CN108366571A - 发酵乳制品及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种发酵乳制品的制造方法，其特征在于，是依次进行第一工序和第二工序的发酵乳的制造方法，所述第一工序将原料乳与乳酸菌混合，得到混合液，所述第二工序使所述混合液发酵，在第二工序结束前，进行向原料乳和/或混合液中添加来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的工序(蛋白酶添加工序)。根据该制造方法，可以在维持发酵乳制品本来的顺滑性的基础上，将发酵乳制品的硬度调节为所期望的值。

Description

发酵乳制品及其制造方法
技术领域
本申请主张基于2015年12月16日申请的日本申请特愿2015－244855号的优先权，将其全部内容通过参照纳入本申请中。本发明涉及发酵乳制品及其制造方法。
背景技术
在发酵乳中，大体上有两种类型。其一为前发酵型，在大型的制造罐内使原料乳发酵，将所得的发酵乳破碎后，填充到独立食用容器中。另一个为后发酵型，向独立食用容器中填充原料乳及乳酸菌等后，使之发酵。无论在哪种类型中，都要将填充到独立食用容器中并经过发酵的发酵乳载运到流通路径上，最终送达到消费者处。
以往，在流通路径中，产生过独立食用容器内的发酵乳破碎的问题、在添加有果肉物的发酵乳的情况下果肉物沉降在独立食用容器的底部的问题。作为防止该问题的方法，可以举出向发酵乳中添加琼脂、明胶等凝胶化剂而使发酵乳的硬度增大的方法。然而，当添加凝胶化剂时，虽然发酵乳不易破碎，但是存在有丧失发酵乳本来的润滑口感(滑らかな食感)的问题。
为了解决上述的问题，提出了在制造发酵乳时添加酶的方法(例如专利文献1、2)。专利文献1中公开有使用过氧化酶的方法，专利文献2中公开有使用转谷氨酰胺酶的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3145829号
专利文献2：日本专利第3182954号
发明内容
发明所要解决的问题
专利文献1中记载，当添加过氧化酶而制造发酵乳时，可以实现顺滑性(滑らかさ)、保水性的提高，并且硬度降低。
专利文献2中记载，当添加转谷氨酰胺酶而制造发酵乳时，利用转谷氨酰胺酶的酶作用可以形成乳蛋白质间及乳蛋白质内(分子间及分子内)的网络(凝胶化)。专利文献2中对于所得的发酵乳的硬度没有记载，然而根据上述的转谷氨酰胺酶的作用机理可以推测，发酵乳的硬度增大。
利用专利文献1或2的发明，有望降低或增大发酵乳的硬度。然而，无论是哪种酶，都不过是仅使发酵乳的硬度降低、或仅使之增大而已。现有的技术很难利用一种酶在维持发酵乳本来的顺滑性的基础上将发酵乳的硬度调节为所期望的值。
因而，本发明的目的在于，提供一种发酵乳制品的制造方法，可以在维持发酵乳制品本来的顺滑性的基础上，将发酵乳制品的硬度调节为所期望的值。
用于解决问题的方法
本发明人等发现，通过将特定的蛋白酶添加到乳中并发酵，可以调节发酵乳制品的凝乳的硬度，另外其内部变得更加均匀顺滑(なめらか)，从而完成了本发明。
因而，根据本发明，可以提供：
〔1〕一种发酵乳制品的制造方法，其特征在于，是依次进行第一工序和第二工序的发酵乳制品的制造方法，所述第一工序将原料乳与乳酸菌混合，得到混合液；所述第二工序使所述混合液发酵，
在上述第二工序结束前，进行向所述原料乳和/或所述混合液中添加来自于类芽孢杆菌属(ペニバチルス属)的蛋白酶的工序(蛋白酶添加工序)；
〔2〕根据所述[1]中记载的发酵乳制品的制造方法，其中，所述原料乳中所含的乳脂成分(质量％)与所述蛋白酶的添加量(PU/g)的比(所述乳脂成分：所述蛋白酶的添加量)为50：1～1：10；
[3]根据所述[1]或[2]中记载的发酵乳制品的制造方法，其中，所述蛋白酶的添加量以所述原料乳的全部质量为基准为0.05～10.0PU/g；
[4]根据所述[1]中记载的发酵乳制品的制造方法，其中，所述原料乳中所含的乳脂成分为0～10质量％；
[5]根据所述[1]～[4]中记载的发酵乳制品的制造方法，其中，所述原料乳中所含的非脂乳固体成分为3.0～20质量％；
[6]根据[1]～[5]中任一项记载的发酵乳制品的制造方法，其特征在于，所述蛋白酶具有下述的(1)～(5)的性质：
(1)利用属于类芽孢杆菌属的细菌产生，
(2)在中性范围中将κ－酪蛋白及血红蛋白分解，
(3)在pH5.5～9.0时稳定、最适pH为7.0～8.0，
(4)在20～75℃发挥作用，最适温度为50～60℃，
(5)基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法的分子量推定为32000～34000Da的蛋白酶；
[7]根据所述[1]～[6]中任一项记载的发酵乳制品的制造方法，其中，还包括向上述原料乳和/或上述混合液中添加选自乳糖酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、菊粉酶、漆酶、过氧化酶、以及所述蛋白酶以外的蛋白酶中的1种或多种的工序；
[8]一种发酵乳制品，其特征在于，是含有来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的发酵乳制品，
使用蠕变仪测定时的凝乳的断裂点为0.002～1.0N；
[9]一种发酵乳制品的制造方法，其特征在于，是发酵乳制品的制造方法，该制造方法包括：
第一工序，将原料乳与乳酸菌混合，得到混合液；
第二工序，使上述混合液发酵；
蛋白酶添加工序，在上述第二工序结束前，向上述原料乳和/或上述混合液中添加来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶，
以所期望的所述发酵乳制品的凝乳硬度、原料乳中所含的乳脂成分、和来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的添加量为指标，确定该乳脂成分和该蛋白酶的添加量，进行发酵工序。
发明效果
根据本发明，能够提供可以在维持发酵乳制品本来的顺滑性的基础上将发酵乳制品的硬度调节为所期望的值的发酵乳制品及其制造方法。
附图说明
图1的面板A是表示对于制造例1及制造例5的酸奶利用蠕变仪得到的断裂强度分析的结果的图，面板B是表示对于制造例2及制造例6的酸奶利用蠕变仪得到的断裂强度分析的结果的图。
图2的面板A是表示对于制造例1及制造例5的酸奶利用蠕变仪得到的质构分析(テクスチャ解析)的结果的图，面板B是表示对于制造例2及制造例6的酸奶利用蠕变仪得到的质构分析的结果的图。
图3是表示对于制造例3及制造例7的酸奶利用蠕变仪得到的断裂强度分析的结果的图。
图4是表示对于制造例3及制造例7的酸奶利用蠕变仪得到的质构分析的结果的图。
图5是表示对于制造例4及制造例8的酸奶利用蠕变仪得到的断裂强度分析的结果的图。
图6是表示对于制造例4及制造例8的酸奶利用蠕变仪得到的质构分析的结果的图。
图7是表示使酶添加量变化时的利用蠕变仪得到的断裂强度分析的结果的图。
图8是表示本发明的利用蛋白酶的发酵反应中的相对于发酵时间而言的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的经时变化的图。
图9是表示适于本发明的蛋白酶的pH依赖性的结果的图。
图10是表示将适于本发明的蛋白酶与乳糖酶并用时的利用蠕变仪得到的断裂强度分析的结果及乳糖分解率的图。
具体实施方式
本发明的发酵乳制品的制造方法必须使用来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶、乳酸菌发酵剂及原料乳，任选地使用稳定剂等添加剂。以下，依次说明(1)发酵乳制品的原材料、以及其(2)添加量、(3)发酵乳制品的性质、(4)发酵乳制品的制造方法、(5)用途。
《发酵乳制品的原材料》
＜中性蛋白酶＞
本发明中可以合适地使用的蛋白酶具有以下的性质。
(1)利用属于类芽孢杆菌属的细菌产生，
(2)在中性范围中分解κ－酪蛋白、血红蛋白，
(3)最适pH为7.0～8.0，
(4)是在pH5.5～9.0时稳定的中性蛋白酶，
(5)在20～75℃发挥作用，最适温度为55℃，
(6)基于电泳法的分子量推定为32000～34000Da。
类芽孢杆菌属以往被分类为杆菌属，然而近年来被重新分类，作为新的属提出。具有上述性质的蛋白酶可以由从多粘芽孢杆菌(バチルス·ポリミキサ)重新鉴定出的类多粘芽孢杆菌(ペニバチルス·ポリミキサ)或包括类芽孢杆菌属(ペニバチルス·エスピー)的其他的种获得。根据文献等不同，有时表示为多粘芽孢杆菌，然而是相同含义。
具体而言，本发明中可以使用的蛋白酶具有下面的性质。
(a)作用
显示出作为中性蛋白酶的一般的性质，在pH的中性范围中将酪蛋白、血红蛋白等蛋白质分解而生成肽至游离的氨基酸。
确认了对于氧化胰岛素的B链将Pha(1)－Val(2)、His(5)－Leu(6)、His(10)－Leu(11)、Glu(13)－Ala(14)、Ala(14)－Ler(15)、Ler(15)－Tyr(16)、Tyr(16)－Leu(17)、Leu(17)－Val(18)、Gly(23)－Phe(24)、Phe(24)－Phe(25)、Phe(25)－Tyr(26)及Lys(29)－Ala(30)的12处肽键切断。
(b)底物特异性
对于κ－酪蛋白，在pH的中性范围中显示出温和的蛋白分解作用。对于α－酪蛋白及β－酪蛋白，即使在pH的中性范围中也基本上不显示出蛋白分解作用。
(c)最适pH及稳定pH范围
i)最适pH：针对κ－酪蛋白的蛋白分解作用的最适pH为7.0～8.0。
ii)稳定的pH范围：在5.5～9.0的范围中极为稳定。
(d)作用合适温度的范围
在20℃～75℃的范围中发挥作用，最适温度为50～60℃。最适温度为55℃。
(e)由pH、温度等造成的失活的条件
在pH3.0以下及pH10.0以上时，活性会完全消失。另外，利用65℃、10分钟的加热处理，会完全失活。
(f)抑制、活化及稳定化
受乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、邻菲咯啉、2，2－联吡啶、氟化钠之类的金属螯合剂、以及N－溴代琥珀酰亚胺(NBS)、碘之类的氧化剂抑制。
由钙离子稳定化，活化时需要锌离子。
(g)分子量
基于电泳法的分子量推定为32000～34000Da。
蛋白酶根据其催化部位可以分类为以下的5种。酸性蛋白酶(催化部位：天冬氨酸、例子：胃蛋白酶)、金属蛋白酶(催化部位：金属)、丝氨酸蛋白酶(催化部位：丝氨酸、例子：胰蛋白酶)、半胱氨酸蛋白酶(催化部位：半胱氨酸之类的具有SH基的氨基酸、例如木瓜蛋白酶)、以及将它们当中的至少2种混合了的混合型(例如肌动蛋白酶(アクチナーゼ)AS)。本发明中使用的来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶被分类为中性金属蛋白酶。如后所述，在中性蛋白酶的情况下，因发酵而使乳的pH降低，由此失活，所以在使用了本发明的乳制品中蛋白酶变为失活了的状态。
本发明的蛋白酶是内切型的中性金属蛋白酶。内切型的蛋白酶具有将蛋白质粗略地分解、低分子化的作用。如果使蛋白酶作用于乳蛋白，则在大多数情况下，会呈现出苦味。但是，即使使上述的本发明的蛋白酶作用于乳蛋白也不会产生苦味，对味道、气味没有影响。
作为牛乳酪蛋白的一种成分的κ－酪蛋白(kappa-酪蛋白)在形成酪蛋白胶束的方面起到重要的作用。上述的蛋白酶尤其会将该κ－酪蛋白特异性地分解，对其他的酪蛋白不会造成结构上的大的变化，可以改善所得的发酵乳制品的口感(顺滑性(なめらかさ))。
(原料生物的种类)
蛋白酶是从包括微生物在内的非常大的范围的生物中分离出来的。从价格、反应性的方面出发，优选的蛋白酶为来自于微生物的蛋白酶。例如，作为此种蛋白酶，可以举出来自于属于芽孢杆菌(Bacillus)属或类芽孢杆菌属(paenibacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、曲霉(Aspergillus)属、根霉属(Rhizopus)、根毛霉属(Rhizomucor)、链霉菌属(Streptomyces)的微生物的蛋白酶、来自于乳酸菌的蛋白酶等。可以作为本发明的酶使用的蛋白酶是来自于类芽孢杆菌属(paenibacillus)的蛋白酶，具体而言，优选的蛋白酶是来自于选自Paenibacillus polymyxa、Paenibacillus macerans、Paenibacilluspabuli、Paenibacillus peoriae、Paenibacillus thiaminolyticus、Paenibacillusvalidus、Paenibacillus glucanolyticus、Paenibacillus kobensis、Paenibacilluslautus、Paenibacillus alginolyticus、Paenibacillus alvei、Paenibacillusamylolyticus、Paenibacillus chitinolyticus、Paenibacillus chondroitinus、Paenibacillus curdlanolyticus、Paenibacillus durus、Paenibacillus ehimensis、Paenibacillus sp.中的微生物(细菌)的蛋白酶。
酶可以是纯化酶、半纯化酶、粗制酶、破碎菌体(优选为冷冻干燥品)等任意种形态，只要是具有κ－酪蛋白的分解作用即可，从分解κ－酪蛋白的大多数蛋白酶容易产生苦味、异味的理由考虑，优选为来自于属于类芽孢杆菌(Paenibacillus)属、特别是属于Paenibacillus polymyxa、或16S rDNA的同源性与Paenibacillus polymyxa的序列相比为98％以上的Paenibacillus属的微生物(细菌)的具有前述的性质的金属蛋白酶。来自于这些属的金属蛋白酶即使在添加到乳中的情况下，也具有分解乳中所含的κ－酪蛋白的作用，并且不会在处理乳中产生苦味、异味。
适于本发明的金属蛋白酶在作为发酵乳制品的一般的发酵温度的43℃下、以偶氮酪蛋白为底物在pH4.5反应1小时的情况下的残存活性为10％以下。利用该性质，可以使发酵调制物中不残存该蛋白酶活性，在保存时，该蛋白酶不会对发酵调制物造成不良影响。
(金属蛋白酶的制法)
本发明中使用的金属蛋白酶可以是利用以往的一般的方法从微生物回收、纯化的金属蛋白酶。因而，该蛋白酶的生产可以通过基因重组或非基因重组来实施。例如可以在Difco公司制营养培养基等中培养Paenibacillus polymyxa NBRC 15309株，作为从培养物中过滤或离心而得的培养上清液得到。另外，也可以将所得的培养上清液利用柱层析、硫酸铵分级等适当地纯化后使用。所得的酶液的形状除了可以是液状以外，还可以利用喷雾干燥、冷冻干燥制成粉末状。此时也可以添加日常所用的稳定剂、赋形剂。
(金属蛋白酶的添加量)
以原料乳的全部质量为基准，优选在0.05～10.0PU/g的范围中添加金属蛋白酶。可以更优选在0.25～5.0PU/g的范围中添加。这是因为，如果是本范围内，发酵乳制品的凝乳内部的硬度的不均减少，口感变得顺滑。另外，通过改变其添加量，可以改变、调节凝乳内部的硬度。例如，即使相对于乳脂成分较高的原料乳(例如大于1.5％且为5.0％以下)添加4.0PU/g的蛋白酶，也可以保持凝乳的形状，因此可以合适地用于后发酵型的发酵乳制品中，此外，通过添加0.25PU/g以上，可以对凝乳赋予更加充分的柔软性。另一方面，通过对于低脂肪乳、无脂肪乳(例如为1.5％以下)添加本发明的蛋白酶，可以赋予凝乳的适度的硬度。即，为了获得所期望的凝乳硬度的发酵乳制品，只要以原料乳中所含的乳脂成分、和来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的添加量为指标，确定该乳脂成分和该蛋白酶的添加量{例如对于某种乳脂成分的原料乳，事先变换蛋白酶的添加量而进行研究，确定该添加量(制成标准曲线等而确定)}等，进行发酵工序即可。
上述的金属蛋白酶的添加量(酶量)可以基于利用以下的方法定义的酶量1.0PU作为每单位质量酶的酶活性算出。向0.6％酪蛋白水溶液(pH7.5、含有2mM乙酸钙的50mM Tris盐酸缓冲液)中添加酶稀释液1mL，在30℃反应10分钟后，加入三氯乙酸试剂(pH4.0、1.8％无水乙酸钠、1.8％三氯乙酸、1.98％乙酸)5mL后停止反应，再在30℃静置30分钟，过滤后，测定275nm的吸光度。将在该条件下1分钟内游离出相当于1μg的酪氨酸的氨基酸的酶量(酶活性)定义为1PU(酶单位；Protease Unit)。
＜乳酸菌发酵剂＞
本发明的乳制品在其制造方法中使用乳酸菌发酵剂。本发明中，作为所使用的乳酸菌，没有特别限定，例如可以使用Lactobacillus.delbrueckii subsp.bulgaricus、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei等以往使用的乳酸菌。作为这些乳酸菌发酵剂的获取方法，可以买入一般流通的市售品，也可以使用独自分离出的菌株。需要说明的是，可以组合使用多个同一种的乳酸菌，也可以组合使用多个不同种的乳酸菌。另外，也可以还同时地与发酵剂同时添加双歧杆菌等益生菌使用。
(乳酸菌发酵剂的添加量)
作为乳酸菌发酵剂的添加量，没有特别限定。可以添加通常的量。例如，在使用科汉森(Christian Hansen)公司冷冻干燥发酵剂的情况下，以原料乳为基准，为0.1～0.5mg/g，然而只要是乳酸菌能够生长的添加量，添加量就没有特别限定。
＜原料乳＞
作为原料乳，没有特别限定，是包含生乳、原乳、全脂乳、脱脂乳、乳清、黄油等乳成分的液体及粉末的溶解液，可以将它们组合使用。
原料乳中所含的乳脂成分优选为0～10质量％。更优选为0.1～5.0质量％，进一步优选为1.0～5.0质量％。在中性蛋白酶的存在下，存在有乳脂成分越低则发酵乳制品的硬度越是增大的趋势。在中性蛋白酶的存在下，乳脂成分越高，越可以降低发酵乳制品的硬度。原料乳中所含的乳脂成分根据乳的种类而不同，然而可以通过添加黄油等来调节乳脂成分。
原料乳中所含的非脂乳固体成分优选为3.0～20质量％。
无论是小于下限值还是大于上限值，发酵乳制品的顺滑性都有可能不足。如果小于下限值，则发酵乳制品难以凝固，如果大于上限值，则发酵乳制品有可能过度凝固。另外，本发明的乳制品并不限定于固形物(例如乳酪)及凝胶状的物体(例如酸奶)，也包括液体状及溶胶状的物体(例如饮料型的酸奶)，该情况下，上述非脂乳固体成分也可以小于下限值(3.0％)。在非脂乳固体成分中，包含以酪蛋白为主成分的蛋白质、以乳糖为主成分的糖、以各种无机盐为主成分的盐类等。
原料乳中所含的乳脂成分(质量％)与来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的添加量(PU/g)的比(所述乳脂成分：所述蛋白酶的添加量)优选为50：1～1：10{即，在将乳脂成分(质量％)设为a、将蛋白酶的添加量(PU/g)设为b的情况下，a/b(质量％·g/PU)为50～0.1}。另外，由该比的值和蛋白酶的添加量造成的硬度变化显示出如下的趋势，即，该比相对越高，则与无添加的发酵乳制品相比，因该蛋白酶的添加，发酵乳制品的硬度越是降低(越柔软)。另一方面显示出如下的趋势，即，该比相对越低，则与无添加的发酵乳制品相比，因该蛋白酶的添加，发酵乳制品的硬度越是提高(变硬)。
＜任选成分＞
在本发明的乳制品的制造方法中，根据需要，可以添加各种成分。作为具体例，可以举出有助于乳制品的稳定化的金属盐类、各种糖类、抗坏血酸、甘油等、用于增强使用便利性的作为赋形剂的淀粉、糊精、具有缓冲作用的无机盐类、作为来自于乳的成分的乳糖、乳清、乳蛋白类、作为凝胶化剂的琼脂、明胶、果胶等。
(乳糖酶)
本发明的乳制品的制造方法中，也可以添加乳糖酶溶液等乳糖酶制品。该乳糖酶溶液等没有特别限定，可以使用市售的制品。
(其他酶)
本发明的乳制品的制造方法中，也可以添加液状、粉末状等各种酶制品。该酶制品没有特别限定，例如为选自葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、菊粉酶、第二蛋白酶中的1种或多种，可以使用市售的制品。
作为第二蛋白酶，可以使用来自于属于芽孢杆菌(Bacillus)属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、曲霉(Aspergillus)属、根霉属(Rhizopus)、根毛霉属(Rhizomucor)、链霉菌属(Streptomyces)的微生物的蛋白酶、来自于乳酸菌的蛋白酶等。具体而言，优选的蛋白酶是来自于选自Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillusamyloliquefaciens、Bacillus sp.、Geoacillus caldoproteolyticus、Aspergillus sp.、Aspergillus oryzae、Aspergillus melleus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillusbulgaricus及Streptococcus thermophilus中的微生物的蛋白酶。
《乳制品的性质》
＜口感的评价＞
对于本发明的发酵乳制品所具有的口感(顺滑性(なめらかさ)、粘性)、硬度的评价(断裂强度分析)，可以基于使用株式会社山电公司制的蠕变仪(RE2－33005C)得到的物性值来进行。
(顺滑性)
对于口感中的“顺滑性”，可以基于利用蠕变仪得到的波形的直线性进行评价。如果在波形中越是没有错乱(接近直线)，则作为口感越可以称作顺滑(なめらか)。
(粘性)
对于粘性(拉丝性(糸引き性)：质构分析)可以利用目视及后述的柱形探头升高时的切线的斜率来评价。可以认为，切线的斜率越小，则发酵乳制品越具有粘性，越具有浓厚感，可以对发酵乳制品赋予在口中越加一致的感觉(よりまとまる感覚)。
(硬度)
作为本发明的发酵乳制品的凝乳的硬度，可以利用后述的断裂强度分析进行评价。作为具体的物性值，可以在不打碎凝乳地利用蠕变仪将柱形探头压下的情况下，将凝乳破碎的时刻的载荷(N)作为“断裂点”(由蠕变仪自动计算的值)，来评价其硬度。作为本发明的发酵乳制品的硬度，可以调节为所期望的硬度，没有特别限定，例如，作为优选的硬度(断裂点)，为0.002～1.0N，更优选为0.005～0.5N。
(由发酵造成的蛋白质的SDS－PAGE的变化)
在使包含本发明的金属蛋白酶的原料乳发酵的情况下，在其前后κ－酪蛋白以外的乳蛋白的变化适合为最小限度。这是因为，能够不改变味道、风味等地改善口感。对于该情况，可以将发酵前后的发酵物提供给SDS－PAGE，根据其所显现出的各条带的变化来确认。
此处，各条带的级分的比例可以如下算出，即，将提供给SDS－PAGE的泳动后的凝胶干燥后，用EPSON公司制扫描仪GT‐X820作为灰度的图像导入，利用Image J软件(NIH，Bethesda，MD)，测定各条带的浓度(蛋白量)，由此算出。
本发明中，在将本发明的金属蛋白酶添加到原料乳后，在20～60℃发酵5小时后的基于SDS‐PAGE电泳的约25kDa以外的条带的级分与发酵前相比，优选没有大幅度变动。可以推定，利用此种特性，可以在调整发酵乳制品的凝乳硬度、顺滑性等的同时，防止因酶处理而损害其他的本来的风味等。需要说明的是，基于SDS‐PAGE电泳的各条带的分子量可以利用公知的方法算出，对于各条带区的分子量范围，也可以同样地利用公知的方法算出。
《乳制品的制造方法》
本发明的乳制品的制造方法只要是依次进行将原料乳与乳酸菌混合、得到混合液的第一工序、以及使混合液发酵的第二工序，在第二工序结束前，包括向所述原料乳和/或所述混合液中添加来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的工序(蛋白酶添加工序)即可，具体的制造方法没有特别限定。例如，在乳制品为发酵乳的情况下，其制造方法包括：(1)向牛乳中以给定的浓度同时地添加乳酸菌发酵剂和金属蛋白酶；(2)在43℃搅拌10～15分钟左右；(3)将所得的混合液分注到玻璃容器中、在43℃发酵5小时；(4)将所得的发酵调制物在4～5℃冷藏保存1天以上等工序。
《乳制品的用途》
前发酵型可以用于饮料型或水果酸奶等中。后发酵型可以用于原味酸奶(プレーンヨーグルト)等中。另外，由于不会对乳糖酶的活性造成影响，因此也可以制成添加了乳糖酶的乳制品。
[实施例]
以下，利用实施例及比较例对本发明进行说明，然而本发明并不受实施例、比较例限定。
《发酵乳制品的制造》
＜制造例1＞
(材料)
牛乳：明治美味牛乳(明治おいしい牛乳)(乳脂成分3.8±0.3质量％、非脂乳固体成分8.6±0.3质量％)
中性蛋白酶：将Paenibacillus polymyxa NBRC 15309株植入Difco公司制营养液体培养基中，在30℃培养2天，将所得的培养液以10000g离心10分钟，将所得的上清液利用透析进行脱盐后使用。需要说明的是，该蛋白酶具有前述的(a)～(g)的性质。
乳酸菌发酵剂：乳酸菌粉末FD－DVS YF－L812Yo－Flex(科汉森公司制：Lactobacillus.delbrueckii subsp.及Streptococcus.thermophilus的混合)。
(制造方法)
将牛乳450g加入已灭菌玻璃容器中，同时地添加乳酸菌发酵剂YF－L812和中性蛋白酶。发酵剂添加浓度以原料乳为基准设为0.1mg/g，中性蛋白酶添加浓度设为1.0(PU/g)。将添加有发酵剂、中性蛋白酶的牛乳在恒温水槽中在43℃搅拌10～15分钟左右。接下来，分注到玻璃容器(Daiso公司制、220ml)中，在43℃发酵5小时。将发酵调制物冷藏保存(4～5℃)1天以上，得到制造例1的酸奶。
＜制造例2＞
除了将乳酸菌发酵剂设为FD－DVS YC－380Yo－Flex(科汉森社制：Lactobacillus.delbrueckii subsp.及Streptococcus.thermophilus的混合。)以外，与制造例1相同地得到制造例2的酸奶。
＜制造例3＞
除了将牛乳设为低脂肪牛乳(UHT杀菌牛乳：明治美味低脂肪乳乳脂成分1.2质量％、乳固体成分11±1.0质量％)以外，与制造例1相同地得到制造例3的酸奶。
＜制造例4＞
除了将牛乳设为无脂肪乳(UHT杀菌牛乳：小岩井无脂肪牛乳乳脂成分0.1质量％、乳固体成分8.8±0.2质量％)以外，与制造例1相同地得到制造例4的酸奶。
＜制造例5＞
除了未添加中性蛋白酶以外，与制造例1相同地得到制造例5的酸奶。
＜制造例6＞
除了未添加中性蛋白酶以外，与制造例2相同地得到制造例6的酸奶。
＜制造例7＞
除了未添加中性蛋白酶以外，与制造例3相同地得到制造例7的酸奶。
＜制造例8＞
除了未添加中性蛋白酶以外，与制造例4相同地得到制造例8的酸奶。
《评价》
＜试验例1(关于口感的物性评价)＞
(断裂强度分析)
对制造例1(实施例)及制造例2(实施例)的酸奶以及制造例5(比较例)及制造例6(比较例)的酸奶，进行了物性的测定。使用山电公司制的蠕变仪(RE2－33005C)进行物性的测定。不打碎凝乳地进行断裂强度分析。将结果表示于图1中。在断裂强度分析中，将柱形探头的压入速度设定为1mm/s，将样品厚度设定为47mm，将柱形探头形状设定为直径16mm的圆形，将测定变形率设定为40％，将压力传感器的规格设定为2N。
如图1所示，可知当添加中性蛋白酶时，凝乳的硬度就会减小。在未添加酶的情况下，在凝乳内部的硬度方面存在有不均(实线的凸凹波形)。另一方面，当添加中性蛋白酶时，凝乳内部的硬度的不均就会减小(虚线的波形)，可以认为口感变得顺滑。
(质构分析)
质构分析是用勺子充分地搅拌而打碎凝乳，放入专用杯中进行测定。在质构分析中，将柱形探头的压入速度设定为5mm/s，将样品厚度设定为15mm，将柱形探头形状设定为直径16mm的圆形，将测定变形率设定为66.66％，将压力传感器的规格设定为2N。利用该设定，在质构分析中，将柱形探头向凝乳内插入10mm，接下来使柱形探头升高，测定出加在柱形探头上的载荷变化。将结果表示于图2中。因柱形探头的插入而增加的载荷随着柱形探头的升高而显示出负值，当柱形探头离开凝乳的界面时，就会变为拉丝样。在添加了中性蛋白酶的情况下，与未添加酶相比附着性(载荷零以下的面积)减小，而拉丝样的粘性增加。拉丝样的粘性使得柱形探头在升高时被反向牵拉，因此载荷的升高变得平缓，在波形上引出切线的情况下，与未添加酶的切线(切线1及切线3、实线)相比中性蛋白酶添加的切线(切线2及切线4、破线)的斜率变小。切线的斜率是使用Excel(注册商标)如下所示地求出。从波形的载荷达到最小的点在变形率14％的范围中引出近似直线，根据所得的近似直线求出切线的斜率。将详情表示于表1中。由于该粘性的原因，口感在口中有一致的感觉，变得浓厚并且顺滑。
[表1]
【表1】
切线的斜率
制造例1(实施例) 0.000645
制造例5(比较例) 0.000917
制造例2(实施例) 0.000650
制造例6(比较例) 0.001121
<试验例2(关于低脂肪乳的口感的物性评价)>
(断裂强度分析)
对于制造例3(实施例)、以及制造例7(比较例)的酸奶，与试验例1相同地进行了断裂强度分析。将结果表示于图3中。
如图3所示，可知当添加中性蛋白酶时，凝乳的硬度增加。在未添加酶(制造例7)的情况下，在凝乳内部的硬度方面存在有不均(实线的凸凹波形)。另一方面，当添加中性蛋白酶时，凝乳内部的硬度的不均就会减小(虚线的波形)，可以认为口感变得顺滑。
(质构分析)
与试验例1相同地进行了质构分析。将结果表示于图4中。在添加了中性蛋白酶的情况下，与未添加酶相比附着性(载荷零以下的面积)增加，虽然没有表示在表中，然而切线的斜率减小，拉丝样的粘性增加。由于该粘性的原因，口感在口中有一致的感觉，变得浓厚并且顺滑。
<试验例3(关于无脂肪乳的口感的物性评价)>
(断裂强度分析)
对于制造例4(实施例)及制造例8(比较例)的酸奶，与试验例1相同地进行了断裂强度分析。将结果表示于图5中。
如图5所示，可知当添加中性蛋白酶时，凝乳的硬度即增加。在未添加酶(制造例8)的情况下，在凝乳内部的硬度方面存在有不均(实线的凸凹波形)。另一方面，当添加中性蛋白酶时，凝乳内部的硬度的不均减小(虚线的波形)，可以认为口感变得顺滑。
(质构分析)
与试验例1相同地进行了质构分析。将结果表示于图6中。在添加了中性蛋白酶的情况下，与未添加酶(制造例8)相比附着性(载荷零以下的面积)增加。没有表示于表中，虽然切线的斜率基本上没有变化，但是由于硬度和附着性的增加，感官评价的结果是，口感在口中有一致的感觉，变得浓厚并且顺滑。
＜试验例4(浓度依赖性)＞
针对制造例1的发酵乳改变添加浓度(0.05、0.10、0.25、1.0、2.0及4.0PU/g)而研究了可以观察到质构改变效果的本发明的中性金属蛋白酶的添加浓度。不打碎凝乳地进行断裂强度分析。将结果表示于图7中。当添加0.25PU/g以上的中性蛋白酶时，凝乳的硬度减小。即使添加4.0PU/g的中性蛋白酶，也会保持凝乳的形状，可以认为能够在后发酵型的发酵乳中使用。在未添加酶的情况下，在凝乳内部的硬度方面存在有不均(粗实线的凸凹波形)，而当添加0.05PU/g以上的中性蛋白酶时，凝乳内部的硬度的不均减小，可以认为口感变得顺滑。
＜试验例5(关于口感的感官试验)＞
由10名被测者对添加了中性蛋白酶的酸奶(制造例1)和未添加的酸奶(制造例5)，基于以下的评价基准，在下面的4个基准下进行了感官试验。将其结果表示于表2中。
(评价基准)
作为评价基准，将酸奶的口感分为顺滑性、舌感(口当たり)、风味、浓厚感这4个评价项目，设为4个级别的评价(特别良好＝3分、良好＝2分、普通＝1分、差＝0分)，算出平均分(○＝2～3分、△＝1～2分、×＝0～1分)。
[表2]
【表2】
顺滑性 舌感 风味 浓厚感
制造例1(添加) ○ ○ ○ ○
制造例5(未添加) Δ Δ ○ ×
<试验例6(发酵前后的SDS-PAGE中的条带的变化)>
(发酵方法)
与制造例1相同地将中性蛋白酶的添加浓度设为1.0PU/g并在43℃搅拌10～15分钟左右后，分注到15mL容量离心沉降管中，在43℃发酵5小时。发酵前，对发酵1、2、3、4及5小时后的发酵液，依照下述的方法，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了发酵过程的蛋白质变化。
(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
将上述所得的发酵溶液用超纯水稀释为20倍，与SDS-PAGE用样品缓冲液(0.125MTris-HCl pH6.8、0.0125％溴百里酚蓝、20％甘油、2.5％SDS、2.5％2-巯基乙醇)以1∶1混合，利用95℃、5分钟的加热处理制备出泳动用样品。向12.5％丙烯酰胺凝胶(4％积层胶、凝胶厚1mm、泳动距离50mm)供给分子量标准品及泳动用样品，在Marisol产业电泳槽中，利用积层10mA恒电流、分离20mA泳动至泳动前线到达凝胶下端附近。作为分子量标准品(泳道M)使用了BIO-RAD#161-0313(经过预染)。对泳动后的凝胶进行了1小时的借助CBB染色液(APRO SP-4010)的蛋白染色。将泳动结果表示于图8中。另外，将基于Image J的条带的分析结果表示于表3中。
需要说明的是，表3所示的基于Image J的条带的分析结果中的条带区A(100～40kDa)、条带区B(33～26kDa)、条带区C(26～23kDa)、条带区D(20～18kDa)、条带区E(16.5～15kDa)、条带区F(14～10kDa)对应于表示出泳动结果的图8右中所示的A～F的条带。
[表3]
【表3】
从发酵开始第1小时起，κ－酪蛋白的条带{约25kDa(条带区C)}特异性地消失，条带区D及F的条带增加。发酵开始第2小时以后，在各条带区的浓度方面观察不到大的变化，其他的来自于乳的蛋白的浓度在发酵5小时后也观察不到大的变化。因而可以推断，根据本发明的制造方法，在口感以外，可以不大幅度改变乳的性质地改善其口感。
＜试验例7(伴随着pH变化的蛋白酶活性的变化)＞
进行了中性蛋白酶的pH稳定性试验。将中性蛋白酶用含有50mMMES、1mM乙酸钙的溶液(pH6.5)稀释为约1000PU/mL，在稀释后用1N盐酸进行pH调整，在43℃加热1小时。测定蛋白酶，求出将未进行pH调整未加热的样品设为100％时的残存活性。如下所示地测定蛋白酶活性。在含有50mM MES、1mM乙酸钙的溶液(pH6.5)中以5％溶解偶氮酪蛋白(SIGMAA2765)，作为底物。向100μL的5％偶氮酪蛋白中添加300μL的含有50mM MES、1mM乙酸钙的溶液(pH6.5)及100μL的稀释酶液，在43℃反应30分钟后，利用500μL的10％三氯乙酸停止反应。向离心上清液中添加等量的1N NaOH并混合，测定出OD 428nm的吸光度。将结果表示于图9中。在作为发酵乳的一般的发酵温度的43℃，中性蛋白酶在pH4.5、1小时条件下失活。因而，在发酵调制物中不残存中性蛋白酶活性，可以预计，在保存时，中性蛋白酶不会对发酵调制物造成不良影响。
＜试验例8(中性蛋白酶与乳糖酶溶液的并用)＞
对于中性蛋白酶与乳糖酶溶液的并用，针对口感的变化、以及乳糖酶对乳糖分解率的影响进行了研究。与制造例1相同，将发酵剂添加浓度设为0.1mg/g，将中性蛋白酶添加浓度设为1PU/g，制造出酸奶。与上述的断裂强度分析相同地对柔软性及凝乳内部的不均(顺滑性)进行了研究。将结果表示于图10的面板A中。需要说明的是，添加有发酵剂、中性蛋白酶的牛乳在43℃搅拌10～15分钟左右后分注到玻璃容器中，在43℃发酵5小时。将发酵调制物冷藏保存1天以上，进行了物性测定。不打碎凝乳地进行了断裂强度分析。将结果表示于图10的面板B中。
尽管中性蛋白酶是蛋白酶，在与乳糖酶同时地添加时，不会消除乳糖酶的效果，可以期待由乳糖分解带来的防止乳糖不耐受症的效果、甜味增强效果。另一方面，乳糖酶也不会消除中性蛋白酶的效果，因此可以说能够制造顺滑的发酵乳。

Claims (9)

1.一种发酵乳制品的制造方法，其特征在于，是依次进行第一工序和第二工序的发酵乳制品的制造方法，所述第一工序将原料乳与乳酸菌混合，得到混合液；所述第二工序使所述混合液发酵，
在所述第二工序结束前，进行向所述原料乳和/或所述混合液中添加来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的工序即蛋白酶添加工序。
2.根据权利要求1所述的发酵乳制品的制造方法，其中，
所述原料乳中所含的乳脂成分与所述蛋白酶的添加量的比即所述乳脂成分：所述蛋白酶的添加量为50∶1～1∶10，
其中，所述乳脂成分的单位为质量％，所述蛋白酶的添加量的单位为PU/g。
3.根据权利要求1或2所述的发酵乳制品的制造方法，其中，
所述蛋白酶的添加量以所述原料乳的全部质量为基准为0.05PU/g～10.0PU/g。
4.根据权利要求1所述的发酵乳制品的制造方法，其中，
所述原料乳中所含的乳脂成分为0质量％～10质量％。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的发酵乳制品的制造方法，其中，
所述原料乳中所含的非脂乳固体成分为3.0质量％～20质量％。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的发酵乳制品的制造方法，其特征在于，
所述蛋白酶具有下述的(1)～(5)的性质：
(1)利用属于类芽孢杆菌属的细菌产生，
(2)在中性范围中将κ－酪蛋白及血红蛋白分解，
(3)在pH5.5～9.0时稳定，最适pH为7.0～8.0，
(4)在20℃～75℃发挥作用，最适温度为50℃～60℃，
(5)基于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法的分子量推定为32000Da～34000Da的蛋白酶。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的发酵乳制品的制造方法，其中，
还包括向所述原料乳和/或所述混合液中添加选自乳糖酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、菊粉酶、漆酶、过氧化酶、以及所述蛋白酶以外的蛋白酶中的1种或多种的工序。
8.一种发酵乳制品，其特征在于，
是含有来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶的发酵乳制品，
使用蠕变仪测定时的凝乳的断裂点为0.002N～1.0N。
9.一种发酵乳制品的制造方法，其特征在于，
该制造方法包括：
第一工序，将原料乳与乳酸菌混合，得到混合液；
第二工序，使所述混合液发酵；
蛋白酶添加工序，在所述第二工序结束前，向所述原料乳和/或所述混合液中添加来自于类芽孢杆菌属的蛋白酶，
以所期望的所述发酵乳制品的凝乳硬度、原料乳中所含的乳脂成分、和来自于类芽孢杆菌属蛋白酶的添加量为指标，确定该乳脂成分和该蛋白酶的添加量，进行发酵工序。
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