CN114716531B - 一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用 - Google Patents

一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用，涉及分子检测技术领域。A1β酪蛋白多肽具有如SEQ ID NO.1所示的序列，A2β酪蛋白多肽具有如SEQ ID NO.2所示的序列。本发明提供的酪蛋白多肽包含有A1和A2酪蛋白突变位点，具有A1和A2酪蛋白表位特异性，且具有合成简单，成本低廉的技术优势。借助载体蛋白即可实现多肽抗原的制备，有利于进一步制备能够鉴别A1和A2酪蛋白的抗体，用于免疫检测分析。由此制备的A1β酪蛋白检测试纸条和A2β酪蛋白检测试纸条可以分别完成对A1β酪蛋白和A2β酪蛋白的快速精确检测。因此，本发明为市场A2牛奶掺假提供了现场快速检测方法。

Description

一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体而言，涉及一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用。
背景技术
近年来，一种来自澳洲的A2牛奶产品风靡国内市场，越来越多受到消费者的关注，与A1牛奶相比，A2号称稀有的原生态牛奶，价格是普通牛奶的5-10倍。同时国内乳品企业也开始选育A2奶牛，市场上也出现了越来越多国产A2牛奶产品，价格也远高于A1牛奶。
所谓A2奶和A1奶指的是牛奶中的β酪蛋白的两种主要形式。普通牛奶中的β酪蛋白以A1酪蛋白为主，如果牛奶中的β酪蛋白都是A2酪蛋白，即称为“A2奶”。A1和A2β-酪蛋白之间的差异是由于氨基酸67发生突变(A1处的组氨酸(CAT)取代了A2处的脯氨酸(CCT))，A1酪蛋白会产生一个7个氨基酸的肽段(BCM-7)，而A2酪蛋白酶解产生的是9个氨基酸的肽段(BCM-9)。有研究称A1奶的BCM-7肽有引起和糖尿病、心脏病的风险，因此导致现在市场上A2牛奶价格昂贵。
由于目前全球牧场的奶牛大多为A1奶牛，A2奶牛数量不到30％，因此导致了A2奶产量远低于A1奶。再加上研究宣称的A1奶健康风险和A2的建议裨益作用，导致了A2奶价格远高于A1奶。
价格差距大，必然催动A2牛奶掺假，现在市场上A2牛奶种类繁多，真假难辨，市场监管缺乏相应的鉴别方法，消费者也无从辨识真假A2奶。这样一方面扰乱了市场秩序，也侵害了消费者权益。同时企业在收购鲜奶时也为无法鉴别是否A1掺假而束手无策。
因此亟需开发能够鉴别A1奶和A2奶的快速检测方法。
目前检测A1和A2牛奶的方法分为两类，一类是基因检测，即通过检测A1A2酪蛋白基因突变。主要技术有测序方法和竞争性等位基因特异性PCR(KASP)技术。其中测序技术是目前主流技术，也是基因型检测的金标准。但是该方法成本高，时间长，不适合大规模种质资源筛查。KASP技术虽然操作简单，但也需要送到第三方检测，且专利归属国外，不宜大规模推广。其他诸如先扩增再酶切鉴定方法操作复杂，也不适合推广应用。另一类方法是直接检测牛奶中的β-酪蛋白类型。目前报道的牛奶中的A1/A2β-酪蛋白的检测方法均是基于液相色谱质谱或毛细管电泳的仪器分析法，仪器昂贵操作复杂，检测时间长，且需要专业人员，无法实现在收奶现场对牦牛奶进行鉴定。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用为市场A1牛奶和A2牛奶提供了现场快速检测方法。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种酪蛋白多肽，其为A1β酪蛋白多肽或A2β酪蛋白多肽，A1β酪蛋白多肽具有如SEQ ID NO.1所示的序列，A2β酪蛋白多肽具有如SEQ ID NO.2所示的序列。
上述A1β酪蛋白多肽含有A1和A2蛋白的区别氨基酸位点(即具有A1β酪蛋白氨基酸全长的第67位组氨酸)，A2β酪蛋白多肽含有A1和A2蛋白的区别氨基酸位点(即具有A2β酪蛋白氨基酸全长的第67位脯氨酸)。发明人利用蛋白多肽表位抗原分析，该多肽序列保持了原有蛋白的表位构象，且能够区分A1和A2酪蛋白，具有免疫原性。分别设计合成了A1β酪蛋白多肽和A2β酪蛋白多肽序列，由A1β酪蛋白多肽和A2β酪蛋白多肽制备的抗原表位构象不同。由此，可用于制备区分A1和A2β酪蛋白的单抗或多抗。A1单抗可以特异性结合待测样本中的A1酪蛋白，A2单抗可以特异性结合待测样本中的A2酪蛋白。从而实现A1酪蛋白和A2酪蛋白的快速检测。
SEQ ID NO.1的序列如下：
FAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQ；
SEQ ID NO.2的序列如下：LVYPFPGPIPNSLPQNIPPLT。
本发明还提供了一种多肽抗原，其包括载体蛋白和上述酪蛋白多肽，且载体蛋白与酪蛋白多肽偶联。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、破伤风类毒素和细菌表达的蛋白中的任意一种载体蛋白或两种以上载体蛋白形成的融合蛋白。
在本发明应用较佳的实施方式中，载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述载体蛋白与酪蛋白多肽通过偶联反应进行偶联。
在本发明应用较佳的实施方式中，载体蛋白与酪蛋白多肽通过SPDP连接法进行偶联。SPDP连接法是指采用3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯进行偶联。例如：将分散有SPDP的分散液与载体蛋白混合偶联得到载体蛋白-SPDP，然后将酪蛋白多肽与载体蛋白-SPDP混合孵育。
本发明还提供了一种酪蛋白多克隆抗体，其由从牛奶中纯化的A1和A2型Beta酪蛋白免疫获得；
例如将上述纯化的A1和A2型Beta酪蛋白在新西兰大白兔背部多点皮下注射，多次加强免疫后，采血分离血清，获得相应的多克隆抗体。
本发明还提供了一种酪蛋白单克隆抗体，其由上述的多肽抗原制备得到。
在本发明应用较佳的实施方式中，A1β酪蛋白单克隆抗体或A2β酪蛋白单克隆抗体分别由载体蛋白与A1β酪蛋白偶联的抗原或载体蛋白与A2β酪蛋白偶联的抗原制备得到。
在一种可选的实施方式中，以A1β酪蛋白多肽-BSA抗原为免疫原或以A2β酪蛋白多肽-BSA抗原为免疫原分别免疫目标动物。
本发明还提供了一种酪蛋白免疫层析试纸条，其包括样品垫、反应膜和吸水垫，样品垫上包被有经可被检测的标记物标记的A1β酪蛋白单克隆抗体或A2β酪蛋白单克隆抗体；反应膜上设置有检测线和质控线，检测线上对应于样品垫具有如下任意一种的包被方式：
(1)检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白多克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白多克隆抗体；
(2)检测线上包被有由权利要求4的A1β酪蛋白多克隆抗体或A2β酪蛋白多克隆抗体；
(3)检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白单克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白单克隆抗体，且由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白单克隆抗体与A1β酪蛋白单克隆抗体所针对的A1β酪蛋白的抗原表位不同；由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白单克隆抗体与A2β酪蛋白单克隆抗体所针对的A2β酪蛋白的抗原表位不同。
质控线上包被有二抗。
本发明基于免疫层析试纸条方法开发的酪蛋白快速检测方法具有简单快速定量等优点，为市场A2牛奶掺假提供了现场快速检测方法。
针对A1β酪蛋白检测试纸条而言，即样品垫上包被有经可被检测的标记物标记的A1β酪蛋白单克隆抗体，检测线上包被有A1β酪蛋白多克隆抗体。若检测线和质控线上均存在显色带，则判断待测样本含有A1β酪蛋白。若检测线上不存在显色带，且质控线上存在显色带，则判断待测样本不含有A1β酪蛋白。
针对A2β酪蛋白检测试纸条而言，即样品垫上包被有经可被检测的标记物标记的A2β酪蛋白单克隆抗体，检测线上包被有A2β酪蛋白多克隆抗体。若检测线和质控线上均存在显色带，则判断待测样本含有A2β酪蛋白。若检测线上不存在显色带，且质控线上存在显色带，则判断待测样本不含有A2β酪蛋白。
若目标样本在A1β酪蛋白检测试纸条和A2β酪蛋白检测试纸条均存在检测线显色，则判断目标样本同时含A1β酪蛋白和A2β酪蛋白。
检测方法是将目标样本直接上样至样品垫上，孵育后，即可观察显色情况。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述可被检测的标记物选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金属颗粒、荧光素或量子点。
上述胶体金属颗粒包括不限于胶体金、胶体银，在其他实施方式中，还可选自胶体碳或胶体硒。
在一种可选的实施方式中，上述量子点为核壳型量子点，如ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点。根据需要，上述量子点可以调整为单一化合物形成的量子点，如硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、碲化镉(CdTe)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、磷化铟(InP)或砷化铟(InAs)，或是CdSe核上包裹一层ZnS或CdS组成的纳米晶或半导体纳米晶等物质中的一种。
在一种可选的实施方式中，荧光微球选自时间分辨荧光微球，磁性微球选自磁珠。在一种可选的实施方式中，时间分辨荧光微球选自时间分辨荧光物质与乳胶或纳米颗粒的结合物，时间分辨荧光物质为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的任意一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，反应膜由如下任意一种的材料制得：棉质纤维、聚酯纤维、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维和聚醚砜。
在一种可选的实施方式中，本发明还提供了一种酪蛋白免疫层析试纸条，其包括样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，结合垫上包被有经可被检测的标记物标记的A1β酪蛋白单克隆抗体或A2β酪蛋白单克隆抗体；反应膜上设置有检测线和质控线，检测线上对应于样品垫具有如下任意一种的包被方式：
(1)检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白多克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白多克隆抗体；
(2)检测线上包被有由权利要求4的A1β酪蛋白多克隆抗体或A2β酪蛋白多克隆抗体；
(3)检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白单克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白单克隆抗体，且由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白单克隆抗体与权利要求5的A1β酪蛋白单克隆抗体所针对的A1β酪蛋白的抗原表位不同；由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白单克隆抗体与权利要求5的A2β酪蛋白单克隆抗体所针对的A2β酪蛋白的抗原表位不同。
质控线上包被有二抗。
在一种可选的实施方式中，上述可被检测的标记物选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金属颗粒、荧光素或量子点；
在一种可选的实施方式中，上述反应膜由如下任意一种的材料制得：棉质纤维、聚酯纤维、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维和聚醚砜。
在一种可选的实施方式中，本发明还提供了一种酪蛋白免疫层析试剂盒，其包括酪蛋白免疫层析试纸条和标记试剂，标记试剂为经可被检测的标记物标记的A1β酪蛋白单克隆抗体或A2β酪蛋白单克隆抗体，试纸条包括样品垫、反应膜和吸水垫，反应膜上设置有检测线和质控线，检测线上对应于样品垫具有如下任意一种的包被方式：
(1)检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白多克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白多克隆抗体；
(2)检测线上包被有由权利要求4的A1β酪蛋白多克隆抗体或A2β酪蛋白多克隆抗体；
(3)检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白单克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白单克隆抗体，且由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白单克隆抗体与权利要求5的A1β酪蛋白单克隆抗体所针对的A1β酪蛋白的抗原表位不同；由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白单克隆抗体与权利要求5的A2β酪蛋白单克隆抗体所针对的A2β酪蛋白的抗原表位不同。
质控线上包被有二抗。
在一种可选的实施方式中，上述可被检测的标记物选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金属颗粒、荧光素或量子点；
在一种可选的实施方式中，上述反应膜由如下任意一种的材料制得：棉质纤维、聚酯纤维、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维和聚醚砜。
本发明还提供了一种酪蛋白多肽、多肽抗原、酪蛋白多克隆抗体、酪蛋白单克隆抗体或酪蛋白免疫层析试纸条在检测A1β酪蛋白和/或A2β酪蛋白中的应用。
本发明还提供了一种核酸，其编码上述的酪蛋白多肽。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的酪蛋白多肽既保留了A1和A2酪蛋白抗原表位构象，同时具有合成简单，成本低廉的技术优势。借助载体蛋白即可实现多肽抗原的制备，有利于进一步制备相应的抗体，用于免疫检测分析。鉴于A1β酪蛋白多肽或A2β酪蛋白多肽的序列差异，由此制备的A1β酪蛋白检测试纸条可以完成对A1β酪蛋白的快速精确检测，由此制备的A2β酪蛋白检测试纸条可以完成对A2β酪蛋白的快速精确检测。因此，本发明为市场A2牛奶掺假提供了现场快速检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试纸条结构解析图；
图2为A1酪蛋白检测试纸条针对目标样本检测结果图；
图3为A1酪蛋白检测试纸条和A2酪蛋白检测试纸条分别针对A1和A2牛奶样品检测结果图；
图4为A1和A2酪蛋白试纸条灵敏度检测结果图；
图5为市场牛奶样品A1A2酪蛋白试纸条的测试结果图。
附图标号：1-样品垫；2-反应膜；3-吸水垫；4-底板；5-检测线；6-质控线；7-捕获抗体(A1或A2酪蛋白多克隆抗体)；8-羊抗小鼠抗体；9-金标或荧光素标记的A1或A2酪蛋白单克隆抗体；10-胶体金或荧光素；11-待检酪蛋白。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种检测酪蛋白胶体金免疫层析试纸条。
参照图1所示，其包括依次在底板4上铺设的样品垫1、反应膜2和吸水垫3；在反应膜2上包被有检测线5和质控线6，检测线5包被有捕获抗体(A1或A2酪蛋白多克隆抗体)7，质控线6包被有羊抗小鼠抗体8(即为二抗)。在样品垫上包被有金标或荧光素标记的A1或A2酪蛋白单克隆抗体9。图中A1或A2酪蛋白单克隆抗体的标记物即为胶体金或荧光素10。
为制备上述酪蛋白胶体金免疫层析试纸条，发明人依次进行了牛奶A1和A2型Beta酪蛋白分离纯化、A1和A2蛋白多肽抗原合成及免疫原制备、A1和A2蛋白多克隆抗体以及单克隆抗体制备以及试纸条的组装。
一、牛奶A1和A2型Beta酪蛋白分离纯化
分别选择A1A1型奶牛所产的A1型牛奶和A2A2型奶牛所产的A2型牛奶，纯化其中的beta酪蛋白，作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体。分离beta酪蛋白主要依据其等电点、钙离子敏感以及低温地酸游离等特点进行beta酪蛋白的纯化，最后纯度均在85％以上。
具体步骤如下：取经过基因测序鉴定为纯合型的A1A1和A2A2型奶牛的新鲜牛奶，4℃下4000g离心30分钟，然后冷藏静置1小时，然后去除奶油脂肪层。然后用WhatmanNo.4filter paper进行过滤。然后冰上搅拌的情况下，逐滴加入1M的盐酸，至牛奶pH值到4.6，使beta酪蛋白进行等电点沉淀。然后室温继续搅拌1小时，使酪蛋白充分沉淀。然后3,000×g离心10min去除上清，沉淀用纯水溶解，并用纯水洗涤3次以去除残留的乳糖。最后用纯水重悬沉淀，并用1M的NaOH调pH值至6.8使酪蛋白复融。然后加入CaCl2至终浓度50mM，用来沉淀αS-和β-酪蛋白。然后3000g离心10分钟，去除含有κ-CN型酪蛋白的上清部分。然后再用纯水洗涤沉淀3次。最后用纯水重悬。然后在4℃下冷却24小时，使β-酪蛋白与αS-酪蛋白解离，分离到上清可溶相。取上清，加热至40度，沉淀蛋白，然后进一步冻干备用。
结果：纯化后的蛋白经LC-MS分析，均为单峰，分子量符合预期，A1和A2型Beta酪蛋白的分子量分别为24,018和23,977。
二、A1和A2蛋白多肽抗原合成及免疫原制备。
1、多肽设计与合成：
利用蛋白多肽表位抗原分析，分别设计合成了A1和A2蛋白多肽序列：
A1：FAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQ；
A2：LVYPFPGPIPNSLPQNIPPLT。
上述多肽序列委托公司进行合成。
2、多肽抗原制备
载体蛋白分别选择BSA蛋白和OVA蛋白，其中多肽-BSA蛋白作为免疫原，多肽-OVA蛋白作为包被原。
分别将A1和A2多肽通过SPDP(：3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)连接法将合成的多肽与BSA或OVA进行偶联：取4.6mgSPDP溶解于740μl DMSO，终浓度为20mM。取0.1008g的BSA或OVA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。HiTrap Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜，分别制得A1β酪蛋白多肽抗原和A2β酪蛋白多肽抗原。
三、A1和A2蛋白多克隆抗体以及单克隆抗体制备。
1、多克隆抗体制备：
取步骤一纯化的A1和A2酪蛋白各100mg(2ml)，加入等体积的不完全佐剂，充分混悬。选择体重1.5-2kg的健康雄性新西兰大白兔，按常规操作卡介苗活化其免疫系统。
在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4周后加强免疫，其后每隔2周进行1次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次免疫后，检测效价。耳源静脉采血、分离血清。制备A1蛋白和A2蛋白的多克隆抗体。
2、单克隆抗体制备：
分别用A1β酪蛋白多肽-BSA抗原和A2β酪蛋白多肽-BSA抗原加等体积的不完全佐剂，充分混悬。免疫8周龄磁性Balb/c小鼠。
1)初次免疫时，将A1β酪蛋白多肽-BSA抗原和A2β酪蛋白多肽-BSA抗原溶液中加入等量福氏完全佐剂(FCA)，充分混匀乳化。取0.5ml，以腹腔、皮下、肌肉多点多途径注射BALB/c小鼠，每鼠1mg A1β酪蛋白多肽-BSA抗原或A2β酪蛋白多肽-BSA抗原。3周后进行第二次免疫，用A1和A2多肽-BSA抗原加福氏不完全佐剂(FIA)的乳化液0.5ml免疫小鼠，每鼠1mgA1β酪蛋白多肽-BSA抗原和A2β酪蛋白多肽-BSA抗原。2周后，进行第三次免疫，每鼠1mg A1β酪蛋白-BSA抗原和A2β酪蛋白-BSA抗原，方法同第二次免疫。1周后(融合前3天)，配制A1β酪蛋白多肽-BSA抗原和A2β酪蛋白多肽-BSA抗原生理盐水溶液，按每天每鼠1mg的剂量进行尾部静脉注射，连续三天。
免疫开始后第2、4、6周随机取一只免疫小鼠，眼眶取血，用A1β酪蛋白多肽-OVA抗原和A2β酪蛋白多肽-OVA抗原作为包被原以间接ELISA法检测抗血清效价。留取融合用免疫小鼠的抗血清，检测效价并作为阳性血清待用。取未免疫小鼠血清作为阴性血清。
2)细胞融合与阳性单克隆筛选
取血清效价高于106的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞，利用有限稀释法生成单克隆细胞株。
筛选A1酪蛋白单克隆抗体细胞株时，使用A1β酪蛋白多肽-OVA抗原和A2β酪蛋白多肽-OVA抗原同时作为包被原利用间接ELISA方法进行筛选，选择只和A1酪蛋白反应而不与A2酪蛋白反应的阳性细胞株进行克隆。
筛选A2酪蛋白单克隆抗体细胞株时，使用A1β酪蛋白多肽-OVA抗原和A2β酪蛋白多肽-OVA抗原同时作为包被原利用间接ELISA方法进行筛选，选择只和A2酪蛋白反应不与A1酪蛋白反应的阳性细胞株进行克隆。
3)单克隆抗体制备
预先用0.5ml/鼠液体石蜡注射于10～12周龄雌性BALB/c小鼠腹腔。一周后，将生长良好的杂交瘤细胞以4×105/ml的浓度注射于上述已经诱导的小鼠腹腔，每鼠0.5ml。大约8天后收获腹水。采用饱和硫酸铵-辛酸盐析纯化单克隆抗体，分装保存。
由上述步骤分别制得A1β酪蛋白单克隆抗体或A2β酪蛋白单克隆抗体。
四、A1和A2酪蛋白胶体金免疫层析试纸条的制备。
1、A1酪蛋白检测试纸条制备方法如下：
在反应膜2上的检测线5包被有A1β酪蛋白多克隆抗体，质控线6包被有羊抗小鼠抗体8。检测线5和质控线6上相应抗体的包被浓度均为1mg/mL，包被量均为0.5μL。
将样品吸收垫、反应膜2和吸水垫3固定在底板4上。
2、A2酪蛋白检测试纸条制备
在反应膜2上的检测线5包被有A2β酪蛋白多克隆抗体，质控线6包被有羊抗小鼠抗体8。将样品吸收垫、反应膜2和吸水垫3固定在底板4上。
如下为金标A1或A2酪蛋白单克隆抗体制备方法：
取100ml的胶体金，在磁力搅拌下，加纯化的抗体(A1β酪蛋白单克隆抗体或A2β酪蛋白单克隆抗体)2mg。混合搅拌反应5-10min，加PEG20000至0.05％终浓度，继续搅拌1小时；2000转/分离心20min，去沉淀。上清液12000转/分离心1小时，弃上清，沉淀用20mmol/LTBS胶体金洗涤液(pH8.2，含0.1％BSA 0.05/％NaN3)洗涤2次，最后沉淀用适量50mmol/LTBS胶体金保存液(pH7.4，含1％BSA0.05/％NaN3)溶解即为金标抗体工作液。金标抗体密封于4℃或室温保存。
单独设置一瓶金标抗体工作液，使用时将待测样品与金标抗体工作液结合后，再上样于样品垫上。在其他实施方式中，也可将金标抗体工作液均匀平铺到样品垫上，经过类真空环境2h干燥。
实施例2
本实施例提供了实施例1中的A1酪蛋白检测试纸条和A2酪蛋白检测试纸条的检测方法。
1、A1酪蛋白检测
将100μL牛奶样品(即为待检酪蛋白11)与50μL金标A1酪蛋白单克隆抗体孵育5分钟后，加入A1酪蛋白检测试纸条样品垫，观察反应膜2上检测线5显色情况(图2)。质控线6为红色，若检测线5显红色为阳性，不显色为阴性。
2、A2酪蛋白检测
将100μL牛奶样品与50μL金标A2酪蛋白单克隆抗体孵育5分钟后，加入A2酪蛋白检测试纸条样品垫，观察反应膜2上检测线5显色情况。质控线6为红色，检测线5显红色为阳性，不显色为阴性。
实验例1
本实验例采用实施例2的方法对实施例1制备的A1酪蛋白检测试纸条和A2酪蛋白检测试纸条进行特异性验证。
分别取经基因鉴定为A1A1型奶牛产的A1酪蛋白牛奶以及A2A2型奶牛产的A2A2型奶牛产的A2酪蛋白牛奶对试纸条的特异性进行检测。
结果如图3所示，1和2为A1酪蛋白检测试纸条。4和5为A2酪蛋白检测试纸条。
结果显示，A1酪蛋白试纸条在A1酪蛋白牛奶检测呈阳性，A2酪蛋白牛奶呈阴性；A2酪蛋白试纸条在A1酪蛋白牛奶检测呈阴性，A2酪蛋白牛奶呈阳性(图3)。表明本发明的试纸条具有非常好的特异性。
实验例2
本实验例进行试纸条的灵敏度实验。
取实施例1步骤(一)纯化的A1和A2酪蛋白稀释，分别配制1mg/mL，500μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、0μg/mL浓度，分别对应图4编号1-9，然后用各自试纸条进行检测，结果如图4所示，A为A1，B为A2试纸条检测结果。
结果可知，A1和A2试纸条检测各自系列稀释的酪蛋白溶液，20μg/mL蛋白样品均可以实现检测，因此试纸条灵敏度可以达到20μg/mL，具有良好的检测灵敏度。
实验例3
本实验例对市场牛奶样品中A2酪蛋白进行检测及验证。
分别取市场上普通牛奶样品1，普通牛奶样品2，A2牛奶样品3,A2牛奶样品4，A2牛奶样品5和A2牛奶样品6，用试纸条进行检测。
结果如图5所示。利用A1酪蛋白试纸条测试，表明2个普通牛奶中都含有A1酪蛋白，4个A2牛奶样品中有一个也含有A1蛋白。利用A2酪蛋白试纸条测试，表明2个普通牛奶中有1个普通牛奶样品中也含有A2酪蛋白，4个A2牛奶中均含有A2酪蛋白。
所有6份牛奶样品同时用市售的A1A2基因鉴定试剂盒进行检测，结果表明，样品1中A1和A2基因均检出，样品2只检出A1基因，样品3、4和6只检出A2基因，样品5同时检出A1和A2基因。与本发明A1A2酪蛋白试纸条检测结果一致，表明本发明试纸条结果可靠。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 一种酪蛋白多肽、多肽抗原、抗体、试纸条及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile His
1 5 10 15
Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln
20 25
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn
1 5 10 15
Ile Pro Pro Leu Thr
20

Claims (12)

1.一种酪蛋白多肽，其特征在于，其为A1β酪蛋白多肽或A2β酪蛋白多肽，所述A1β酪蛋白多肽的序列如SEQ ID NO.1所示，所述A2β酪蛋白多肽的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种多肽抗原，其特征在于，其包括载体蛋白和权利要求1所述的酪蛋白多肽，且所述载体蛋白与所述酪蛋白多肽偶联。
3.根据权利要求2所述的多肽抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、破伤风类毒素和细菌表达的蛋白中的任意一种载体蛋白或两种以上载体蛋白形成的融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的多肽抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.根据权利要求2所述的多肽抗原，其特征在于，所述载体蛋白与所述酪蛋白多肽通过偶联反应进行偶联。
6.根据权利要求5所述的多肽抗原，其特征在于，载体蛋白与所述酪蛋白多肽通过SPDP连接法进行偶联。
7.一种酪蛋白多克隆抗体，其特征在于，其由权利要求2-6任一项所述的多肽抗原免疫获得；A1β酪蛋白多克隆抗体或A2β酪蛋白多克隆抗体分别由A1β酪蛋白多肽与载体蛋白的偶联物或A2β酪蛋白多肽与载体蛋白的偶联物免疫获得。
8.一种如权利要求1所述的酪蛋白多肽、权利要求2-6任一项所述的多肽抗原或权利要求7所述的酪蛋白多克隆抗体在检测A1β酪蛋白和/或A2β酪蛋白中的应用。
9.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1所述的酪蛋白多肽。
10.如权利要求7所述的酪蛋白多克隆抗体在制备酪蛋白免疫层析试纸条中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述酪蛋白免疫层析试纸条包括样品垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上对应于所述样品垫具有如下任意一种的包被方式：
（1）所述检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白多克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白多克隆抗体；所述A1β酪蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，所述A2β酪蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）所述检测线上包被有权利要求7所述的A1β酪蛋白多克隆抗体或A2β酪蛋白多克隆抗体；
所述质控线上包被有二抗。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述酪蛋白免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上对应于所述样品垫具有如下任意一种的包被方式：
（1）所述检测线上包被有由A1酪蛋白制备的A1β酪蛋白多克隆抗体或由A2酪蛋白制备的A2β酪蛋白多克隆抗体；所述A1β酪蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，所述A2β酪蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）所述检测线上包被有由权利要求7所述的A1β酪蛋白多克隆抗体或A2β酪蛋白多克隆抗体；
所述质控线上包被有二抗。
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