CN117567604A - 一种抗mbp的纳米抗体、融合蛋白的富集纯化产品及其应用 - Google Patents

一种抗mbp的纳米抗体、融合蛋白的富集纯化产品及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗MBP的纳米抗体、融合蛋白的富集纯化产品及其应用，涉及单域重链抗体技术领域。该纳米抗体能够特异性结合MBP，且纳米抗体的热稳定性高，生产成本低，能够用于带有MBP标签的蛋白的亲和纯化以及蛋白质互相作用蛋白的分离和研究。

Description

一种抗MBP的纳米抗体、融合蛋白的富集纯化产品及其应用
技术领域
本发明涉及单域重链抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗MBP的纳米抗体、融合蛋白的富集纯化产品及其应用。
背景技术
随着蛋白质组学的进展，基因工程重组蛋白的分离纯化技术起着十分重要的作用，想要特异而快速地将目标蛋白从复杂的样品中分离纯化出来就要选择合适的蛋白纯化方法，其中，最常用的蛋白纯化方法就是亲和层析(Affinity chromatography,AC)方法，该方法常用融合标签技术将蛋白与亲和标签融合表达，利用亲和标签进一步纯化出目的蛋白。目前研究人员已经相继开发出了许多具有不同功能的蛋白标签，包括：谷胱甘肽转移酶(GST)、多聚组氨酸(poly-His)、V5标签、MBP标签、mCherry标签、Flag多肽以及免疫球蛋白的Fc段等。融合标签的使用方便了目的蛋白的表达和纯化，为研究目的蛋白的结构和功能提供了便利手段。
麦芽糖结合蛋白(MBP)是一种有用的亲和标签，是由大肠杆菌K12的malE编码的。MBP蛋白由396个氨基酸组成，大小为42.5kDa，在其N端有26个氨基酸的信号肽序列，使最终表达的MBP蛋白定位到细胞周质中，它可以从周质中获取麦芽糖转运至细胞内。在重组细菌体内，外源蛋白在表达时常常形成包涵体，从而增加了获得大量有活性天然蛋白的难度。为防止包涵体的形成，研究者们一般会采用低温诱导表达蛋白，但这种方法并非对所有蛋白都有效果，而利用标签技术将MBP与目的蛋白融合表达增加蛋白溶解性的方法却很有成效。由于成熟的MBP分子能与麦芽糖有特异的结合能力，MBP融合蛋白最后可用20～100mM的麦芽糖竞争性地分离洗脱以获得目的蛋白，在纯化后期可以用酶将MBP标签切除掉。
在现代分子克隆中，MBP标签不仅使融合蛋白的原核表达载体表达效率高、易于纯化，而且可以促进与其连接的目的蛋白的正确折叠，因此，MBP常作为融合蛋白被广泛应用，在蛋白质的亲和纯化方面有着很好的应用前景。最近的研究还发现，MBP作为分子伴侣能提高疫苗对抗病原菌的能力，除此之外，有些研究通过pull-down等技术利用MBP融合蛋白来研究细胞内的蛋白相互作用。因此MBP在蛋白质功能研究中越发重要。
基于MBP标签在蛋白表达纯化等生物学实验的突出特性，研发出针对MBP标签蛋白的抗体显得尤为重要。
1993年，HamersCasterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。
纳米抗体由于其独特的结构、功能和生物理化性质，相比于其他抗体分子具有重要的竞争优势。第一，特异性强。纳米抗体的分子量为12～15kD，是目前已知的具有抗原结合能力且分子量最小的抗体。由于其体积小，纳米抗体可以进入其他抗体无法到达的抗原表位，或者相对隐秘的抗原表位，大大增加了其特异性。此外，由于纳米抗体其特殊的三维结构，它的较长的CDR3区域能够进入分子靶标的腔内，如酶的活性部位等，这是传统抗体做不到的。第二，结构稳定。由于纳米抗体内部存在二硫键，使其结构更为稳定，有研究证明，纳米抗体在37℃环境下放置一周，仍有80％的抗体保留结合活性，甚至在90℃以上的高温条件下仍能复性，具有非常优异的热稳定性，大大增加了其重复利用的次数。第三，易于生产。特异性的纳米抗体基因一经获得就可以通过真核/原核表达系统大量生产，避免了不同批次间抗体的差异，同时又大大降低了生产成本。因此，MBP标签蛋白的纳米抗体的制备为进一步建立抗原－抗体特异性的MBP亲和层析系统奠定了物质基础。此外，由于纳米抗体分子量小，可以在磁珠或者介质表面偶联更多的抗体片段来增加信号的强度，从而提高蛋白质间相互作用的灵敏度；解离常数低，可以快速与目的蛋白相结合，从而大大节省实验时间等优点，而被用于免疫(共)沉淀(IP/CoIP)、染色质免疫沉淀法(ChIP)、Pull-down实验等。
目前将纳米抗体技术与标签蛋白相结合的方法正逐渐应用到生物研究领域中。其中，德国的Chromotek公司已率先展开了Nano-Trap技术，该技术将标签蛋白的纳米抗体与琼脂糖凝胶或磁珠共价偶联，形成一系列产品。由于纳米抗体的优质特性，Nano-Trap缩短了实验时间，并且降低了非特异性结合，从而极大的促进了对蛋白质功能研究的进展。
鉴于MBP的功能特性及纳米抗体的优点，有必要研发MBP的纳米抗体，以方便研究含有MBP的融合蛋白或与MBP相互作用的蛋白。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗MBP的纳米抗体、融合蛋白的富集纯化产品及其应用，该纳米抗体能够特异性结合MBP，且纳米抗体的热稳定性高，生产成本低，能够用于带有MBP标签的蛋白的亲和纯化以及蛋白质互相作用蛋白的分离和研究。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗MBP的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.9～11所示；
(2)如SEQ ID No.12～14所示；
(3)如SEQ ID No.15～17所示；
和(4)如SEQ ID No.18～20所示。
SEQ ID No.9：GGTVDYYT；
SEQ ID No.10：ISKTGST；
SEQ ID No.11：AAGDTGSNYPTLLSDWFAI；
SEQ ID No.12：GFIFYISY；
SEQ ID No.13：LYTSTGRT；
SEQ ID No.14：AAAEWGSQSPLYYWFYRY；
SEQ ID No.15：GFIHEIEY；
SEQ ID No.16：LMTFQGYT；
SEQ ID No.17：AAAYWGKQSPLDEWDYSY；
SEQ ID No.18：GFIEHIEY；
SEQ ID No.19：LITYTGHT；
SEQ ID No.20：AAAEWGSQSPLYYWFYRY。
本发明筛选获得了4种抗MBP纳米抗体，这4种纳米抗体对MBP抗原均具有特异性的识别和结合能力，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。基于此，可以制备抗MBP纳米抗体亲和纯化材料，用于MBP抗原的分离或纯化、MBP标签蛋白的分离或纯化、蛋白质-DNA复合物的分离。
本发明提供的纳米抗体可以通过生物学方法大量培养表达纯化生产，避免了使用小鼠腹水纯化等繁琐生产步骤，大大降低了生产成本，并且可以多次重复使用，多次重复使用目的蛋白的回收率高，稳定性好，应用前景广阔。
本发明中，“MBP”、“麦芽糖结合蛋白”均为指代相同的含义。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一种可选的实施方式中，骨架区选自如下任意一种：
(1)序列依次如SEQ ID NO.21-24所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4(对应MBP05)；
(2)序列依次如SEQ ID NO.25-28所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4(对应MBP13)；
(3)序列依次如SEQ ID NO.29-32所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4(对应MBP16)；
以及(4)序列依次如SEQ ID NO.33-36所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4(对应MBP25)；
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
名词解释：
单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。
多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。
在一种可选的实施方式中，当纳米抗体为单价纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
本发明提供的4种抗MBP纳米抗体在温度80℃，依然具有较强的生物活性。
第二方面，本发明还提供了一种抗体，其含有上述的抗MBP的纳米抗体。抗体包括不限于重链抗体、全长抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。
本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。
上述抗体包括不限于抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性，选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体或纳米抗体还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗MBP的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体；
在一种可选的实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。
宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
在一种可选的实施方式中，真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；真菌例如毕赤酵母菌等。
在一种可选的实施方式中，动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
第五方面，本发明还提供了一种制备上述的抗MBP的纳米抗体或制备上述的抗体的方法，其包括：培养上述的宿主细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成等)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明还提供了一种抗MBP的纳米抗体或抗体在制备MBP检测产品、MBP富集或纯化产品、带有MBP标签的融合蛋白的富集产品或纯化产品、用于带有MBP标签蛋白的互作蛋白的分离或纯化的产品、或带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的分离或纯化的产品中的应用。
基于前述的4种纳米抗体均具有与MBP较高的亲和力，因此可以用于MBP的检测、富集和纯化，也可用于带有MBP标签的融合蛋白的富集和纯化，用于带有MBP标签的蛋白的互作蛋白的分离或纯化、用于带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的分离或纯化。
在一种可选的实施方式中，检测产品选自试剂、试剂盒或芯片。
在一种可选的实施方式中，试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒、放射性免疫分析试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、荧光免疫分析试剂盒或时间分辨荧光免疫分析试剂盒；
在一种可选的实施方式中，试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒。
在一种可选的实施方式中，芯片为染色质免疫共沉淀芯片(ChromatinImmunoprecipitation–chip，ChIP-chip)、免疫沉淀芯片、免疫共沉淀芯片或MBP融合蛋白沉降芯片(如基于Pull down分析)。
在一种可选的实施方式中，MBP富集或纯化产品、带有MBP标签的融合蛋白的富集产品或纯化产品、用于带有MBP标签蛋白的互作蛋白的分离或纯化的产品、或带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的分离或纯化的产品包括：载体以及载体上的纳米抗体或抗体。
在一种可选的实施方式中，载体选自纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、芯片或多孔材料。例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。例如将琼脂糖凝胶微球或硅胶微球上偶联纳米抗体，制得相应的免疫亲和吸附材料，置于层析柱中从而制备相应的亲和柱，用于MBP富集或纯化或者用于带有MBP标签的融合蛋白的富集和纯化。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
第七方面，本发明还提供了一种带有上述的抗MBP的纳米抗体或上述的抗体的产品，产品为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、EP管、多孔板微量反应板凹孔、NC膜、PDMS膜或芯片。
磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、PEG修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、磁性聚丙烯酰胺微球、二氧化硅磁性微球。
乳胶微球是由无定形聚合物(通常是聚苯乙烯)形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5μm的颗粒，或者粒径超过1μm的颗粒。
乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。
带有纳米抗体或抗体的琼脂糖凝胶微球例如通过如下方法制备：
将琼脂糖凝胶与偶联试剂反应形成带有环氧基的活化琼脂糖凝胶微球，然后与MBP纳米抗体或抗体的氨基偶联，制备琼脂糖凝胶-MBP的吸附材料，即得。其中，偶联试剂为卤代环氧化合物和/或双缩水甘油醚类试剂。
在其他实施方式中，也可将溴化氰活化的琼脂糖凝胶至相应规格的砂芯漏斗中抽干，用HCl搅拌均匀后抽干，再加入偶联缓冲液处理，在将MBP纳米抗体或抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶反应，获得带有纳米抗体或抗体的琼脂糖凝胶微球。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在一种可选的实施方式中，多孔板为酶标板。在其他实施方式中，也可以是其他的固相支持物。
在本发明应用较佳的实施方式中，纳米抗体或抗体与产品偶联和/或物理连接；物理连接包括不限于静电吸附等。物理连接如免疫比浊平台。
在一种可选的实施方式中，纳米抗体或抗体还标记有可被检测的标记物。
在一种可选的实施方式中，可被检测的标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。
荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。
胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
第八方面，本发明还提供了一种分离MBP、带有MBP标签的融合蛋白、MBP互作蛋白或带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的方法，其包括：将上述的抗MBP的纳米抗体、上述的抗体或上述的产品对待分离样本混合，洗脱；
在一种可选的实施方式中，采用采用甘氨酸进行洗脱。
带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的分离原理为：利用MBP标签的纳米抗体与目的蛋白中带有的相同MBP标签结合，将核酸酶(如微球菌核酸酶)带到目的蛋白与染色质结合位点处，通过核酸酶的激活使染色质裂解，释放出蛋白-DNA复合体。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的4种抗MBP纳米抗体对MBP抗原具有特异性的识别和结合能力，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。
(2)本发明还提供了一种含抗MBP纳米抗体的亲和纯化材料，可以用于带有MBP标签蛋白、MBP抗原、带有MBP标签的融合蛋白、MBP互作蛋白或带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的分离、纯化。
(3)本发明提供的纳米抗体可以通过生物学方法大量培养表达纯化生产，避免使用小鼠腹水纯化等繁琐生产步骤，大大降低了生产成本，并且可以多次重复使用，多次重复使用仍具有较高的回收率，应用前景广阔。
(4)本发明提供的纳米抗体具有较强的热稳定性，在温度80℃，依然具有较强的生物活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为4株MBP标签纳米抗体(MBP05、MBP13、MBP16和MBP25)的电泳图；
图2为4株MBP标签纳米抗体与抗原的结合情况统计结果图；
图3为4株MBP标签纳米抗体和传统MBP抗体的热稳定性实验结果图；
图4为抗MBP纳米抗体琼脂糖凝胶(MBP13)重复使用回收率统计结果图；
图5为抗MBP纳米抗体琼脂糖凝胶(MBP16)重复使用回收率统计结果图；
图6为2株MBP标签纳米抗体(MBP13、MBP 16)和传统MBP抗体应用于免疫沉淀的实验结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选过程。
1.羊驼免疫及淋巴细胞分离
通过对大肠杆菌的诱导表达，从中纯化出MBP蛋白，再对其buffer利用超滤进行置换，去除内毒素、杂蛋白、盐离子等多余有害物质，方便下一步免疫羊驼。选取健康成年羊驼一只，将1mg纯化的MBP蛋白与弗氏佐剂按1：1的比例混匀，采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫7次，第一次使用弗氏完全佐剂，其余6次使用弗氏不完全佐剂，免疫间隔为1周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余80℃保存。
2.总RNA提取和逆转录合成cDNA
RNA的提取参照TAKARA公司Total RNA提取试剂盒说明书进行。以RNA为模板，oligo-dT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。
3.抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μL。第二轮PCR的引物序列如下：
VHHBack：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHHFor：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物。
4.载体构建
将pMES4与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果。
5.电转化及库容测定
取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG；
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG。
6.噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YTAG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10mL菌液加入4×1010VCSM13(购自北京启研生物)，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YTAK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40mL管中，加入10mL PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1mL冰PBS洗涤离心，取上清250μL预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/mL))＝稀释倍数×噬菌斑数目×100。
7.纳米抗体筛选
通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μL噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。挑取ELISA中鉴定为阳性的克隆摇菌抽质粒，送交测序公司进行测序。
8.纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用His标签琼脂糖凝胶(上海翎因生物科技有限公司自产)进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、淋巴细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗MBP的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary DeterminingRegions，CDR)。
结果发现共有4种DNA序列，将这4个抗体按照其克隆编号命名分别为MBP05、MBP13、MBP16和MBP25，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。
实施例2
本实施例进行纳米抗体的表达和纯化。
1.纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LBA培养基，37℃200rpm过夜培养。次日，使用质粒抽提试剂盒(购自OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μL转化于100μL感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μL LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μL，用三角涂布器涂布在LBA平板上，37℃倒置培养过夜。
2.纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100mL新鲜LB A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0mL TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5mL的上清(周质提取物)。
3.纳米抗体的纯化和鉴定
将以上样品使用His标签琼脂糖凝胶(上海翎因生物科技有限公司自产)进行纯化，使用20mM咪唑洗杂后，再使用300mM咪唑进行洗脱和收集，然后使用分子筛进行二次纯化，将纯化的样品进行SDS-PAGE电泳分析，如图1所示，最后将纯化好的纳米抗体透析到PBS中，置于2～8℃保存待用。
实施例3
本实施例采用ELISA法验证MBP纳米抗体与MBP抗原的结合能力。
利用酶联免疫分析法(ELISA)对纯化的MBP纳米抗体进行抗原结合力测试。首先，按照EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒的说明书，将纯化的MBP纳米抗体偶联上生物素。其次将MBP抗原(1μg/孔)包被在酶标板上，4℃过夜，用3％BSA封闭，室温孵育2h，用PBST清洗5次，每次1min。加入生物素化的纳米抗体(1μg/孔)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min，洗去未结合的抗体。再加入HRP偶联的链霉亲和素(1：10000)，室温孵育1h，用PBST清洗5次，每次1min。最后加入100μL TMB显色液，室温避光显色20min。加入50μL 2M浓硫酸终止反应，在酶标仪上，测定450nm波长下的吸收值。
结果如图2所示，4株MBP纳米抗体都与MBP抗原有较好的结合能力，尤其是MBP13的结合能力最强。
实施例4
本实施例对抗MBP纳米抗体的热稳定性进行检测。
利用酶联免疫分析法(ELISA)对纯化的MBP纳米抗体的热稳定性进行测试。以5μg/mL的浓度包被MBP抗原，100μL/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入稀释的MBP纳米抗体，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：2000比例稀释的HRP标记的山羊抗美洲驼IgG和山羊抗鼠IgG(购自Abcam)，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，在25、37、50、60、70、80、90℃孵育30min，2M硫酸终止反应，读取吸光值450nm读数。采用ELISA测定各抗体在不同温度处理下剩余抗原结合活性，每组设立3个平行重复孔，以室温(25℃)处理后的结合值作为100％结合对照，计算每组重复测定样品的平均吸光度值，计算相对活性。
如图3所示，结果显示与传统抗MBP抗体(购自Cell Signaling Technology，货号2396)相比，4株抗MBP纳米抗体在温度80℃，依然具有较强的生物活性，具有较好的热稳定性，应用前景广阔。
实施例5
本实施例将上述的抗MBP纳米抗体进行亲和纯化材料的制备。
1.抗MBP纳米抗体磁珠的制备。
量取一定量羧基磁珠(来源于上海翎因生物科技有限公司)，用pH为5.0的0.1M的MES缓冲液洗涤羧基磁珠，洗涤次数为2～3次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下活化30min，活化完成后，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用MES缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数3～4次；加入抗MBP纳米抗体进行偶联，在室温下使用旋转混匀仪混匀，反应2h；反应结束后加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用含有3％BSA的封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)进行封闭3h以保存抗MBP纳米抗体磁珠，使入抗MBP纳米抗体磁珠的最终浓度为10mg/mL，于2～8℃保存备用。
2.抗MBP纳米抗体琼脂糖凝胶的制备。
量取一定量的CNBr活化的琼脂糖凝胶(来源于上海翎因生物科技有限公司)至相应规格的砂芯漏斗中抽干，加入2倍凝胶体积的0.01M HCl搅拌均匀后抽干，重复2-3次。再加入偶联缓冲液(PBS，pH7.2)搅拌混匀后抽干，重复2-3次，置于反应容器中，加入抗MBP纳米抗体(5mg抗体/g琼脂糖凝胶)，室温反应2h。反应结束后，用2倍凝胶体积的PBS洗涤两次，加入封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)室温反应3h以封闭未反应的活性基团。用2倍凝胶体积的PBS洗涤5次后，加入20％乙醇水溶液保存抗MBP纳米抗体琼脂糖凝胶，最终浓度为50％，于2～8℃保存备用。
3.抗MBP纳米抗体琼脂糖磁珠的制备。
量取一定量的NHS活化的琼脂糖磁珠(来源于上海翎因生物科技有限公司)至反应容器中，加磁场，使磁珠与液体分开，弃去上清，用MES缓冲液(0.1M，pH6.0)洗涤2次，去除上清。加入抗MBP纳米抗体(2mg抗体/mL琼脂糖磁珠)，室温反应2h。反应结束后，磁性分离，去除上清，加入封闭液(pH为8.0的0.1M的Tris-HCl)室温反应3h以封闭未反应的活性基团。用PBS洗涤5次后，加入20％乙醇水溶液保存抗MBP纳米抗体琼脂糖磁珠，最终浓度为50％，于2～8℃保存备。
实施例6
按照实施例5的方法，分别将MBP13和MBP16制备为抗MBP纳米抗体琼脂糖凝胶，分别对MBP标签蛋白的进行十次纯化，测试纯化后的蛋白溶液回收率。
将抗MBP纳米抗体琼脂糖凝胶加入至层析柱中，流出保存液，使用PBS(pH7.2)清洗层析柱数次后，加入MBP标签蛋白样品溶液，置于旋转混匀仪孵育30～60min后，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。用5～10倍柱体积的PBS进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白后使用甘氨酸(pH2.2)洗脱特异性的MBP标签蛋白，收集洗脱液，即为纯化后的蛋白溶液。再进行10次重复使用，计算回收率。
结果如图4、5所示，结果显示使用2款抗MBP纳米抗体琼脂糖凝胶(MBP13、MBP16)可以特异性纯化MBP标签蛋白，且经过10次重复使用，回收率依然大于80％，具有较好的稳定性，应用前景广阔。
实施例7
本实施例将抗MBP纳米抗体应用于免疫沉淀实验(Immunoprecipitation)。
将MBP蛋白过表达的质粒转染到293T细胞中。细胞转染48小时后，弃去培养细胞的上清液，经预冷的PBS清洗2遍，加入含终浓度1mM PMSF的IP裂解/结合缓冲液，冰上裂解10分钟后转移至预冷的离心管中，4℃离心10分钟再将上清转移至新的预冷的离心管中，从中吸取20μL作为input。然后加入MBP抗体，2-8℃孵育2小时使抗体与相应蛋白发生结合形成蛋白-抗体免疫复合物。其中，IgG抗体作为阴性对照，传统抗MBP抗体(购自Cell SignalingTechnology，货号2396)作为阳性对照。然后将20μL的Protein A/G磁珠加入1.5mL离心管中，用500μL PBS洗涤一次，再向离心管中加入500μL IP裂解/结合缓冲液，洗涤一次，然后将已准备好的蛋白-抗体免疫复合物样品加入装有磁珠的离心管中，保持混匀室温下孵育2h。用磁力架收集磁珠，除去未结合的样品。向离心管中加入1mL裂解/结合缓冲液，轻柔混匀磁珠10min。磁性分离，弃上清。重复洗涤两次。向离心管中加入80μL上样缓冲液(1×)，将样品置于100℃水浴或者金属浴中加热10min。通过磁力架分离磁珠，保留含有目的蛋白的上清，进行Western Blot分析。
如图6所示，与传统MBP抗体一样，MBP纳米抗体(MBP13、MBP16)可以与细胞样品中的MBP蛋白结合，并使用免疫印迹的方式将MBP蛋白检测出来。因此，MBP纳米抗体(MBP13、MBP16)可以应用于免疫沉淀试验检测MBP蛋白及其相互作用蛋白。
综上，本发明提供的4株抗MBP纳米抗体对MBP抗原具有特异性的识别和结合能力，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。另外，本发明提供的抗MBP纳米抗体亲和纯化材料(包含抗MBP纳米抗体磁珠、琼脂糖凝胶、琼脂糖磁珠等)中在MBP标签蛋白的纯化中显示了优异的性能，该特性得以保证本发明提供的纳米抗体应用于MBP标签蛋白亲和纯化试剂的开发。同时，此抗体可以通过生物学方法大量培养表达纯化生产，避免使用小鼠腹水纯化等繁琐生产步骤，大大降低了生产成本，并且可以多次重复使用，应用前景广阔。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗MBP的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如下任一项所示的重链可变区，且每个所述重链可变区均包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)如SEQ ID No.9～11所示；
(2)如SEQ ID No.12～14所示；
(3)如SEQ ID No.15～17所示；
和(4)如SEQ ID No.18～20所示。
2.根据权利要求1所述的抗MBP的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括骨架区；
优选地，所述骨架区选自如下任意一种：
(1)序列依次如SEQ ID NO.21-24所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
(2)序列依次如SEQ ID NO.25-28所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
(3)序列依次如SEQ ID NO.29-32所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
以及(4)序列依次如SEQ ID NO.33-36所示的重链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4；
优选地，所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种；
优选地，当所述纳米抗体为单价纳米抗体时，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
3.一种抗体，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的抗MBP的纳米抗体。
4.一种核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗MBP的纳米抗体；或所述核酸分子编码权利要求3所述的抗体；
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示。
5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的重组载体。
6.一种制备如权利要求1或2所述的抗MBP的纳米抗体或制备如权利要求3所述的抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求5所述的宿主细胞。
7.一种如权利要求1或2所述的抗MBP的纳米抗体或权利要求3所述的抗体在制备MBP检测产品、MBP富集或纯化产品、带有MBP标签的融合蛋白的富集产品或纯化产品、用于带有MBP标签蛋白的互作蛋白的分离或纯化的产品、或带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的分离或纯化的产品中的应用；
优选地，所述检测产品选自试剂、试剂盒或芯片；
优选地，所述试剂盒为化学发光免疫分析试剂盒、放射性免疫分析试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、荧光免疫分析试剂盒或时间分辨荧光免疫分析试剂盒；
优选地，所述试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒；
优选地，所述芯片为染色质免疫共沉淀芯片、免疫沉淀芯片、免疫共沉淀芯片或MBP融合蛋白沉降芯片；
优选地，所述MBP富集或纯化产品、带有MBP标签的融合蛋白的富集产品或纯化产品、用于带有MBP标签蛋白的互作蛋白的分离或纯化的产品、或带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的分离或纯化的产品包括：载体以及载体上的纳米抗体或抗体；
优选地，所述载体选自纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、芯片或多孔材料。
8.一种带有权利要求1或2所述的抗MBP的纳米抗体或权利要求3所述的抗体的产品，其特征在于，所述产品为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、EP管、多孔板微量反应板凹孔、NC膜、PDMS膜或芯片；
优选地，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒；
优选地，所述多孔板为酶标板。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述纳米抗体或抗体与所述产品偶联和/或物理连接；
优选地，所述纳米抗体或抗体还标记有可被检测的标记物；
优选地，所述可被检测的标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。
10.一种分离MBP、带有MBP标签的融合蛋白、MBP互作蛋白或带有MBP标签的特异性蛋白-DNA复合体的方法，其特征在于，其包括：将权利要求1或2所述的抗MBP的纳米抗体、权利要求3所述的抗体或权利要求8-9任一项所述的产品对待分离样本混合，洗脱；
优选地，采用采用甘氨酸进行洗脱。
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