CN117567610A - 酪蛋白变体a1和a2的单克隆抗体在制备酪蛋白表型检测试剂中的应用 - Google Patents

酪蛋白变体a1和a2的单克隆抗体在制备酪蛋白表型检测试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酪蛋白变体A1和A2的单克隆抗体在制备酪蛋白表型检测试剂中的应用，属于生物化学领域。通过生物信息手段检索A1型和A2型β‑酪蛋白的多肽序列，筛选特异性多肽片段作为半抗原，通过与大分子偶联形成免疫抗原，用A1型和A2型β‑酪蛋白作为筛选抗原。利用免疫注射和杂交瘤细胞融合的方式获得β‑酪蛋白变体A1蛋和A2蛋白单克隆抗体株。制备所得抗体可用于A1和A2蛋白快速检测卡的开发，对奶源筛查和奶牛选育具有重要意义。

Description

酪蛋白变体A1和A2的单克隆抗体在制备酪蛋白表型检测试剂 中的应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及酪蛋白变体A1和A2的单克隆抗体在制备酪蛋白表型检测试剂中的应用。
背景技术
随着人们对营养健康的重视程度与日俱增，大众对牛奶的品质也提出了更高的要求。牛奶中有矿物质、脂溶性维生素和各种蛋白质，其最主要功效是为人体提供钙离子和丰富的蛋白质。牛奶蛋白中有约80％的酪蛋白和20％的乳清蛋白，酪蛋白是牛奶中最主要的蛋白质，分有αs1、αs2、β和κ四类亚型，分别由位于牛6号染色体上的CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因编码。酪蛋白约占总蛋白质含量的36％，主要功能是运输磷酸钙。在牛奶酪蛋白12种变体(A1,A2,A3,B,C,D,E,F,H1,H2,I,和G)中，最常见的A1和A2变体。有研究认为，酪蛋白变体A1是乳糖不耐受的致病主源，同时可能是Ⅰ型糖尿病、婴儿猝死综合征和心血管疾病的危险因素，这与A1蛋白的水解产物β-酪啡肽7(BCM-7)有关。不同的是，A2变体蛋白的摄入并不会引起人体过多的不良反应，在β-酪蛋白A2变体的水解牛奶中不存在BCM-7。基于β-酪蛋白基因多态性，一项关于A2β-酪蛋白牛奶对人体肠道健康的影响研究显示，志愿者在饮用A2酪蛋白牛奶2周后，肠道双歧杆菌的丰度比入组时显著提高。A2酪蛋白牛奶较明显地降低了志愿者腹胀、肠鸣比例，增加了正常排便频率。
尽管对于变体A蛋白的更多机制有待深入研究。目前研究表明A2-β酪蛋白牛奶更接近于母乳，更贴合人体的消化系统。
2000年，CorporationLtd.在新西兰成立，该公司就以A2基因检测和售卖A2变体牛奶盈利。随着全球化的发展，A2牛奶的市场逐渐扩大，目前在中国、澳大利亚、英国、美国、新西兰和荷兰等许多国家都可以买到β-酪蛋白A2变体的新生儿配方奶粉。不足的是，在国内少有A2变体牛奶自主开发产品，A2产业在国内的发展具有广大商业前景。拥有A2奶源，甄选高品质安全生奶是更多大企业的发展趋势。
目前上市A2奶粉的奶源控制以A2纯种奶牛的选育为主导，通过A变体基因型的核酸测序和变体蛋白质的检测实现。测序基因分型和等位基因特异性聚合酶链式反应是监测奶牛β-酪蛋白变异基因的一种准确可靠的方法，而奶粉则需要通过高效液相色谱法、等电聚焦电泳法、质谱和毛细管电泳等方法实现检测。这些方法均需要用到仪器，检测步骤繁多，样品处理要求高，成本高，检测时间长。若能用利用免疫学原理制备A1和A2蛋白的检测卡，有望使检测更加便捷快速，且结果精准，检测成本最低。
开发A1和A2的单克隆抗体能解决我国在A2奶源检测试剂盒方面的需求缺口，能快速可靠检测牛奶中的酪蛋白表型，有助于A2牛奶食品工业的应用。
发明内容
针对上述问题，本发明通过酪蛋白变型创新开发A1和A2的单克隆抗体，所得抗体可有效应用于A1和A2蛋白快速检测卡的开发，对奶源筛查和奶牛选育具有重要意义。
本发明采用的具体方案为：
第一方面，一种酪蛋白变体A1和A2蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、对比A1蛋白和A2蛋白的同源蛋白，对两个蛋白序列进行分析，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的A1蛋白的第67个氨基酸是一个组氨酸，而氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的A2是一个脯氨酸，以第67个氨基酸为中心设计并合成两段多肽序列，分别针对A1和A2型酪蛋白，多肽长度为7-15个氨基酸；
步骤二、免疫抗原采用合成的多肽与大分子蛋白进行共价偶联获得，筛选抗原采用A1酪蛋白、A2酪蛋白；
步骤三、小鼠免疫采用多点皮下法或肌肉注射法，佐剂为佛氏佐剂或铝佐剂；
步骤四、采用PEG进行B细胞与骨髓瘤细胞的融合，HAT筛选后，用A1酪蛋白、A2酪蛋白包被的ELISA方法筛选，最后分别得到A1酪蛋白、A2酪蛋白的单克隆抗体株。
作为对上述制备方法的进一步优化，步骤一中，所述多肽的长度为9-12个氨基酸。更进一步地，针对A1型酪蛋白的多肽序列如SEQ ID NO：3所示，针对A2型酪蛋白的多肽序列如SEQ ID NO：4所示。
作为对上述制备方法的进一步优化，步骤二中，所述大分子蛋白为KLH、BSA或OVA。
第二方面，酪蛋白变体A1和A2的单克隆抗体在制备酪蛋白表型检测试剂中的应用，针对A1型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽制备；针对A2型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的多肽制备。
第三方面，一种酪蛋白表型检测试剂卡，包含酪蛋白变体A1和A2的单克隆抗体，其中，针对A1型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽制备，针对A2型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的多肽制备。进一步地，所述检测试纸卡由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成。
有益效果：本发明通过生物信息手段检索A1型和A2型β-酪蛋白的多肽序列，筛选特异性多肽片段作为半抗原，通过与大分子偶联形成免疫抗原，用A1型和A2型β-酪蛋白作为筛选抗原。利用免疫注射和杂交瘤细胞融合的方式获得β-酪蛋白变体A1蛋和A2蛋白单克隆抗体株。制备所得抗体可用于A1和A2蛋白快速检测卡的开发，对奶源筛查和奶牛选育具有重要意义。
附图说明
图1是酪蛋白变体A1蛋白和A2蛋白单克隆抗体筛选结果图。
图2是检测卡的灵敏度检测结果图。
图3是A1/A2不同质量比下检测卡的特异性检测结果图；其中，从左到右对应的A1/A2的质量比依次为1∶10000、1∶1000、1∶500、1∶100。
图4是A2/A1不同质量比下检测卡的特异性检测结果图；其中，从左到右对应的A2/A1的质量比依次为1∶10000、1∶1000、1∶500、1∶100。
具体实施方式
本发明提供一种A1蛋白和A2蛋白的单克隆抗体及制备方法。
1、通过生信检索，对比A1蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)、A2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)的同源蛋白，对两个蛋白序列进行分析，A1的第67个氨基酸是一个组氨酸，而A2是一个脯氨酸，因此以第67个氨基酸为中心设计两段多肽序列，分别针对A1和A2型酪蛋白，多肽长度为7-15个，以9-12个为优。设计结果如下表1所示。
表1两段多肽序列
A2酪蛋白 PGPIPNSLP
A1酪蛋白 PGPIHNSLP
2、免疫抗原采用合成的多肽与大分子蛋白，如KLH、BSA、OVA等，进行共价偶联获得。筛选抗原采用市面销售奶粉中的A1酪蛋白、A2酪蛋白。
3、小鼠免疫采用多点皮下法或肌肉注射法，佐剂为佛氏佐剂或铝佐剂。
4、采用PEG进行B细胞与骨髓瘤细胞的融合，HAT筛选后，用A1酪蛋白、A2酪蛋白包被的ELISA方法筛选，最后得到分别得到A1酪蛋白、A2酪蛋白的单克隆抗体株。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
如非特别说明，下述实施例所用试剂或材料均为常规市售，所用操作手段均为常规技术。
实施例1
一、免疫抗原和检测抗原的制备
1、将2种多肽、KLH、EDC分别用50mM MES缓冲液(PH6)溶解，终浓度分别为1mg/mL，5mg/mL及500mg/mL。
2、取500μL的多肽溶液加入到1mL的KLH溶液中并混合，并往里缓慢滴加100μLEDC溶液，边滴加边振荡，并置于磁力搅拌器室温反应2h，使多肽和KLH进行偶联。
3、反应结束后，将混合物加入15kDa的透析袋中，4℃下用1L的PBS中透析5次，除去偶联副产物，换液间隔为4-6h。
4、收集透析后的多肽-KLH偶联物。
二、小鼠免疫
4只6-8周龄BALB/c雌性小鼠，采用皮下多点免疫。
表2小鼠免疫流程表
表1中，抗原与铝佐剂按照1:1体积混合，融合前三天的加强免疫不加佐剂腹腔注射。
三、ELISA血清和培养上清检测
1、抗原包被：将A1或A2酪蛋白用碳酸盐包被缓冲液(无水碳酸钠63.6克及碳酸氢钠33.6克溶于蒸馏水中稀释至1000mL)稀释到5μg/mL，100μL/孔，包被96孔板，然后37℃恒温恒湿孵育2h。
2、封闭：孵育2h后倒弃包被液，用含有0.1％BSA的PBS进行封闭，每孔200μL，37℃孵育2h。
3、洗涤：每孔用200μL的PBST洗3次，并拍干。
4、加样：小鼠的血清分别用PBS稀释4-12万倍后，取于100μL加入96孔板，37℃孵育20min。融合细胞筛选直接取细胞培养板内100μL的培养上清加入ELISA板即可。
5、洗涤：将酶标板内的待测血清(或培养上清)倒空，每孔用200μL的PBST洗3次，并拍干。
6、二抗：HRP标记的兔抗鼠IgG抗体用PBS稀释2000倍后，每孔加入100μL，37℃孵育20min。
7、洗涤：倒弃二抗溶液，每孔用200μL的PBST洗3次，并拍干。
8、显色：每孔加入显色液100μL，置于室温下显色10min。
9、终止：每孔加入终止液50μL，并于450nm酶标仪检测OD值。
10、取血清效价60000以上的小鼠进行融合。
四、细胞融合
1、脾淋巴细胞的制备
拉颈处死免疫小鼠，75％的酒精浸泡消毒3min。无菌取出脾脏，用DMEM不完全培养基清晰外层后置于小培养皿内，用5mL注射器往脾脏内注入培养基，冲出脾脏内细胞，通过多次注射直至脾脏颜色从深红变为微红。1200rpm离心5min收集脾细胞，用DMEM不完全培养基重悬并计数。
2、细胞融合
从培养皿收集SP2/0骨髓瘤细胞，按照骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：10的比例混合均匀，离心清洗2次(1000rpm，5min)。完全去除无血清培养基，轻轻敲打离心管，边转边敲打，将细胞沉淀完全分散。将离心管置于加了37℃水的250mL烧杯中，轻微摇晃2min后缓慢滴加1mL的50％PEG，静置60s进行融合。90s后缓慢滴加37℃的不完全DMEM 30mL,900rpm离心5min收集细胞。HAT完全培养基(15％小牛血清)重悬细胞，100μL/孔加入饲养细胞的培养板，隔2天换液，7天后更换为HT培养基，13天后换成正常完全培养基。待融合的细胞克隆长满10％孔底的时候进行上清中抗体检测，具体ELISA血清和培养上清检测所述。
3、细胞亚克隆
采用有限稀释法进行亚克隆。提前一天按照前述制备好饲养细胞。在显微镜下用油性笔对筛选到的阳性克隆做标记，用10μL的移液枪把克隆吸出后用HT培养基梯度稀释，每孔100μL加入到饲养细胞板中，每个梯度1排。培养7～10天，每2天换液，在肉眼观察到克隆后再次检测上清中抗体，再将阳性孔内的细胞继续扩大培养并冻存。
4、采用β-酪蛋白(A1和A2型均可)通过弗氏佐剂乳化，背部皮下6多注射兔子，连续3次注射，每次间隔10天，然后心脏取血，分离血清后用蛋白A柱纯化兔β-酪蛋白多抗。
5、ELISA检测
杂交瘤细胞培养上清用蛋白A柱纯化后，采用高碘酸法偶联HRP。具体如下：
①称取1mg HRP溶解于1ml蒸馏水中。
②于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
③将上述溶液用15KD的超滤管过滤。
④用1ml的10mM(PH9.5)碳酸盐缓冲液重悬，取100ul分别加入1ml的0.1mg/ml的A1或A2抗体的碳酸盐缓冲液中(0.01M)，室温避光轻轻搅拌2小时。
⑤加0.03ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
⑥将上述溶液用15KD的超滤管过滤，用500ul PBS重悬。
⑦抗体棋盘杂交：采用100ul 5ug/ml的兔β-酪蛋白多克隆抗体包板，封闭后与0.5-4ug/ml的A1或A2酪蛋白反应，清洗3次后分别加入HRP标记的兔抗鼠抗体，37℃反应5min后清洗显色，结果如图1所示。
实施例2
一种快速检测试剂卡：包括如下组分：
1、用于使检测样品显色的胶体金，所述胶体金标标记发明中针对酪蛋白变体A1或A2的单克隆抗体。标记条件为PH 8.5，标记量为5ug/ml，室温标记半小时后采用1％的BSA进行室温封闭1小时(终浓度0.01％)。4℃，12000rpm离心15min，收集金沉淀后用20mM的硼酸缓冲液(PH 7.5，1％BSA，1％蔗糖)重悬，并喷涂在玻璃纤维上干燥。
2、检测线用酪蛋白的兔多克隆抗体(1mg/ml)划线，质控线为兔抗鼠多抗(1mg/ml)划线。样品垫采用20mM的硼酸缓冲液浸泡后干燥处理(PH 7.5，1％BSA，1％蔗糖，0.75％曲拉通-100)。
3、检测卡由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成。样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸按照2-3mm重叠依次黏贴在底衬上，并用切条机且为3mm条子，包装后干燥室温保存。
4、检测卡对A1和A2酪蛋白的灵敏度均为50ng/ml，结果如2所示。
5、针对特异性，检测卡依次对A2/A1和A1/A2质量比为1:10000，1：1000，1：500和1:100的奶粉按10mg/ml溶解在PBS中进行检测，其结果如图3和图4所示，A1/A2比例为1:10000可检测到微量的A1蛋白(图3)，A2/A1比例为1:1000可检测到微量的A2蛋白(图4)。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种酪蛋白变体A1和A2蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、对比A1蛋白和A2蛋白的同源蛋白，对两个蛋白序列进行分析，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的A1蛋白的第67个氨基酸是一个组氨酸，而氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的A2是一个脯氨酸，以第67个氨基酸为中心设计并合成两段多肽序列，分别针对A1和A2型酪蛋白，多肽长度为7-15个氨基酸；
步骤二、免疫抗原采用合成的多肽与大分子蛋白进行共价偶联获得，筛选抗原采用A1酪蛋白、A2酪蛋白；
步骤三、小鼠免疫采用多点皮下法或肌肉注射法，佐剂为佛氏佐剂或铝佐剂；
步骤四、采用PEG进行B细胞与骨髓瘤细胞的融合，HAT筛选后，用A1酪蛋白、A2酪蛋白包被的ELISA方法筛选，最后分别得到A1酪蛋白、A2酪蛋白的单克隆抗体株。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述多肽的长度为9-12个氨基酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：针对A1型酪蛋白的多肽序列如SEQ IDNO：3所示，针对A2型酪蛋白的多肽序列如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤二中，所述大分子蛋白为KLH、BSA或OVA。
5.酪蛋白变体A1和A2的单克隆抗体在制备酪蛋白表型检测试剂中的应用，针对A1型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽制备；针对A2型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的多肽制备。
6.一种酪蛋白表型检测试剂卡，其特征在于：包含酪蛋白变体A1和A2的单克隆抗体，其中，针对A1型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽制备；针对A2型酪蛋白的单克隆抗体采用氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的多肽制备。
7.根据权利要求6所述的检测试纸卡，其特征在于：所述检测试纸卡由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成。
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