CN116589578A - 一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体、试剂盒及其应用，涉及单域重链抗体技术领域。本发明提供的4株抗AMH纳米抗体对AMH抗原均具有特异的识别和结合能力，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。可应用于缪勒氏管激素的检测、富集和纯化，制备的试剂盒可以用于女性生殖诊断。

Description

一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及单域重链抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体、试剂盒及其应用。
背景技术
抗缪勒氏管激素(也称为AMH)是一种属于转化生长因子β(TGF-β)家族的二聚体糖蛋白。这一超级家族的所有成员都参与调节组织生长和分化。在分泌之前，激素经过糖基化和二聚化，生成大约140kDa前体的两个相同的二硫键的70kDa亚基。每个单体都含有一个大型N末端前区和一个小得多的C末端成熟域。与其他TGF-β家族成员相反，AMH被认为需要N-末端域增强C-末端域的活性，以得到完整的生物活性。
在男性中，AMH由睾丸的支持细胞分泌。在男性的胚胎发育中，睾丸支持细胞的AMH分泌负责缪勒氏管的衰退和男性生殖道的正常发育。支持细胞的AMH分泌在胚胎发生的过程中开始，并持续终生。AMH从睾丸中持续生成直至青春期，随后缓慢减少至青春期后水平。
在女性中，AMH在卵巢的卵泡发育中发挥重要作用。卵巢中的卵泡发育包括两个不同的阶段：起始招募阶段，此时初始卵泡开始成熟，并循环招募，促进一系列小囊状卵泡生长，随后选出其中的优势卵泡(排卵用)。FSH指导循环招募。粒层细胞中的AMH表达开始于初级卵泡，在腔前的粒层细胞中达到最高，且小窦状卵泡直径最大约为6mm。当卵泡生长开始依赖FSH，AMH表达消失且无法检测出。这种表达形式的AMH能够支持AMH在卵泡发育两个不同阶段的抑制作用。第一，AMH抑制卵泡从初始阶段转变为成熟阶段，进而在调节初始卵泡池中的剩余卵泡数量中发挥重要作用。第二，AMH能够抑制卵泡对FSH的灵敏度，因此在卵泡选择过程中发挥作用。
因此，AMH已经应用于女性生殖的各种领域，特别是与卵巢相关的领域。例如，循环中AMH的测定使得能够独立于周期来评估卵巢中存在的窦状卵泡和窦前期卵泡的数目。此外，作为卵巢储量自然衰减的指示并因此作为低能育性的固有风险的指示，AMH的测定指示用于帮助妇女管理他们的受孕计划。在辅助生殖技术的背景下，AMH的测定有助于通过特别地优化卵巢的受控刺激的步骤，同时避免过度刺激的风险来选择用于患者的最佳策略。AMH的测定还使得能够在例如癌症的情况下监测已经接受促性腺激素治疗的年轻女孩或妇女中卵巢储量的变化。对于具有排卵病症的妇女，确定血清AMH水平使得能够更好地表征卵巢功能紊乱的类型，特别是与卵巢功能不全相关的促性腺激素分泌过多的无排卵，例如多囊卵巢综合征。在年轻男孩中，AMH是由新生儿胎儿的睾丸以非常显著的量产生的，并因此在早期就参与男性生殖道的分化。因此，在与性别分化相关的病症的背景下，已经发现在青春期前的男孩中测定AMH是有用的。
基于AMH在女性生殖领域的诊断、治疗和预后方面所表现出的突出特性，研发出针对AMH的特异性结合抗体显得尤为重要。
针对AMH这一卵巢储备标志物，目前国外主要是有罗氏的电化学发光试剂盒问世，但是电化学发光存在交叉污染潜在问题，且对环境因素和其它非特异性反应过于敏感，同时电化学发光仪器及试剂完全依赖进口，价格非常昂贵，为患者带来一定的经济负担。另外生物梅里埃公司的酶联免疫法检测试剂盒，其存在检测线性范围较窄，灵敏度低，且检测费时等弊端。国产试剂盒有深圳爱康、深圳普门、国赛生物、康润生物的化学发光试剂盒，也有微点生物、天津华科泰等的免疫层析试剂盒，总体来说，都存在有检测灵敏度低的缺点。现有专利中，CN114609394A中提供了从杂交瘤细胞株得到抗AMH单克隆抗体的技术，但传统单克隆抗体的亲和力仍低于纳米抗体。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体、试剂盒及其应用，从而改善抗体的亲和力，提升试剂盒的检测灵敏度。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.9～11所示；
(2)如SEQ ID No.12～14所示；
(3)如SEQ ID No.15～17所示；
和(4)如SEQ ID No.18～20所示。
发明人筛选获得了4种纳米抗体，这4种纳米抗体对于缪勒氏管激素均具有优异的特异性抗原结合能力，且均具有较高的亲和力。可以用于开发缪勒氏管激素的检测产品、富集产品和纯化产品。将上述纳米抗体与免疫磁珠体系、化学发光体系相结合，可以开发磁微粒化学发光检测试剂盒。磁微粒化学发光技术既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫操作的简便、快速特点，易于自动化操作。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
名词解释：
单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。
多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。
在一种可选的实施方式中，当纳米抗体为单价纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
第二方面，本发明还提供了一种抗体，其含有上述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体或包括上述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体的重链可变区。
在一些实施例中，抗体可以为全长抗体、重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。抗原结合片段包括所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。
本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。
上述抗原结合片段也即抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体；
在一种可选的实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。
宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
在一种可选的实施方式中，真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；
在一种可选的实施方式中，动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
第五方面，本发明还提供了一种制备抗缪勒氏管激素的纳米抗体或制备上述抗体的方法，其包括：培养上述的宿主细胞。进而从培养产物中分离纯化得到上述纳米抗体或制备上述抗体。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成等)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明还提供了一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体或抗体在制备缪勒氏管激素检测产品、缪勒氏管激素富集产品或纯化产品中的应用。
基于前述的4种纳米抗体均具有与缪勒氏管激素较高的亲和力，因此可以用于缪勒氏管激素的检测、富集和纯化。
在一种可选的实施方式中，检测产品选自试剂、试剂盒或芯片。在一种可选的实施方式中，试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒。例如基于双抗体夹心法的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括检测抗体和捕获抗体。
在一种可选的实施方式中，缪勒氏管激素富集产品或纯化产品包括载体以及载体上的纳米抗体或抗体；
在一种可选的实施方式中，载体选自磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联纳米抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料，至于层析柱中从而制备相应的亲和柱，用于缪勒氏管激素富集或纯化。
第七方面，本发明还提供了一种包被有抗缪勒氏管激素的纳米抗体或抗体的纳米颗粒，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒中的任意一种。
例如抗缪勒氏管激素的纳米抗体或抗体的纳米颗粒为磁性纳米颗粒。
第八方面，本发明还提供了一种缪勒氏管激素检测试剂或试剂盒，其包括：抗缪勒氏管激素的纳米抗体或抗体。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中的纳米抗体或抗体标记有可被检测的标记物，和/或试剂盒包括纳米颗粒，且纳米颗粒包被有纳米抗体或抗体。
在一种实施方式中，包被有纳米抗体或抗体的纳米颗粒作为捕获抗体，标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体作为检测抗体。
在另外一种实施方式中，当试剂盒仅包括：标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体；此时的纳米抗体或抗体可用于捕获或检测抗体。
在一种可选的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱和过氧草酸盐中的至少一种。
胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示的纳米抗体为捕获抗体。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体包被于纳米颗粒上，检测抗体上标记有标记物。
SEQ ID NO.5所示的纳米抗体与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体分别针对AMH抗原不同的抗原表位，可以结合不同的抗原表位并扩大检测信号而获得更好的检测灵敏度，通过双抗夹心的方法，可以快速准确地完成AMH的捕获和检测。由此，组成的捕获-检测抗体对可以增大检测和诊断的效率。此外，本发明提供的检测试剂盒与罗氏AMH诊断试剂盒的检测值相关性较好，精密度在4％以下，灵敏度在0.01-0.012，性能良好。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体包被于磁性纳米颗粒上，检测抗体上标记有标记物。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的4株抗AMH纳米抗体对AMH抗原均具有特异的识别和结合能力，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。可应用于缪勒氏管激素的检测、富集和纯化，制备的试剂盒可以用于女性生殖诊断。
(2)本发明提供的4种抗缪勒氏管激素的纳米抗体与缪勒氏管激素具有良好的亲和力。
(3)本发明制备的检测试剂盒与罗氏AMH诊断试剂盒检测值相关性较好。
(4)本发明制备的检测试剂盒的精密度高。
(5)本发明制备的检测试剂盒的灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为4株AMH纳米抗体(3A5、1C6、4D7和2F4)的电泳图；
图2为AMH纳米抗体与抗原的结合情况；
图3为制备的AMH检测试剂盒(3A5-2F4)与罗氏AMH诊断试剂盒检测值的相关性。
图4为制备的AMH检测试剂盒(4D7-3A5)与罗氏AMH诊断试剂盒检测值的相关性。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例进行纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选。
1.羊驼免疫及淋巴细胞分离
选取健康成年羊驼一只，将重组AMH抗原与弗氏佐剂按1：1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。
2.总RNA提取和逆转录合成cDNA
RNA的提取参照TAKARA公司Total RNA提取试剂盒说明书进行。以RNA为模板，oligo-dT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。
3.抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物
序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μL。第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物。
4.载体构建
将pMES4与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果。
5.电转化及库容测定
取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG
6.噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10mL菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40mL管中，加入10mL PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1mL冰PBS洗涤离心，取上清250μL预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/mL))＝稀释倍数×噬菌斑数目×100。
7.纳米抗体筛选
通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μL噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。挑选ELISA鉴定结果为阳性的克隆摇菌抽质粒，送测序公司进行测序鉴定分析。
8.纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用His标签琼脂糖凝胶(上海翎因生物科技有限公司自产)进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、淋巴细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗AMH的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary DeterminingRegions，CDR)。
结果发现共有4种DNA序列，将这4个抗体按照其克隆编号命名分别为3A5、1C6、4D7和2F4，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
实施例2
本实施例进行纳米抗体的表达和纯化。
1.纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃200rpm过夜培养。次日，使用质粒抽提试剂盒(购自OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μL转化于100μL感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μL LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μL，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
2.纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100mL新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0mL TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5mL的上清(周质提取物)。
3.纳米抗体的纯化和鉴定
将以上样品使用His标签琼脂糖凝胶(上海翎因生物科技有限公司自产)进行纯化，使用20mM咪唑洗杂后，再使用300mM咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行SDS-PAGE电泳分析。电泳分析结果如图1所示，最后将纯化好的纳米抗体透析到PBS中，置于2～8℃保存待用。
实施例3
本实施例采用ELISA法验证AMH纳米抗体与AMH抗原的结合能力。
利用酶联免疫分析法(ELISA)对纯化的AMH纳米抗体进行抗原结合力测试。首先按照EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒的说明书，将纯化的AMH纳米抗体偶联上生物素。其次将AMH抗原(1μg/孔)包被在酶标板上，4℃过夜，用3％BSA封闭，室温孵育2h，用PBST清洗5次，每次1min。加入生物素化的纳米抗体(1μg/孔)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。再加入HRP偶联的链霉亲和素(1：10000)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min。最后加入100μL TMB显色液，室温避光显色20min。加入50μL 2M浓硫酸终止反应，在酶标仪上，测定450nm波长下的吸收值。
结果如图2所示。4株AMH纳米抗体都与AMH抗原有一定的结合能力，尤其是3A5和2F4的结合能力最强。
实施例4
本实施例进行AMH纳米抗体的ELISA叠加数据分析
1.抗原饱和浓度的确定
以2μg/mL的浓度包被AMH抗原，100μL/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体，阴性对照(阴性血清1:100)，PBS空白对照，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10min，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。
2.位点叠加实验
先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2*A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)*100％
A1—第一株抗体读数
A2—第二株抗体读数
A(1+2)—叠加2种抗体读数
表1抗体抗原表位叠加实验
1st抗体 2nd抗体 1st抗体+2nd抗体 叠加率
3A5+2F4 0.594 0.638 1.102 88.2％
3A5+1C6 0.594 0.451 0.782 66.4％
3A5+4D7 0.594 0.509 0.765 55.8％
2F4+1C6 0.638 0.451 0.614 22.6％
2F4+4D7 0.638 0.509 0.652 24.1％
1C6+4D7 0.451 0.509 0.515 13.6％
实验结果见表1，3A5与2F4、1C6、4D7三株纳米抗体分别针对AMH抗原不同的抗原表位，这预示着在AMH的检测应用上，该三组纳米抗体尤其是3A5+2F4组成的检测抗体对的几率大大增加，从而可以增大检测和诊断的效率。
实施例5
本实施例提供了抗AMH纳米抗体在磁微粒化学发光检测试剂盒的应用。
1.包被抗AMH纳米抗体磁珠的制备
量取一定量羧基磁珠(来源于上海翎因生物科技有限公司)，用pH为5.0的0.1M的MES缓冲液洗涤羧基磁珠，洗涤次数为2～3次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下活化30min，活化完成后，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用pH为5.0的0.1M的MES缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数3～4次；加入抗AMH纳米抗体进行包被，在室温下使用旋转混匀仪混匀，反应2h；包被反应结束后加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用含有3％BSA的封闭液(pH为7.2的0.1M的Tris-HCl)进行封闭3h以保存抗体包被磁珠，使入抗AMH纳米抗体包被磁珠的最终浓度为0.5mg/mL，于2-8℃保存备用。
2.吖啶酯标记抗AMH纳米抗体溶液的制备
量取一定量的吖啶酯(浓度为0.5mM)，再按照一定比例加入抗AMH纳米抗体，在旋转混匀仪上避光反应2h，再加入一定量的赖氨酸淬灭未反应的吖啶酯，后续使用脱盐柱去除吖啶酯，得到吖啶酯标记的抗AMH纳米抗体溶液，于2-8℃保存备用。
3.AMH系列校准品的配制
用0.01M PBS缓冲液(pH 7.2)加入3％牛血清白蛋白，再加入0.05％浓度的EDTA稳定剂以及0.2％Proclin-300配成校准品稀释液，用上述稀释液稀释AMH抗原配制成标示浓度为的30ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.2ng/mL、0.05ng/mL、0ng/mL的一系列校准品，于2-8℃保存备用。
4.AMH检测试剂盒性能测试
(1)相关性测试
搜集30份临床血清样本，理论值覆盖线性范围0.01～20ng/mL，用罗氏AMH诊断试剂盒及电化学发光分析仪，参照说明书条件测试。相同的阳性样本用自制的AMH检测试剂盒性能测试。25μL样本+25μL抗AMH纳米抗体包被磁珠+100μL吖啶酯标记抗AMH纳米抗体溶液(100倍稀释)，37℃反应15分钟，洗涤6次，加入每孔加入发光液A和发光液B各100μL，振荡混匀后测定发光信号值。记录测试结果，计算自配AMH检测试剂盒与罗氏AMH诊断试剂盒测试结果线性拟合相关性曲线方程及相关性系数R2。
参见图3，3A5(磁珠包被抗体)与2F4(吖啶酯标记抗体)配对所制备发光试剂测试结果与罗氏AMH诊断试剂盒检测值的线性拟合曲线为：y＝0.9778x-0.1556，R2＝0.9932，因此，本发明制备的AMH检测试剂盒与罗氏AMH诊断试剂盒检测值相关性较好。
参见图4，4D7(磁珠包被抗体)与3A5(吖啶酯标记抗体)配对所制备发光试剂测试结果与罗氏AMH诊断试剂盒检测值的线性拟合曲线为：y＝1.0375x-0.0029，R2＝0.9983，因此，本发明制备的AMH检测试剂盒与罗氏AMH诊断试剂盒检测值相关性较好。
(2)精密度测试
选择低值和高值两个水平的质控血清作为评价样本，测试上述3A5(磁珠包被抗体)与2F4(吖啶酯标记抗体)以及4D7(磁珠包被抗体)与3A5(吖啶酯标记抗体)配对的AMH检测试剂盒的性能。25μL样本+25μL抗AMH纳米抗体包被磁珠+100μL吖啶酯标记抗AMH纳米抗体溶液(100倍稀释)，37℃反应15分钟，洗涤6次，加入每孔加入发光液A和发光液B各100μL，振荡混匀后测定发光信号值。精密度：在较短的时间内及稳定的条件下连续重复测定10次，记录每次的测定结果并计算均值、标准差(SD)、变异系数(CV)。
结果如下表2和表3所示，结果显示，本发明制备的AMH检测试剂盒的精密度为3％以下，性能良好。
表2自制AMH检测试剂盒(3A5-2F4)精密度测试结果
表3自制AMH检测试剂盒(4D7-3A5)精密度测试结果
(3)灵敏度测试
选择0水平校准品(校准品稀释液)作为评价样本，测试上述3A5(磁珠包被抗体)与2F4(吖啶酯标记抗体)以及4D7(磁珠包被抗体)与3A5(吖啶酯标记抗体)配对的AMH检测试剂盒的性能。25μL样本+25μL抗AMH纳米抗体包被磁珠+100μL吖啶酯标记抗AMH纳米抗体溶液(100倍稀释)，37℃反应15分钟，洗涤6次，加入每孔加入发光液A和发光液B各100μL，振荡混匀后测定发光信号值。分析灵敏度(最低检出限)：重复测定0水平校准品(校准品稀释液)20次，记录每次的测定结果并计算均值(M)、标准差(SD)，将M+2SD带入标准曲线所得结果即为灵敏度。
结果如下表4所示，结果显示，本发明制备的AMH检测试剂盒(3A5-2F4)及(4D7-3A5)的灵敏度分别为0.010和0.012，性能良好。
表4自制AMH检测试剂盒(3A5-2F4)及(4D7-3A5)灵敏度测试结果
3A5-2F4 4D7-3A5
1 67.6 70.9
2 48.9 50.2
3 81.3 85.9
4 54.6 57.3
5 57.8 60.7
6 67.8 71.2
7 71.9 68.9
8 65.6 79.9
9 76.2 75.6
10 54.4 57.1
11 72.8 76.5
12 65.8 69.1
13 72.1 75.7
14 70.8 74.3
15 81.2 86.1
16 70.7 74.2
17 71.6 75.1
18 70.2 73.7
19 73.6 77.1
20 60.8 63.9
M 67.8 71.2
SD 8.7 9.4
M+2SD 85.2 89.9
回算浓度 0.010 0.012
实施例6
本实施例提供了AMH纳米抗体用于亲和纯化介质的制备和纯化步骤。
1.AMH纳米抗体磁珠的制备
量取一定量羧基磁珠(来源于上海翎因生物科技有限公司)，用pH为5.0的0.1M的MES缓冲液洗涤羧基磁珠，洗涤次数为2～3次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下活化30min，活化完成后，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用MES缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数3～4次；加入AMH纳米抗体进行偶联，在室温下使用旋转混匀仪混匀，反应2h；反应结束后加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用含有3％BSA的封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)进行封闭3h以保存AMH纳米抗体磁珠，使入AMH纳米抗体磁珠的最终浓度为10mg/mL，于2～8℃保存备用。
2.AMH纳米抗体琼脂糖凝胶的制备
量取一定量的CNBr活化的琼脂糖凝胶至相应规格的砂芯漏斗中抽干，加入2倍凝胶体积的0.01M HCl搅拌均匀后抽干，重复2-3次。再加入偶联缓冲液(PBS，pH7.2)搅拌混匀后抽干，重复2-3次，置于反应容器中，加入AMH纳米抗体(5mg抗体/g琼脂糖凝胶)，室温反应2h。反应结束后，用2倍凝胶体积的PBS洗涤两次，加入封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)室温反应3h以封闭未反应的活性基团。用2倍凝胶体积的PBS洗涤5次后，加入20％乙醇水溶液保存AMH纳米抗体琼脂糖凝胶，最终浓度为50％，于2～8℃保存备用。
3.AMH纳米抗体琼脂糖磁珠的制备
量取一定量的NHS活化的琼脂糖磁珠至反应容器中，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用MES缓冲液(0.1M，pH6.0)洗涤2次，去除上清。加入AMH纳米抗体(2mg抗体/mL琼脂糖磁珠)，室温反应2h。反应结束后，磁性分离，去除上清，加入封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)室温反应3h以封闭未反应的活性基团。用PBS洗涤5次后，加入20％乙醇水溶液保存AMH纳米抗体琼脂糖磁珠，最终浓度为50％，于2～8℃保存备用。
4.AMH纳米抗体亲和纯化介质用于亲和纯化
使用上述制备的AMH纳米抗体亲和纯化介质进行AMH蛋白的纯化。将AMH纳米抗体亲和纯化介质加入至层析柱中，流出保存液，使用PBS(pH7.2)清洗层析柱数次后，加入AMH蛋白样品溶液，置于旋转混匀仪孵育30～60min后，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。用5～10倍柱体积的PBS进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白后使用甘氨酸(pH2.2)洗脱特异性的AMH蛋白，收集洗脱液，即为纯化后的AMH蛋白溶液。
综上，本发明提供的4株抗AMH纳米抗体对AMH抗原具有特异的识别和结合能力，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。另外，本发明提供的抗AMH纳米抗体(3A5)在ELISA叠加实验中显示其与抗AMH纳米抗体(2F4)在抗原识别表位上具有较低的重叠性，且抗AMH纳米抗体(3A5)作为磁珠包被抗体，与作为吖啶酯标记抗体的抗AMH纳米抗体(2F4)配对使用，应用于磁微粒化学发光检测AMH的方法中显示了优异的检测性能。同时发现抗AMH纳米抗体(4D7)作为磁珠包被抗体，与作为吖啶酯标记抗体的抗AMH纳米抗体(3A5)配对使用，应用于磁微粒化学发光检测AMH的方法中也显示了优异的检测性能。该特性有助于本发明提供的纳米抗体应用于AMH磁微粒化学发光检测试剂盒的开发。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗缪勒氏管激素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个所述重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.9～11所示；
(2)如SEQ ID No.12～14所示；
(3)如SEQ ID No.15～17所示；
和(4)如SEQ ID No.18～20所示。
2.根据权利要求1所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括骨架区；
优选地，所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种；
优选地，当所述纳米抗体为单价纳米抗体时，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
3.一种抗体，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体或包括权利要求1或2所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体的重链可变区。
4.一种核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体；或所述核酸分子编码权利要求3所述的抗体；
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示。
5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的重组载体。
6.一种制备如权利要求1或2所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体或制备如权利要求3所述的抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞。
7.一种如权利要求1或2所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体或权利要求3所述的抗体在制备缪勒氏管激素检测产品、缪勒氏管激素富集产品或纯化产品中的应用；
优选地，所述检测产品选自试剂、试剂盒或芯片；优选地，所述试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒；
优选地，所述缪勒氏管激素富集产品或纯化产品包括载体以及载体上的纳米抗体或抗体；
优选地，所述载体选自磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。
8.一种包被有权利要求1或2所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体或权利要求3所述的抗体的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒中的任意一种。
9.一种缪勒氏管激素检测试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1或2所述的抗缪勒氏管激素的纳米抗体或权利要求3所述的抗体。
10.根据权利要求9所述的缪勒氏管激素检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的纳米抗体或抗体标记有可被检测的标记物，和/或所述试剂盒包括纳米颗粒，且所述纳米颗粒包被有所述纳米抗体或抗体；
优选地，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
优选地，所述化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱和过氧草酸盐中的至少一种；
优选地，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒；
优选地，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体；
优选地，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；所述捕获抗体包被于所述纳米颗粒上，所述检测抗体上标记有所述标记物；
优选地，以SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为检测抗体；所述捕获抗体包被于所述磁性纳米颗粒上，所述检测抗体上标记有所述标记物。
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