CN116874595A - 一种抗甲胎蛋白的纳米抗体、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗甲胎蛋白的纳米抗体、试剂盒及应用，涉及单域重链抗体技术领域。本发明提供的4株抗AFP纳米抗体对AFP抗原均具有特异的识别和结合能力，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。可应用于甲胎蛋白的检测、富集和纯化。此外，上述抗体也可用于制备检测试剂、芯片，用于开发肝癌等以AFP为检测标志物的癌症辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒，尤其是肝癌的早期诊断，具有良好的应用前景。

Description

一种抗甲胎蛋白的纳米抗体、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及单域重链抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗甲胎蛋白的纳米抗体、试剂盒及应用。
背景技术
甲胎蛋白(AFP)是1965年Bergstrand和Czar在人胎儿血清中发现的一种胚胎专一性甲种球蛋白。AFP是单一多聚体肽键蛋白，由590个氨基酸组成，分子量约70kD，含糖4％。AFP主要由胎肝和卵黄囊合成，其次是胃肠道粘膜，肾脏也可少量合成。胎儿6周开始合成，12-15周达高峰，出生后1-2年降至成人水平。成人在发生肿瘤和妊娠时会出现AFP浓度的升高。
AFP是迄今为止发现的原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志物，70-95％的原发性肝癌患者呈现AFP水平升高。
通过检测血清AFP的动态变化可了解患者病情进展状态。治疗后病人血清中浓度的下降预示着治疗的成功，而浓度上升提升肿瘤组织的残留或复发。
检测血清AFP含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一。由于方法学的不断改进,使原发性肝癌的阳性检出率达到了85-90％以上。正常成人血清AFP含量各家报告不一致。可能与测定方法、标准品等不同有关。中国肝癌研究协会报道正常人血清＜20ng/mL。而原发性肝癌患者血清多数在500ng/mL左右。
通过观察血清AFP的动态变化可了解患者病情进展状态，因为血清AFP升高常发生在患者症状和体征出现数月之前，故AFP检测对原发性肝癌具有早期辅助诊断的价值。
目前AFP检测方法大多使用的传统抗体，如鼠源单克隆抗体、兔源多克隆抗体以及山羊抗体。这些抗体存在分子量大，稳定性差等缺陷，使得AFP检测灵敏度受到了一定的限制。
基于AFP在临床诊断、治疗和预后方面所表现出的突出特性，研发出针对AFP的新型特异性结合抗体显得尤为重要。
纳米抗体是来源于成年骆驼体内的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体更容易。纳米抗体具有独特的性质，在极端温度和pH环境中具有良好的稳定性，可以低成本大产量制造。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
AFP这一原发性肝癌标志物，目前国外有罗氏的电化学发光试剂盒问世，但是电化学发光存在交叉污染潜在问题，且对环境因素和其它非特异性反应过于敏感，同时电化学发光仪器及试剂完全依赖进口，价格非常昂贵，为患者带来一定的经济负担。另外，雅培、贝克曼、西门子等进口品牌都有AFP的化学发光检测试剂盒，其主要弊端是较为昂贵。国产试剂盒有深圳新产业、上海透景、安图生物、科美诊断的化学发光试剂盒，也有万孚生物、青岛汉唐等的免疫层析试剂盒，总体来说，都存在有检测灵敏度低的缺点。
现有专利中，CN113583133A、CN113173994A、CN113234166A、CN113214399A中提供了AFP纳米抗体的相关专利申请，且展示了纳米抗体在抗原检测上的应用前景，但是在具体应用上，即使拥有高亲和力的纳米抗体，在抗原检测的实际操作中仍然存在很大的技术问题。例如，在免疫夹心检测法中的第一抗体和第二抗体之间的抗原结合位点的重叠度问题，以及纳米抗体热稳定性的一系列问题依然是获得高效检测试剂盒的技术难题所在。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗甲胎蛋白的纳米抗体、试剂盒及应用，从而改善抗体的亲和力，降低多种抗体之间的抗原结合位点的重叠度，提高抗体的耐热稳定性，提升试剂盒的检测灵敏度。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗甲胎蛋白的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.9～11所示；
(2)如SEQ ID No.12～14所示；
(3)如SEQ ID No.15～17所示；
和(4)如SEQ ID No.18～20所示。
发明人筛选获得了4种纳米抗体，这4种纳米抗体对于甲胎蛋白均具有优异的特异性抗原结合能力，且均具有较高的亲和力和热稳定性。可以用于开发甲胎蛋白的检测产品、富集产品和纯化产品。将上述纳米抗体与免疫磁珠体系、化学发光体系相结合，可以开发磁微粒化学发光检测试剂盒。磁微粒化学发光技术既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫操作的简便、快速特点，易于自动化操作。此外，上述抗体也可用于制备检测试剂、芯片，用于开发肝癌等癌症的辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒，尤其是肝癌的早期诊断，具有良好的应用前景。
本发明中，“甲胎蛋白”，“AFP”均为指代相同的含义。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一种可选的实施方式中，骨架区选自如下任意一种：
(1)序列依次如SEQ ID NO.21-24所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
(2)序列依次如SEQ ID NO.25-28所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
(3)序列依次如SEQ ID NO.29-32所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
以及(4)序列依次如SEQ ID NO.33-36所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4。
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
名词解释：
单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。
多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。
在一种可选的实施方式中，当纳米抗体为单价纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
第二方面，本发明还提供了一种抗体，其含有上述的抗甲胎蛋白的纳米抗体或包括上述的抗甲胎蛋白的纳米抗体的重链可变区。
在一些实施例中，抗体可以为全长抗体、重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。
本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。
上述抗体包括不限于抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性，选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体或纳米抗体还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗甲胎蛋白的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体；
在一种可选的实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。
宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
在一种可选的实施方式中，真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；
在一种可选的实施方式中，动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
第五方面，本发明还提供了一种制备抗甲胎蛋白的纳米抗体或制备抗体的方法，其包括：培养上述的宿主细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成等)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明还提供了一种抗甲胎蛋白的纳米抗体或抗体在制备甲胎蛋白检测产品、甲胎蛋白富集产品、甲胎蛋白纯化产品、疾病辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒中的应用；疾病选自肝癌、肺癌、胰腺癌、性腺母细胞瘤、睾丸癌、卵巢肿瘤、恶性畸胎瘤和肝病中的任一种。癌症辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒以AFP为辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测标志物。
肝病包括不限于病毒性肝炎(viral hepatitis)、脂肪性肝病(FLD)、自身免疫性肝病(AIH)和药物性肝炎(drug-induced hepatitis)、胆汁淤积性肝病。
脂肪性肝病选自酒精性和非酒精性脂肪肝病。脂肪性肝病选自脂肪肝和脂肪性肝炎。
基于前述的4种纳米抗体均具有与甲胎蛋白较高的亲和力，因此可以用于甲胎蛋白的检测、富集和纯化。
现有技术研究表明，AFP是迄今为止发现的原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志物，70-95％的原发性肝癌患者呈现AFP水平升高。由于血清AFP升高常发生在患者症状和体征出现数月之前，故AFP检测对原发性肝癌具有早期辅助诊断的价值。因此，可以通过检测血清AFP含量从而辅助诊断或诊断肝癌。
通过检测血清AFP的动态变化可了解患者病情进展状态。治疗后病人血清中浓度的下降预示着治疗的成功，而浓度上升提升肿瘤组织的残留或复发。因此，本发明提供的抗甲胎蛋白的纳米抗体或抗体可以用于癌症的疗效评估或复发监测。
在一种可选的实施方式中，检测产品选自试剂盒或芯片。
在一种可选的实施方式中，检测产品选自试剂。
在一种可选的实施方式中，试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒、放射性免疫分析试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、荧光免疫分析试剂盒或时间分辨荧光免疫分析试剂盒。
在一种可选的实施方式中，试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒。例如基于双抗体夹心法的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括检测抗体和捕获抗体。
在一种可选的实施方式中，甲胎蛋白富集产品或纯化产品包括载体以及载体上的纳米抗体或抗体。
在一种可选的实施方式中，载体选自纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球或多孔材料。例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联纳米抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料，至于层析柱中从而制备相应的亲和柱，用于甲胎蛋白富集或纯化。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示的纳米抗体为捕获抗体。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.6所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体。特别是以SEQ ID NO.6所示的纳米抗体为捕获抗体，SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体时，与其他的组合相比，抗原表位差异更大，位点重叠极少，可以扩大检测信号而获得更好的检测灵敏度，可以增大检测和诊断的效率。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.6-8任一项所示的纳米抗体为检测抗体。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.7所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.5-6任一项所示的纳米抗体或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.5-7任一项所示的纳米抗体为检测抗体。
第七方面，本发明还提供了一种带有抗甲胎蛋白的纳米抗体或抗体的产品，产品为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、EP管、多孔板微量反应板凹孔、NC膜或PDMS膜。
磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、PEG修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、二氧化硅磁性微球。
乳胶微球是由无定形聚合物(通常是聚苯乙烯)形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5μm的颗粒，或者粒径超过1μm的颗粒。
乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。
带有纳米抗体或抗体的琼脂糖凝胶微球例如通过如下方法制备：
将琼脂糖凝胶与偶联试剂反应形成带有环氧基的活化琼脂糖凝胶微球，然后与AFP纳米抗体或抗体的氨基偶联，制备琼脂糖凝胶-AFP的吸附材料，即得。其中，偶联试剂为卤代环氧化合物和/或双缩水甘油醚类试剂。
在其他实施方式中，也可将溴化氰活化的琼脂糖凝胶至相应规格的砂芯漏斗中抽干，用HCl搅拌均匀后抽干，再加入偶联缓冲液处理，在将AFP纳米抗体或抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶反应，获得带有纳米抗体或抗体的琼脂糖凝胶微球。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在一种可选的实施方式中，多孔板为酶标板。在其他实施方式中，也可以是其他的固相支持物。
第八方面，本发明还提供了一种疾病辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒或甲胎蛋白检测的试剂盒，辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒以AFP为辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测标志物，其包括：抗甲胎蛋白的纳米抗体、抗体和产品三者中的至少一种；
疾病选自肝癌、肺癌、胰腺癌、性腺母细胞瘤、睾丸癌、卵巢肿瘤、恶性畸胎瘤和肝病中的任一种；
在一种可选的实施方式中，肝病包括不限于病毒性肝炎(viral hepatitis)、脂肪性肝病(FLD)、自身免疫性肝病(AIH)和药物性肝炎(drug-induced hepatitis)、胆汁淤积性肝病。
脂肪性肝病选自酒精性和非酒精性脂肪肝病。脂肪性肝病选自脂肪肝和脂肪性肝炎。
在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括缓冲液、AFP标准品、化学发光预激发液、化学发光激发液以及清洗液。
化学发光预激发液为HNO3、H2O2、乙腈、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱和水或其中若干组成的混合液，例如含有1.32％w/v过氧化氢的酸性溶液，化学发光激发液为NaOH、乙腈、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱和水或其中若干组成的混合液，用于激发化学发光反应。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中的纳米抗体或抗体标记有可被检测的标记物，和/或试剂盒包括产品，且产品连接有纳米抗体或抗体。
在一种可选的实施方式中，连接为偶联和/或物理连接。物理连接包括不限于静电吸附等。物理连接如免疫比浊平台。
在一种实施方式中，连接有纳米抗体或抗体的纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或乳胶微球作为捕获抗体，标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体作为检测抗体。
在另外一种实施方式中，当试剂盒仅包括：标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体；此时的纳米抗体或抗体可用于捕获或检测抗体。
在一种可选的实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。
荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。
胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示的纳米抗体为捕获抗体。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.6所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体偶联于产品上，检测抗体上标记有标记物。特别是以SEQ ID NO.6所示的纳米抗体为捕获抗体，SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体时，与其他的组合相比，抗原表位差异更大，位点重叠极少，可以扩大检测信号而获得更好的检测灵敏度，可以增大检测和诊断的效率。
本发明提供的SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的四种纳米抗体分别针对AFP抗原不同的抗原表位，可以结合不同的抗原表位并扩大检测信号而获得更好的检测灵敏度，通过双抗夹心的方法，可以快速准确地完成AFP的捕获和检测。由此，组成的捕获-检测抗体对可以增大检测和诊断的效率。此外，本发明提供的检测试剂盒与罗氏AFP诊断试剂盒的检测值相关性较好，精密度在3％以下，灵敏度在0.2以下，性能良好。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.6-8任一项所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体偶联于产品上，检测抗体上标记有标记物。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.7所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.5-6任一项所示的纳米抗体或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体偶联于产品上，检测抗体上标记有标记物。
在一种可选的实施方式中，以SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ IDNO.5-7任一项所示的纳米抗体为检测抗体；捕获抗体偶联于产品上，检测抗体上标记有标记物。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的4株抗AFP纳米抗体对AFP抗原均具有特异的识别和结合能力，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。可应用于甲胎蛋白的检测、富集和纯化。上述抗体也可用于制备检测试剂、芯片，用于开发肝癌等以AFP为检测标志物的癌症辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒，尤其是肝癌的早期诊断，具有良好的应用前景。
(2)本发明提供的4种抗甲胎蛋白的纳米抗体与甲胎蛋白具有良好的亲和力。
(3)本发明提供的4种抗甲胎蛋白的纳米抗体与传统甲胎蛋白抗体相比具有更优的热稳定性。
(4)本发明制备的检测试剂盒与罗氏AFP诊断试剂盒检测值相关性较好。
(5)本发明制备的检测试剂盒的精密度高。
(6)本发明制备的检测试剂盒的灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为4株AFP纳米抗体(AFP05、AFP11、AFP22和AFP38)的电泳图；
图2为AFP纳米抗体与抗原的结合情况；
图3为4株AFP纳米抗体和传统AFP抗体的热稳定性；
图4为制备的AFP检测试剂盒(AFP11-AFP38)与罗氏AFP诊断试剂盒检测值的相关性；
图5为制备的AFP检测试剂盒(AFP22-AFP11)与罗氏AFP诊断试剂盒检测值的相关性。
图6为制备的AFP试剂盒(AFP22-AFP11)检测肝癌患者与健康人血清AFP浓度的散点图；
图7为制备的AFP试剂盒(AFP22-AFP11)检测肝癌患者与健康人血清AFP浓度的ROC曲线。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例进行纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选。
1.羊驼免疫及淋巴细胞分离
选取健康成年羊驼一只，将重组AFP抗原与弗氏佐剂按1：1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。
2.总RNA提取和逆转录合成cDNA
RNA的提取参照TAKARA公司Total RNA提取试剂盒说明书进行。以RNA为模板，oligo-dT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。
3.抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物
序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μL。第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物。
4.载体构建
将pMES4与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果。
5.电转化及库容测定
取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG
6.噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10mL菌液加入4×1010VCSM13(购买自北京启研生物)，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40mL管中，加入10mL PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1mL冰PBS洗涤离心，取上清250μL预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/mL))＝稀释倍数×噬菌斑数目×100。
7.纳米抗体筛选
通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μL噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。挑选ELISA鉴定结果为阳性的克隆摇菌抽质粒，送测序公司进行测序鉴定分析。
8.纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用His标签琼脂糖凝胶(上海翎因生物科技有限公司自产)进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、淋巴细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗AFP的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary DeterminingRegions，CDR)。
结果发现共有4种DNA序列，将这4个抗体按照其克隆编号命名分别为AFP05、AFP11、AFP22和AFP38，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。
实施例2
本实施例进行纳米抗体的表达和纯化。
1.纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃200rpm过夜培养。次日，使用质粒抽提试剂盒(购自OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μL转化于100μL感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μL LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μL，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
2.纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100mL新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0mL TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5mL的上清(周质提取物)。
3.纳米抗体的纯化和鉴定
将以上样品使用His标签琼脂糖凝胶(上海翎因生物科技有限公司自产)进行纯化，使用20mM咪唑洗杂后，再使用300mM咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行SDS-PAGE电泳分析。电泳分析结果如图1所示，最后将纯化好的纳米抗体透析到PBS中，置于2～8℃保存待用。
实施例3
本实施例采用ELISA法验证AFP纳米抗体与AFP抗原的结合能力。
利用酶联免疫分析法(ELISA)对纯化的AFP纳米抗体进行抗原结合力测试。首先按照EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒的说明书，将纯化的AFP纳米抗体偶联上生物素。其次将AFP抗原(1μg/孔)包被在酶标板上，4℃过夜，用3％BSA封闭，室温孵育2h，用PBST清洗5次，每次1min。加入生物素化的纳米抗体(1μg/孔)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。再加入HRP偶联的链霉亲和素(1：10000)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min。最后加入100μL TMB显色液，室温避光显色20min。加入50μL 2M浓硫酸终止反应，在酶标仪上，测定450nm波长下的吸收值。
结果如图2所示，空白为PBST。4株AFP纳米抗体都与AFP抗原有很强的结合能力，尤其是AFP11和AFP38的结合能力最强。
实施例4
本实施例进行AFP纳米抗体的ELISA叠加数据分析。
1.抗原饱和浓度的确定
以2μg/mL的浓度包被AFP抗原，100μL/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体，阴性对照(阴性血清1:100)，PBS空白对照，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10min，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。
2.位点叠加实验
先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2*A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)*100％
A1—第一株抗体读数
A2—第二株抗体读数
A(1+2)—叠加2种抗体读数
表1抗体抗原表位叠加实验
1st抗体 2nd抗体 1st抗体+2nd抗体 叠加率
AFP05+AFP11 0.413 0.656 0.775 62.1％
AFP05+AFP22 0.413 0.479 0.682 69.2％
AFP05+AFP38 0.413 0.523 0.665 59.2％
AFP11+AFP22 0.656 0.479 1.084 95.3％
AFP11+AFP38 0.656 0.523 1.102 93.0％
AFP22+AFP38 0.479 0.523 0.815 77.1％
实验结果见表1，4株纳米抗体分别针对AFP抗原不同的抗原表位，这预示着在AFP的检测应用上，每种组合都可以结合不同的抗原表位并扩大检测信号而获得更好的检测灵敏度。尤其是AFP11+AFP22和AFP11+AFP38组成的检测抗体对，抗原表位差异更大，位点重叠极少，可以扩大检测信号而获得更好的检测灵敏度，可以增大检测和诊断的效率。
实施例5
本实施例展示了抗AFP纳米抗体的热稳定性。
利用酶联免疫分析法(ELISA)对纯化的AFP纳米抗体的热稳定性进行测试。以5μg/mL的浓度包被AFP抗原，100μL/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入稀释的AFP纳米抗体或传统抗AFP抗体(购买自Medix Biochemica)，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：2000比例稀释的HRP标记的抗His标签二抗，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，分别在25℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃孵育30min，2M硫酸终止反应，读取吸光值450nm读数。采用ELISA测定各抗体在不同温度处理下剩余抗原结合活性，每组设立3个平行重复孔，以室温(25℃)处理后的结合值作为100％结合对照，计算每组重复测定样品的平均吸光度值，计算相对活性，如图3所示。
结果显示与传统抗AFP抗体相比，4株抗AFP纳米抗体在温度90℃，依然具有较强的生物活性，具有较好的热稳定性，应用前景广阔。
实施例6
本实施例提供了抗AFP纳米抗体在磁微粒化学发光检测试剂盒的应用。
1.包被抗AFP纳米抗体磁珠的制备
量取一定量羧基磁珠(来源于上海翎因生物科技有限公司)，用pH为5.0的0.1M的MES缓冲液洗涤羧基磁珠，洗涤次数为2～3次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下活化30min，活化完成后，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用pH为5.0的0.1M的MES缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数3～4次；加入抗AFP纳米抗体进行包被，在室温下使用旋转混匀仪混匀，反应2h；包被反应结束后加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用含有3％BSA的封闭液(pH为7.2的0.1M的Tris-HCl)进行封闭3h以保存抗体包被磁珠，使入抗AFP纳米抗体包被磁珠的最终浓度为0.5mg/mL，于2-8℃保存备用。
2.吖啶酯标记抗AFP纳米抗体溶液的制备
量取一定量的吖啶酯(浓度为0.5mM)，再按照一定比例加入抗AFP纳米抗体，在旋转混匀仪上避光反应2h，再加入一定量的赖氨酸淬灭未反应的吖啶酯，后续使用脱盐柱去除吖啶酯，得到吖啶酯标记的抗AFP纳米抗体溶液，于2-8℃保存备用。
3.AFP系列校准品的配制
用0.01M PBS缓冲液(pH 7.2)加入3％牛血清白蛋白和0.5％蛋白稳定剂AES，再加入0.05％浓度的EDTA稳定剂以及0.2％Proclin-300配成校准品稀释液，用上述稀释液稀释AFP抗原配制成标示浓度为的1100ng/mL、500ng/mL、125ng/mL、25ng/mL、5ng/mL、0ng/mL的一系列校准品，于2-8℃保存备用。
4.AFP检测试剂盒性能测试
(1)相关性测试
搜集30份临床血清样本，理论值覆盖线性范围1～1000ng/mL，用罗氏AFP诊断试剂盒及电化学发光分析仪，参照说明书条件测试。相同的阳性样本用自制的AFP检测试剂盒性能测试10μL样本+25μL抗AFP纳米抗体包被磁珠+100μL吖啶酯标记抗AFP纳米抗体溶液(100倍稀释)，37℃反应15分钟，洗涤6次，加入每孔加入发光液A和发光液B各100μL，振荡混匀后测定发光信号值。记录测试结果，计算自配AFP检测试剂盒与罗氏AFP诊断试剂盒测试结果线性拟合相关性曲线方程及相关性系数R2。
参见图4，AFP11(磁珠包被抗体)与AFP38(吖啶酯标记抗体)配对所制备发光试剂测试结果与罗氏AFP诊断试剂盒检测值的线性拟合曲线为：y＝0.983x+2.0223，R2＝0.9974，因此，本发明制备的AFP检测试剂盒与罗氏AFP诊断试剂盒检测值相关性较好。
参见图5，AFP22(磁珠包被抗体)与AFP11(吖啶酯标记抗体)配对所制备发光试剂测试结果与罗氏AFP诊断试剂盒检测值的线性拟合曲线为：y＝1.1063x-1.964，R2＝0.9976，因此，本发明制备的AFP检测试剂盒与罗氏AFP诊断试剂盒检测值相关性较好。
(2)精密度测试
选择低值和高值两个水平的质控血清作为评价样本，测试上述AFP11(磁珠包被抗体)与AFP38(吖啶酯标记抗体)以及AFP22(磁珠包被抗体)与AFP11(吖啶酯标记抗体)配对的AFP检测试剂盒的性能。10μL样本+25μL抗AFP纳米抗体包被磁珠+100μL吖啶酯标记抗AFP纳米抗体溶液(100倍稀释)，37℃反应15分钟，洗涤6次，加入每孔加入发光液A和发光液B各100μL，振荡混匀后测定发光信号值。精密度：在较短的时间内及稳定的条件下连续重复测定10次，记录每次的测定结果并计算均值、标准差(SD)、变异系数(CV)。
结果如下表2和表3所示，结果显示，本发明制备的AFP检测试剂盒的精密度为3％以下，性能良好。
表2自制AFP检测试剂盒(AFP11-AFP38)精密度测试结果
表3自制AFP检测试剂盒(AFP22-AFP11)精密度测试结果
(3)灵敏度测试
选择0水平校准品(校准品稀释液0ng/ml)作为评价样本，测试上述AFP11(磁珠包被抗体)与AFP38(吖啶酯标记抗体)以及AFP22(磁珠包被抗体)与AFP11(吖啶酯标记抗体)配对的AFP检测试剂盒的性能。10μL样本+25μL抗AFP纳米抗体包被磁珠+100μL吖啶酯标记抗AFP纳米抗体溶液(100倍稀释)，37℃反应15分钟，洗涤6次，加入每孔加入发光液A和发光液B各100μL，振荡混匀后测定发光信号值。分析灵敏度(最低检出限)：重复测定0水平校准品(校准品稀释液)20次，记录每次的测定结果并计算均值(M)、标准差(SD)，将M+2SD带入标准曲线所得结果即为灵敏度。
结果如下表4所示，结果显示，本发明制备的AFP检测试剂盒(AFP11-AFP38)及(AFP22-AFP11)的灵敏度分别为0.164和0.140，性能良好。
表4自制AFP检测试剂盒(AFP11-AFP38)及(AFP22-AFP11)灵敏度测试结果
实施例7
本实施例提供自制AFP检测试剂盒(AFP22-AFP11)用于肝癌诊断。
从上海肿瘤医院收集肝癌患者血清40例，从血站收集健康人血清40例，用实施例6中试剂盒(AFP22-AFP11)检测血清AFP浓度，考察血清AFP浓度检测用于肝癌诊断和预示的效果。结果如下：
图6与图7分别为采用实施例6中试剂盒(AFP22-AFP11)检测肝癌患者与健康人血清AFP浓度的散点图和ROC曲线。由图6、7可知，ROC曲线下面积为0.8994，95％CI＝0.8328-0.9660，由此确定临床诊断cutoff值为16.26ng/mL，血清AFP浓度明显高于16.26ng/mL的判断为肝癌患者，明显低于16.26ng/mL的判断为非肝癌患者，在该值附近区域的为疑似肝癌患者，灵敏度为80％，特异性为80％。
综上结果可以看出，自制AFP检测试剂盒(AFP22-AFP11)可以用于肝癌诊断和预示，且灵敏度和特异性性能较为优异。
实施例8
本实施例提供了AFP纳米抗体用于亲和纯化介质的制备和纯化步骤。
1.AFP纳米抗体磁珠的制备
量取一定量羧基磁珠(来源于上海翎因生物科技有限公司)，用pH为5.0的0.1M的MES缓冲液洗涤羧基磁珠，洗涤次数为2～3次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下活化30min，活化完成后，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用MES缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数3～4次；加入AFP纳米抗体进行偶联，在室温下使用旋转混匀仪混匀，反应2h；反应结束后加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用含有3％BSA的封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)进行封闭3h以保存AFP纳米抗体磁珠，使入AFP纳米抗体磁珠的最终浓度为10mg/mL，于2～8℃保存备用。
2.AFP纳米抗体琼脂糖凝胶的制备
量取一定量的CNBr活化的琼脂糖凝胶至相应规格的砂芯漏斗中抽干，加入2倍凝胶体积的0.01M HCl搅拌均匀后抽干，重复2-3次。再加入偶联缓冲液(PBS，pH7.2)搅拌混匀后抽干，重复2-3次，置于反应容器中，加入AFP纳米抗体(5mg抗体/g琼脂糖凝胶)，室温反应2h。反应结束后，用2倍凝胶体积的PBS洗涤两次，加入封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)室温反应3h以封闭未反应的活性基团。用2倍凝胶体积的PBS洗涤5次后，加入20％乙醇水溶液保存AFP纳米抗体琼脂糖凝胶，最终浓度为50％，于2～8℃保存备用。
3.AFP纳米抗体琼脂糖磁珠的制备
量取一定量的NHS活化的琼脂糖磁珠至反应容器中，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用MES缓冲液(0.1M，pH6.0)洗涤2次，去除上清。加入AFP纳米抗体(2mg抗体/mL琼脂糖磁珠)，室温反应2h。反应结束后，磁性分离，去除上清，加入封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)室温反应3h以封闭未反应的活性基团。用PBS洗涤5次后，加入20％乙醇水溶液保存AFP纳米抗体琼脂糖磁珠，最终浓度为50％，于2～8℃保存备用。
4.AFP纳米抗体亲和纯化介质用于亲和纯化
使用上述制备的AFP纳米抗体亲和纯化介质进行AFP蛋白的纯化。将AFP纳米抗体亲和纯化介质加入至层析柱中，流出保存液，使用PBS(pH7.2)清洗层析柱数次后，加入AFP蛋白样品溶液，置于旋转混匀仪孵育30～60min后，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。用5～10倍柱体积的PBS进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白后使用甘氨酸(pH2.2)洗脱特异性的AFP蛋白，收集洗脱液，即为纯化后的AFP蛋白溶液。
综上，本发明提供的4株抗AFP纳米抗体对AFP抗原具有特异的识别和结合能力，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。同时，本发明提供的4种抗甲胎蛋白的纳米抗体与传统甲胎蛋白抗体相比具有良好的热稳定性。另外，本发明提供的抗AFP纳米抗体(AFP11)在ELISA叠加实验中显示其与抗AFP纳米抗体(AFP38)在抗原识别表位上具有较低的重叠性，且抗AFP纳米抗体(AFP11)作为磁珠包被抗体，与作为吖啶酯标记抗体的抗AFP纳米抗体(AFP38)配对使用，应用于磁微粒化学发光检测AFP的方法中显示了优异的检测性能。同时发现抗AFP纳米抗体(AFP22)作为磁珠包被抗体，与作为吖啶酯标记抗体的抗AFP纳米抗体(AFP11)配对使用，应用于磁微粒化学发光检测AFP的方法中也显示了优异的检测性能。该特性有助于本发明提供的纳米抗体应用于AFP磁微粒化学发光检测试剂盒的开发。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗甲胎蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个所述重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.9～11所示；
(2)如SEQ ID No.12～14所示；
(3)如SEQ ID No.15～17所示；
和(4)如SEQ ID No.18～20所示。
2.根据权利要求1所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括骨架区；
优选地，所述骨架区选自如下任意一种：
(1)序列依次如SEQ ID NO.21-24所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
(2)序列依次如SEQ ID NO.25-28所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
(3)序列依次如SEQ ID NO.29-32所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
以及(4)序列依次如SEQ ID NO.33-36所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
优选地，所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种；
优选地，当所述纳米抗体为单价纳米抗体时，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
3.一种抗体，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体或包括权利要求1或2所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体的重链可变区。
4.一种核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体；或所述核酸分子编码权利要求3所述的抗体；
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示。
5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的重组载体。
6.一种制备如权利要求1或2所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体或制备如权利要求3所述的抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞。
7.一种如权利要求1或2所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体或权利要求3所述的抗体在制备甲胎蛋白检测产品、甲胎蛋白富集产品、甲胎蛋白纯化产品、疾病辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒中的应用；其特征在于，所述疾病选自肝癌、肺癌、胰腺癌、性腺母细胞瘤、睾丸癌、卵巢肿瘤、恶性畸胎瘤和肝病中的任一种，且所述癌症辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒以AFP为辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测标志物；
优选地，所述肝病选自病毒性肝炎、脂肪性肝病、自身免疫性肝病和药物性肝炎、胆汁淤积性肝病中的至少一种；
优选地，所述检测产品选自试剂盒或芯片；
优选地，所述检测产品选自试剂；
优选地，所述试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒、放射性免疫分析试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、荧光免疫分析试剂盒或时间分辨荧光免疫分析试剂盒；
优选地，所述试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒；
优选地，所述甲胎蛋白富集产品或纯化产品包括载体以及载体上的纳米抗体或抗体；
优选地，所述载体选自纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球或多孔材料；
优选地，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体；
优选地，以SEQ ID NO.6所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；
优选地，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.6-8任一项所示的纳米抗体为检测抗体；
优选地，以SEQ ID NO.7所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5-6任一项所示的纳米抗体或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；
优选地，以SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5-7任一项所示的纳米抗体为检测抗体。
8.一种带有权利要求1或2所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体或权利要求3所述的抗体的产品，其特征在于，所述产品为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、EP管、多孔板微量反应板凹孔、NC膜或PDMS膜；
优选地，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒；
优选地，所述多孔板为酶标板。
9.一种疾病辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒或甲胎蛋白检测的试剂盒，所述辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测试剂盒以AFP为辅助诊断、诊断、疗效评估或复发监测标志物，其特征在于，其包括：权利要求1或2所述的抗甲胎蛋白的纳米抗体、权利要求3所述的抗体和权利要求8所述的产品三者中的至少一种；
所述疾病选自肝癌、肺癌、胰腺癌、性腺母细胞瘤、睾丸癌、卵巢肿瘤、恶性畸胎瘤和肝病中的任一种；
优选地，所述肝病选自病毒性肝炎、脂肪性肝病、自身免疫性肝病和药物性肝炎、胆汁淤积性肝病中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的纳米抗体或抗体标记有可被检测的标记物，和/或所述试剂盒包括所述产品，且所述产品连接有所述纳米抗体或抗体；
优选地，所述连接为偶联和/或物理连接；
优选地，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
优选地，所述化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种；
优选地，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体；
优选地，以SEQ ID NO.6所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；所述捕获抗体偶联于所述产品上，所述检测抗体上标记有所述标记物；
优选地，以SEQ ID NO.5所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.6-8任一项所示的纳米抗体为检测抗体；所述捕获抗体偶联于所述产品上，所述检测抗体上标记有所述标记物；
优选地，以SEQ ID NO.7所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5-6任一项所示的纳米抗体或SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为检测抗体；所述捕获抗体偶联于所述产品上，所述检测抗体上标记有所述标记物；
优选地，以SEQ ID NO.8所示的纳米抗体为捕获抗体，以SEQ ID NO.5-7任一项所示的纳米抗体为检测抗体；所述捕获抗体偶联于所述产品上，所述检测抗体上标记有所述标记物。
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