TWI589876B - Ｐｉｖｋａ－ii測定方法、測定試藥及測定套組 - Google Patents

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Description

PIVKA-II測定方法、測定試藥及測定套組
本發明係關於一種血清‧血漿關聯良好之PIVKA-II測定方法，以及PIVKA-II免疫測定試藥及套組。
PIVKA-II(Protein induced by vitamin K absence-II)係具有類似於與血液凝固相關之凝血酶原之構造之醣蛋白質。凝血酶原係622殘基之蛋白質，存在於N末端附近之10個麩胺酸(Glu)殘基受到γ-羧化而成為γ-羧基麩胺酸(Gla)殘基。已知於在活體內產生該凝血酶原時，起因於維生素K之缺乏、肝功能不全、維生素K拮抗劑之投予、肝細胞損傷等，γ-羧化變得不完全，而於血液中發現10個殘基中之全部或一部分成為Glu殘基之醣蛋白質。該蛋白質係亦稱為異常凝血酶原之PIVKA-II。近年來，報導有對於肝細胞癌患者，於血漿中檢測出高濃度之PIVKA-II，其作為肝細胞癌之標記物而被利用於診斷之監測器。
作為特異性地(specifically)檢測檢體中之PIVKA-II之方法，報告有如下免疫測定法：使用特異性地辨識PIVKA-II之單株抗體及針對凝血酶原之多株抗體兩者，將其中一者作為固定化抗體，將另一者作為標記抗體而進行測定(專利文獻1)。
於測定源自血液之樣品中之被檢物質之情形時，主要使用血清或血漿。根據被檢物質之性質或測定系統等，有時於自同一被 驗者獲得之血清‧血漿檢體對中，血清檢體與血漿檢體中之被檢物質之測定值不同，即血清‧血漿關聯較低，而只能利用血清及血漿樣品中之任一者進行測定。其於同時測定2種被檢物質之情形時尤其可能成為問題。例如於同時測定2種被檢物質時，於一者之被檢物質只能利用血清進行測定之情形時，若另一者之被檢物質亦可利用血清進行測定，則自患者採取之樣品僅為血清樣品即可。但是，於另一者之被檢物質只能利用血漿樣品進行測定之情形時，必須自患者採取血清與血漿兩者之樣品，而樣品獲取或處理需要勞力及時間，進而亦增加患者之負擔。因此，期待血清‧血漿關聯較高之測定系統之確立。
已知於利用ELISA法之PIVKA-II之測定中，於使用特異性地辨識PIVKA-II之單株抗體作為固相抗體，使用針對凝血酶原之多株抗體作為二次抗體之情形時，由於與凝血酶顯示出反應性之抗體包含於二次抗體中，而會對血清檢體之測定系統造成不良影響，無法獲得穩定之測定值(專利文獻2)。於專利文獻2中，為了解決此問題，報告有藉由使用不與人凝血酶反應而與人凝血酶原特異性地反應之抗體作為二次抗體，即便為血清檢體亦可穩定地測定PIVKA-II。然而，於專利文獻2中記載之方法，為了自針對人凝血酶原之多株抗體中去除針對凝血酶之抗體，必須於使用人凝血酶原親和管柱獲取與凝血酶原反應之抗體後進行透析，進而使用人凝血酶親和管柱獲取不與凝血酶反應之抗體並進行透析，抗體之精製步驟非常繁雜。又，即便於專利文獻2之方法中血清‧血漿關聯得以改善，亦期待進一步之改善。進而，由於多株抗體會產生由批次差所導致之變異，故而為了嚴密地確保特異性，一般而言單株抗體較多株抗體更為理想。於專利文獻2中，亦記載有於利用ELISA法之PIVKA-II測定法中，使用不與人凝 血酶反應而與人凝血酶原特異性地反應之單株抗體，但關於對使用此種單株抗體之情形時之血清‧血漿關聯之影響或問題並無任何記載。
於專利文獻3中，記載有如下免疫測定法：使用特異性地辨識PIVKA-II之單株抗體與針對凝血酶原之單株抗體兩者，將其中一者作為固定化抗體，將另一者作為標記抗體而進行測定。亦記載有關於混合使用PIVKA-II特異性單株抗體。然而，於專利文獻3中完全未記載免疫測定系統中之血清‧血漿關聯之問題，而專利文獻3記載之方法如何影響血清‧血漿關聯不明。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：日本專利特開昭60-60557公報
專利文獻2：日本專利特開平5-249108公報
專利文獻3：日本專利特開平9-43237公報
本發明之目的在於提供一種血清‧血漿關聯較習知法良好之PIVKA-II之測定手段。
本案發明人等反覆努力地進行關於PIVKA-II之測定之研究，結果發現：藉由使用將與人凝血酶原片段1特異性地結合之抗體及與人凝血酶原片段2特異性地結合之抗體混合而成之混合抗體作為免疫測定中之抗體，可較習知法大幅改善血清‧血漿關聯，從而完成本發明。
即，本發明提供一種PIVKA-II之測定方法，其包括：藉由使用與凝血酶原片段F1特異性地結合之抗F1抗體或其抗原結合性片段及與凝血酶原片段F2特異性地結合之抗F2抗體或其抗原結合性片段之混合物、及與PIVKA-II特異性地結合之抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段的免疫測定，而測定檢體中之PIVKA-II。又，本發明提供一種檢體中之PIVKA-II之免疫測定試藥，其包含與PIVKA-II特異性地結合之抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段、與凝血酶原片段F1特異性地結合之抗F1抗體或其抗原結合性片段、及與凝血酶原片段F2特異性地結合之抗F2抗體或其抗原結合性片段。進而，本發明提供一種檢體中之PIVKA-II之免疫測定套組，其包含上述本發明之免疫測定試藥。
根據本發明，可提供一種血清‧血漿關聯良好之PIVKA-II之測定方法，以及用於其之試藥及套組。本發明之方法較習知法進一步大幅改善血清‧血漿關聯，作為PIVKA-II測定方法實用性更高。
圖1係表示實施例1中製作之單株抗體對總長人凝血酶原(1)、F1區域(2)及F2區域(3)之反應性之圖表。
凝血酶原包含凝血酶原片段1(F1)區域、凝血酶原片段2(F2)區域、及凝血酶區域。PIVKA-II係由於N末端附近之10個Glu殘基之γ-羧化不完全，故而10個殘基之全部或一部分未變為Gla而保 持Glu之狀態之醣蛋白質，又，PIVKA-II亦包含凝血酶原片段1(F1)區域、凝血酶原片段2(F2)區域、及凝血酶區域。
序列編號1所示之胺基酸序列為PIVKA-II之胺基酸序列，44號~198號胺基酸之區域為凝血酶原F1區域，199號~314號胺基酸之區域為凝血酶原F2區域。將包含F1區域內之一部分之25號~88號胺基酸之區域稱為Gla區域。於凝血酶原中，序列編號1中之10個「Xaa」全部成為γ-羧基麩胺酸(Gla)殘基。該凝血酶原序列於GenBank中以寄存編號NP_000497登錄。序列編號2所示之鹼基序列係編碼序列編號1之PIVKA-II及NP_000497之凝血酶原之序列，於GenBank中以寄存編號NM_000506登錄。序列編號2中之44號~1912號鹼基之區域為編碼區域。
於本發明之測定方法中，使用抗F1抗體及抗F2抗體之混合物、及與PIVKA-II特異性地結合之抗PIVKA-II抗體進行夾層免疫測定。藉由使用抗F1抗體及抗F2抗體之混合物作為夾層法中之抗體之一者，可較理想地改善PIVKA-II測定值之血清‧血漿關聯。
抗F1抗體係與凝血酶原F1特異性地結合之抗體。即，其係於PIVKA-II之凝血酶原F1區域內具有抗原決定基，辨識該抗原決定基並與PIVKA-II結合之抗體。例如僅與凝血酶原或PIVKA-II之F1區域片段結合，而不與F2區域片段及凝血酶區域片段之任一者實質上結合之抗體係於F1區域內具有抗原決定基之「與凝血酶原F1特異性地結合之抗體」。此處所謂「不實質上結合」，意指不與F2區域片段及凝血酶區域片段之任一者於可檢測出之程度上結合(即與F2區域片段及凝血酶區域片段之結合為背景以下)，或即便於可檢測出之程度上結合，與其等之結合之程度亦明顯少於與F1區域片段之結合，而僅 於本領域從業者明瞭並非與F2區域片段或凝血酶區域片段結合之程度上結合。抗F1抗體可為可與PIVKA-II之F1區域結合，亦可與凝血酶原之F1區域結合之抗體，且可不具有對PIVKA-II分子之特異性(即不與凝血酶原結合，而僅與PIVKA-II結合之結合性)。
抗F2抗體係與凝血酶原F2特異性地結合之抗體。即，其係於PIVKA-II之凝血酶原F2區域內具有抗原決定基，辨識該抗原決定基並與PIVKA-II結合之抗體。例如僅與凝血酶原或PIVKA-II之F2區域片段結合，而不與F1區域片段及凝血酶區域片段之任一者實質上結合之抗體係「與凝血酶原F2特異性地結合之抗體」。此處所謂「不實質上結合」，意指不與F1區域片段及凝血酶區域片段之任一者於可檢測出之程度上結合(即與F1區域片段及凝血酶區域片段之結合為背景以下)，或即便於可檢測出之程度上結合，與其等之結合之程度亦明顯少於與F2區域片段之結合，而僅於本領域從業者明瞭並非與F1區域片段或凝血酶區域片段結合之程度上結合。F2區域之胺基酸序列於PIVKA-II及凝血酶原中均相同，因此，抗F2抗體通常為可與PIVKA-II之F2區域結合，亦可與凝血酶原之F2區域結合之抗體。
抗PIVKA-II抗體係僅與PIVKA-II結合，而不與凝血酶原實質上結合之抗體。
抗F1抗體、抗F2抗體及抗PIVKA-II抗體中之任一者可為單株抗體，亦可為多株抗體。就免疫測定之再現性等觀點而言，可較佳地使用單株抗體。又，該等抗體亦可以維持與對應抗原之結合性之抗體片段(抗原結合性片段)之形態使用。
多株抗體、單株抗體及抗原結合性片段之製作方法本身為周知之常法，抗F1抗體、抗F2抗體、抗PIVKA-II抗體及該等之抗 原結合性片段可依據常法製作。又，由於該等抗體亦存在市售品，故而亦可使用市售之抗體。
抗F1多株抗體例如可藉由將F1多肽或其部分片段與適當佐劑一同對動物(除人以外)進行免疫，由自該動物採取之血液獲得抗血清，並將該抗血清中之多株抗體進行精製而獲得。免疫係，為了使被免疫動物中之抗體效價上升，通常持續數周進行數次。抗血清中之抗體之精製係例如可藉由利用硫酸銨沉澱或陰離子層析法之分離、親和管柱精製等進行。抗F2多株抗體亦可將F2多肽或其部分片段作為免疫原同樣地製作。
抗F1單株抗體例如可藉由周知之融合瘤法製作。具體而言，可將F1多肽(F1區域片段)、凝血酶原、PIVKA-II或該等之部分片段與適當佐劑一同對動物(除人以外)進行免疫，自該動物採取脾細胞或淋巴球等之抗體產生細胞，使其與骨髓瘤細胞融合而製備融合瘤，選擇產生與F1多肽結合之抗體之融合瘤，使其增殖並自培養上清液中獲得抗F1單株抗體。抗F2單株抗體亦同樣，可藉由將F2多肽、凝血酶原、PIVKA-II或其部分片段作為免疫原，選擇產生與F2多肽結合之抗體之融合瘤而製作。
關於抗PIVKA-II抗體，多株抗體可使用羧化不完全之Gla區域部分片段作為免疫原而製作，但於本發明中，由於必須具有對PIVKA-II之充分之特異性，故而通常使用單株抗體。PIVKA-II單株抗體只要使用PIVKA-II或其部分片段(包含受到羧化之Gla區域之10殘基中之至少一部分之部分片段)作為免疫原，於製備融合瘤後，選擇產生與PIVKA-II結合但不與凝血酶原結合之抗體之融合瘤，並回收抗體即可。作為抗PIVKA-II抗體之製造方法之具體例，可列舉日本專利特 開昭60-60557公報、日本專利特開平9-249699公報中記載之方法。
「抗原結合性片段」只要維持原始抗體對於對應抗原之結合性(抗原抗體反應性)，則可為任何抗體片段。作為具體例，可列舉Fab、F(ab')2、scFv等，但並不限定於該等。Fab或F(ab')2係，如眾所周知，可藉由將單株抗體利用木瓜酶或胃蛋白酶之類之蛋白質分解酵素進行處理而獲得。scFv(single chain fragment of variable region，單鏈抗體)之製作方法亦為周知之方法，例如可將以上述之方式製作之融合瘤之mRNA抽出，而製備單鏈cDNA，並使用對免疫球蛋白H鏈及L鏈具有特異性之引子進行聚合酶連鎖反應(PCR，polymerase chain reaction)而使免疫球蛋白H鏈基因及L鏈基因放大，將該等利用連結子連結，賦予適當之限制酵素部位並導入至質粒載體中，利用該載體使大腸桿菌轉形而表現scFv，並將其自大腸桿菌回收，藉此獲得scFv。
用作免疫原之多肽或其部分片段可藉由化學合成、基因工程方法等常法製作。或者亦可自新鮮之人血漿等中將凝血酶原或PIVKA-II抽出‧精製而獲得(參照Thromb.Diath.Haemorph.1966；16：469-90等)。
作為化學合成法之具體例，例如可列舉Fmoc法(茀基甲氧羰基法)、tBoc法(第三丁氧羰基法)等。又，亦可利用各種市售之肽合成器藉由常法而合成。於化學合成之情形時，可僅基於胺基酸序列而合成所需之多肽。
利用基因工程方法之多肽之製作方法亦為周知之方法。具體而言，例如可藉由如下之方法製作。首先，由源自人之培養細胞等中抽出RNA，並藉由反轉錄反應由mRNA合成cDNA。將該cDNA作為模板，使用基於人凝血酶原之mRNA序列資訊而設計之引 子進行PCR，而製備編碼凝血酶原之總長或所需之一部分(F1區域或F2區域等)之聚核苷酸。用於PCR之引子可基於序列編號2所示之鹼基序列或GenBank等資料庫中所登錄之人凝血酶原序列資訊等而適當設計。或者，編碼所需之多肽之聚核苷酸亦可藉由使用市售之核酸合成器以常法而製備。由於編碼各胺基酸之密碼子為公知者，故而只要可特定出胺基酸序列，則亦可決定編碼該胺基酸序列之聚核苷酸之鹼基序列。其次，藉由將所製備之聚核苷酸編入適當之載體中，利用適當之表現系統使多肽表現，並將該多肽回收，可獲得所需之多肽。使用之載體或各種表現系統(細菌表現系統、酵母細胞表現系統、哺乳動物細胞表現系統、昆蟲細胞表現系統、無細胞表現系統等)亦為周知者，由於市售有各種載體或宿主細胞、試藥類、套組，故而若為本領域從業者則可適當選擇而使用。源自人之培養細胞(亦可由市售‧分售)，而容易獲取。
抗F1抗體與抗F2抗體之混合比率只要為可獲得PIVKA-II測定值之良好之血清‧血漿關聯之範圍內即可，並無特別限定，但以抗F1抗體：抗F2抗體=1：0.2~2、較佳為1：0.3~1.5、更佳為1：0.5~1.0之混合比率可獲得尤其良好之血清‧血漿關聯。如後述實施例所示，於僅使用抗F2抗體之情形時，血漿樣品之PIVKA-II測定值與血清樣品之測定值相比較高，無法獲得良好之血清‧血漿關聯。又，於僅使用抗F1抗體之情形時，血清樣品之PIVKA-II測定值與血漿樣品之測定值相比較高，無法獲得良好之血清‧血漿關聯。另一方面，藉由混合使用抗F1抗體與抗F2抗體，可改善血清‧血漿關聯。
夾層免疫測定本身為周知之常法。若列舉具體例，則有 化學發光酵素免疫測定法(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)、酵素結合免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)、放射免疫測定法、電化學發光免疫測定法等各種方法，於本發明中可使用任一方法。
於夾層測定系統中，通常使用2種抗體中之一者作為固定化於固相之固相抗體，使用另一者作為標記抗體。於本發明中，使用抗F1抗體/抗F2抗體混合物作為1種抗體，使用抗PIVKA-II抗體作為另1種抗體，但可使用任一者作為固相抗體。於下述實施例中，使用抗PIVKA-II抗體作為固相抗體，使用抗體混合物作為標記抗體，但並不限定於此。
以使用抗F1抗體/抗F2抗體混合物作為標記抗體之情形為例，對本發明之PIVKA-II測定方法進行具體說明。首先，將PIVKA-II抗體(固相抗體)固相化於載體。藉由使已固相化之PIVKA-II抗體與檢體中所含有之PIVKA-II接觸，而使固相抗體與PIVKA-II特異性地結合。其次，將未結合之檢體中之成分，例如載體藉由利用適當之緩衝液洗淨而去除後，使已利用標記物質標記之抗F1抗體/抗F2抗體混合物(即標記抗F1抗體與標記抗F2抗體之混合物)與結合於固相抗體之PIVKA-II結合。反應結束後，為了去除未反應之成分，例如將載體利用適當之緩衝液進行洗淨後，藉由適當之方法檢測出來自標記物質之訊號，而可測定檢體中所含有之PIVKA-II。
固相並無特別限定，可與公知之夾層免疫測定系統中所使用之固相同樣。作為固相之材質之具體例，可列舉聚苯乙烯、聚乙烯、瓊脂糖(sepharose)等，但並不限定於該等。固相之物理形狀本質上並不重要。使用之固相較佳為抗體對其表面之固定化容易，且可將測 定中所形成之免疫複合體與未反應之成分容易地分離者。尤佳為通常之免疫測定法中所使用之塑膠板或磁性粒子。就操作、保存、及分離之容易性等觀點而言，最佳為使用如上述之材質之磁性粒子。抗體對該等固相之結合可藉由本領域從業者所周知之常法進行。
標記物質亦無特別限定，可使用與公知之免疫測定系統中所使用之標記物質同樣者。作為具體例，可列舉酵素、螢光物質、化學發光物質、染色物質、放射性物質等。作為酵素，可使用鹼性磷酸酶(ALP)、過氧化酶、β半乳糖苷酶等公知者，但並不限定於此。為了提供較高之檢測感度之測定系統，較理想為使用ALP。
於使用酵素作為標記物質之情形時，藉由使對應於該酵素之顯色基質、螢光基質或發光基質等基質與該酵素進行反應，並測定其結果產生之訊號，可求出酵素活性而對測定對象物進行測定。例如於使用ALP作為標記物質之情形時，可使用3-(4-甲氧基螺(1,2-二氧雜環丁烷-3,2'-三環[3.3.1.13,7]癸烷)-4-基)苯基磷酸二鈉鹽(例如商品名AMPPD)等發光基質。
於使用生物素或半抗原作為標記物質之情形時，可使用結合酵素、螢光物質、化學發光物質、染色物質或放射性物質等而成之抗生蛋白鏈菌素或半抗原抗體等進行測定。
訊號之檢測係根據標記物質之種類而適當選擇。例如訊號若為顯色則可使用比色計或吸收光譜計，若為螢光則可使用螢光光譜計，若為發光則可使用光子計數器，若為放射線則可使用放射線測定裝置。對於以多種濃度含有PIVKA-II之濃度已知之標準試樣，藉由本發明之方法測定PIVKA-II，預先對來自標記之訊號之量與標準試樣中之PIVKA-II濃度之關聯關係進行繪圖而製作校準曲線，對PIVKA-II 濃度未知之檢體進行相同之測定操作並測定來自標記之訊號量，將測定值套用至該校準曲線，藉此可將檢體中之PIVKA-II定量。
本發明之方法所適用之檢體係自被檢者分離之檢體，較佳為血液檢體，尤佳為血漿或血清。根據本發明之測定方法，血漿檢體及血清檢體均可穩定地測定PIVKA-II。檢體亦可視需要適當稀釋而使用。
又，本發明提供一種檢體中之PIVKA-II之免疫測定試藥，其包含抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段(抗PIVKA-II抗體等)、抗F1抗體或其抗原結合性片段(抗F1抗體等)、及抗F2抗體或其抗原結合性片段(抗F2抗體等)。關於該免疫測定試藥，抗F1抗體等及抗F2抗體等可分別封入容器中，或者亦可預先混合並封入容器中。亦可進而含有對該等抗體或其抗原結合性片段之穩定化等有用之其他成分。又，該等抗體或其抗原結合性片段可為利用標記物質標記之形態，或固定化於板、粒子等固相之形態。
上述免疫測定試藥可與其他試藥類等適當組合，作為檢體中之PIVKA-II之免疫測定套組而提供。免疫測定所需之其他試藥類為周知者。例如於本發明之套組中，除上述免疫測定試藥以外，亦可進而包含檢體稀釋液、洗淨液、及於標記抗體所使用之標記物質為酵素之情形時該酵素之基質液等。
[實施例]
以下，藉由實施例對本發明進行具體說明。但本發明並不受該等實施例等限定。
實施例1.標記抗體之製作 (A)融合瘤之製作
將精製凝血酶原(藉由Shapiro S.et al.,The purification of human prothrombin.Thromb.Diath.Haemorph.1966；16：469-90中記載之方法由新鮮之人血漿精製而成者)於含有0.15M NaCl之10mM磷酸緩衝液(pH值7.3)中以最終濃度成為0.2~1.0mg/mL之方式進行稀釋，並與等量之弗氏完全佐劑(Freund's adjuvant)混合而製成油中水型乳膠。對7週齡之BALB/c系小鼠腹腔內投予該乳膠，以後每隔2週，將弗氏完全佐劑變更為弗氏不完全佐劑進行同樣之免疫2至3次。進而約2週後，將溶解於生理鹽水中之0.2~1.0mg/mL之精製凝血酶原100μL投予至腹腔內(最終追加免疫)。
於最終追加免疫後第3天，自該免疫動物無菌地摘出脾臟，利用剪刀製成切片進而使用篩網將脾臟拆散成各個細胞，利用RPMI-1640培養基洗淨3次並測量細胞數。將對數增殖期之小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8-U1以與上述同樣之方式洗淨後，調整為所測量之脾細胞數之1至1/10之細胞數，加入至容量50ml之離心管中並進行混合。進行200×g、5分鐘之離心分離，去除上清液，並添加聚乙二醇(PEG)1500(Merck公司製造)1ml進行細胞融合。其後，添加RPMI-1640培養基15ml進行聚乙二醇之稀釋。
對於融合細胞，藉由離心分離(200×g、5分鐘)去除PEG後，使用96孔板，於包含10%胎牛血清、次黃嘌呤、胺喋呤及胸苷(HAT)之RPMI-1640培養基中培養約10天而僅使融合瘤增殖。其後，取出培養上清液之一部分，藉由將精製凝血酶原用於固相化抗原之ELISA法，篩選分別產生凝血酶原抗體之孔，而獲得產生具有對凝血酶原之反應性之單株抗體之複數個融合瘤。對所獲得之融合瘤，依據常法之 極限稀釋法進行單一選殖化。
(B)單株抗體之製作
將藉由(A)中記載之方法所獲得之融合瘤於預先將姥鮫烷(pristane)0.5mL投予至腹腔之小鼠腹腔中每隻移植約1×107個，並獲取於腹水中逐漸產生之單株抗體。該單株抗體之精製係藉由利用結合有蛋白質A之瓊脂糖凝膠管柱(Bio-Rad公司製造)將IgG餾份進行分離而進行。
其次，分別將凝血酶原多肽、F1多肽及F2多肽固相化於微量滴定板，並對每個所獲得之單株抗體調查對於各多肽之反應性。即，分別將總長凝血酶原(Termo公司)、凝血酶原-片段1(Haematologic Technologies Inc.)、凝血酶原-片段2(Haematologic Technologies Inc.)利用0.1M磷酸緩衝液(pH值7.0)製備成5μg/mL之溶液。將該等抗原溶液100μL添加至微量板(Nunc公司，Maxisorp)之各孔中，於4℃下反應12~18小時後，去除抗原溶液，並將含有1%牛血清白蛋白(BSA，Bovine Serum Albumin)、0.1%疊氮化鈉之50mM Tris-HCl緩衝液(pH值7.2)300μL添加至各孔中。於室溫下靜置2小時後，藉由將微量板之未反應部位阻隔，並利用含有0.01%TritonX-100、0.03M NaCl之10mM Tris-HCl(pH值7.2)(以下記載為洗淨液)洗淨3次，而獲得各種多肽固相化板。製作單株抗體hPTN7-2、PT5-23及20B8之5μg/mL抗體溶液，並將該溶液100μL添加至將上述3種多肽(總長凝血酶原、凝血酶原-片段1、凝血酶原-片段2)固相化而成之微量板之各孔中，於室溫下反應1小時後，將抗體溶液捨棄，並利用洗淨液洗淨3次。將稀釋為一定濃度之鹼性磷酸酶標記抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research公司製造)100μL添加至各孔中，於室溫下反應1小時後，將標記抗體溶液捨棄，利用洗淨液洗淨3次，並添加含有作為顯色基質之10mM4-硝基苯磷酸、1mM氯化鎂之1M二乙醇胺-鹽酸緩衝液(pH值10.5)100μL進行顯色反應。於遮光下室溫靜置15分鐘後，添加含有50mM EDTA之0.1M磷酸緩衝液(pH值7.0)100μL停止反應後，利用微量板讀取器(Bio-Rad公司)測定450nm/630nm之吸光度。
將測定結果示於圖1。由於單株抗體hPTN7-2及PT5-23與凝血酶原多肽及F1多肽反應而不與F2多肽反應，故而確認為特異性地辨識F1之抗F1單株抗體。另一方面，由於單株抗體20B8與凝血酶原多肽及F2多肽反應而不與F1多肽反應，故而確認為特異性地辨識F2之抗F2單株抗體。
(C)標記抗體之製作
其次，取出3mg/mL之hPTN7-2抗體溶液6mL，添加至利用0.1M檸檬酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之G-25管柱(Pharmacia公司製造)中，進行抗體溶液之緩衝液置換。於其中添加1mg/mL胃蛋白酶溶液約100μL，於37℃下放置1小時，利用三羥甲基胺基甲烷緩衝液將pH值變為中性附近後添加至Superdex 200管柱(Pharmacia公司製造)中，進行抗體之凝膠過濾精製。將所獲得之分餾之吸光度280nm下之單峰混合，製成hPTN7-2抗體F(ab')2片段。於該F(ab')2片段溶液4mL中，添加0.2M 2-巰基乙胺(以下記為2-MEA)溶液200μL，於37℃下放置2小時，進行還原處理。將其添加至G-25管柱中並去除2-MEA，製成hPTN7-2抗體Fab'片段。
將10mg/mL之高比活性ALP溶液1.5mL添加至利用0.1M磷酸緩衝液(pH值7.0)平衡化之G-25中，進行ALP溶液之緩衝液置換。於其中添加10mg/mL之N-(4-馬來醯亞胺丁醯氧基)-丁二醯亞胺(以下記為GMBS)之二甲基甲醯胺溶液70μL，於30℃下放置1小時進行反應。將該溶液添加至利用0.1M磷酸緩衝液(pH值6.3)平衡化之G-25管柱中，去除過量之GMBS，而製作馬來醯亞胺化ALP。將之前製作之hPTN7-2抗體Fab'片段溶液4mL、馬來醯亞胺化ALP溶液3mL、及0.1M磷酸緩衝液(pH值6.3)13mL進行混合，於室溫下放置1小時，藉此製作ALP標記抗體。於其中添加2M之2-MEA溶液1mL，於室溫下放置30分鐘，將多餘之馬來醯亞胺基封端後，添加至Superdex 200管柱中進行精製。於吸光度280nm之若干峰中，將Fab'與ALP成為1：1之分子量之峰混合，製成精製ALP標記hPTN7-2抗體(ALP標記抗F1抗體)。對於PT5-23抗體及20B8抗體亦以同樣之方式製作精製ALP標記PT5-23抗體(ALP標記F1抗體)及精製ALP標記20B8抗體(ALP標記抗F2抗體)。
實施例2.測定資料 (D)PIVKA-II之測定
檢體係自同一健康被檢者獲得之人血清‧血漿(肝素鈉及EDTA-二鈉)檢體對。於測定時，除酵素標記抗體以外，使用附屬於Lumipulse Presto PIVKA-II衛材(FUJIREBIO公司製造)之試藥(抗體結合粒子、洗淨液)。
首先，於結合有與PIVKA-II特異性地結合之抗PIVKA-II單株抗體(小鼠)之抗體結合粒子(結合抗PIVKA-II單株抗體 (小鼠)之鐵磁粒子)50μL中添加檢體20μL並進行攪拌後，於37℃下反應8分鐘。藉由磁力自磁性粒子中分離去除反應殘液，並利用洗淨液進行洗淨。於洗淨後之粒子中添加(C)中所製作之ALP標記抗F1抗體(hPTN7-2抗體或PT5-23抗體)(最終濃度0.4μg/mL)與ALP標記抗F2抗體(最終濃度0.2μg/mL)並攪拌後，於37℃下反應8分鐘。又，作為比較例，使用ALP標記抗凝血酶原多株抗體作為酵素標記抗體。
其後，再次藉由磁力將磁性粒子與反應殘液分離去除，並利用洗淨液進行洗淨。於該粒子中添加包含鹼性磷酸酶之化學發光基質即3-(2'-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷醯氧基)苯基-1,2-二氧雜環丁烷‧二鈉鹽(AMPPD)之基質液200μL，於37℃下進行4分鐘酵素反應。利用照度計測定反應後之化學發光量。測定機器係使用全自動化學發光免疫測定裝置Lumipulse Presto II(FUJIREBIO公司製造)。
於表1中，表示使用ALP標記抗凝血酶原多株抗體作為酵素標記抗體，對9個血清‧血漿檢體對進行測定之結果。又，於表2中，表示使用ALP標記抗F1抗體(hPTN7-2抗體)與ALP標記抗F2抗體(20B8抗體)之混合物作為酵素標記抗體，對9個血清‧血漿檢體對進行測定之結果。其結果，如表1所示，於使用ALP標記抗凝血酶原多株抗體之情形時，肝素血漿中之血漿/血清比率平均約為79%，確認血清‧血漿關聯較低。另一方面，於以重量比2：1混合抗F1抗體與抗F2抗體作為ALP標記抗體之情形時，如表2所示，肝素血漿中之血漿/血清比率約為102%，EDTA血漿中之血漿/血清比率約為105%，於任一情形時血清‧血漿關聯均改善。
於表3中，表示使用PT5-23抗體代替hPTN7-2抗體作為抗F1抗體，使用ALP標記抗F1抗體(PT5-23抗體)與ALP標記抗F2抗體(20B8抗體)之2：1混合物作為酵素標記抗體，對10個血清‧血漿檢體對中之PIVKA-II進行測定之結果。即便於使用PT5-23抗體作為ALP標記抗F1抗體之情形時，藉由與ALP標記抗F2抗體混合使用，肝素血漿中之血漿/血清比率約為106%，EDTA血漿中之血漿/血清比率約為107%，確認於任一情形時均可獲得良好之血清‧血漿關聯。
(E)混合比之研究
對ALP標記抗F1抗體與ALP標記抗F2抗體之混合比率進行研究。如表4所示，於單獨添加抗F2抗體1.5μg/mL作為標記抗體之情形時，血漿/血清比率約為118%，於單獨添加抗F2抗體0.5μg/mL之情形時，血漿/血清比率非常高，約為127%。於單獨添加抗F1抗體1.5μg/mL作為標記抗體之情形時，血漿/血清比率成為非常低之結果，約為68%。如此，可知若單獨為抗F1抗體或抗F2抗體，則血清‧血漿關聯較低。另一方面，於混合抗F1抗體與抗F2抗體之情形時，於研究之比率2：1~1：2之全部中血漿/血清比率約98%~約110%，確認顯示出良好之血清‧血漿關聯。
<110> FUJIREBIO Inc. EIDIA Co.,Ltd.
<120> Method,reagent and kit for measurement of PIVKA-II
<130> PF489-PCT
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 622
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (57)..(57)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (63)..(63)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (68)..(68)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (69)..(69)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (72)..(72)
<223> Gla or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (75)..(75)
<223> Gla or Glu
<400> 1
<210> 2
<211> 2018
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2

Claims (11)

  1. 一種PIVKA-II之測定方法，其包括：藉由使用與凝血酶原片段1特異性(specific)地結合之抗F1抗體或其抗原結合性片段及與凝血酶原片段2特異性地結合之抗F2抗體或其抗原結合性片段之混合物、及與PIVKA-II特異性地結合之抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段的免疫測定，而測定檢體中之PIVKA-II，其中，上述抗F1抗體、上述抗F2抗體及上述抗PIVKA-II抗體為單株抗體。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，上述抗F1抗體係辨識F1區域內之抗原決定基並與PIVKA-II結合之抗體，上述抗F2抗體係辨識F2區域內之抗原決定基並與PIVKA-II結合之抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，上述免疫測定係藉由使用上述混合物作為標記抗體，使用上述抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段作為固相化抗體之夾層法而進行。
  4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中，上述免疫測定係藉由使用上述混合物作為標記抗體，使用上述抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段作為固相化抗體之夾層法而進行。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，上述混合物係以1：0.2~2之比率含有抗F1抗體與抗F2抗體之混合物。
  6. 如申請專利範圍第2項之方法，其中，上述混合物係以1：0.2~2之比率含有抗F1抗體與抗F2抗體之混合物。
  7. 如申請專利範圍第3項之方法，其中，上述混合物係以1：0.2~2之比率含有抗F1抗體與抗F2抗體之混合物。
  8. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，上述混合物係以1：0.2~2之比率含有抗F1抗體與抗F2抗體之混合物。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之方法，其中，上述檢體為血清或血漿。
  10. 一種檢體中之PIVKA-II之免疫測定試藥，其包含與PIVKA-II特異性地結合之抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段、與凝血酶原片段F1特異性地結合之抗F1抗體或其抗原結合性片段、及與凝血酶原片段F2特異性地結合之抗F2抗體或其抗原結合性片段，上述抗F1抗體、上述抗F2抗體及上述抗PIVKA-II抗體為單株抗體。
  11. 一種檢體中之PIVKA-II之免疫測定套組，其包含申請專利範圍第10項之免疫測定試藥。
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