述具有动态涂层的毛细管进行检测。由此，能够准确地鉴定出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。
根据本发明的实施例，所述动态涂层试剂含有：200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；60mmol/L的戊二胺；120mmol/L的十六烷基溴化铵；以及80mmol/L的聚乙二醇，利用0.1mol/L的HCl溶液调节所述动态涂层试剂的pH值至3.0。由此，能够准确地鉴定出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。
根据本发明的实施例，所述活化处理包括：用色谱级甲醇冲洗所述未涂层毛细管内壁5-20分钟，再用去离子水冲洗5-20分钟，接着用1～4mol/L NaOH溶液冲洗5～20分钟，静置5～30分钟，最后用去离子水冲洗5～20分钟。由此，以便于后续涂层处理。
根据本发明的实施例，所述涂层处理包括：用0.1～0.5mol/L的NaOH溶液冲洗3～5分钟，再用去离子水冲洗3～5分钟，接着用所述动态涂层试剂冲洗3～10分钟，静置5～10分钟，最后用缓冲溶液冲洗3～5分钟。由此，能够得到内壁具有动态涂层试剂的毛细管。
根据本发明的实施例，所述检测条件包括：检测波长为200～450nm；检测温度为0～40℃，优选25℃；进样方式为压力进样或真空进样，优选压力进样，压力为0～1psi，更优选0.5psi；进样时间为1～20s；工作电压为5～30kv，优选20～30kv；检测频率为4～18Hz；毛细管长度为30～100cm，优选60cm；毛细管内径为25～75μm。由此，能够准确地检测牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明另一个实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法的流程示意图；以及
图3～16分别显示了根据本发明另一个实施例的图谱。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了一种检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法。根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：加热、离心、冷冻及解冻S100；预处理S200；以及检测S300。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
下面将详细描述检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法。
S100加热、离心、冷冻及解冻
在该步骤中，将待测样品依次进行加热、离心、冷冻及解冻，以便得到待测储备液。
由于牛奶中含有脂肪，脂肪可以很好的吸附于毛细管内壁表面而导致毛细管内部无法形成双电层，最终无法实现蛋白的有效分离，同时脂肪还容易导致毛细管阻塞而影响分离。为此，发明人经过大量实验发现，先将牛奶进行离心处理，以充分除去脂肪，避免脂肪对后续检测的影响。进一步地，离心之前，将牛奶进行加热，除脂肪效果较好。接着，通过将离心后的牛奶进行冷冻及解冻，以破坏酪蛋白胶束结构，以便于后续检测。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
根据本发明的实施例，牛乳包括：生牛乳、巴氏乳(经过巴氏杀菌处理的乳品)或UHT乳(经过超高温杀菌处理的乳品)。
根据本发明的实施例，加热是将所述牛乳加热至40～70℃。发明人发现，在此条件下加热，乳脂肪在离心过程中能更好的被分离，以提高脂肪的去除率。同时，对于牛奶中蛋白质影响较低。若加热温度过高，容易导致乳清蛋白变性，导致检测结果的准确性较低。
根据本发明的实施例，离心是在1500～10000r/min下进行5～40分钟。发明人发现，在上述离心处理条件下，脂肪能够很好的从牛奶中分离出来，贴附在离心管内壁上方，从而能够有效地除去脂肪，防止其吸附于毛细管内壁上导致毛细管内部无法形成双电层，最终无法实现蛋白的有效分离，同时脂肪还容易导致毛细管阻塞而影响分离。具体地，离心过程中保持加热后的牛乳的温度。
根据本发明的实施例，冷冻是在-30～-40℃下进行5～60分钟。发明人发现，通过将离心除去脂肪后的牛奶进行冷冻，再进行后续的解冻，如此处理后，能够破坏酪蛋白之间的分子作用力，使不同β-酪蛋白构型彻底分开，以便于后续检测。
根据本发明的实施例，解冻是将冷冻后的产物恢复至室温。具体地，对于恢复室温的方式不作严格限定，例如，可以将冷冻后的产物于室温条件下静置，也可以进行加热，使冷冻后的产物达到室温。
S200预处理
在该步骤中，将待测储备液进行预处理，以便得到待测液，其中，预处理包括将待测储备液与预处理液进行混合。发明人发现，通过将待测储备液与预处理液混合，能够进一步破坏酪蛋白胶束结构，使β-酪蛋白游离，防止重新聚合，以便于后续检测，保证检测结果的准确性。
根据本发明的实施例，预处理液含有：30mmol/L的磷酸二氢钠；0.1质量％的羟丙基甲基纤维素；7mol/L的尿素；以及0.05质量％二硫苏糖醇，利用0.1mol/L的NaOH溶液调节预处理液的pH值至8.0。发明人经过大量实验得到上述最优预处理液，该预处理液一方面能够防止蛋白在毛细管内壁吸附，同时使酪蛋白胶束彻底分离，且防止各酪蛋白胶束重新聚合在一起。
根据本发明的实施例，将1mL待测储备液与4mL预处理液旋涡振荡3分钟，于4℃下静置30～60分钟，得到待测液。
S300检测
在该步骤中，利用毛细管电泳法对所述待测液进行检测，以便确定牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。
发明人发现，利用毛细管电泳法能够准确地确定牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。例如，首先，分别利用毛细管电泳测定A1β-酪蛋白标准品以及A2β-酪蛋白标准品，能够确定A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的出峰位置；然后，在相同检测条件下，利用毛细管电泳对待测液进行检测，若在A1β-酪蛋白的出峰位置出现具有特征峰，则可确定样品中含有A1β-酪蛋白；若在A2β-酪蛋白的出峰位置出现特征峰，则可确定样品中含有A2β-酪蛋白；若在A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的出峰位置均出现相应的特征峰，则可确定样品中同时含有A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
根据本发明的实施例，利用未涂层毛细管对待测液进行检测。未涂层毛细管价格低廉，重复使用率高，对环境要求低，可以降低检测成本。
根据本发明的实施例，参见图2，步骤S300包括：
S310得到具有动态涂层的毛细管
在该步骤中，将未涂层毛细管进行活化处理，并利用动态涂层试剂将活化后的未涂层毛细管进行涂层处理，得到具有动态涂层的毛细管。
由于未涂层的毛细管内壁的硅羟基在被氢氧化钠活化后容易吸附蛋白质，无法形成双电层而导致样品无法彻底分离，同时出现不同程度的电渗流而导致毛细管电泳的基线不平。但是，未涂层毛细管价格低廉，重复使用率高，对环境要求低，可以降低检测成本。
发明人发现，利用该动态涂层试剂对毛细管进行涂层处理，可以有效地防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，以提高检测结果的准确性。
根据本发明的实施例，动态涂层试剂含有：200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；60mmol/L的戊二胺；120mmol/L的十六烷基溴化铵；以及80mmol/L的聚乙二醇，利用0.1mol/L的HCl溶液调节动态涂层试剂的pH值至3.0。
发明人经过大量实验发现，检测不同蛋白质所用的动态涂层试剂的种类有所不同，该试剂并不具有普遍适用性，由此，发明人经过大量实验筛选得到该试剂的最优组成成分，具有该动态涂层试剂能够有效的抑制蛋白质吸附，提高实验重复性及毛细管柱利用率。同时，能够有效地分离A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，使得检测结果准确性较高。试剂组分浓度过高或者过低都会对检测造成影响。此外，将动态涂层试剂的pH值调节至3.0，为保证与电泳缓冲液体系的一致性，使得蛋白质均带正电荷，提高分离效率。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
根据本发明的实施例，活化处理包括：用色谱级甲醇冲洗未涂层毛细管内壁5～20分钟，再用去离子水冲洗未涂层毛细管内壁5～20分钟，接着用1～4mol/L NaOH溶液冲洗未涂层毛细管内壁5～20分钟，静置5～30分钟，最后用去离子水冲洗未涂层毛细管内壁5～20分钟。利用甲醇进行冲洗，目的去除毛细管内壁的脂类物质，以防止这些脂类物质影响后续操作以及最终的检测结果。利用NaOH进行冲洗，目的是为了活化毛细管内壁硅羟基，使其带电。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
根据本发明的实施例，涂层处理包括：用0.1～0.5mol/L的NaOH溶液冲洗活化后的未涂层毛细管内壁3～5分钟，再用去离子水冲洗活化后的未涂层毛细管内壁3～5分钟，接着用动态涂层试剂冲洗活化后的未涂层毛细管内壁3～10分钟，静置5～10分钟，最后用缓冲溶液冲洗活化后的未涂层毛细管内壁3～5分钟。具体地，重复上述所有涂层处理步骤2～5次。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
S320检测
在该步骤中，利用具有动态涂层的毛细管进行检测。
根据本发明的实施例，所述检测条件包括：检测波长为200～450nm；检测温度为0～40℃，优选25℃；进样方式为压力进样或真空进样，优选压力进样，压力为0～1psi，更优选0.5psi；进样时间为1～20s；工作电压为5～30kv，优选20～30kv；检测频率为4～18Hz；毛细管长度为30～100cm，优选60cm；毛细管内径为25～75μm。
发明人经过大量实验优化得到最优检测条件，利用该方法能够有效地分离检出A1β-酪蛋白和/或A2β-酪蛋白。毛细管长度过长，使检测时间过长，检测效率较低；电压过小，检测时间过长，检测效率较低，电压时间过长，将产生一定的焦耳热，对检测结果造成影响。由此，根据本发明实施例的检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法能够准确地检测出牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，且操作简便、快速。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法检测生牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白：
1、生牛乳前处理：
取30mL待测生牛乳，置于50mL离心管中，加热至60℃，于4000r/min条件下，离心15min，除去上层乳脂肪；然后置于-40℃冰箱中冷冻20min后；取出恢复至室温状态，制得待测储备液。
2、预处理液的配制：
用去离子水配置100ml样品缓冲液，使得各成分浓度分别为磷酸二氢钠浓度为30mmol/L、羟丙基甲基纤维素0.1质量％、尿素7mol/L、二硫苏糖醇(DTT)0.05质量％，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值至8.0。
3、电泳缓冲溶液的配制：
用去离子水准确配制100ml缓冲溶液，使得各成分浓度达到如下：磷酸二氢钠60mmol/L，尿素7mol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.1质量％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.5mol/L磷酸溶液调节pH至3.0。
4、待测液的配制：
取1mL待测储备液，添加4mL预处理液，漩涡震荡3min，于4℃静置60min，制得待测液。
5、未涂层毛细管活化：
截取内径为50μm，总长度为700mm，有效长度为600mm的未涂层石英毛细管柱(美国Bechman Coulter)，用色谱级甲醇冲洗10min，去离子水冲洗10min，1mol/L的NaOH溶液冲洗10min，静置10min，然后用去离子水冲洗10min。
6、动态涂层处理：
①动态涂层试剂的配制：用去离子水准确配制100mL动态涂层试剂，使得各成分浓度为三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至3.0。
②动态涂层：用0.1mol/L的NaOH溶液冲洗毛细管内壁5min，去离子水冲洗5min，动态涂层试剂冲洗10分钟，静置10分钟，缓冲溶液冲洗5分钟，如此循环3次即可。
7、A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品、待测液的测定：
①检测设备为配备紫外光检测器的高效毛细管电泳仪。
②检测设备参数的确定：检测波长为214nm，检测温度为25℃，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为10s，工作电压为30kv；检测频率为8Hz。
③将配置好的A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品以及待测液依次进样，得到A1β-酪蛋白标准图(图3)、A2β-酪蛋白标准图(图4)以及待测液的蛋白全图谱(图5)，然后将A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品出峰时间与待测液蛋白全图谱对比，即可初步确定牛乳中同时含有A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。
④内标法进一步准确定性β-酪蛋白：取待测液，分别加入A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品，重复上述分离步骤，获得加标准品的全蛋白图谱(图6)、(图7)。
可以看出，图5中，生牛乳中35分钟左右出现两个峰，其中左侧峰低于右侧峰，而图6中，含有A1β-酪蛋白标准品的生牛乳在35分钟左右出现两个峰中，左侧峰高于右侧峰，由此说明左侧峰为A1β-酪蛋白对应峰。同理，图7中右侧峰为A2β-酪蛋白。
⑤生牛乳的鉴定：此生牛乳同时含有A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，为A1/A2型生牛乳(即普通牛奶)。
实施例2
在该实施例中，按照下列方法检测巴氏乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白：
1、巴氏乳前处理：
取20mL待测巴氏乳，置于50mL离心管中，加热至50℃，于3000r/min条件下，离心20min，除去上层乳脂肪；然后置于-40℃冰箱中冷冻10min后；取出恢复至室温状态，制得待测储备液。
2、预处理液的配制：
用去离子水配置100ml样品缓冲液，使得各成分浓度分别为磷酸二氢钠浓度30mmol/L、羟丙基甲基纤维素0.1质量％、尿素7mol/L、二硫苏糖醇(DTT)0.05质量％，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值至8.0。
3、电泳缓冲溶液的配制：
用去离子水准确配制100mL缓冲溶液，使得各成分浓度达到如下：磷酸二氢钠60mmol/L，尿素7mol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，羟丙基甲基纤维素0.1质量％，乙二胺四乙酸二钠80mmol/L，用0.5mol/L磷酸溶液调节pH至3.0。
4、待测液的配制：
取1mL待测储备液，添加4mL预处理液，漩涡震荡3min，于4℃静置60min，制得待测液。
5、未涂层毛细管活化：
截取内径为50μm，总长度为800mm，有效长度为700mm的未涂层石英毛细管柱(美国Bechman Coulter)，用色谱级甲醇冲洗10min，去离子水冲洗10min，1mol/L的NaOH溶液冲洗10min，静置10min，然后用去离子水冲洗10min。
6、动态涂层处理：
①动态涂层试剂的配制：用去离子水准确配制100mL动态涂层试剂，使得各成分浓度为三羟甲基氨基甲烷200mmol/L，戊二胺60mmol/L，十六烷基溴化铵120mmol/L，聚乙二醇80mmol/L，用0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至3.0。
②动态涂层：用0.1mol/L的NaOH溶液冲洗毛细管内壁5min，去离子水冲洗5min，动态涂层试剂冲洗10分钟，静置10分钟，缓冲溶液冲洗5分钟，如此循环4次即可。
7、A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品、待测液的测定：
①检测设备为配备紫外光检测器的高效毛细管电泳仪。
②检测设备参数的确定：检测波长为214nm，检测温度为25℃，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为10s，工作电压为30kv；检测频率为8Hz。
③将配置好的A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品以及待测液依次进样，得到A1β-酪蛋白标准图(图3)、A2β-酪蛋白标准图(图4)以及待测液的蛋白全图谱(图8)，然后将A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品出峰时间与待测液蛋白全图谱对比，即可初步确定牛乳中只含有A2β-酪蛋白。
④内标法进一步准确定性β-酪蛋白：取待测液，分别加入A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白标准品，重复上述分离步骤，获得加标准品的全蛋白图谱(图9)、(图10)。
可以看出，图10中，生牛乳中35分钟左右出现一个特征峰，说明此峰为A2β-酪蛋白对应峰。
⑤巴氏乳的鉴定：此巴氏杀菌乳只含有A2β-酪蛋白，为A2型牛奶。
实施例3
按照实施例1的方法检测UHT乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，区别在于，步骤1中，UHT乳前处理操作如下：
取25mL待测UHT乳，置于50mL离心管中，加热至60℃，于6000r/min条件下，离心30min，除去上层乳脂肪；然后置于-40℃冰箱中冷冻10min后；取出恢复至室温状态，制得待测储备液。
UHT乳的鉴定：此UHT乳同时含有A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，为A1/A2型巴氏杀菌乳(见图11)。
对比例1
在该对比例中，按照实施例1的方法检测生牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，区别在于，不含步骤6。
分离图谱如图12所示，可见动态涂层分离效果明显好于未涂层裸管。
对比例2
在该对比例中，按照实施例1的方法检测生牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，区别在于，步骤1中，生牛乳不进行离心处理，直接进行冷冻处理。
分离图谱如图13所示，未经离心处理的生牛乳无法完全分离出A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，从而容易出现误判。
对比例3
在该对比例中，按照实施例1的方法检测生牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，区别在于，步骤1中，生牛乳未进行冷冻处理。
结果如图14所示，可以看出，未经冷冻处理的生牛乳无法完全分离出A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，从而容易出现误判。
对比例4
在该对比例中，按照实施例1的方法检测生牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，区别在于，预处理液中不含有尿素。
结果如图15所示。可以看出，利用不含尿素的预处理液进行处理，无法完全分离出A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，从而容易造成误判。
对比例5
在该对比例中，按照实施例1的方法检测生牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白，区别在于，动态涂层试剂中不含有聚乙二醇。
结果如图16所示。可以看出，利用不含聚乙二醇的动态涂层试剂进行涂层，并利用所得到的具有动态涂层的毛细管进行检测，无法完全分离出A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，从而容易造成误判。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法，其特征在于，包括：
(1)将所述牛乳依次进行加热、离心、冷冻及解冻，以便得到待测储备液；
(2)将所述待测储备液进行预处理，以便得到待测液，其中，所述预处理包括将所述待测储备液与预处理液进行混合；以及
(3)利用毛细管电泳法对所述待测液进行检测，以便确定所述牛乳中是否含有A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述加热是将所述牛乳加热至40～70℃。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述离心是在1500～10000r/min下进行5～40分钟。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述冷冻是在-30～-40℃下进行5～60分钟。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述预处理液含有：
30mmol/L的磷酸二氢钠；
0.1质量％的羟丙基甲基纤维素；
7mol/L的尿素；以及
0.05质量％二硫苏糖醇，
利用0.1mol/L的NaOH溶液调节所述预处理液的pH值至8.0。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用未涂层毛细管对所述待测液进行所述检测。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(3)包括：
将所述未涂层毛细管进行活化处理，并利用动态涂层试剂将活化后的未涂层毛细管进行涂层处理，得到具有动态涂层的毛细管；以及
利用所述具有动态涂层的毛细管进行检测。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述动态涂层试剂含有：
200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷；
60mmol/L的戊二胺；
120mmol/L的十六烷基溴化铵；以及
80mmol/L的聚乙二醇，
利用0.1mol/L的HCl溶液调节所述动态涂层试剂的pH值至3.0。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，
所述活化处理包括：
用色谱级甲醇冲洗所述未涂层毛细管内壁5～20分钟，再用去离子水冲洗5～20分钟，接着用1～4mol/L NaOH溶液冲洗5～20分钟，静置5～30分钟，最后用去离子水冲洗5～20分钟，
所述涂层处理包括：
用0.1～0.5mol/L的NaOH溶液冲洗所述活化后的未涂层毛细管内壁3～5分钟，再用去离子水冲洗3～5分钟，接着用所述动态涂层试剂冲洗3～10分钟，静置5～10分钟，最后用缓冲溶液冲洗3～5分钟。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测条件包括：
检测波长为200～450nm；
检测温度为0～40℃，优选25℃；
进样方式为压力进样或真空进样，优选压力进样，压力为0～1psi，更优选0.5psi；
进样时间为1～20s；
工作电压为5～30kv，优选20～30kv；
检测频率为4～18Hz；
毛细管长度为30～100cm，优选60cm；
毛细管内径为25～75μm。
CN201610784180.6A 2016-08-31 2016-08-31 检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法 Active CN106198692B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610784180.6A CN106198692B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法
PCT/CN2017/095900 WO2018040846A1 (zh) 2016-08-31 2017-08-03 检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法
AU2017232143A AU2017232143B2 (en) 2016-08-31 2017-08-03 Method to detect A1 β-casein and A2 β-casein in bovine milk
NZ735717A NZ735717B2 (en) 2016-08-31 2017-08-03 Method to detect a1 ?-casein and a2 ?-casein in bovine milk

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610784180.6A CN106198692B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106198692A true CN106198692A (zh) 2016-12-07
CN106198692B CN106198692B (zh) 2017-12-01

Family

ID=58087403

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610784180.6A Active CN106198692B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN106198692B (zh)
AU (1) AU2017232143B2 (zh)
WO (1) WO2018040846A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770827A (zh) * 2016-12-23 2017-05-31 上海华碧检测技术有限公司 一种分离蛋白色谱开管柱的制备方法
WO2018040846A1 (zh) * 2016-08-31 2018-03-08 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法
CN108181399A (zh) * 2018-01-23 2018-06-19 新希望乳业股份有限公司 一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法
WO2019144642A1 (zh) * 2018-01-23 2019-08-01 新希望双喜乳业（苏州）有限公司 一种牛奶中A2-β-酪蛋白的分离方法
CN110346443A (zh) * 2018-04-04 2019-10-18 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法
CN112557483A (zh) * 2020-11-20 2021-03-26 黑龙江飞鹤乳业有限公司 乳制品中骨桥蛋白的分析方法
CN114716531A (zh) * 2022-05-17 2022-07-08 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101339158A (zh) * 2008-08-28 2009-01-07 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种乳中β-酪蛋白含量的检测方法
CN101782549A (zh) * 2010-03-29 2010-07-21 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法
TW201207389A (en) * 2010-08-03 2012-02-16 Univ Nat Pingtung Sci & Tech Determination method of lactalbumin denaturation
CN105136896A (zh) * 2015-08-19 2015-12-09 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB368932A (en) * 1930-02-04 1932-03-17 Herman Daniel Wendt Improvements in or relating to cream
GB886518A (en) * 1958-11-17 1962-01-10 Borden Co Improvements in or relating to milk products
GB0116509D0 (en) * 2001-07-06 2001-08-29 Hannah Res Inst The Methods of extracting casein fractions from milk and caseinates and production of novel products
EP2077273B1 (en) * 2007-12-31 2011-09-14 Animal Technology Institute Taiwan Methods for separating casein from soluble proteins in a composition
CN116869047A (zh) * 2013-01-23 2023-10-13 阿拉食品公司 生产β-酪蛋白组合物和相关产品的方法
CN106198692B (zh) * 2016-08-31 2017-12-01 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101339158A (zh) * 2008-08-28 2009-01-07 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种乳中β-酪蛋白含量的检测方法
CN101782549A (zh) * 2010-03-29 2010-07-21 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法
TW201207389A (en) * 2010-08-03 2012-02-16 Univ Nat Pingtung Sci & Tech Determination method of lactalbumin denaturation
CN105136896A (zh) * 2015-08-19 2015-12-09 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 测定牛乳中κ-酪蛋白含量的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
向明霞等: "《应用双向电泳和质谱联用技术研究乳源蛋白的差异性》", 《分析实验室》 *
张东送等: "《毛细管电泳在牛乳中酪蛋白含量测定及掺假检测方面的应用》", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018040846A1 (zh) * 2016-08-31 2018-03-08 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白的方法
CN106770827A (zh) * 2016-12-23 2017-05-31 上海华碧检测技术有限公司 一种分离蛋白色谱开管柱的制备方法
CN108181399A (zh) * 2018-01-23 2018-06-19 新希望乳业股份有限公司 一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法
WO2019144642A1 (zh) * 2018-01-23 2019-08-01 新希望双喜乳业（苏州）有限公司 一种牛奶中A2-β-酪蛋白的分离方法
CN108181399B (zh) * 2018-01-23 2019-08-13 新希望乳业股份有限公司 一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法
CN110346443A (zh) * 2018-04-04 2019-10-18 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法
CN110346443B (zh) * 2018-04-04 2021-11-09 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法
CN112557483A (zh) * 2020-11-20 2021-03-26 黑龙江飞鹤乳业有限公司 乳制品中骨桥蛋白的分析方法
CN112557483B (zh) * 2020-11-20 2023-08-11 黑龙江飞鹤乳业有限公司 乳制品中骨桥蛋白的分析方法
CN114716531A (zh) * 2022-05-17 2022-07-08 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用
CN114716531B (zh) * 2022-05-17 2023-11-03 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017232143B2 (en) 2018-10-11
AU2017232143A1 (en) 2018-03-15
WO2018040846A1 (zh) 2018-03-08
CN106198692B (zh) 2017-12-01
NZ735717A (en) 2021-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106198692A (zh) 检测牛乳中A1β‑酪蛋白及A2β‑酪蛋白的方法
Ye et al. Interactions of whey proteins with milk fat globule membrane proteins during heat treatment of whole milk
Price et al. Extraction of phospholipids from a dairy by-product (whey protein phospholipid concentrate) using ethanol
CN109744316A (zh) 一种基于分离膜技术的脱乳糖牛奶制备方法
CN104402993B (zh) 一种制备静注人免疫球蛋白的方法
Lan et al. Effects of heating temperatures and addition of reconstituted milk on the heat indicators in milk
Seraydarian et al. Density gradient separation of sarcotubular vesicles and other particulate constituents of rabbit muscle
CN108359704A (zh) 用于蛋白质组学研究的山羊乳乳清蛋白的处理方法
CN110208448A (zh) 蛋白质组样本处理试剂盒、处理方法及应用
CN101508730B (zh) 一种豆类植物凝集素的提取方法
CN108048434A (zh) 一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法
CN105136896B (zh) 测定牛乳中κ‑酪蛋白含量的方法
Levy et al. Amino acid composition of the proteins from chylomicrons and human serum lipoproteins
CN106755234A (zh) 一种绿茶降血糖肽的制备方法及其应用
US20070158194A1 (en) Process for the Production of Contaminant-Free Electrodialyzed Products
CN105866438A (zh) 一种使用专属性肽段组鉴别美国肉参的方法
Bazinet et al. Effect of KCl and soy protein concentrations on the performance of bipolar membrane electroacidification
CN106198790A (zh) 一种马和骡共有特征性多肽及其应用
CN108181399A (zh) 一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法
Catinella et al. Matrix‐assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: A valid analytical tool in the dairy industry
CN110346443A (zh) 检测牛乳中A2β-酪蛋白含量的方法
Yamauchi et al. Exchangeability of colloidal calcium in milk with soluble calcium
CN109527115B (zh) 羊乳清粉及其制备方法
US3993585A (en) Elevated human lipids control
DK180097B1 (en) A method for measuring an entity of interest in a stream of rinsing water

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant