CN111133008A

CN111133008A - Pivka的新结合剂和测定

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Publication number: CN111133008A
Application number: CN201880059264.0A
Authority: CN
Inventors: B.埃克特; M.格尔格; J.卡尔; M.考夫曼; J.里德林格; M.斯维亚特克-德兰格; L.希尔林豪斯; K.希尔策尔; M-R.利西
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2020-05-08
Also published as: US20230055005A1; BR112020000386A2; WO2019012019A1; JP2020526542A; JP7267253B2; US11466098B2; US20200140569A1; KR20200027522A; EP3652214A1

Abstract

本公开内容涉及与本领域中迄今已知的抗体相比结合不同的PIVKA‑II形式的特异性结合剂。

Description

PIVKA的新结合剂和测定

本公开内容涉及结合PIVKA-II的特异性结合剂，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽。还公开了一种用于测量羧化不足的（undercarboxylated）PIVKA-II的亚群的方法和基于这种特异性结合剂诊断HCC的方法。

发明背景

蛋白凝血酶原II（也称为因子II）在有维生素K的情况下进行合成后修饰，其中GLA结构域中的十个谷氨酸（GLA）残基被羧化为γ-羧基谷氨酸。羧化过程在患病状态中是异常的并且是不完全的。由于这种不完全的羧化，未形成成熟的凝血酶原，而是形成了PIVKA-II（由维生素K缺乏/拮抗剂诱导的蛋白质-II）。PIVKA-II是具有72 KDa分子量的大糖蛋白，且已知在肝细胞癌（HCC）患者的情况下升高（Liebman等人, The New England Journal ofMedicine (1984), 310 (22), 第1427-1431页；Fujiyama等人, Hepatogastroenterology(1986), 33, 第201-205页；Marreo等人, Hepatology (2003), 37, 第1114-1121页）。

肝癌是全世界第七大最常见的癌症，且也是第二大癌症死因。2012年的发病率和死亡率为每10万人中10.1和9.5。肝细胞癌（HCC）是全世界发生的原发性肝癌的主要组织学类型，占总负荷的70％至85％。对于早期诊断出的患者，可以通过切除、肝移植或射频局部消融治疗HCC。

标记物PIVKA-II被认为与HCC的早期诊断具有较重要的关系，并且已经开发了几种用于测量PIVKA-II的免疫测定。然而，由于十个不同的羧化位点存在并且可以被羧化或不被羧化的事实，并且由于各个谷氨酸残基逐步羧化为γ-羧基谷氨酸，所以存在非常多种所谓的“羧化不足”形式的PIVKA-II。

在具有维生素K-依赖性羧化的遗传性缺陷的患者（Goldsmith等人，J. Clin.Invest. 1982; 69, 1253-1260，Borowski等人，J. Biol. Chem. 1985; 260 (16): 9258-64）、HCC患者和在华法令疗法中的患者（Uehara等人，Clin. Chim. Acta 1999; 289 (1-2): 33-44）中，已经显示了几种部分羧化的凝血酶原变体。不同的羧化模式可能分别与凝血酶原的功能性和疾病的严重程度两者相关。

广泛研究了在Gla结构域（成熟凝血酶原的氨基酸1-46）内各个谷氨酸残基羧化为γ-羧基谷氨酸的顺序及其对凝血酶原功能的意义。Uehara等人（1999）显示人凝血酶原的10个Gla残基以一定顺序被羧化，从Gla残基26开始，后面是Gla残基25、16、29、20、19、14、32、7至6。另外，Gla 16在凝血酶原的功能性中起重要作用，在这个位点的羧化的丧失导致促凝剂活性和磷脂结合的缺乏（Borowski等人，J. Biol. Chem. 1986; 261 (32): 14969-75）。

在用于检测PIVKA-II的现有可商购的试剂盒中，主要应用抗-PIVKA-II单克隆抗体MU-3（Eidia和Fujirebio的PIVKA-II测定）。MU-3的表位位于氨基酸（AAs）17-27之间，位置19（Glu 19）和20（Glu 20）的谷氨酸残基是必不可少的，且位置25（Glu 25）的谷氨酸残基显著增加了这种抗体的结合（Motohara等人，Pediatr. Res. 1985; 19: 354–357，Naraki等人，Biochim. Biophys. Acta 2002; 1586: 287-298）。

IVD Abbott ARCHITECT PIVKA-II测定利用称为3C10的单克隆抗体。已经显示由这种抗体结合的表位与MU-3表位基本相同（Kinukawa等人，Clin. Biochem. 2015; 48(16-17): 1120-5）。

已比较了几种PIVKA-II的可商购测定。显示了WAKO DCP、Abbott ARCHITECTPIVKA-II、Sanko Junyaku和Eisai Picolumi PIVKA-II和Fujirebio PIVKA-II Lumipulse测定之间的高相关性（Passing-Bablok相关系数> 0.95）（Kinukawa等人，Clin Biochem.2015; 48 (16-17): 1120-5，并在PIVKA-II Lumipulse, Fujirebio；DCP-Assay, WAKO；Architect PIVKA-II, Abbott的各自的包装插页中）。因此，看来似乎所有这些测定都检测羧化不足的PIVKA-II的相同亚群（形式）。

Sekisui已经开发了基于两种单克隆抗体P11和P16的夹心式免疫测定（WO 2012/002345；Toyoda, H.等人，Cancer Science，103（2012）921-925）。这些单克隆抗体中的一种与PIVKA-II的N-末端氨基酸结合，而另一种看来似乎与PIVKA-II的氨基酸60至156内的某处结合。如几篇论文中所示的，基于这两种单克隆抗体的测定看来似乎与羧化不足的PIVKA-II形式的另一个亚群结合。

尽管所有可商购的PIVKA-II测定彼此良好地相关，但存在这样的问题和挑战，即，是否可以开发出检测不同于常规使用的测定的羧化不足的PIVKA-II亚群的测定，且如果是这样的话，这种测定是否可导致具有临床意义的结果。

现已令人惊讶地发现，与金标准单克隆抗体MU-3相比，可以开发和使用表现出不同结合性质的新单克隆抗体。这些新单克隆抗体的表位需要存在Glu 16，而Glu 25的存在不是这些新抗体的有效结合所需要的。尽管仅与可商购的PIVKA-II测定具有中等相关性，但令人惊讶地发现基于这些新抗体的夹心式免疫测定产生了具有临床意义的数据，尤其是关于在针对高临床灵敏度设定的截断值（例如，于90％）处改进的测定特异性。

发明概述

本发明公开了结合PIVKA-II的特异性结合剂，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽。

进一步公开了一种检测样品中的PIVKA-II的方法，所述方法包括以下步骤：a）使所述样品与结合PIVKA-II的特异性结合剂接触，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽；在足以形成特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件；和b）检测特异性结合剂-PIVKA-II复合体的存在，其中特异性结合剂-PIVKA-II复合体的存在表明所述样品中存在PIVKA-II。

还公开了一种检测样品中的PIVKA-II的方法，其包括以下步骤：a）使所述样品与PIVKA-II的第一特异性结合剂和PIVKA-II的第二特异性结合剂接触，所述PIVKA-II的第一特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和b）测量在（a）中形成的复合体，从而检测所述样品中的PIVKA-II。

还公开了一种检测样品中的PIVKA-II的方法，其包括以下步骤：a）使所述样品与结合PIVKA-II的特异性结合剂接触，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽；在足以形成特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件；b）将PIVKA-II的第二特异性结合剂添加至所述第一特异性结合剂-PIVKA-II复合体，其中所述第二特异性结合剂结合PIVKA-II上不是SEQ ID NO：1的一部分的表位，且被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和c）测量在（b）中形成的复合体，从而检测样品中PIVKA-II的存在。

还公开了一种在怀疑患有HCC的患者中诊断HCC的方法，其包括以下步骤：a）从所述患者获得样品；b）使所述样品与PIVKA-II的第一特异性结合剂和PIVKA-II的第二特异性结合剂接触，所述PIVKA-II的第一特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ IDNO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；c）测量在（b）中形成的复合体，从而测量所述样品中存在的PIVKA-II的量，其中大于参考水平的PIVKA-II的量指示患者中HCC的存在。

进一步公开了一种在怀疑患有HCC的患者中诊断HCC的方法，其包括以下步骤：a）从所述患者获得样品；b）使所述样品与结合PIVKA-II的特异性结合剂接触，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽；在足以形成特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件；c）将PIVKA-II的第二特异性结合剂添加至所述第一特异性结合剂-PIVKA-II复合体，其中所述第二特异性结合剂结合PIVKA-II上不是SEQ ID NO：1的一部分的表位，且被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；d）测量在（c）中形成的复合体，从而测量所述样品中存在的PIVKA-II的量，其中大于预定水平的PIVKA-II的量指示患者中HCC的存在。

进一步公开了结合PIVKA-II的特异性结合剂在测量PIVKA-II中的用途，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，以及包括这种特异性结合剂的用于检测和/或定量样品中PIVKA-II的量的试剂盒。

发明详述

本公开内容涉及结合PIVKA-II的特异性结合剂，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个（a）”、“一种（an）”和“该（the）”包括复数对象，除非内容另外明确指示。

前凝血酶原（SEQ ID NO：5）在细胞内合成，并通过切割掉前43个N-末端氨基酸（信号肽和前肽序列→SEQ ID NO：6）且通过凝血酶原多肽位置6、7、12、14、16、19、20、25、26和31的谷氨酸残基的γ-羧化加工成（“成熟的”）凝血酶原。在循环中，且随着时间的过去，凝血酶原也被降解成多种降解产物。关于羧化不足的检测特别重要的是那些凝血酶原切割（降解）产物，其至少包含所谓的GLA-结构域（SEQ ID NO：7）。具有较重要的关系的凝血酶原切割产物分别是所谓的F1/F2-片段（SEQ ID NO：8）和所谓的F1-片段（SEQ ID NO：9）。

SEQ ID NO：1的肽序列对应于前凝血酶原（SEQ ID NO：5）的氨基酸位置55至70，即，对应于（羧化不足的和“成熟”的）凝血酶原的氨基酸位置12至27。在SEQ ID NO：1的肽中，并非所有谷氨酸残基都被γ-羧化。因此，SEQ ID NO：1的合成肽对应于并模拟在位置19未被γ-羧化并且分别在位置20和25也未被γ-羧化的PIVKA-II形式。

SEQ ID NO：2的肽序列也对应于前凝血酶原（SEQ ID NO：5）的氨基酸位置55至70，即，对应于（部分羧化的）凝血酶原的氨基酸位置12至27。SEQ ID NO：2的肽包含对应于在成熟凝血酶原的位置19的γ-羧化谷氨酸的γ-羧化谷氨酸。换句话说，这个肽对应于并模拟在位置19（但分别都不在位置20和25）被γ-羧化的PIVKA-形式。

SEQ ID NO：3的肽序列也对应于前凝血酶原（SEQ ID NO：5）的氨基酸位置55至70，即，对应于（部分羧化的）凝血酶原的氨基酸位置12至27。SEQ ID NO：2的肽包含对应于在成熟凝血酶原的位置25的γ-羧化谷氨酸的γ-羧化谷氨酸。换句话说，这个肽对应于并模拟在位置25（但分别都不在位置19和20）被γ-羧化的PIVKA-II形式。

如技术人员将理解的，SEQ ID NO：1的肽对应于前凝血酶原（SEQ ID NO：5）的氨基酸位置55至70，即，对应于非羧化的凝血酶原的氨基酸位置12至27。这个序列以及跨越相同氨基酸序列段的部分γ-羧化的序列（SEQ ID NO：2、3或4）包含两个半胱氨酸残基。在根据本公开内容选择的合成条件下，已经注意两个半胱氨酸被氧化并形成胱氨酸桥（cystinebridge）。因此，在本文使用/公开和/或在序列表中提及的分别包含SEQ ID NOs：1、2、3和4以及SEQ ID NOs：32、33和34的序列的所有合成肽中，两个半胱氨酸残基被氧化以形成胱氨酸桥。

在一个实施方案中，结合PIVKA-II的特异性结合剂是分离的结合PIVKA-II的特异性结合剂。“分离的”特异性结合剂，例如分离的抗体，是已经被鉴定且从其自然环境的组分分离和/或回收的一种。其自然环境中的污染物组分是将与关于所述特异性结合剂（例如，抗体）的研究、诊断或治疗用途相干扰的材料，且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将特异性结合剂纯化（1）至大于90重量％，如通过例如Lowry方法所测定的，且在一些实施方案中至大于95重量％；（2）至足以通过使用例如旋杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或（3）至通过在还原或非还原条件下使用例如考马斯蓝或银染色剂的SDS-PAGE的同质性。

通常，分离的特异性结合剂例如分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备，例如使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。

术语“特异性结合剂”是指与靶特异性结合的天然或非天然分子。特异性结合剂的实例包括但不限于蛋白质、肽和核酸。在某些实施方案中，特异性结合剂是抗体或核酸。在某些实施方案中，特异性结合剂是抗体。在某些实施方案中，特异性结合剂包含抗体的抗原结合区。术语靶和抗原可以互换使用。在一个实施方案中，靶是抗原，且特异性结合剂是抗体。特异性结合剂对其相应的靶分子具有至少10⁷ l/mol的亲和力。特异性结合剂在一个实施方案中对其靶分子具有至少10⁸ l/mol或更高的亲和力，或在进一步的实施方案中对其靶分子具有至少10⁹ l/mol或更高的亲和力。

在一个实施方案中，本文公开的特异性结合剂选自抗体或适配体。

在一个实施方案中，特异性结合剂是也称为适配体的特异性结合核酸。

术语“适配体”是指识别并结合多肽的核酸。适配体可以通过选择方法例如SELEX（参见例如 Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50；Klug和Famulok (1994) M.Mol. Biol. Rep., 20, 97-107；US 5,582,981）从一大批不同的单链RNA分子分离。适配体也可以以其镜像形式合成和选择，例如作为L-核糖核苷酸（Nolte等人 (1996) Nat.Biotechnol., 14, 1116-9；Klussmann等人 (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5）。已以后一种方式分离的形式具有的优点是它们不被天然存在的核糖核酸酶降解，且因此具有更大的稳定性。

在本发明的上下文中，术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短多聚体。它具有与蛋白质相同的化学（肽）键，但长度通常较短。最短的肽是二肽，由通过单个肽键连接的两个氨基酸组成。也可以有三肽、四肽、五肽等。一般，肽具有最多到4、6、8、10、12、15、18或20个氨基酸的长度。除非其是状肽，否则肽具有氨基端和羧基端。

在本发明的上下文中，术语“多肽”是指通过肽键结合在一起的氨基酸的单线性链，并且一般包含至少约21个氨基酸，即，至少21个、22个、23个、24个、25个等氨基酸。多肽可以是由不止一条链组成的蛋白质的一条链，或者如果蛋白质由一条链组成，则它可以是蛋白质本身。

在肽的上下文中的术语“合成的”对本领域技术人员而言是完全清楚的，并且仅用于表示所述肽不是已从天然来源分离的，而是已通过体外化学合成获得的。

术语“结合偏爱”或“结合偏爱”表示其他条件都可比较时，两种可供选择的抗原或靶中的一种比另一种更好地结合。根据本公开内容的特异性结合剂与SEQ ID NO：1的肽强有力地结合，而与SEQ ID NO：2的肽较少结合。与这两种肽以及与其他肽如例如SEQ ID NO：3的特异性结合如实施例3中所述进行评估。简单地说，使用包含待分析的序列的生物素化的肽。在实施例3的测定条件下对它们进行评估，并将对所分析的每种（生物素化的）肽获得的信号（计数）与用包含SEQ ID NO：1的生物素化的肽获得的信号进行比较。

如本文所公开的PIVKA-II的特异性结合剂满足至少以下两个标准：a）比起SEQ IDNO：2来以至少10-倍优先结合SEQ ID NO：1，以及b）与SEQ ID NO：1的肽一样好或更好地结合SEQ ID NO：3的肽。换句话说，且与MU-3抗体和本领域已知的类似抗体不同，本发明的特异性结合剂与或者不包含PIVKA-II的谷氨酸位置25或者与PIVKA-II位置25的谷氨酸的羧化存在或不存在无关的表位结合。

如技术人员将完全理解的，如同其他任何实验一样，对结合强度或结合偏爱的实验评估易发生一些变化。这种变化可以例如导致信号强度的正/负20％。因此，这种变化在绝对数给定的范围内，例如，50％必须被理解为从40％一直到60％。相应地，可以确认被发现与另一种靶的结合一样好地与一种靶的比较结合（即100％），如果这种比较产生的结果在80％到120％的范围内的话（对于靶一的信号除以对于靶二的信号且乘以100）。在一个实施方案中，如实施例3中所公开的评估根据本发明的结合剂的结合性质。表述“至少一样好地结合”是指特异性结合剂以相等或更大的结合亲和力结合。以同样的方式，“至少10-倍的结合偏爱”是指以至少10-倍的更大亲和力结合。

本公开内容还涉及结合PIVKA-II的分离的特异性结合剂，其特征在于其结合SEQID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少15-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽。

在一个实施方案中，本发明涉及本公开内容，本公开内容涉及结合PIVKA-II的特异性结合剂，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQID NO：3的合成肽，其进一步特征在于与SEQ ID NO：4的肽相比，具有对SEQ ID NO：1的肽的结合偏爱。换句话说，在这个实施方案中，与在位置19具有谷氨酸但在位置20具有γ-羧基谷氨酸的肽相比，PIVKA-II的特异性结合剂与在对应于PIVKA-II的氨基酸19和20的两个位置上都具有谷氨酸残基的肽更好地结合。然而，与在位置20的γ-羧基谷氨酸相比，与在位置20的谷氨酸有关的结合偏爱到目前为止不如同现有技术的结合剂（即，如MU-3抗体）一样明显。

在一个实施方案中，根据本公开内容的特异性结合剂是抗体。

在一个实施方案中，如本文所公开的特异性结合剂是单克隆抗体。

抗体的总结构在本领域中是众所周知的，并且包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。重链和轻链各自由一个恒定结构域和一个可变结构域组成。形成抗体的轻链和重链的可变结构域提供了对抗原的结合特异性。更具体地，将决定其特异性并与具体配体接触的抗体部分称为互补性决定区（CDRs）。CDRs是分子中变化最大的部分，并且有助于这些分子的多样性。每个可变结构域中都有三个CDR区CDR1、CDR2和CDR3，嵌入4个构架区（FW）中。如本文所用的，CDR-HC（或CDR（HC））描绘了可变重链的CDR区，且CDR-LC（或CDR（LC））涉及可变轻链的CDR区。类似地，FW-HC（或FW（HC））描绘了可变重链的构架区，且FW-LC（或FW（LC））涉及可变轻链的构架区。

如根据本发明所使用的术语“包含”表示除明确叙述的序列和/或组分之外可以包括进一步的序列/组分。然而，这个术语还包含所请求保护的主题恰好由所叙述的序列和/或组分组成。

在那些本发明的抗体包括不止所叙述的氨基酸序列的实施方案中，在N-末端或C-末端或这两个末端可以存在额外的氨基酸延伸。额外的序列可以包括例如引入的序列，例如用于纯化或检测，如下文详细讨论的。此外，在各个序列“包含”所叙述的序列的场合，它们还可以在N-末端或C-末端或这两个末端包括额外的氨基酸。

在本发明的上下文中，术语“抗体”涉及完全的免疫球蛋白分子及其抗原结合片段，如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv。此外，所述术语涉及修饰和/或改变的抗体分子，以及重组或合成产生/合成的抗体。术语“抗体”还包括双功能抗体、三功能抗体、完全人抗体、嵌合抗体和抗体构建体，如单链Fvs（scFv）或抗体融合蛋白质。

如本文所用的“Fab片段”包含一条轻链和一条重链的C_H1以及可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab'片段”含有一条轻链和一条含有V_H结构域和C_H1结构域亦及C_H1和C_H2结构域之间的区域的重链的一部分，从而使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')₂分子。“F(ab')₂片段”含有两条轻链和两条含有C_H1和C_H2结构域之间的恒定区的一部分的重链，从而使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')₂片段由两个Fab'片段组成，所述两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键结合。

Fab/c片段含有Fc和Fab决定簇（determinant）两者，其中“Fc”区含有两个重链片段，其包含抗体的C_H2和C_H3结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过C_H3结构域的疏水作用结合。

“Fv区”包含来自重链和轻链两者的可变区，但是缺乏恒定区。“单链Fvs”（也缩写为“scFv”）是在本发明的上下文中具有抗体的V_H和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽在V_H和V_L结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所期望的结构。例如在Plückthun于The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag, N.Y. 113 (1994),269-315中描述了产生单链抗体的技术。

如本文所用的术语“完全人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。然而，如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可能含有鼠碳水化合物链，或者如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在衍生自大鼠细胞的杂交瘤中产生，则其可能含有大鼠碳水化合物链。类似地，如果在仓鼠中、在仓鼠细胞如例如CHO细胞中或在衍生自仓鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可能含有仓鼠碳水化合物链。另一方面，“小鼠抗体”或“鼠抗体”是仅包含小鼠（鼠）免疫球蛋白蛋白质序列的抗体，而“大鼠抗体”或“兔抗体”是分别仅包含大鼠或兔免疫球蛋白序列的抗体。如同完全人抗体一样，这种鼠、大鼠或兔抗体可能含有来自其他物种的碳水化合物链，如果在这种动物或这种动物的细胞中产生的话。例如，如果抗体在仓鼠细胞如例如CHO细胞中或在衍生自仓鼠细胞的杂交瘤中产生，则所述抗体可能含有仓鼠碳水化合物链。完全人抗体可以例如通过噬菌体展示来产生，所述噬菌体展示是广泛使用的筛选技术，其使得能够产生和筛选完全人抗体。在本发明的上下文中也可使用噬菌体抗体。噬菌体展示方法描述于例如US 5,403,484、US 5,969,108和US 5,885,793中。使得能够开发完全人抗体的另一种技术涉及对小鼠杂交瘤技术的改良。使小鼠成为转基因的以含有人免疫球蛋白基因座来替换其自身的小鼠基因（参见，例如，US 5,877,397）。

术语“嵌合抗体”是指包含与来自另一人或非人物种（例如，小鼠、马、兔、狗、牛、鸡）的抗体区域（例如，恒定区）融合或嵌合的人或非人物种的可变区的抗体。

如上文所提及的，术语“抗体”也包括抗体构建体，例如抗体融合蛋白质，其中所述抗体除了本文中由具体氨基酸序列定义的结构域以外，包含一个或多个额外的结构域，例如，用于分离和/或制备重组产生的构建体。

可以产生本发明的抗体，从而使得它是重组抗体，例如重组人抗体，异种抗体或异杂合抗体（hetero-hybrid antibody）。术语“重组（人）抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有（人序列）抗体，例如从对人免疫球蛋白基因转基因的动物（例如，小鼠）分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区（如果存在的话）。然而，这种抗体可以经受体外诱变（或，当使用对人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），且因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管衍生自人种系V_H和V_L序列并与之相关，但可能不在体内天然存在于人抗体种系谱（repertoire）中。

“异种抗体”是相对于产生这种抗体的转基因非人生物进行定义的。这个术语是指具有对应于在不是所述转基因非人动物的生物中发现的且通常来自于不同于所述转基因非人动物的物种的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体。

术语“异杂合抗体”是指具有起源于不同生物的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异杂合抗体。异杂合抗体的实例包括嵌合和人源化抗体。

用于与PIVKA-II或相应的合成肽结合的抗PIVKA-II的现有技术抗体，如MU-3，强烈地依赖于位置20中谷氨酸的存在（并且部分地依赖于位置25处谷氨酸的存在）。如果γ-羧基谷氨酸存在于位置20，则那些现有技术的抗体几乎不显示与这种肽和十之八九与在位置20被γ-羧化的相应的PIVKA-II形式的任何结合。然而，并且完全不同的是，本文公开的抗体小得多地依赖于位置20中谷氨酸的存在。在一个实施方案中，本发明涉及如上文所定义的特异性结合剂，其进一步特征在于与SEQ ID NO：1相比，与SEQ ID NO：4的相对结合在40％至小于80％的范围内，并且在进一步的实施方案中，在50％至80％的范围内。

因此，本发明涉及与PIVKA-II特异性结合的抗体，其特征在于，其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，其中所述抗体进一步特征在于，CDRs包含以下氨基酸序列或每个CDR在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体：

（i）在轻链可变结构域中的包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR3，以及在重链可变结构域中的包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3；

（ii）在轻链可变结构域中的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR3，以及在重链可变结构域中的包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3；

（iii）在轻链可变结构域中的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO：11的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR3，以及在重链可变结构域中的包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3；或

（iv）在轻链可变结构域中的包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR3，以及在重链可变结构域中的包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3。

根据本发明的抗体包含轻链CRDs和重链CRDs的四个所述组合（i）至（iv）之一。向其中并入CDRs的各个可变结构域的周围构架序列可以由技术人员在没有进一步费力的情况下选择。例如，可以使用以下进一步描述的构架序列或在所附实施例中采用的具体构架序列。

根据本发明，CDRs可包含明确叙述的序列或可以由此每个CDR在最多一个氨基酸取代方面不同。因此，每个CDR中的一个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。将理解的是，还包括氨基酸取代存在于一条链或一种抗体的一些但不是全部CDRs中。

根据本发明，术语“取代”是指氨基酸被另一种氨基酸置换。因此，氨基酸总数目保持相同。术语“取代”明确地不包括分别在某个位置的氨基酸的缺失或在不同位置的一个（或多个）氨基酸的引入。

在一个实施方案中，根据本发明，取代是保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有拥有相似化学性质（例如，电荷或疏水性）的侧链（R基团）的另一种氨基酸残基取代的情况。通常，保守的氨基酸取代将基本上不改变蛋白质的功能性质。这种相似性包括，例如，所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质中的相似性。在一个实施方案中，保守的氨基酸取代是包含在以下组之一中的一种氨基酸对另一种氨基酸的取代：（i）非极性（疏水）氨基酸，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；（ii）极性中性氨基酸，包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；（iii）带阳电荷的（碱性）氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和（iv）带阴电荷的（酸性）氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。

在一个实施方案中，本发明涉及与PIVKA-II特异性结合的抗体，其特征在于，其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，其中所述抗体进一步特征在于，CDRs包含以下氨基酸序列或每个CDR在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，以重链可变结构域的CDR3由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成为条件：

在一个实施方案中，CDRs包含以上明确叙述的序列，即，没有任何氨基酸变异。

重链和轻链两者的轻链可变区/结构域/序列分别包含决定抗体特异性的CDRs和“将CDRs保持在应有的位置”的更通用的构架区。

轻链可变结构域/序列由如式I中所表示的构架区（FWs）和CDRs组成：

FW(LC)1 – CDR(LC)1 – FW(LC)2 – CDR(LC)2 – FW(LC)3 – CDR(LC)3 – FW(LC)4（式I）。

重链可变结构域/序列由如式II中所表示的FWs和CDRs组成：

FW(HC)1 – CDR(HC)1 – FW(HC)2 – CDR(HC)2 – FW(HC)3 – CDR(HC)3 – FW(HC)4（式II），

式I中所示的一级结构表示了本发明的抗体的轻链可变结构域的组分从N-末端到C-末端的顺序。式II中所示的一级结构表示了本发明的抗体的重链可变结构域的组分从N-末端到C-末端的顺序。在每种情况中，构架区（FW）1表示相应的可变链结构域的最N-末端部分，而FW 4表示相应的可变链结构域的最C-末端部分。

一旦如本公开内容中那样给出了全长可变链序列和其中包含的CDRs的序列，技术人员就可以完美地推断出每个FW-区的序列。

此外，本公开内容涉及特异性结合PIVKA-II的抗体，其特征在于其结合SEQ IDNO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，其中所述抗体进一步特征在于其包含：

（i）SEQ ID NO：16的轻链可变序列，包含SEQ ID NO：10的CDR1、SEQ ID NO：11的CDR2和SEQ ID NO：12的CDR3，以及SEQ ID NO：17的重链可变序列，包含SEQ ID NO：13的CDR1、SEQID NO：14的CDR2和SEQ ID NO：15的CDR3；

（ii）SEQ ID NO：23的轻链可变序列，包含SEQ ID NO：18的CDR1、SEQ ID NO：19的CDR2和SEQ ID NO：20的CDR3，以及SEQ ID NO：24的重链可变序列，包含SEQ ID NO：21的CDR1、SEQ ID NO：22的CDR2和SEQ ID NO：15的CDR3；

（iii）SEQ ID NO：26的轻链可变序列，包含SEQ ID NO：18的CDR1、SEQ ID NO：11的CDR2和SEQ ID NO：20的CDR3，以及SEQ ID NO：27的重链可变序列，包含SEQ ID NO：21的CDR1、SEQ ID NO：25的CDR2和SEQ ID NO：15的CDR3；或

（iv）SEQ ID NO：30的轻链可变序列，包含SEQ ID NO：18的CDR1、SEQ ID NO：11的CDR2和SEQ ID NO：28的CDR3，以及SEQ ID NO：31的重链可变序列，包含SEQ ID NO：29的CDR1、SEQ ID NO：25的CDR2和SEQ ID NO：15的CDR3；

其中每个FW是如上述给定的可变链序列中所包含的或是其与如通过上述可变链序列所公开的FW-序列至少85％等同的变体，并且其中每个CDR是如上文所给定的或在最多一个氨基酸取代方面不同：

关于CDRs及其变体，上文提供的定义和明确示例性的实施方案经适当的修改后适用。

关于构架区，本文中还预计一定程度的变异性，即，各个FWs可包含明确叙述的氨基酸序列或与其至少85％相同的氨基酸序列或由其组成。在一个进一步的实施方案中，同一性为至少90％。在再进一步的实施方案中，同一性为至少95％。

根据本发明，术语“％序列同一性”描述两个或更多个比对的氨基酸序列的相同氨基酸如与构成全长氨基酸序列（或其总比较的部分）的氨基酸残基的数目相比的匹配数目（“命中（hits）”）。通过将相同残基的数目除以残基总数目并将结果乘以100来确定百分比同一性。换句话说，使用比对，当将两个或更多个序列或子序列在比较窗口上或在指定区域上关于最大对应进行比较和比对时，如使用本领域已知的序列比较算法所测量的，或当手工比对和目测检查时，可以确定这些（子）序列的相同氨基酸残基的百分比（例如，85％同一性）。

本领域技术人员知道如何使用例如诸如基于NCBI BLAST算法（Altschul, S.F.等人. [1997] Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）、CLUSTALW计算机程序（Tompson, J.D.等人. [1994] Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）或FASTA（Pearson, W.R. & Lipman,D.J. [1988] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448）的那些的算法确定序列之间/中的百分比序列同一性。在一个实施方案中，根据本发明采用NCBI BLAST算法。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字长（word length）（W）和10的期望值（E）。BLOSUM62评分矩阵（scoring matrix）（Henikoff, S. & Henikoff, J.G. [1992] Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 89:10915-10919）使用50的比对（B），10的期望值（E），M = 5，N = 4，以及两条链的比较。因此，在那些显示％序列同一性的实施方案中，如用NCBI BLAST程序测定的具有至少85％的序列同一性的所有氨基酸序列都归入所述实施方案的范围内。

与各个明确叙述的氨基酸序列相比，所述构架区中的上述变异程度可以归因于一个或多个氨基酸的取代、插入、添加或缺失。

上文已经定义了术语“取代”。在那些要取代不止一个氨基酸的情况下，每个氨基酸独立地被另一个氨基酸置换，即，对于每个被去除的氨基酸，在相同位置引入不同的氨基酸。

根据本发明，术语“插入”是指向明确叙述的氨基酸序列添加一个或多个氨基酸，其中所述添加不是至多肽的N-或C-末端。

根据本发明，术语“添加”是指向多肽的N-或C-末端或两者给明确叙述的氨基酸序列添加一个或多个氨基酸。

如根据本发明所使用的术语“缺失”是指从明确叙述的氨基酸序列中丧失一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，构架区的氨基酸序列的变异归因于一个或多个氨基酸的取代。如本文上文所定义的，取代可以是保守的氨基酸取代或非保守的氨基酸取代。上面关于术语“取代”提供的定义和明确示例性的实施方案经适当的修改后适用。在一实施方案中，构架区中的取代是保守的氨基酸取代。

在本发明的抗体的进一步的实施方案中，所述抗体包含由如上式I所表示的构架区（FWs）和CDRs组成的轻链可变结构域，以及由如上式II所表示的FWs和CDRs组成的重链可变结构域，其中所述FWs包含经由可变链序列或与其至少85％相同的其变体公开的氨基酸序列，并且其中所述CDRs包含以下氨基酸序列：

（iv）SEQ ID NO：30的轻链可变序列，包含SEQ ID NO：18的CDR1、SEQ ID NO：11的CDR2和SEQ ID NO：28的CDR3，以及SEQ ID NO：31的重链可变序列，包含SEQ ID NO：29的CDR1、SEQ ID NO：25的CDR2和SEQ ID NO：15的CDR3。

因为本文中定义为FWs的式I和式II的部分是形成可变链区域的构架或支架的一部分的氨基酸序列，所以在所述序列内的取代，特别是以保守的氨基酸取代的形式，将在许多情况下不影响抗-PIVKA-II抗体的结合能力。

本发明进一步涉及特异性结合PIVKA-II的抗体，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，所述抗体包含

（i）由与由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的轻链可变结构域和由与由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的重链可变结构域；

（ii）由与由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的轻链可变结构域和由与由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的重链可变结构域；

（iii）由与由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的轻链可变结构域和由与由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的重链可变结构域；或

（iv）由与由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的轻链可变结构域和由与由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列组成的重链可变结构域。

上文关于本发明的抗-PIVKA-II抗体在本文中提供的所有定义和明确示例性的实施方案，特别是所列举的变异程度和类型，经适当的修改后适用。

在一个实施方案中，所述特异性结合PIVKA-II的抗体特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽：

（i）包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列作为轻链可变结构域和SEQ ID NO：17的氨基酸序列作为重链可变结构域（即，对应于在所附实施例中称为7A10的单克隆抗体的可变链区域）；

（ii）包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列作为轻链可变结构域和SEQ ID NO：24的氨基酸序列作为重链可变结构域（即，对应于在所附实施例中称为4E8的单克隆抗体的可变链区域）；

（iii）包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列作为轻链可变结构域和SEQ ID NO：27的氨基酸序列作为重链可变结构域（即，对应于在所附实施例中称为9A6的单克隆抗体的可变链区域）；或

（iv）包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列作为轻链可变结构域和SEQ ID NO：31的氨基酸序列作为重链可变结构域（即，对应于在所附实施例中称为13H7的可变链区域）。

上述可变轻链和重链区域的序列是已在所附实施例中应用的氨基酸序列。实施例中应用的抗体（其包含所述可变结构域）中存在的轻链和重链的全长氨基酸序列分别在SEQID NOs：16、23、26和30以及SEQ ID NOs：17、24、27和31中表示。如实施例中所示的，这些抗-PIVKA-II抗体提供了优良的结合效率和特异性。

本发明进一步涉及编码上文定义的本发明的任何一种抗体的轻链可变区的核酸分子。这个核酸分子在本文中称为本发明的第一核酸分子。此外，本发明也涉及编码上文定义的本发明的任何一种抗体的重链可变区的核酸分子。这个核酸分子在本文中称为本发明的第二核酸分子。

根据本发明，术语“核酸分子”，在本文中也称为核酸序列或多核苷酸，包括DNA，例如cDNA或基因组DNA。

本发明的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。

根据本发明，本发明的第一核酸分子编码特异性结合PIVKA-II的抗体的轻链可变区，所述特异性结合PIVKA-II的抗体特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽：

（i）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（ii）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（iii）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（iv）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（v）与由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列；

（vi）与由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列；

（vii）与由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列；或

（viii）与由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成的轻链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列。

类似地，本发明的第二核酸分子编码特异性结合PIVKA-II的抗体的重链可变区，所述特异性结合PIVKA-II的抗体特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽：

（i）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（ii）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（iii）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（iv）包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，所述CDR2包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体，且所述CDR3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列或在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体；

（v）与由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列；

（vi）与由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列；

（vii）与由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列；或

（viii）与由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成的重链可变结构域至少85％相同的氨基酸序列。

本发明进一步涉及包含本发明的第一核酸分子，即编码上文定义的本发明的任何一种抗体的轻链可变区的核酸分子的载体。本发明进一步涉及包含本发明的第二核酸分子，即编码上文定义的本发明的任何一种抗体的重链可变区的核酸分子的载体。这种载体在本文中也称为“一种或多种本发明的个别载体”。

分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒、黏粒、病毒、噬菌体和其他常规用于例如遗传工程的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体；参见，例如，Sambrook等人（上述引用文中）和Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, GreenPublishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)中描述的技术。

在一个实施方案中，载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达，并因此保证由此编码的本发明的抗-PIVKA-II抗体的可变链结构域在选择的宿主中的表达。在进一步的实施方案中，一种或多种载体包含进一步的序列以确保不仅表达本发明的所述可变链结构域，而且也表达包含本发明的所述可变链结构域的全长IgG抗体。

表达载体可以例如是克隆载体、双元载体（binary vector）或整合型载体。表达包括核酸分子的转录，例如转录成可翻译的mRNA。在一个实施方案中，载体是用于单克隆兔抗体的重链和/或轻链的瞬时重组表达的真核表达质粒。这种载体已经被具体开发用于通过例如真核细胞如HEK 293或其衍生物或CHO细胞的瞬时转染进行抗体表达，但也用于抗体生产。

载体的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript (Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO (Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a)载体系统、pREP (Invitrogen)、pCEP4 (Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1 (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1 (GIBCO BRL)、pGEMHE (Promega)、pLXIN、pSIR (Clontech)、pIRES-EGFP (Clontech)、pEAK-10 (EdgeBiosystems) pTriEx-Hygro (Novagen)和pCINeo (Promega)。适合于巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K（全部为Invitrogen）。适合于在爪蟾属（Xenopus）胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。

通常，载体可含有一种或多种用于克隆或表达的复制起点（ori）和遗传系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记（例如，抗生素抗性）和一种或多种表达盒。另外，可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列连接。这种调控序列是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点（IRES）（Owens, G.C.等人. [2001] Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 98:1471-1476）和任选的确保转录终止和转录物稳定的调控元件。确保转录起始的这种调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件，其包括在本发明的核酸分子的下游。进一步的例子包括Kozak序列和侧翼为用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列，编码分泌信号的核苷酸序列，或取决于所用的表达系统的信号序列，其能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基。载体也可含有编码一种或多种蛋白伴侣的另外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。

合适的复制起点的额外的例子包括，例如，全长ColE1、截短的ColEI、SV40病毒和M13复制起点，而合适的启动子的额外的例子包括但不限于巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40-启动子、RSV-启动子（劳斯肉瘤病毒）、lacZ启动子、四环素启动子/操纵基因（tet^p/o）、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG-启动子（鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒立即早期增强子的组合）、gai10启动子、人延伸因子1α-启动子、AOX1启动子、GAL1启动子CaM-激酶启动子，lac，trp或tac启动子，T7或T5启动子，lacUV5启动子，苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）多核型多角体病毒（AcMNPV）多角体启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的珠蛋白内含子。增强子的一个例子是例如SV40-增强子。确保转录终止的调控元件的非限制性的额外例子包括SV40-聚腺苷酸化位点、tk-聚腺苷酸化位点、不依赖ρ因子的lpp终止子或AcMNPV多角体聚腺苷酸化信号。选择标记的进一步的非限制性实例包括dhfr，其赋予了对氨甲蝶呤的抗性（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149），npt，其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素（paromycin）的抗性（Herrera-Estrella, EMBOJ. 2 (1983), 987-995）和hygro，其赋予对潮霉素的抗性（Marsh, Gene 32 (1984), 481-485）。已经描述了额外的选择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇（histinol）代替组氨酸（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988), 8047）；甘露糖6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖（WO 94/20627）和ODC（鸟氨酸脱羧酶），其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性（McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, ColdSpring Harbor Laboratory ed.）或赋予对杀稻瘟素S抗性的来自土曲霉（Aspergillus terreus）的脱氨酶（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338）。

在进一步的实施方案中，载体是真核表达质粒，其含有由包括内含子A的5` CMV启动子和3` BGH聚腺苷酸化序列组成的表达盒。除所述表达盒以外，质粒还可以含有pUC18-衍生的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，用于在大肠杆菌（E. coli）中的质粒扩增。为了分泌抗体，可以将真核前导序列克隆到抗体基因的5`。

合适的细菌表达宿主包括例如衍生自JM83、W3110、KS272、TG1、K12、BL21（例如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE）或Rosettaâ的菌株。关于载体修饰、PCR扩增和连接技术，参见Sambrook＆Russel [2001]（Cold Spring HarborLaboratory, NY）。

可以设计本发明的核酸分子和/或载体以通过例如基于化学的方法（聚乙烯亚胺（polyethylenimine）、磷酸钙、脂质体，DEAE-葡聚糖、核转染（nucleofection））、非化学方法（电穿孔、声致穿孔（sonoporation）、光转染（optical transfection）、基因电转移、流体递送（hydrodynamic delivery）或细胞与本发明的核酸分子接触时自然发生的转化）、基于粒子的方法（基因枪、磁转染（magnetofection）、穿刺转染（impalefection））基于噬菌体载体的方法和病毒方法引入细胞。例如，衍生自诸如反转录病毒、牛痘病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、Semliki病毒或牛乳头瘤病毒的病毒的表达载体可用于将核酸分子递送至靶向的细胞群体中。另外，杆状病毒系统也可以用作本发明核酸分子的真核表达系统中的载体。在一个实施方案中，本发明的核酸分子和/或载体被设计用于通过磷酸钙转化化学感受态大肠杆菌和/或通过聚乙烯亚胺-或脂转染胺试剂-转染瞬时转染HEK293和CHO。

本发明进一步涉及一种载体，其包含编码如上文所定义的根据任选项（i）至（viii）的轻链可变结构域和根据上文定义的任选项（i）至（viii）的配对（例如上文的（vi）和（vi））重链可变结构域的核酸分子；

在一个实施方案中，载体是表达载体。

上文关于本发明的载体特别是载体类型或调控序列所提供的所有定义和明确示例性的实施方案均经适当的修改后适用。载体的这种第二类型涉及包含至少两个核酸分子的载体，即编码轻链可变结构域的一个核酸分子和编码重链可变结构域的一个核酸分子。如从上述组合可明显看出的，轻链可变结构域和重链可变结构域在载体中组合，从而使得能够表达本发明的功能性抗-PIVKA-II抗体。载体的这种第二类型在本文中也称为“本发明的组合载体”。

本发明进一步涉及宿主细胞或非人宿主，其包含：

（i）本发明的组合载体；或

（ii）包含本发明的第一核酸分子即编码根据本发明的轻链可变区的核酸分子的本发明的个别载体，和包含本发明的第二核酸分子即编码本发明的重链可变区的核酸分子的本发明的个别载体，其中这两种载体包含编码如上文所定义的配对轻链和重链可变区的核酸分子。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。术语“原核生物”意欲包括所有可用DNA或DNA或RNA分子转化、转导或转染以表达本发明蛋白质的细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌，如例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、棒杆菌属（Corynebacterium）（谷氨酸棒杆菌（glutamicum））、假单胞菌属（Pseudomonas）（荧光假单胞菌（fluorescens））、乳杆菌属（Lactobacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、沙门氏菌属（Salmonella）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

术语“真核”意欲包括酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。典型的哺乳动物宿主细胞包括Hela，HEK293，H9，Per.C6和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3，NS/0，SP2/0和C127细胞，COS细胞，例如 COS 1或COS 7，CV1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞，小鼠肉瘤细胞，Bowes黑素瘤细胞和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。根据本发明的示例性哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。其他合适的真核宿主细胞包括但不限于，鸡细胞，如例如DT40细胞，或酵母，如啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）、粟酒裂殖糖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和乳克鲁维氏酵母（Kluyveromyces lactis）。适合于表达的昆虫细胞是例如果蝇属（Drosophila）S2，果蝇属Kc，灰翅夜蛾属（Spodoptera）Sf9和Sf21或粉夜蛾属（Trichoplusia）Hi5细胞。合适的斑马鱼细胞系包括但不限于ZFL、SJD或ZF4。

所描述的一种或多种载体可以整合到宿主的基因组中，或者可以维持在染色体外。一旦已将载体并入合适的宿主中，就将宿主维持在适合于核酸分子高水平表达的条件下，并且如所期望的，可以接着发生本发明的抗体的收集和纯化。对于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。

在一个实施方案中，所述宿主是哺乳动物细胞，例如人细胞或人细胞系。在进一步的实施方案中，用本发明的一种或多种载体转化的宿主细胞是HEK293或CHO。在再进一步的实施方案中，用本发明的一种或多种载体转化的宿主细胞是CHO。这些宿主细胞以及适合的培养基和细胞培养条件已经在本领域中进行了描述，参见例如，Baldi L.等人,Biotechnol Prog. 2005年1-2月;21(1):148-53，Girard P.等人, Cytotechnology 2002年1月;38(1-3):15-21和Stettler M.等人, Biotechnol. Prog. 2007年11-12月;23(6):1340-6。

关于根据本发明的术语“载体包含”，要理解的是，载体中存在进一步的核酸序列，其对于宿主细胞产生本发明的抗-PIVKA-II抗体是必需的和/或足够的。这种进一步的核酸序列是例如编码轻链剩余部分的核酸序列以及编码重链剩余部分的核酸序列。

根据本发明，宿主细胞或非人宿主包含编码如上文所定义的轻链和重链可变区两者的一种载体，或其包含两种单独的载体，其中一种载体携带编码根据本发明的轻链可变区的核酸分子，且第二载体携带编码根据本发明的配对重链可变区的核酸分子。因此，在第一载体携带编码根据上文任选项（i）的轻链可变区的核酸分子的场合，那么第二载体携带编码也根据上文任选项（i）的重链可变区的核酸分子。上述情况经适当的修改后适用于任选项（ii）至（viii）。

因此，在所有情况下，需要在一个抗体分子中存在的那些核酸分子的表达彼此联合，以确保产生由上文所述的结合能力组成的本发明的抗-PIVKA-II抗体。

根据这个实施方案的宿主细胞可以例如被应用于产生大量本发明的抗-PIVKA-II抗体。通过将上述一种或多种载体引入宿主中产生所述宿主细胞。所述一种或多种载体在宿主中的存在然后介导编码上述本发明的抗-PIVKA-II抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域的核酸分子的表达。如上文所述的，本发明的一种或多种载体可以包含使得能够表达全长IgG抗体的进一步的序列，从而导致宿主细胞产生全长IgG抗体，其中所述抗体的特征在于存在根据本发明的可变轻链和/或重链结构域。

本发明进一步涉及一种产生特异性结合PIVKA-II的抗体的方法，所述特异性结合PIVKA-II的抗体特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，所述方法包括在适合的条件下培养本发明的宿主细胞并分离产生的抗体。

根据这个实施方案，存在于本发明宿主中的一种或多种载体是一种或多种表达载体，或所述一种或多种载体介导本发明的一种或多种核酸分子以确保其表达的方式稳定整合到宿主细胞的基因组中。用于选择已经向其中成功地引入了编码本发明的抗-PIVKA-II抗体的相应轻链和重链结构域的核酸分子从而使得确保抗体表达的宿主细胞的手段和方法是本领域众所周知的且已经得到了描述（Browne, S.M. & Al-Rubeai, M. [2007]Trends Biotechnol. 25:425-432；Matasci, M等人. [2008] Drug Discov. Today:Technol. 5:e37-e42；Wurm, F.M. [2004] Nat. Biotechnol. 22:1393-1398）。

用于培养原核或真核宿主细胞的合适条件是本领域技术人员众所周知的。例如，细菌如例如大肠杆菌可以在Luria Bertani（LB）培养基中通气培养，一般在4至约37℃的温度。为了增加表达产物的得率和溶解度，可以用已知增强或促进两者的合适的添加剂缓冲或补充培养基。在诱导型启动子控制宿主细胞中存在的一种或多种载体中的本发明核酸分子的那些情况下，可以通过添加适当的诱导剂如例如无水四环素来诱导多肽的表达。合适的表达规程和策略已在本领域中进行了描述（例如，在Dyson, M. R.等人. (2004). BMCBiotechnol. 4, 32–49和在Baldi, L.等人. (2007) Biotechnol. Lett. 29, 677–684中），并且可以适应特定宿主细胞的需要和要表达的蛋白质的要求（如果需要的话）。

取决于细胞类型及其特定要求，哺乳动物细胞培养可以例如在含有10％（v/v）FCS、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/ml青霉素/链霉素的RPMI、Williams’ E或DMEM培养基中进行。对于DT40鸡细胞，细胞可以保持于例如37℃或41℃，在5％CO₂，水饱和的气氛中。

用于昆虫细胞培养的适合的培养基是例如TNM + 10％FCS、SF900或HyClone SFX-Insect培养基。昆虫细胞通常在27℃作为黏附或悬浮培养物生长。

用于真核或脊椎动物细胞的合适的表达规程是技术人员众所周知的，并且可以例如从Sambrook, J & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY)查找。

在一个实施方案中，所述方法是使用哺乳动物细胞，如例如CHO或HEK293细胞进行的。在进一步的实施例中，所述方法使用CHO细胞进行。

取决于重组生产程序中使用的宿主，表达的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的。在一个实施方案中，使用含有本发明抗体的编码序列和基因融合到其的N-末端FLAG-标记和/或C-末端His-标记的质粒或病毒。在进一步的实施方案中，所述FLAG-标记的长度为约4至8个氨基酸，如例如，恰好8个氨基酸。可以使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术，将上述载体用于转化或转染宿主。此外，用于制备融合的、可操作地连接的基因并在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法是本领域众所周知的（Sambrook，上述引用文中）。

转化的宿主可以在生物反应器中生长并根据本领域已知的技术培养以实现最佳的细胞生长。然后可以从生长培养基中分离本发明的抗体。本发明的例如微生物表达的抗体的分离和纯化可以通过任何常规方式进行，如例如亲和层析（例如，使用融合-标记如Strep-标记II或His6标记）、凝胶过滤（尺寸排阻层析）、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、高压液相层析（HPLC）、反相HPLC或免疫沉淀法。这些方法在本领域中是众所周知的，并且已被普遍地描述于例如Sambrook, J & Russel, D.W. [2001] (Cold SpringHarbor Laboratory, NY)中。

将理解的是，根据本发明，术语“分离产生的抗体”是指分离本发明的抗-PIVKA-II抗体。

此外，本发明涉及特异性结合PIVKA-II的抗体，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，其中所述抗体可通过本发明方法获得或通过本发明方法获得。

本发明进一步涉及包含以下至少一种的组合物：

（i）本发明的抗体，

（ii）本发明的核酸分子，

（iii）本发明的载体，

（iv）本发明的宿主细胞，和/或

（v）通过本发明的方法产生的抗体。

如根据本发明所使用的术语“组合物”涉及包含至少一种所述化合物的组合物。它可以任选地包含能够改变本发明化合物的特征，从而例如稳定、调节和/或增强其功能的进一步的分子。所述组合物可以是固体或液体形式，并且尤其可以是一种或多种粉末、一种或多种片剂或一种或多种溶液的形式。

所述组合物的组分可以作为水溶液或作为用于重构的冻干制剂包装在一个容器或多个容器中，例如密封的安瓿或小瓶。作为冻干制剂的实例，在10-ml小瓶中填充5 ml1％（w/v）或10％（w/v）的水溶液，且将所得混合物冻干。通过使用例如用于治疗用途的注射用水（water-for-injection）或用于诊断目的的另一种所期望的溶剂如缓冲剂重构一种或多种冻干的化合物来制备供使用的溶液。也可以存在防腐剂和其他添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

组合物的各种组分可以作为具有使用说明书的试剂盒进行包装。

在一个实施方案中，本公开内容涉及一种检测样品中的PIVKA-II的方法，所述方法包括以下步骤：a）使所述样品与结合PIVKA-II的特异性结合剂接触，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽；在足以形成特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件；和b）检测特异性结合剂-PIVKA-II复合体的存在，其中特异性结合剂-PIVKA-II复合体的存在表明所述样品中存在PIVKA-II。

在一个实施方案中，本发明涉及一种检测样品中的PIVKA-II的方法，其包括以下步骤：a）使所述样品与PIVKA-II的第一特异性结合剂和PIVKA-II的第二特异性结合剂接触，所述PIVKA-II的第一特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ IDNO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和b）测量在（a）中形成的复合体，从而检测所述样品中的PIVKA-II。

如对于本领域技术人员所显而易见的，可以使样品以任何期望的顺序与所述第一和第二特异性结合剂接触，即，第一→第二；第二→第一，或同时，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件。

在一个实施方案中，本公开内容涉及一种检测样品中的PIVKA-II的方法，其包括以下步骤：a）使所述样品与结合PIVKA-II的第一特异性结合剂接触，所述结合PIVKA-II的第一特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽；在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件；b）将PIVKA-II的第二特异性结合剂添加至所述第一特异性结合剂-PIVKA-II复合体，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和c）测量在（b）中形成的复合体，从而检测样品中的PIVKA-II。

如技术人员将容易理解的，确定对于在（对于PIVKA-II的）特异性结合剂和（PIVKA-II）抗原/分析物之间形成复合体（=特异性结合剂-抗原/分析物复合体）或形成包含（对于PIVKA-II的）第一特异性结合剂、（PIVKA-II）抗原/分析物和（对于PIVKA-II的）第二特异性结合剂的次级或夹心复合体（=第一特异性结合剂-抗原/分析物-第二特异性结合剂复合体）适当或充分的时间和条件只不过是常规的实验。

在用于检测分析物PIVKA-II的方法的进一步的实施方案中，PIVKA-II的特异性结合剂或所用的结合剂中的至少一种如上文所定义。

特异性结合剂-PIVKA-II复合体的检测可以通过任何适当的手段进行。本领域技术人员绝对熟悉这种手段/方法。

术语“样品”或“感兴趣的样品”或“测试样品”在本文可互换使用。所述样品是体外样品，其将在体外进行分析，且不转移回体内。样品的实例包括但不限于流体样品，例如血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液和淋巴液，或固体样品，例如组织提取物、软骨、骨、滑膜和结缔组织。在一个实施方案中，样品选自血液、血清、血浆、滑液和尿。在一个实施方案中，样品选自血液、血清和血浆。在一个实施方案中，样品是血清或血浆。

如本文所用的术语“参考样品”是指以与感兴趣的样品基本相同的方式进行分析并且其信息与感兴趣的样品的信息进行比较的样品。因此，参考样品提供了一种标准，其允许评价从感兴趣的样品获得的信息。参考样品可以来自健康或正常组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的健康状态的标准。正常参考样品的状态与感兴趣的样品的状态之间的差异可能为疾病发展的风险或这种疾病或病症的存在或进一步进展的征兆。参考样品可以来自异常或患病的组织、器官或个体，从而提供了组织、器官或个体的患病状态的标准。异常参考样品的状态与感兴趣的样品的状态之间的差异可能为疾病发展的降低的风险或这种疾病或病症的不存在或改善的征兆。

术语指示剂的“升高的”或“增加的”水平是指样品中的这种指示剂的水平与参考或参考样品中这种指示剂的水平相比更高。例如，在患有给定疾病的一个个体的流体样品中以比在未患有所述疾病的个体的相同流体样品中更高的量可检测的蛋白质具有升高的水平。

在某些实施方案中，将形成包含（对于PIVKA-II的）第一特异性结合剂、（PIVKA-II）抗原和（对于PIVKA-II的）第二特异性结合剂的夹心，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记。

通常可以分为以下类别的许多标记（也称为染料）是可利用的，它们一起以及它们的每一个都代表根据本公开内容的实施方案：

（a）荧光染料

荧光染料例如由Briggs等人"Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes andTheir Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1(1997) 1051-1058)描述。

荧光标记或荧光团包括稀土螯合物（铕螯合物），荧光素类型的标记，包括FITC，5-羧基荧光素，6-羧基荧光素；罗丹明类型的标记，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺；花菁；藻红蛋白；德克萨斯红；及其类似物。荧光标记可以使用本文公开的技术与靶分子中包含的醛基缀合。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/Molecular Probes（Eugene, Oregon,USA）和Pierce Biotechnology, Inc.（Rockford, Ill.）商购获得的那些。

（b）发光染料

发光染料或标记可以进一步细分为化学发光和电化学发光染料。

致化学发光的标记的不同类别包括鲁米诺，吖啶

（acridinium）化合物，腔肠素（coelenterazine）和类似物，二氧杂环丁烷，基于过氧草酸的系统及其衍生物。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶

的标记（详细综述在Dodeigne C.等人, Talanta 51 (2000)415-439中给出）。

用作电化学发光标记的具有较重要的关系的标记分别是基于钌和铱的电化学发光络合物。电化学发光（ECL）作为高度灵敏和选择性的方法在分析应用中证明是非常有用的。它组合了化学发光分析（不存在背景光信号）的分析优势和通过施加电极电位进行反应控制的容易程度。通常，将在液相或液-固界面由TPA（三丙胺）再生的钌络合物，尤其是[Ru(Bpy)3]2+（在~620 nm释放光子）用作ECL-标记。最近，也已经描述了基于铱的ECL-标记（WO2012107419（A1））。

（c）放射性标记利用放射性同位素（放射性核素），例如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。

（d）适合作为用于成像和治疗目的的标记的金属螯合物是本领域众所周知的（US2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich等人, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares等人, Anal.Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh等人, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65;Meares等人, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard等人, Bioconjugate Chem.3 (1992) 346-350; Nikula等人, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera等人,Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis等人, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera等人, J. Nucl. Med.21 (1994) 640-646; Ruegg等人, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel等人, J.Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee等人, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482;Mitchell等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi等人 BioconjugateChem. 10 (1999) 103-111; Miederer等人, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137;DeNardo等人, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend等人, CancerBiotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula等人 J. Nucl. Med.40 (1999) 166-76; Kobayashi等人, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian等人, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli等人, Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20）。

在一个实施方案中，用于形成包含第一特异性结合剂、PIVKA-II和第二特异性结合剂复合体的夹心的PIVKA-II的第二特异性结合剂是多克隆或单克隆抗体。

在一个实施方案中，使用根据本发明的PIVKA-II的第一特异性结合剂作为这种夹心测定中的一个配偶体以及与PIVKA-II的F1/F2-片段（SEQ ID NO：8）结合的第二特异性结合剂作为另一个结合配偶体来实施夹心免疫测定方法。

在一个实施方案中，使用根据本发明的PIVKA-II的第一特异性结合剂作为这种夹心测定中的一个配偶体以及与PIVKA-II的F1 -片段（SEQ ID NO：9）结合的第二特异性结合剂作为另一个结合配偶体来实施夹心免疫测定方法。

在一个实施方案中，使用根据本发明的PIVKA-II的第一特异性结合剂作为这种夹心测定中的一个配偶体以及与PIVKA-II的Gla-结构域（SEQ ID NO：7）结合的第二特异性结合剂作为另一个结合配偶体来实施夹心免疫测定方法。

在包含第一特异性结合剂、PIVKA-II和第二特异性结合剂的夹心的形成中；两种特异性结合剂与不重叠的表位结合。在一个实施方案中，PIVKA-II的第二特异性结合剂与PIVKA-II上不是SEQ ID NO：1的一部分的表位结合。在一个实施方案中，第一和第二特异性结合剂两者每一个都是抗体，在一个实施方案中两者都是单克隆抗体。

在一个实施方案中，本公开内容涉及一种在怀疑患有HCC的患者中诊断HCC的方法，其包括以下步骤：a）从所述患者获得样品；b）使所述样品与根据权利要求1-5任一项的PIVKA-II的第一特异性结合剂和PIVKA-II的第二特异性结合剂接触，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；c）测量在（b）中形成的复合体，从而测量所述样品中存在的PIVKA-II的量，其中大于参考水平的PIVKA-II的量指示患者中HCC的存在。

在一个实施方案中，本公开内容涉及一种在怀疑患有HCC的患者中诊断HCC的方法，其包括以下步骤：a）从所述患者获得样品；b）使所述样品与结合PIVKA-II的特异性结合剂接触，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ IDNO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽；在足以形成特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件；c）将PIVKA-II的第二特异性结合剂添加至所述第一特异性结合剂-PIVKA-II复合体，其中所述第二特异性结合剂结合PIVKA-II上不是SEQ ID NO：1的一部分的表位，且被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；d）测量在（c）中形成的复合体，从而测量所述样品中存在的PIVKA-II的量，其中大于预定水平的PIVKA-II的量指示患者中HCC的存在。

在一个实施方案中，本公开内容涉及结合PIVKA-II的特异性结合剂在测量PIVKA-II中的用途，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ IDNO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽。

在一个实施方案中，本公开内容涉及用于检测和/或定量样品中PIVKA-II的量的试剂盒，其包括含有结合PIVKA-II的特异性结合剂的容器，所述结合PIVKA-II的特异性结合剂的特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ ID NO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ IDNO：3的合成肽。

附图图例：

图1：Elecsys上PIVKA-II免疫测定的简图

示意性地描绘了抗体-PIVKA-II-抗体夹心的形成及其结合链霉抗生物素蛋白包被的微粒。DCP（脱羧基凝血酶原）是PIVKA-II的其他名称，且“RU”表示与第二抗-PIVKA-II抗体结合的钌标记。

图2：PIVKA-II Elecsys对DCP WAKO的方法比较

比较了在PIVKA-II Elecsys®测定中测量的值对在DCP WAKO测定中测量的值。由HCC患者、对照和其他（即，胆管癌（CCC）或混合的HCC/CCC患者或怀疑患有HCC/CCC的患者）组成的三个组用不同的符号显示。绘制所有点（实线）和参考线（虚线/斜率为1且截距为0的参考对角线）的Deming回归。发现的相关系数分别为Pearson's r = 0.86和Spearman's p =0.88。排除来自华法令治疗的患者的样品。

图3：WAKO DCP和Elecsys PIVKA-II /所有HCC的临床表现

在这个图中，分别显示了对于所有HCC患者（BCLC 0-D期）与对照相比的WAKO DCP测定和Elecsys PIVKA-II测定的AUCs。对于高灵敏度区域，Elecsys PIVKA-II测定显示出比WAKO DCP测试更好的特异性。

图4：WAKO DCP和Elecsys PIVKA-II /早期HCC的临床表现

在这个图中，分别显示了对于所有HCC患者（BCLC 0和A期）与对照相比的WAKO DCP测定和Elecsys PIVKA-II测定的AUCs。对于高灵敏度区域（60-90%），Elecsys PIVKA-II测定显示出比WAKO DCP测试更好的特异性。

提供以下实施例以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中陈述。要理解的是，可以在不背离本发明的精神的情况下在所陈述的程序中进行修改。

实施例1

用于产生单克隆抗-PIVKA-II抗体的肽免疫原的合成

1.1 用于免疫原和筛选试剂的肽的一般合成方法

通过芴甲氧羰基（Fmoc）固相肽合成，在多重肽合成仪上，例如来自ProteinTechnologies, Inc.的，来合成肽。在这个合成中，在合成的每个步骤中使用4当量的每种氨基酸衍生物。将氨基酸衍生物溶解在含有1当量的1-羟基-7-氮杂苯并三唑的二甲基甲酰胺中。在Tentagel®树脂（Rapp Polymere GmbH, Tübingen）上合成肽。偶联反应在作为反应介质的二甲基甲酰胺中以相对于树脂荷载4当量的HATU（1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶

3-氧化物六氟磷酸盐）和8当量的N,N-二异丙基乙胺进行5分钟。在每个合成步骤后的8分钟内，使用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶切除Fmoc-基团。于室温，以含有三氟乙酸、三异丙基硅烷和水（38:1:1）的混合物，在3小时内实现肽从合成树脂的释放和酸不稳定的保护基的切割。接着将反应溶液与冷却的二异丙基醚混合以沉淀肽。将沉淀物过滤，再次用冷的二异丙基醚洗涤，溶解在少量含水乙酸中并冻干。通过制备型RP-HPLC，使用含有0.1％三氟乙酸的乙腈/水的梯度，纯化获得的粗材料。通过离子喷射质谱分析法检查纯化的材料的身份。

1.2 肽免疫原51-73

合成了肽βAla-Ahx-βAla-βAla-VRRGNLERECVEETCSYEEAFEA-NH2（SEQ ID NO：32），其除了在位置53上的赖氨酸被精氨酸取代之外包含前凝血酶原（SEQ ID NO：5）的氨基酸51至73以及在N-末端由βAla-Ahx-βAla-βAla的延伸。

ESI-MS_计算的：M+ = 3045.4 Da；

ESI-MS_预期的：[M + 3H]³⁺ = 1015.6 Da

这个肽的二硫化物氧化如下进行。将CLEAR-OX^TM树脂（130 mg，26μmol）在二氯甲烷（DCM）中溶胀30分钟，且然后依次用二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇和乙腈洗涤。将还原的肽（16mg，8.5μmol）溶解在加入树脂中的脱气的乙酸铵缓冲剂（0.1 M；pH 7.8）和乙腈的混合物（1:1，2.5 mL）中，并温和地搅拌4小时。用50％含水乙腈洗涤树脂，并将滤液冻干。

ESI-MS_计算的：M+ = 3043.4 Da；ESI-MS_预期的：[M + 3H]³⁺ = 1015.2 Da

下一个步骤是方酸二乙酯（diethyl squarate）的N-末端缀合（方酸= 3-乙氧基-3-环丁烯-1,2-二酮）。向肽（9 mg，3μmol）在乙醇和水（1:1）中的溶液中加入3,4-二乙氧基-3-环丁烯-1,2-二酮（1.2当量）。通过添加碳酸钠将溶液保持在pH 8.0，搅拌过夜，且接着蒸发至干燥。

ESI-MS_计算的：M+ = 3167.2 Da；ESI-MS_预期的：[M + 3H]³⁺ = 1056.5 Da

然后，合成肽-KLH缀合物。向KLH（35 mg）在硼酸盐缓冲剂（10 mL，0.1 M，pH 9.0）中的溶液中添加含方酰胺（squaramide）的肽（9 mg，3μmol）。将反应于室温温育过夜，并对磷酸盐缓冲剂（0.1 M，pH 7.0）透析以产生35.3 mg肽-KLH缀合物。

1.3 肽免疫原55-70

合成了肽βAla-Ahx-βAla-βAla-NLERECVEETCSYEEA-NH2（SEQ ID NO：33），其包含前凝血酶原（SEQ ID NO：5）的氨基酸55至70以及在N-末端由βAla-Ahx-βAla-βAla的延伸。

ESI-MS_计算的：M+ = 2229.0 Da；

ESI-MS_预期的：[M + 2H]²⁺ = 1115.5 Da

这个肽的二硫化物氧化如下进行。将CLEAR-OX^TM树脂（230 mg，46μmol）在DCM中溶胀30分钟，且然后依次用DMF、甲醇和乙腈洗涤。将还原的肽（34 mg，15.3μmol）溶解在加入树脂中的脱气的乙酸铵缓冲剂（0.1 M；pH 7.8）和乙腈的混合物（1:1，5 mL）中，并温和地搅拌4小时。用50％含水乙腈洗涤树脂，并将滤液冻干。

ESI-MS_计算的：M+ = 2227.0 Da；

ESI-MS_预期的：[M + 2H]²⁺ = 1114.5 Da

下一个步骤是方酸二乙酯的N-末端缀合。向肽（34 mg，15.3μmol）在乙醇和水（1:1）中的溶液中加入3,4-二乙氧基-3-环丁烯-1,2-二酮（1.5当量）。通过添加碳酸钠将溶液保持在pH 8.0，搅拌过夜，且接着蒸发至干燥。

ESI-MS_计算的：M+ = 2351.4 Da；

ESI-MS_预期的：[M + 2H]²⁺ = 1176.6 Da

然后，合成肽-KLH缀合物。向KLH（50 mg）在硼酸盐缓冲剂（15 mL，0.1 M，pH 9.0）中的溶液中添加含方酰胺的肽（27.2 mg，12.2μmol）。将反应于室温温育过夜，并对磷酸盐缓冲剂（0.1 M，pH 7.0）透析以产生49.5 mg肽-KLH缀合物。

实施例2

单克隆抗-PIVKA-II抗体的产生

2.1 免疫兔用于产生抗PIVKA-II的抗体

在这里，我们描述了具有与PIVKA-II的N-末端区域内不同表位结合的能力的开发抗体。对于这种抗体的产生，用跨越PIVKA-II的N-末端区域的各种肽免疫12-16-周大的NZW兔。为了增强肽的免疫原性，如实施例1所述，将它们与作为载体蛋白的KLH偶联。对于免疫，选择分别覆盖前凝血酶原的AAs 51-73和55-70的肽。所有兔都经受重复免疫。在第一个月，每周对动物免疫一次。从第二个月起，每月对动物免疫一次。对于第一次免疫，将500μgKLH-偶联的肽溶解在1 mL 140 mM NaCl中，并在1 ml完全弗氏佐剂（CFA）中乳化。对于所有后面的免疫，CFA被不完全弗氏佐剂（IFA）代替。免疫开始后分别在第45天和第105天评价动物的滴度。

2.2 滴度分析

为了确定免疫的动物的滴度，使用C-末端生物素化的SEQ ID NO：1的肽（=NLERECVEETCSYEEA-E(生物素-PEG)-NH2，C/C为二硫化物）进行血清滴定。通过芴甲氧羰基（Fmoc）固相肽合成，在多重肽合成仪上，例如来自Protein Technologies, Inc.的，来合成所述肽。为此，使用4当量的每种氨基酸衍生物。将氨基酸衍生物溶解在含有1当量的1-羟基-7-氮杂苯并三唑的二甲基甲酰胺中。在Tentagel R树脂上合成肽。偶联反应在作为反应介质的二甲基甲酰胺中以相对于树脂荷载4当量的HATU和8当量的N,N-二异丙基乙胺进行5分钟。在每个合成步骤后的8分钟内，使用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶切割Fmoc-基团。于室温，以含有三氟乙酸、三异丙基硅烷和水（38:1:1）的混合物，在3小时内实现肽从合成树脂的释放和酸不稳定的保护基的切割。接着将反应溶液与冷却的二异丙基醚混合以沉淀肽。将沉淀物过滤，再次用冷的二异丙基醚洗涤，溶解在少量含水乙酸中并冻干。通过制备型RP-HPLC，使用含有0.1％三氟乙酸的乙腈/水的梯度，纯化获得的粗材料。通过离子喷射质谱分析法检查纯化的材料的身份。

序列：NLERECVEETCSYEEA-E(生物素-PEG)-NH2

缩写：DMF =二甲基甲酰胺；DCM =二氯甲烷；E(生物素-PEG) = Nδ-(N-生物素-3-(2-(2-(3-氨基丙基氧基)-乙氧基)乙氧基丙基)-L-谷氨酰胺；-NH2 = C-末端羧酰胺；

ESI-MS_计算的：M+ = 2459.7 Da；ESI-MS_预期的：[M + 2H]²⁺ = 1231.0 Da

二硫化物氧化

将CLEAR-OX^TM树脂（80 mg，16μmol）在DCM中溶胀30分钟，且然后依次用DMF、甲醇和乙腈洗涤。将还原的肽（10.4 mg，4.2μmol）溶解在加入树脂中的脱气的乙酸铵缓冲剂（0.1 M；pH 7.8）和乙腈的混合物（1:1，1.5 mL）中，并温和地搅拌2小时。用水洗涤树脂，并将滤液冻干。

ESI-MS_计算的：M+ = 2457.7 Da；ESI-MS_预期的：[M + 2H]²⁺ = 1230.1 Da

将上述生物素化的筛选肽固定在96孔链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板的表面上。对于固定，将生物素化的肽（100μl）在微量滴定板的孔中以100 ng/ml的浓度温育30分钟。分别在免疫活动（campaign）开始后的第45天和第105天收集每只兔的少量血清（每只动物2-3 ml）。将来自每只兔的血清在具有1％BSA的PBS中稀释，并将稀释物添加到平板中。于分别为1:300、1:900、1:2700、1:8100、1:24300、1:72900、1:218700和1:656100的稀度测试血清。对于ELISA测试，将100μl各种稀度的血清添加至96孔板的孔中，所述孔用如上所述的相应肽包被。将血清（sere）于室温温育30分钟。用HRP-标记的F(ab`)2山羊抗兔Fcγ（Dianova）和ABTS（Roche）作为底物检测结合的抗体。将分析的动物的滴度设定为稀释曲线的50％信号降低。

表1：用PIVKA-II肽免疫原免疫后的滴度

如从表1可以看出的，来自免疫的动物的多克隆血清与筛选肽结合。因此，所有动物都适合后来的抗体开发。

2.3 与PIVKA-II结合的抗体的开发

在与PIVKA-II结合的抗体的开发中，使用如Seeber等人(2014), PLoS One. 2014年2月4日;9(2)所述的B-细胞克隆。对于抗原反应B-细胞的富集，将具有与免疫原同源的序列的相应生物素化的筛选肽固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠（Miltenyi）上。对于珠的包被，以250 ng/ml的浓度使用肽。以后，制备免疫的动物的外周血单核细胞（PBMC）库，并将其与肽包被的珠温育1小时。对于抗原反应B-细胞的富集，使用了MACS柱（Miltenyi）。B-细胞分选和温育如Seeber等人(2014), PLoS One. 2014年2月4日;9(2)所述进行。对于所谓的Hit-ELISA，将相应的筛选肽固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板（Greiner Bio-One）的表面上。将生物素化的肽以100ng/ml的浓度固定在板表面上。因此，将100μl的肽溶液在板上于室温温育30分钟。洗涤后，将板于室温用100μl 5％BSA封闭30分钟以减少背景信号。再次洗涤板，并将30μl的兔B-细胞培养物转移至96孔板，并于室温温育1小时。对于与筛选肽结合的抗体的检测，添加了HRP-标记的F(ab`)2山羊抗兔Fcγ（Dianova）和ABTS（Roche）作为底物。选择结合它们各自的筛选肽的克隆，用于后来的分子克隆，如Seeber等人(2014),PLoS One. 2014年2月4日;9(2)所述的。

2.4 选择的克隆的筛选

人凝血酶原获自Haemochrom Diagnostica（Essen, 德国）。凝血酶原的γ-羧基谷氨酸残基按照Bajaj, S.P.等人. (1982), JBC 1982, Vol. 257, No. 7, 3726-3731的方法热脱羧。生物素化的凝血酶原以及生物素化的脱羰的凝血酶原如下所述生成：将凝血酶原变体对100 mM KPO₄/100 mM KCl, pH 8.0进行透析，接着将pH调节至pH 8.4，并使用生物素-DDS（生物素酰基-氨基-3,6-二氧杂辛烷-氨羰基-庚酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Biotinoyl-amino-3,6-dioxaoctanyl-aminocarbonyl-heptanoic-acid-N-hydroxy succinimideester）（EP 0632810 B1））将各凝血酶原变体以化学计量1:2.75（摩尔PT/摩尔生物素-NHS-酯）进行生物素化。反应完成后，将生物素化的凝血酶原变体在Superdex 200 HR 10/30柱（GE Healthcare Life Sciences）上通过尺寸排阻层析纯化。

结合它们各自的筛选肽的抗体通过克隆的小规模表达（HEK-细胞的2 mL转染）获得，并进一步评价如下：

首先，使用标准兔IgG夹心ECL-免疫测定确定培养物上清液中兔-IgG的浓度（20μL样品体积）。在这个测定中，将均在测定缓冲剂（测定缓冲剂包含40 mM NaPO₄、150 mM NaCl、5mM EDTA、0.1％（w/v）聚多卡醇（polydocanol）、2.0％（w/v）牛血浆清蛋白并且具有pH 7.5）中的1μg/mL生物素化的IgG绵羊抗兔Fcγ（75μL）以及1μg/mL钌化的（ruthenylated）绵羊抗兔Fcγ（70μl）和链霉抗生物素蛋白包被的磁珠（=Elecsys®珠）（35μL；0.7 mg/mL）混合，并在Elecsys 2010（Roche Diagnostics, 德国）自动免疫分析仪上测量形成的夹心。此处使用的链霉抗生物素蛋白包被的磁珠（Elecsys®珠）与如由Roche（Roche DiagnosticsGmbH, 德国）出售的Elecsys®试剂容器中含有的链霉抗生物素蛋白包被的磁珠相同。

基于获得的结果，将上清液相对于兔IgG浓度归一化，并确定与生物素化的脱羧基凝血酶原的反应性以及与生物素化的凝血酶原的交叉反应性：稀释至50 ng/mL兔IgG的培养物上清液（50μL）在第一步中分别与75 ng/mL生物素化的脱羧基凝血酶原或凝血酶原（50μL）反应，并在第二温育步骤中使用在测定缓冲剂中的1μg/ mL钌化的IgG绵羊抗兔Fcγ（参见上述；60μL）和链霉抗生物素蛋白包被的磁性Elecsys®珠（40μL；0.7 mg/mL）。使用Elecsys 2010自动免疫分析仪测量形成的夹心复合体。仅显示可忽略的与天然凝血酶原的交叉反应性的克隆进行进一步评价。

在上述脱羧基-凝血酶原结合测定中，通过分析由苯丙香豆素（marcoumar）治疗的患者的稀释的血浆（“香豆素-血浆”）或患有肝细胞癌的患者的血浆（“HCC-血浆”）的存在引起的抑制程度，研究了这个克隆亚群与人样品中所含的天然PIVKA-II的反应性：INR > 4的香豆素-血浆从Biomex GmbH（Heidelberg, 德国）获得。在第一步中，将稀释至50 ng/mL兔IgG的培养物上清液（20μL）与香豆素血浆（1:25在测定缓冲剂中）或仅与测定缓冲剂（参考）（40μL）反应，且与上述实验相似，接着使用Elecsys 2010自动免疫分析仪与50μL包含75ng/mL生物素化的脱羧基凝血酶原和在测定缓冲剂中的55μL 1μg/mL钌化的IgG绵羊抗兔Fcγ和链霉抗生物素蛋白包被的磁性Elecsys®珠（35μL；0.7 mg/mL）反应。类似地，作为第一步，使培养物上清液（20μL）与稀释的HCC-血浆（1:3-1:160在测定缓冲剂中，取决于样品）或测定缓冲剂（参考）（40μL）反应，后面的步骤如对于香豆素-血浆抑制实验所述。通过计算百分比抑制，即，在天然PIVKA-II存在或不存在（即，参考条件）的情况下获得的信号比，来评价克隆与天然PIVKA II的相对反应性。

实施例3：

羧化对抗体结合的影响

对于就PIVKA-II中确定的谷氨酸残基的γ-羧化的影响而论对所选择的克隆的表位特异性的详细分析，使用了一组生物素化的肽（表2）：

表2：不具有或具有γ-羧基谷氨酸残基的生物素化的PIVKA-II-肽

对于N-末端生物素化，根据标准程序使用E(生物素-PEG)（= Nδ-(N-生物素-3-(2-(2-(3-氨基丙基氧基)-乙氧基)乙氧基丙基)-L-谷氨酰胺）。表2中由*H**Glu(Bi-PEG)*代表N-末端生物素-（接头）-标记。*NH2用于举例说明C-末端氨基酸以C-末端羧酰胺的形式存在。

Elecsys 2010免疫分析仪用于如下所示确定所选择的抗-PIVKA-II抗体与上述肽的反应性：

在第一步中，使50μL钌化的抗-PIVKA-II抗体（在测定缓冲剂中300 ng/mL，参见实施例2.4）与50μL生物素化的肽（在测定缓冲剂中2.5 ng/mL）和70μL测定缓冲剂反应，并于37℃温育9分钟。在添加30μL链霉抗生物素蛋白包被的顺磁Elecsys®珠（0.7 mg/mL；参见实施例2.4）和第二温育步骤（37℃，9分钟）之后，将反应混合物吸到测量池中，在那里微粒被磁性地捕获到测量电极的表面上。未结合的物质用ProCell系统缓冲剂（Roche DiagnosticsGmbH,德国）去除。然后，电压到电极上的施加诱导基于电化学发光的光发射，其由光电倍增管测量。

将使用各种含γ-羧基-谷氨酸残基的肽（分别为Bi-SEQ ID NO：2、3和4）获得的信号相对于没有任何γ-羧基-谷氨酸残基的参考肽（Bi-SEQ ID NO：1）归一化。

表3：所选择的单克隆抗体对各种生物素化的PIVKA-II-肽的反应性

如从表3可以看出的，在成熟凝血酶原（SEQ ID NO：6）的位置19存在谷氨酸（不存在谷氨酸残基的γ-羧化）对于良好的抗体结合绝对关键。SEQ ID NO：2的肽完全以与SEQ IDNO：1的参考肽（根本没有γ-羧基-谷氨酸残基）相同的方式进行生物素化和其他不同处理后仅仅产生用参考肽获得的信号的约5％。另一方面，且与现有技术的抗体相反，如表3所例示的，根据本公开内容的抗体与SEQ ID NO：3的肽的结合至少与SEQ ID NO：1的肽一样好。

实施例4：

用于PIVKA-II测量的夹心测定

4.1抗体的大量生产和纯化

用2 M乙酸将1L HEK-细胞转染的培养物上清液的pH调节至pH 4.75，并将溶液于室温搅拌20分钟。通过于≥20 000 x g离心> 20分钟来澄清混浊溶液。接着，通过添加2M K₃PO₄将溶液的pH再调节至pH 7.5。兔IgG通过使用MabSelect SuRe A蛋白介质的亲和层析纯化：将10 mL MabSelect SuRe™ A蛋白柱（GE Healthcare Life Sciences）用PBS（25 mMKPO₄、150 mM KCl，pH 7.5平衡，然后将清澈的培养物上清液以流速5-20 CV/h用泵抽过柱，继之以用PBS进行的第一洗涤，用130 mM KPO₄/15 mM柠檬酸钠pH 6.5进行的第二洗涤，且最后用0.14 M KPO₄，15 mM柠檬酸盐，0.1 M硫酸铵，pH 5.0洗脱。合并含IgG的级分，并使用2M K₃PO₄将合并物（pool）的pH再调节至pH 7.5-8.0。最后，将溶液对50 mM KPO₄，150 mMKCl，pH 7.5透析。

4.2 生物素化

向1 mL IgG溶液（在100 mM KPO₄/150 mM KCl pH 8.4中4.5 mg/mL）添加50μL生物素-DDS（生物素酰基-氨基-3,6-二氧杂辛烷-氨羰基-庚酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（EP 0632810B1）；在DMSO中1.4 mg/ml）溶液（即，每摩尔IgG 3摩尔生物素-NHS-酯的化学计量）。于室温搅拌30分钟后，通过添加10 mM赖氨酸终止衍生化。用饱和的KH₂PO₄将pH调节至pH 7.5，并将溶液对50 mM KPO4/150 mM KCl pH 7.4透析。对于聚集体的去除，从在Superdex 200 HR10/30柱（GE Healthcare Life Sciences）上的尺寸排阻层析收集适当的级分。

4.3 钌化（Ruthenylation）

向1 mL IgG溶液（在100 mM KPO₄/150 mM KCl pH 8.4中4.5 mg/mL）添加50μL钌酸盐(3-), 双(2,2'-联吡啶-κN1,κN1') [N-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κN1,κN1')-1-氧代丁基]-β-丙氨酰-L-α-谷氨酰-L-α-谷氨酰-N6-[8-[(2,5-二氧-1-吡咯烷基)氧]-1,8-二氧辛基]-L-赖氨酸(3-)]-, (OC-6-33)-(9CI) (BPRu-UEEK-DSS；CAS 406218-59-5；在DMSO中4.3 mg/ml）溶液（即，每摩尔IgG 4.0摩尔钌-NHS-酯的化学计量）。于室温搅拌30分钟后，通过添加10 mM赖氨酸终止衍生化。用饱和的KH₂PO₄将pH调节至pH 7.0，并将反应混合物对50 mM K-PO₄/0.15 M KCl/2％蔗糖，pH 7.0透析。对于聚集体的去除，从在Superdex200 HR 10/30柱（GE Healthcare Life Sciences）上的尺寸排阻层析收集适当的级分。

实施例5：

针对PIVKA-II的N-末端的抗体的产生

还产生了针对PIVKA-II的N-末端的单克隆抗体。简而言之，合成了肽ANTFLEEVRKGNLERE-βAla-Ahx-βAla-Cys-NH2（SEQ ID NO：34），其包含前凝血酶原的氨基酸44至59（SEQ ID NO：5）以及由-βAla-Ahx-βAla-Cys-NH2组成的N-末端接头。这个接头分别包含氨基酸衍生物βAla =β-丙氨酸和Ahx = 6-氨基己酸。

ESI-MS_计算的：M⁺ = 2262.6 Da；

ESI-MS_预期的：[M + 2H]²⁺ = 1131.8 Da

向匙孔䗩血蓝蛋白（KLH）（150 mg）在磷酸盐缓冲剂（45 mL，20 mM，pH 7.2）中的溶液添加3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（55 mg，207μmol，溶解于1.5 mL二甲基亚砜（DMSO）中）。将反应混合物于室温温育5小时，且然后对磷酸盐缓冲剂（0.1 M，pH 7.05）透析。将包含N-末端半胱氨酸的（SEQ ID NO：34）的肽（6.8 mg，3μmol）溶解在DMSO中，并添加到含有0.1M EDTA的马来酰亚胺活化的KLH（36.7 mg）溶液中。将所述溶液于室温搅拌5小时，且然后对磷酸盐缓冲剂（0.1 M，pH 7.05）透析，以产生28 mg KLH-肽缀合物。

此后，根据标准程序获得借助于这个免疫原产生的抗体。

实施例6：

Elecsys夹心测定的一般说明

免疫夹心测定的测试原理在图1中描绘。测定所需的总温育时间为18分钟。

第一温育（9分钟）：20μL样品（1:5预稀释的）、针对PIVKA-II的N-末端的第一生物素化的单克隆PIVKA-II-特异性抗体）和根据实施例4用钌络合物标记的第二PIVKA-II-特异性单克隆抗体（7A10）共温育，并形成包含生物素化的抗体、PIVKA-II和钌化的抗体的夹心复合体。

第二温育（9分钟）：将链霉抗生物素蛋白包被的微粒（Elecsys®珠）添加到第一温育步骤的混合物中，且在这个第二温育过程中，包含生物素化的抗体、PIVKA-II和钌化的抗体的复合体通过生物素和链霉抗生物素蛋白的相互作用变得与固相结合。

将反应混合物吸到测量池中，在那里微粒被磁性地捕获到电极的表面上。未结合的物质然后用ProCell II M去除。然后，电压到电极上的施加诱导基于电化学发光的光发射，其由光电倍增管测量。

按照标准和常规，然后通过校准曲线对PIVKA-II进行定量/测量。

新开发的PIVKA-II Elecsys®测定的测量范围是0-5000 ng/ml

实施例7：

PIVKA-II Elecsys测定在肝细胞癌（HCC）的早期检测中的应用

7.1 分析的样品

在前瞻性多中心样品收集中，在从患者和对照收集的血清中检查了PIVKA-II水平。

样品试验对象组的组成如下：

患者：

•肝细胞癌（HCC）（n = 309），包括：

•BCLC（巴塞罗那临床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer））0期（n = 10），BCLC A（n = 116），BCLC B（n = 77），BCLC C（n = 82），BCLC D：（n = 12）；没有分期的患者（n =12），

•其他患者CCC（=胆管癌）和混合的HCC/CCC（n = 21），

对照：

已获得了来自对照主体的总计742个样品，包括慢性乙型肝炎感染（HBV）患者（n =226），慢性丙型肝炎感染（HCV）患者（n = 52），肝硬变+ HBV（n = 173），肝硬变+ HCV（n =136），混合性肝硬变（n = 88），其他（n = 67）。另一组对照主体包括可疑但未进一步阐明的病例（n = 12）。

样品来历：

已在以下地点收集了样品：（1）泰国：合艾Songklanagarind医院；孔敬Srinagarind医院；曼谷Siriraj医院；清迈Maharaj Nakorn医院；（2）中国：香港威尔斯亲王医院；（3）德国：NCT Heidelberg；（4）西班牙：Hospital Vall d‘Hebron Barcelona

表4：关于收集/分析的样品的人口统计信息

7.2 Elecsys PIVKA-II测定与WAKO DCP测试的方法比较

由PIVKA-II Elecsys测定和WAKO DCP测定（WAKO Chemicals GmbH, Fuggerstr. 12,D-41 468 Neuss，德国）分析了7.1中描述的血清样品（n = 1084）。

WAKO DCP测定基于用激光诱导的荧光检测的抗体结合的DCP的微观流体等速电泳，并应用一种针对凝血酶原aa11-35产生的特异性抗体（YS5；Yamaguchi等人, Clin.Chem. Lab. Med. 2008; 46(3): 411-6）。WAKO DCP测试的可报告范围是0.1-950 ng/ml。

线性相关系数（图2）低于0.9，从而表明所分析的样品中天然PIVKA-II的识别中的差异。假定WAKO和本文上面公开的Elecsys测定之间的弱相关的原因在于由于根据本发明的捕获抗体的不同抗体结合的不同PIVKA-II形式的识别。

7.3 Elecsys PIVKA-II测定与WAKO DCP（PIVKA-II）测试相比的临床表现比较

Roche PIVKA-II和WAKO DCP测定的临床灵敏度于90％特异性进行计算。同样， RochePIVKA-II和WAKO DCP测定的临床特异性于90％灵敏度进行计算。对于所有病期的HCC（n =309）对所有对照以及早期的HCC（BCLC 0和A，n = 126）对所有对照进行了独立评价。此外，对两种测定和评价方法计算了曲线下面积（AUC）。

表5：PIVKA-II Elecsys测定和WAKO DCP测定的临床表现特征

如从表5可以看出的，与WAKO DCP测试相比，对于Elecsys PIVKA-II测定的所有HCC病期对对照以及早期HCC对对照在对于90％灵敏度进行最优化的截断值（cut-off）的临床特异性更优越（分别为59％对51％和27.6％对26.1％）。

同时，对于两种测定，在对于90％特异性进行最优化的截断值的灵敏度非常类似。

Elecsys PIVKA-II测定还显示，与对照相比，分别对于所有HCC组和早期HCC组两者计算的稍微增加的AUC。高灵敏度区域（60-95％）中的受试者工作曲线（receiveroperator curve）（ROC）的详细分析证实了分别对于所有HCC病期（图3）和早期HCC病期（图4）Elecsys PIVKA-II与WAKO DCP相比更优越的特异性。

7.4 结论

因为现有PIVKA-II测定的假阳性率仍然显著（Lee等人，Korean J. Clin. Pathol.1997; 17(3): 395-404，Taketa等人. Acta Med. Okayama 2002; 56 (6): 317-320），并且因为在早期的HCC检测中的灵敏度和特异性不与对于晚期HCC一样好（Lim等人. Scand.J. Gastroenterol. 2016; 51(3): 344-53），所以PIVKA-II检测方法的改进在临床决定的作出中非常重要。如本文所公开的，分别在PIVKA-II的γ-羧化氨基酸19和20周围具有独特结合性质的抗体的使用导致这种新开发的PIVKA-II测定改进的特异性，尤其是在高灵敏度区域。这对于所有HCC患者的检测以及甚至对于早期（BCLC 0-A）的HCC的检测均是正确的。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> PIVKA的新结合剂和测定

<130> P34334-WO

<150> EP17181242

<151> 2017-07-13

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala

1 5 10 15

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> Xaa

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是γ-羧化的谷氨酸

<400> 2

Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Xaa Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> Xaa

<222> (13)..(13)

<223> Xaa代表γ羧化的谷氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 3

Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Xaa Glu Ala

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> Xaa

<222> (9)..(9)

<223> Xaa代表γ羧化的谷氨酸

<400> 4

Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Xaa Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala

1 5 10 15

<210> 5

<211> 622

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln

20 25 30

Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu

35 40 45

Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr

50 55 60

Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr

65 70 75 80

Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro

85 90 95

Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu

100 105 110

Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu

115 120 125

Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu Ile Asn Ser

130 135 140

Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro

145 150 155 160

Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val

165 170 175

Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr

180 185 190

Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro

195 200 205

Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg

210 215 220

Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala

225 230 235 240

Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln

245 250 255

Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val

260 265 270

Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu

275 280 285

Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp

290 295 300

Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr

305 310 315 320

Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys

325 330 335

Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu

340 345 350

Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser

355 360 365

Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys

370 375 380

Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp

385 390 395 400

Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn

405 410 415

Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr

420 425 430

Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr

435 440 445

Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala

450 455 460

Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro

465 470 475 480

Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly

485 490 495

Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr

500 505 510

Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu

515 520 525

Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile

530 535 540

Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg

545 550 555 560

Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser

565 570 575

Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu

580 585 590

Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg

595 600 605

Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu

610 615 620

<210> 6

<211> 579

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu

20 25 30

Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu

35 40 45

Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn

50 55 60

Cys Ala Glu Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr

65 70 75 80

Arg Ser Gly Ile Glu Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys

85 90 95

Pro Glu Ile Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn

100 105 110

Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr

115 120 125

Thr Asp Pro Thr Val Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly

130 135 140

Gln Asp Gln Val Thr Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser

145 150 155 160

Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln

165 170 175

Gln Tyr Gln Gly Arg Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu

180 185 190

Ala Trp Ala Ser Ala Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe

195 200 205

Asn Ser Ala Val Gln Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly

210 215 220

Asp Glu Glu Gly Val Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe

225 230 235 240

Gly Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr

245 250 255

Gly Asp Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr

260 265 270

Ala Thr Ser Glu Tyr Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser

275 280 285

Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu

290 295 300

Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg

305 310 315 320

Ile Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val

325 330 335

Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu

340 345 350

Ile Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro

355 360 365

Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly

370 375 380

Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met

385 390 395 400

Leu Glu Lys Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu

405 410 415

Asp Arg Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser

420 425 430

Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser

435 440 445

Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu

450 455 460

Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu

465 470 475 480

Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser

485 490 495

Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro

500 505 510

Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro

515 520 525

Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile

530 535 540

Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr

545 550 555 560

Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln

565 570 575

Phe Gly Glu

<210> 7

<211> 46

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu

20 25 30

Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala

35 40 45

<210> 8

<211> 225

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu

1 5 10 15

Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn

20 25 30

Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro

35 40 45

His Lys Pro Glu Ile Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln

50 55 60

Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys

65 70 75 80

Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val

85 90 95

Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly

100 105 110

Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg

115 120 125

Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro

130 135 140

Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln

145 150 155 160

Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro

165 170 175

Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly

180 185 190

Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu

195 200 205

Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly

210 215 220

Arg

225

<210> 9

<211> 155

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu

20 25 30

Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu

35 40 45

Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn

50 55 60

Cys Ala Glu Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr

65 70 75 80

Arg Ser Gly Ile Glu Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys

85 90 95

Pro Glu Ile Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn

100 105 110

Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr

115 120 125

Thr Asp Pro Thr Val Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly

130 135 140

Gln Asp Gln Val Thr Val Ala Met Thr Pro Arg

145 150 155

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 11

Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 12

Gln Ser Tyr Ala Gly Val Ser Glu Ser Val Phe Trp Tyr Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 13

Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 14

Ile Ile Arg Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 15

Asn Val Ser Leu

1

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 16

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys

65 70 75 80

Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Gly Val Ser Glu

85 90 95

Ser Val Phe Trp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Gly Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 110

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 17

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Thr Tyr Ala

20 25 30

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Arg Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Ser Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asn

85 90 95

Val Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

100 105 110

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 18

Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 19

Ser Ala Ser Thr Leu Ala Pro

1 5

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 20

Gln Ser Tyr Ala Gly Val Ser Ala Asn Ile Phe Tyr Tyr Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 21

Thr Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Val Gly

1 5 10

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 22

Leu Ile Thr Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 23

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Phe Thr Gly Val Gln Cys

65 70 75 80

Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Ala Gly Val Ser Ala

85 90 95

Asn Ile Phe Tyr Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Met

100 105 110

<210> 24

<211> 110

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 24

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Arg Tyr Ala

20 25 30

Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Leu Ile Thr Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asn

85 90 95

Val Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

100 105 110

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 25

Leu Ile Val Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 26

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Phe Ser Gly Val Gln Cys

65 70 75 80

Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Ala Gly Val Ser Ala

85 90 95

Asn Ile Phe Tyr Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Met

100 105 110

<210> 27

<211> 110

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 27

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Ile Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Arg Tyr Ala

20 25 30

Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Leu Ile Val Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Pro Thr Ala Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asn

85 90 95

Val Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

100 105 110

<210> 28

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 28

Gln Ser Tyr Ala Gly Ile Ser Ala Asn Ile Phe Tyr Tyr Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 29

Thr Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 30

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 30

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys

65 70 75 80

Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Gly Ile Ser Ala

85 90 95

Asn Ile Phe Tyr Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Met

100 105 110

<210> 31

<211> 110

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 31

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Glu Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Asp Leu Ser Arg Tyr Ala

20 25 30

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Leu Ile Val Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Ala Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asn

85 90 95

Val Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Glu

100 105 110

<210> 32

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(4)

<223> 位置1、3和4处的Xaa是β-丙氨酸；位置2处的Xaa是6-氨基己酸

<400> 32

Xaa Xaa Xaa Xaa Val Arg Arg Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu

1 5 10 15

Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala

20 25

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> Xaa

<222> (1)..(4)

<400> 33

Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser

1 5 10 15

Tyr Glu Glu Ala

20

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> Xaa

<222> (17)..(19)

<223> 位置17和19处的Xaa是β-丙氨酸；位置18处的Xaa是6-氨基己酸

<400> 34

Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Cys

20

Claims

1.结合PIVKA-II的特异性结合剂，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ IDNO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少10-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽。

2.结合PIVKA-II的特异性结合剂，其特征在于其结合SEQ ID NO：1的合成肽，与SEQ IDNO：2的合成肽相比对SEQ ID NO：1的肽具有至少15-倍的结合偏爱，且与SEQ ID NO：1的肽相比至少一样好地结合SEQ ID NO：3的合成肽。

3.权利要求1或2的特异性结合剂，其进一步特征在于与SEQ ID NO：4的肽相比对SEQID NO：1的肽具有结合偏爱。

4.根据权利要求1-3任一项的特异性结合剂，其中所述特异性结合剂是单克隆抗体。

5.根据权利要求4的单克隆抗体，其中所述抗体进一步特征在于，CDRs包含以下氨基酸序列或每个CDR在最多一个氨基酸取代方面不同的其变体：

6.检测样品中的PIVKA-II的方法，所述方法包括以下步骤：

a）在足以形成特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件使所述样品与根据权利要求1-5任一项的PIVKA-II的特异性结合剂接触；和

b）检测特异性结合剂-PIVKA-II复合体的存在，其中所述特异性结合剂-PIVKA-II复合体的存在表明所述样品中存在PIVKA-II。

7.检测样品中的PIVKA-II的方法，其包括以下步骤：

a）使所述样品与根据权利要求1-5任一项的PIVKA-II的第一特异性结合剂和PIVKA-II的第二特异性结合剂接触，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和

b）测量在（a）中形成的复合体，从而检测所述样品中的PIVKA-II。

8.检测样品中的PIVKA-II的方法，所述方法包括以下步骤：

a）在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II复合体的时间和条件使所述样品与根据权利要求1-5任一项的PIVKA-II的第一特异性结合剂接触；

b）将PIVKA-II的第二特异性结合剂添加至所述第一特异性结合剂-PIVKA-II复合体，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；和

c）测量在（b）中形成的复合体，从而检测所述样品中的PIVKA-II。

9.根据权利要求7或8的方法，其中所述第二特异性结合剂是多克隆或单克隆抗体。

10.根据权利要求7-9的方法，其中由所述第二特异性结合剂结合的PIVKA-II上的表位包含在F1/F2中。

11.根据权利要求7-10任一项的方法，其中由所述第二特异性结合剂结合的PIVKA-II上的表位包含在F1中。

12.根据权利要求7-11任一项的方法，其中由所述第二特异性结合剂结合的PIVKA-II上的表位包含在PIVKA-II的Gla-结构域中。

13.在怀疑患有HCC的患者中诊断HCC的方法，其包括以下步骤：

a）从所述患者获得样品；

b）使所述样品与根据权利要求1-5任一项的PIVKA-II的第一特异性结合剂和PIVKA-II的第二特异性结合剂接触，其中所述第二特异性结合剂被可检测地标记，在足以形成第一特异性结合剂-PIVKA-II-第二特异性结合剂复合体的时间和条件；

c）测量在（b）中形成的复合体，从而测量所述样品中存在的PIVKA-II的量，其中大于参考水平的PIVKA-II的量指示患者中HCC的存在。

14.根据权利要求1-5任一项的结特异性结合剂在测量PIVKA-II中的用途。

15.用于检测和/或定量样品中PIVKA-II的量的试剂盒，其包括含有根据权利要求1-5任一项的特异性结合剂的容器。