CN118076233A - 采用微生物和蛋白酶、优选金属蛋白酶的组合的基于植物的发酵产品的制备 - Google Patents
采用微生物和蛋白酶、优选金属蛋白酶的组合的基于植物的发酵产品的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种制备基于植物的发酵产品的酶法。更特别地，该方法涉及用一种或多种蛋白酶和微生物处理具有1％(w/w)或更高的植物蛋白含量的基于植物的液体底物；并且允许经处理的基于植物的底物发酵以产生该基于植物的发酵产品。优选地，该蛋白酶是解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶(芽孢杆菌溶素，P7L)，并且乳酸菌用于发酵。在低水解度下，经蛋白酶处理的植物蛋白的粘度令人惊讶地增加，这可能是由于具有疏水性N末端部分的肽的形成，这些肽可以由于疏水相互作用形成凝胶。在较高水解度下，粘度如预期的那样降低。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月28日提交的美国临时申请号63/194,240的权益，该临时申请通过引用以其全文特此并入。
技术领域
本发明涉及一种制备基于植物的发酵产品的酶法。更特别地，该方法涉及用一种或多种蛋白酶和微生物处理具有1％(w/w)或更高的植物蛋白含量的基于植物的液体底物；并且允许经处理的基于植物的底物发酵以产生该基于植物的发酵产品。
背景技术
传统上，酸奶和相关发酵产品全部衍生自奶、典型地牛奶。虽然奶富含蛋白质和其他营养物质，但许多消费者对食用乳制品产品有健康担忧。例如，乳制品产品可以为饮食贡献大量的饱和脂肪(取决于食用水平)。高脂肪且尤其是高饱和脂肪的饮食可能增加心脏病的风险并且可能引起其他严重的健康问题。其他可能与乳制品食用相关的健康问题是乳糖不耐症和其他食物过敏症。
目前可获得非乳制品替代品，诸如基于大豆和杏仁的酸奶和发酵饮料。但是，非乳制品酸奶与其乳制品对应物相比典型地具有较差质地和苦味风味。一直需要基于植物的乳制品替代品，其具有与传统基于奶的酸奶和发酵饮料更相似的流变学和质地特性，而不伴有苦味味道的形成。
发明内容
根据本发明的一个方面，呈现了一种用于制备基于植物的发酵产品的方法，该方法具有以下步骤：(a)用蛋白酶和微生物处理具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)或更高的植物蛋白含量的基于植物的液体底物；并且(b)允许经处理的底物发酵以产生该基于植物的发酵产品。任选地，该植物蛋白含量是6％(w/w)或更高。任选地，该植物蛋白衍生自大豆、杏仁、豌豆、菜豆、稻或燕麦。
任选地，该蛋白酶属于酶委员会(E.C.)3.4.24.x(其中x是任何数字)。任选地，该蛋白酶来自M4家族。任选地，该蛋白酶是金属蛋白酶或中性蛋白酶。任选地，该蛋白酶与SEQID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。任选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。任选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
任选地，将该基于植物的液体底物在添加所述微生物之前用该蛋白酶处理。任选地，将该蛋白酶与该微生物一起添加。任选地，将该蛋白酶在添加该微生物之后添加。
任选地，该微生物是乳酸菌。任选地，该蛋白酶是金属蛋白酶并且该微生物是乳酸菌。
任选地，该微生物是链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、假明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)或其任何组合中的一种或多种。
任选地，呈现了一种通过上述方法可获得的基于植物的发酵产品。
在本发明的仍另一个方面，呈现了一种基于植物的发酵产品，该基于植物的发酵产品具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)或更高的植物蛋白含量并且具有一种或多种外源性蛋白酶和外源性微生物。任选地，该植物蛋白含量是6％(w/w)或更高。任选地，该植物蛋白衍生自大豆、杏仁、豌豆、菜豆、稻或燕麦。
任选地，该蛋白酶属于酶委员会(E.C.)3.4.24.x(其中x是任何数字)。任选地，该蛋白酶来自M4家族。任选地，该蛋白酶是金属蛋白酶或中性蛋白酶。任选地，该蛋白酶与SEQID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。任选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。任选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
任选地，该微生物是乳酸菌。任选地，该蛋白酶是金属蛋白酶并且该微生物是乳酸菌。
任选地，该微生物是链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属或双歧杆菌属或其任何组合中的一种或多种。
任选地，该基于植物的发酵产品是高蛋白酸奶、希腊酸奶、浓缩酸奶(Labneh)或酸奶油。
在本发明的另一个方面，呈现了蛋白酶在生产基于植物的高蛋白发酵产品中用于以下的用途：
(a)改善粘度；(b)改善凝胶强度；(c)改善质地；(d)改善凝乳的硬度；(e)提供较早的发酵开始；(f)提供较早的凝胶化开始；(g)提供较早的发酵结束；(h)降低脱水收缩；(i)改善保质期；(j)减少后酸化；(k)改善风味；(l)降低粘性；或(m)(a)至(l)的任何组合。
在本发明的另一个方面，呈现了一种基本上如上前文参考任何一个实例所述的方法、基于植物的发酵产品或用途。
在本发明的另一个方面，呈现了一种稳定化用于在酸性食物基质中使用的基于植物的奶的方法，该方法包括用蛋白酶处理所述基于植物的奶。任选地，该基于植物的奶是大豆奶、杏仁奶、腰果奶、稻米奶、椰子奶、澳洲坚果奶或燕麦奶。任选地，该酸性食物基质是咖啡。
任选地，该蛋白酶属于酶委员会(E.C.)3.4.24.x(其中x是任何数字)。任选地，该蛋白酶来自M4家族。任选地，该蛋白酶是金属蛋白酶或中性蛋白酶。任选地，该蛋白酶与SEQID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。任选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。任选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
附图说明
图1描绘了用不同剂量的酶处理的大豆蛋白(Supro 760IP)。在热处理(■)之前和在72℃加热步骤之后。
图2描绘了对用不同剂量的P7L处理的大豆蛋白(Supro 760IP)样品测量的粘度。
图3描绘了用不同剂量的P7L酶处理的豌豆蛋白(Trupro 2000)。在热处理(■)之前和在72℃加热步骤之后
图4示出了对于用0-18ppm P7L酶(基于蛋白质)处理的样品在保质期内测量的杏仁酸奶粘度。
图5描绘了对于具有和不具有0.15％总果胶并且与不添加果胶、具有2ppm P7L(基于蛋白质)的杏仁酸奶相比的杏仁酸奶对照样品在保质期内测量的粘度。
图6描绘了对于具有和不具有0.15％总果胶并且与不添加果胶、具有7ppm P7L(基于蛋白质)的杏仁酸奶相比的杏仁酸奶对照样品在保质期内测量的粘度。
图7示出了对于具有和不具有0.15％总果胶并且与不添加果胶、具有7ppm P7L(基于蛋白质)的杏仁酸奶相比的杏仁酸奶对照样品在保质期内测量的pH值。
图8描绘了对于椰子和豌豆酸奶在保质期内测量的粘度。将不添加酶的对照与在巴氏灭菌之前用18ppm P7L(基于蛋白质)制成的酸奶相对于用在培养物添加步骤期间在巴氏灭菌之后添加的7、25或50ppm P7L(基于蛋白质)制成的酸奶进行比较。
图9描绘了具有4.15％以及具有和不具有192.8ppm P7L(基于蛋白质)的发酵豌豆蛋白饮料相对于具有6.27％蛋白质以及具有和不具有223.4ppm P7L的发酵豌豆蛋白饮料测量的粘度。
图10描绘了具有15、20或25克蛋白质/份而不添加酶的发酵大豆蛋白饮料相对于具有15.6、31.1或62.2ppm P7L(基于蛋白质)的饮料测量的粘度。
图11示出了与不同的基于燕麦的饮料混合的(蒸汽加压煮出的)浓咖啡(espresso)(pH＝5)。在生产过程中将基于燕麦的饮料不用P7L(对照)或用在0.1-1ppm范围内的P7L处理。图片是在将燕麦饮品和咖啡混合之后6min获取的。
图12示出了在倒入至pH为5的浓咖啡中之后直接用0.1ppm P7L处理的蒸汽起泡的燕麦饮品。
序列ID号简述
SEQ ID NO:1是来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的P7L的全氨基酸序列。
具体实施方式
本公开提供了改善基于植物的产品的特性的方法、装置、成分和试剂盒。在一些实施例中，本公开提供了通过使用一种或多种酶改善基于植物的产品的特性的方法、装置、成分和试剂盒。在一些实施例中，本公开提供了改善基于植物的发酵产品的流变学特性和整体可接受性(例如，基于植物的酸奶产品的粘度)的方法、装置、成分和试剂盒。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第20版,John Wiley and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所用的许多术语的通用词典。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，否则分别地，任何核酸序列都从左向右以5'至3'取向书写；氨基酸序列都从左向右以氨基至羧基取向书写。本文提供的标题并不是对本公开的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把本说明书作为一个整体参考时，以下即将定义的术语得以更全面地定义。
必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白酶”包括多种此类酶，并且提及“该饲料”包括提及一种或多种饲料以及本领域技术人员已知的其等效物，等等。
本文讨论的出版物只是针对它们在本申请的申请日之前的公开而提供。本文中的内容都不应理解为承认这些出版物构成所附权利要求中的现有技术。
基于植物的产品
在一些实施例中，本发明提供了改善基于植物的发酵产品的特性的方法、装置、成分和试剂盒。
“基于植物的发酵产品”是还可以称为“食物产品”或“饲料产品”的产品、优选食用产品。该基于植物的发酵产品是通过用微生物(如下所定义)发酵而产生的产品。
在一些实施例中，该基于植物的发酵产品是乳制品类似物产品，优选基于植物的酸奶、基于植物的希腊酸奶、浓缩酸奶、基于植物的冷冻酸奶、基于植物的新鲜干酪、基于植物的夸克(quark)或史克尔(skyr)类似物、基于植物的浓缩酸奶类似物、基于植物的rjaschenka类似物、基于植物的干酪类似物(诸如酸凝乳干酪、硬干酪、半硬干酪、白软干酪)、基于植物的黄油、基于植物的黄油夸克、基于植物的酸奶油、开菲尔(kefir)、基于植物的发酵乳清饮料、基于植物的饮料、基于植物的发酵饮品、基于植物的熟化奶油、清爽干酪(fromage frais)、基于植物的凝乳、加工干酪类似物、基于植物的白软干酪、基于植物的奶油甜点。
在一些实施例中，该基于植物的发酵产品是基于植物的酸奶、优选凝固酸奶或搅拌酸奶。
基于植物的搅拌酸奶已经在发酵后搅拌至少5至60秒。最优选地，搅拌酸奶已经在发酵后搅拌至少10秒。最优选地，搅拌酸奶已经在发酵后搅拌至少20秒。在优选的实施例中，搅拌酸奶已经在发酵后搅拌至少30秒。搅拌可以用手动混合器或电动混合器进行。凝固酸奶在发酵后不搅拌。在发酵后可以将凝固酸奶冷却并且然后储存。这是在不搅拌的情况下进行的。
如以上所用的短语“在发酵后”意指当发酵结束时。当达到发酵培养物的特定pH时，发酵优选结束。此pH优选在3与6之间、最优选在4与5之间。在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.1。在另外的实施例中，发酵结束时的pH是4.2。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.3。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.4。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.5。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.6。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.8。在另外的实施例中，发酵结束时的pH是4.9。在一些实施例中，发酵在使如下所述使用的低pH敏感性肽酶的活性失活或降低的pH下结束。这是pH 4.6-4.8。
如本文所用，术语“酸奶(yoghurt)”是具有相同含义的“酸奶(yogurt)”的替代拼写。
在优选的实施例中，在发酵步骤期间或之后搅拌该基于植物的发酵产品。优选地，搅拌进行至少5至60秒或多于60秒。在一个实施例中，搅拌进行至少10至30秒。在另外的实施例中，搅拌进行至少12至20秒。在优选的实施例中，搅拌进行至少15秒。搅拌可以用手动混合器或电动混合器进行。
在一个实施例中，将该基于植物的发酵产品冷却、优选立即冷却。此冷却可以例如使用水浴或热交换器进行。优选地，将该基于植物的发酵产品冷却至20℃-30℃。最优选地，将该基于植物的发酵产品冷却至约25℃或至25℃。
可替代地，在一个实施例中，将该基于植物的发酵产品冷却至1℃-10℃的较低温度、最优选4℃-6℃。在一个实施例中，通过将该基于植物的发酵产品置于冷室或冰箱中来缓慢地进行此冷却。
在优选的实施例中，将该基于植物的发酵产品立即冷却至20℃-30℃、最优选至约25℃或至25℃。然后将该基于植物的发酵产品冷却第二次，但此次冷却至1℃-10℃、最优选4℃-6℃。在一个实施例中，将该基于植物的发酵产品冷却第二次至3℃。在另一个实施例中，将该基于植物的发酵产品冷却第二次至4℃。在另外的实施例中，将该基于植物的发酵产品冷却第二次至5℃。在一些实施例中，将该第二次冷却缓慢进行，例如超过10至48个小时。在一个实施例中，冷却进行超过12至20小时。在优选的实施例中，冷却进行超过15至20小时。在最优选的实施例中，冷却进行超过10小时或冷却进行超过15小时。最优选地，在冷室或冰箱中进行此第二次冷却。
在一些实施例中，在发酵后和任何冷却步骤之前立即进行上述搅拌。搅拌还可以在两个冷却步骤之间进行。
在一些实施例中，将该发酵产品在发酵后经由UF过滤或滗析器浓缩。
在一些实施例中，将该发酵产品在生产后加热处理至>50C的温度。
本发明的方法可以进一步包括发酵后的储存步骤。这可以在搅拌和/或冷却(一次或多次)之后进行，优选在两者之后进行。
通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有以下特征中的一个或多个：(a)改善的粘度；(b)改善的凝胶强度；(c)改善的质地；(d)改善的凝乳的硬度；(e)较早的发酵开始；(f)较早的凝胶化开始；(g)较早的发酵结束；(h)降低的脱水收缩；(i)改善的保质期；(j)减少的后酸化；(k)改善的风味(例如较少的异味)；(l)减小的粘性；(m)改善的硬度；(n)改善的内聚性；(o)改善的粘合性；或(p)(a)至(o)的任何组合。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有改善的粘度。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有改善的凝胶强度。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有改善的质地。
在另外的实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有改善的凝乳硬度。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有较早的发酵开始。
在另外的实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有较早的凝胶化开始。
在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有较早的发酵结束。
在一个实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有降低的脱水收缩。
在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有改善的保质期。在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有改善的风味。
在优选的实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有减小的粘性。
这些特征改变该基于植物的发酵产品、优选酸奶的质地，并且还改变口感和味道。在一些实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品具有改善的味道，例如较少的异味和/或较少的苦味。
本发明的基于植物的发酵产品比不通过本发明的方法生产的和/或不使用本文所述的一种或多种酶生产的基于植物的发酵产品、最优选酸奶还具有更长的保质期。
如本文所用，“更长的保质期”意指该基于植物的发酵产品可以储存更长时间而不会改变质地、口感或味道，或者不会产品的脱水收缩增加。
储存优选在低温、优选低于10℃、最优选0℃-10℃并且更优选4℃-6℃下进行。
在一些实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品、最优选酸奶的保质期相比于不通过本发明的方法生产的和/或不使用本文所述的一种或多种酶生产的基于植物的发酵产品的保质期增加了5至75天。
在一些实施例中，通过本发明的方法生产的基于植物的发酵产品的保质期相比于不通过本发明的方法生产的和/或不使用本文所述的酶生产的基于植物的发酵产品的保质期增加了5至75天。
当比较两种基于植物的发酵产品时，诸如通过本发明的方法生产的产品与通过其他方法生产的产品相比，它们应当是相同类型的基于植物的发酵产品，例如酸奶。这在以下实例中展示。
如本文所用，术语“基于植物的底物”可以涵盖基于任何植物的或基于植物的产品。特别地，该基于植物的底物可以来自大豆植物、燕麦、豌豆、杏仁、椰子、稻、油菜(canola)、扁豆、火麻、奇亚籽(chia)、羽扇豆、向日葵、油菜籽、黑麦、玉米、高粱、马铃薯、粟、小麦、大麦、落花生。该基于植物的底物也可以是基于共混植物的。基于植物的底物是对其应用的如本文所述的本发明方法的起始材料。如本文所用的“接种的基于植物的底物”意指向其中添加乳酸菌(LAB)的基于植物的底物。
如本文所用，术语“植物奶(plant milk)”或“植物奶(plant-milk)”意指包含水和一种或多种植物蛋白的制造的非乳制品产品。例如，如果这些植物蛋白衍生自杏仁，则产品可以称为杏仁奶(almond milk)或杏仁奶(almond-milk)。类似地，根据植物蛋白的来源，本发明设想大豆奶、稻米奶、腰果奶、燕麦奶等。
本发明的方法中使用的基于植物的底物具有1％(w/w)或更高的蛋白质含量。例如，该基于植物的底物可以具有2％、3％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％(w/w)或更多的蛋白质含量。蛋白质含量典型地是按照蛋白质重量比体积(w/v)或蛋白质重量比总重量(w/w)来测量。在本文未指定的情况下，可以假设蛋白质含量的测量按照蛋白质重量对总重量(w/w)进行的。具有6％(w/w)或更多的蛋白质含量的基于植物的底物或基于植物的底物发酵产品在本文中称为“高蛋白”。
该基于植物的底物可以基于其蛋白质含量、基于其干物质含量经由FTIR方法、凯氏(Kjeldahl)或色谱蛋白质确定方法像布拉德福(Bradford)或BCA标准化。
优选在用本文所述的酶处理之前或之后对该基于植物的底物进行巴氏灭菌和/或预巴氏灭菌。巴氏灭菌包括将该基于植物的底物加热到至少72℃持续至少15秒、优选25秒或更多秒。在一个实施例中，在至少73℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在一个实施例中，在至少75℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在另外的实施例中，在至少85℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在另外的实施例中，在至少90℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。在另一个实施例中，在至少95℃下进行巴氏灭菌持续至少15秒。
巴氏灭菌可以进行至少30秒。在一些实施例中，巴氏灭菌可以进行至少1分钟。在另外的实施例中，巴氏灭菌可以进行至少2-15分钟。在另一个实施例中，巴氏灭菌可以进行至少3-10分钟。在另外的实施例中，巴氏灭菌可以进行至少15分钟或更多分钟。巴氏灭菌可以在高压釜中进行。
在一些实施例中，在至少95℃下进行巴氏灭菌持续4-6分钟。
在一些实施例中，在至少85℃下进行巴氏灭菌持续30分钟。
在一些实施例中，预巴氏灭菌和巴氏灭菌两者都进行。在一些实施例中，在标准化之前对原始的基于植物的进行预巴氏灭菌。在一些实施例中，在72℃-85℃(诸如72℃-75℃或72℃)下进行预巴氏灭菌。在一个实施例中，将预巴氏灭菌进行15-25秒、最优选15秒。在本发明的一个方面，在标准化之后将该基于植物的底物进行巴氏灭菌。
优选地，它在上述温度下进行并且持续上述时间。在一些实施例中，将标准化后的巴氏灭菌在约90℃下进行约10分钟，优选在90℃下进行10分钟。也可以在不进行标准化的情况下进行如上所述的巴氏灭菌。
在一个方面中，该基于植物的底物具有的pH(发酵前)为6-8，最优选在pH 6-7处或附近，并且在一些实施例中，在pH 6.7-6.8处或附近。
用本文所述的一种或多种酶处理该基于植物的底物。如本文所用，术语“处理”和“经处理的”可以涵盖添加至...、与...混合、与...一起孵育、与...一起搅拌、与...接触、与...一起发酵、用...接种、与...掺合和应用至...。在一些实施例中，在巴氏灭菌之前或之后用本文所述的一种或多种酶处理该基于植物的底物。在一些实施例中，在巴氏灭菌之前用如本文所述的一种或多种酶处理该基于植物的底物，并且在巴氏灭菌之后用如本文所述的另外的一种或多种酶处理该基于植物的底物。用于巴氏灭菌之前的处理的一种或多种酶可以与用于巴氏灭菌之后的处理的一种或多种酶相同，或者它们可以不同。在一些实施例中，用于巴氏灭菌之前的处理的一种或多种酶与用于巴氏灭菌之后的处理的一种或多种酶不同。
术语“处理”在本文中用于意指将一种或多种蛋白酶和微生物添加至该基于植物的底物。
发酵
如本文所用，术语“发酵”是指使用微生物诸如酵母和细菌或其任何组合将碳水化合物(诸如糖)转化成醇和CO2或有机酸。发酵通常在厌氧条件下进行。使用发酵生产了发酵产品。
如本文所用，术语“允许经处理的基于植物的底物发酵”意指发酵该基于植物的底物。这可以包括在合适的条件(例如厌氧)下和在合适的温度下孵育经处理的基于植物的底物足够的时间段以使发酵发生。
在本发明的基于植物的发酵产品的情况下，优选地，它们由接种有乳酸菌或下述的任何微生物的基于植物的底物产生，该任何微生物具有GRAS状态并且可以通过发酵基于植物的碳水化合物来使基于植物的酸化。例如，嗜热培养物诸如YO-Mix 465、532、860、414、883、885、M11、863、410、450、495、496、499、810、860、854、863、896、T42、VEGE033、/>VEGE 038、/>VEGE 053、/>VEGE 022、/>VEGE 061、/>VEGE 011、/>VEGE 092、/>VEGE 081、/>VEGE C-102or/>HOLDBAC YM VEGE+/>HOLDBAC LC，或者嗜常温培养物诸如Choozit220、Choozit 230或Probat 505。这些培养菌株可从杜邦公司商购获得。
在一个实施例中，该基于植物的底物在35℃-55℃、优选40℃-50℃下发酵。此温度范围对于嗜热微生物或嗜热培养物是优选的。最优选地，嗜热微生物或嗜热培养物的发酵温度是41℃。在一些实施例中，该发酵温度是约42℃。在一些实施例中，该发酵温度是约43℃。在其他实施例中，该发酵温度是约44℃。在一些实施例中，该发酵温度是约45℃。在另一个实施例中，该基于植物的底物在15℃-30℃、优选20℃-25℃下发酵。此温度范围对于嗜常温微生物或嗜常温培养物是优选的。最优选地，嗜常温微生物或嗜常温培养物的发酵温度是21℃。在一些实施例中，该发酵温度是约22℃。在一些实施例中，该发酵温度是约23℃。在其他实施例中，该发酵温度是约24℃。在一些实施例中，该发酵温度是约25℃。发酵温度的实例包括在30℃、37℃和43℃下。发酵温度可以影响所得基于植物的发酵产品的特性。
在一些实施例中，发酵在水浴或热交换器中进行。在一些实施例中，发酵在发酵罐或烧杯中进行。特别地，针对搅拌酸奶在发酵罐中进行发酵或针对凝固酸奶在烧杯中进行发酵。在一些实施例中，当达到特定pH时，发酵结束。此pH优选是比该基于植物的底物的起始pH更酸性的pH，最优选是在3与6之间的pH，更优选是在4与5之间。在一些实施例中，发酵结束时的pH是4.5-4.8。在一些实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在一些实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在一些实施例中，发酵结束时的pH是在或约4.6。
最优选地，当pH的降低减少了低pH敏感性肽酶的活性或使其完全失活时，发酵结束。
在一些实施例中，发酵后，将现在的基于植物的发酵产品冷却，优选如上所述立即冷却(参见标题为“基于植物的发酵产品”的部分)。
此举可以在搅拌之前或之后，或者可以不发生搅拌，这取决于优选的产品。此冷却可以例如使用水浴进行。如上所述，冷却可以在一个或两个步骤中进行。在一些实施例中，将该基于植物的发酵产品冷却至20℃-30℃。在一些实施例中，将该基于植物的发酵产品冷却至约25℃或至25℃。可替代地，在一个实施例中，在本发明的方法的步骤(b)之后，将该基于植物的发酵产品冷却至1℃-10℃的较低温度、最优选4℃-6℃。在一些实施例中，通过将该基于植物的发酵产品置于冷室或冰箱中来缓慢地进行此冷却。可替代地，可以一个接一个地(如上所述)应用这两个冷却步骤。
可以通过冷却或通过可以抑制或杀死发酵培养物的微生物的pH而停止发酵。冷却停止发酵过程。如上进一步所述，该基于植物的发酵产品可以储存在优选4℃-6℃下。
微生物
如本文所述的方法使用微生物。这是出于发酵目的。根据本发明使用的微生物是外源性微生物。如本文所用的术语“外源性”意指微生物典型地不发现于基于植物的中，并且因此获得自不同的(即，非基于植物的)来源。
在一些实施例中，所述微生物是乳酸菌。
如本文所用，术语“乳酸菌”(LAB)是指产生乳酸作为碳水化合物发酵的最终产物的任何细菌。在具体实施例中，该LAB选自由以下物种组成的组：链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属和双歧杆菌属或其任何组合。合适的微生物菌株的实例包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp lactis)、乳酸乳球菌干酪亚种(Lactococcus lactis subsp cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovardiacetylactis)、肠膜明串珠菌干酪亚种(Leuconostoc mesenteroides subspcremoris)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)。发酵或以其他方式生长的微生物(特别是LAB)菌落可以称为“培养物”。
在另外的方面中，该LAB是嗜热培养物。在一些实施例中，这种LAB的发酵在30℃-55℃、最优选37℃-43℃并且最优选在43℃下进行。
特别地，该乳酸菌(LAB)可以用于共混培养物、接种物或起子培养物中。
起子培养物
乳酸菌(LAB)可以用于起子培养物中。
在具体实施例中，本发明的起子培养物包含如上所述的LAB和低pH敏感性肽酶。
本发明的起子培养物可以是冷冻的、干燥的(例如喷雾干燥)、冷冻干燥的、液体、固体、处于颗粒或冷冻颗粒的形式、或处于粉末或干燥的粉末的形式。可以如上所述配制和/或包装该起子培养物。
该起子培养物还可以包含多于一种LAB菌株。在一些实施例中，所述LAB起子培养物具有的LAB浓度在107CFU/g与1011CFU/g起子培养物之间，并且更优选为至少107、至少108、至少109、至少1010或至少1011CFU/g起子培养物。
本发明还提供了如上所定义的起子培养物的用途。本发明的起子培养物可以优选地用于生产基于植物的发酵产品、特别是本发明的基于植物的发酵产品。可以通过将起子培养物添加至基于植物的底物并且允许经处理的基于植物的底物发酵获得且可获得本发明的基于植物的发酵产品。
蛋白水解酶
在一个方面，本发明涉及用于改善基于植物的产品的特性的系统、成分和方法，这些系统、成分和方法包括在该过程期间添加一种或多种酶。在一个实施例中，本发明提供了用于改善基于植物的产品的特性的成分和方法，所述方法包括在该过程期间添加一种或多种单独的或与其他酶组合的蛋白酶。
根据本发明使用的蛋白酶是外源性蛋白酶。如本文所用的术语“外源性”意指该蛋白酶典型地不发现于植物中，并且因此获得自不同的(即，非植物)来源。
如本文所用，术语蛋白酶(protease)与肽酶或蛋白酶(proteinase)同义。用于在本发明中使用的蛋白酶可以是金属蛋白酶或中性蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物来源。经化学修饰或蛋白质工程化的突变体也是合适的。蛋白酶可以是金属蛋白酶、微生物蛋白酶。
在一个实施例中，用于在本发明中使用的蛋白酶可以是Neutrase 0.8LTM诺维信公司(Novozymes)蛋白酶解淀粉芽孢杆菌中的一种或多种蛋白酶。
合适地，该蛋白酶可以是来自芽孢杆菌属(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))的蛋白酶。
在一个实施例中，该蛋白酶来自芽孢杆菌属。适合地，该蛋白酶可以来自物种枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)和地衣芽孢杆菌。在一个实施例中，该蛋白酶来自物种解淀粉芽孢杆菌。
在一个实施例中，该蛋白酶具有氨基酸SEQ ID NO:1。在一些实施例中，该蛋白酶与氨基酸SEQ ID No.1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一些实施例中，用于在本发明中使用的蛋白酶可以是低pH敏感性肽酶。
在一些实施例中，用于在本发明中使用的蛋白酶可以是金属蛋白酶。
如本文所用的术语“金属蛋白酶”是指具有蛋白酶活性的酶，其中该酶的催化机制涉及金属，典型地在活性位点中具有金属离子。
在一些实施例中，该金属蛋白酶是低pH敏感性肽酶。金属蛋白酶的一个或多个金属离子可以是任何金属离子。最优选地，如本文所用的金属蛋白酶包含锌、钙或锌和钙的组合的一个或多个金属离子。
用螯合剂处理除去金属离子并使金属蛋白酶失活。例如，EDTA是从金属蛋白酶中去除必需的锌并因此使酶失活的金属螯合剂。
在一些实施例中，如本文使用的金属蛋白酶在活性位点处具有一个二价离子或两个二价离子或多于两个二价离子。
在一些实施例中，如本文所用的金属蛋白酶在活性位点中具有钙或锌离子、最优选Zn2+。在一些优选的金属蛋白酶中，可能存在一个锌离子，在其他中可能存在两个或更多个锌离子。
优选地，金属蛋白酶包含形成金属离子结合位点或其部分的His-Glu-Xaa-Xaa-His基序(其中“Xaa”是任何氨基酸)。
在一个实施例中，其中金属蛋白酶是谷氨酸锌蛋白(GluZincin)超家族的成员，锌离子通过氨基酸基序His-Glu-Xaa-Xaa-His与另外的谷氨酸结合。优选地，其含有1个锌离子和2个钙离子。
在一些实施例中，该金属蛋白酶来自M4家族或谷氨酸锌蛋白超家族。该M4酶家族的特征在于，此家族中的所有酶结合单一的催化的锌离子。如在许多其他金属蛋白酶家族中一样，存在His-Glu-Xaa-Xaa-His基序。在Biochem.J.[生物化学杂志]290:205-218(1993)中进一步定义了M4家族。
在一些实施例中，本发明中使用的金属蛋白酶采用类似于蛋白质数据库结构1BQB(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)金属蛋白酶)、1EZM(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)金属蛋白酶)和1NPC(蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)金属蛋白酶))的3D结构。在优选的实施例中，该金属蛋白酶具有同类相食自溶位点。这意指该金属蛋白酶可以引起其自身裂解。
如本文所用，术语“金属蛋白酶(metalloprotease)”可以与
“金属肽酶”、“金属蛋白酶(metalloproteinase)”和“中性蛋白酶”互换使用。在一些实施例中，该金属蛋白酶或如本文所述的蛋白酶是低pH敏感性的。如本文所用，术语“低pH敏感性”是指其最适pH值与植物基料的pH值(pH 6.5-6.7)相同或接近并且其活性在pH4.6-4.8下相比于在pH 6.5-6.7下低至少2倍的肽酶。
在一些实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶在pH 4.6-4.8下相比于在pH6.5-6.7下具有低至少10倍、并且最优选低至少15倍的活性。
在一些实施例中，在发酵期间有机酸(例如乳酸)的产生降低了pH并使在本发明的方法期间的低pH敏感性肽酶失活。
在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶在4.6-4.8的低pH下不可逆地失活。在优选的实施例中，使本发明中使用的肽酶减少或失活的低pH是通过发酵引起的。最优选地，此低pH是由糖到有机酸的微生物发酵，诸如乳糖到乳酸的发酵引起的。最优选地，失活是永久的，并且因此所得的基于植物的发酵产品含有很少、不含有或含有仅痕量的活性肽酶。优选地，通过终端发酵，或在储存之前或期间，蛋白水解活性降低，最优选地停止。
作为金属蛋白酶的低pH敏感性肽酶的低pH下的活性降低优选地是通过金属离子的解离引起的。如上所述，这些金属离子对该酶的功能是必需的。
如本文所用，在肽酶的上下文中，术语“降低的活性”意指与pH6.5-6.7的活性最大值下的肽酶活性单位相比，2倍或以上单位的肽酶活性的蛋白酶活性(也称为“肽酶活性”、“酶活性”、“内肽酶活性”或“外切肽酶活性”)的降低。在优选的实施例中，“降低的活性”是指小于在pH 6.5-6.7的活性最大值下的50％的活性。
如本文所用，在肽酶的上下文中，术语“失活”意指与pH 6.5-6.7的活性最大值下的肽酶活性单位相比，2倍或以上单位的肽酶活性的蛋白酶活性降低。在优选的实施例中，“失活”是指小于在pH 6.5-6.7的活性最大值下的90％的活性。
在一个实施例中，该低pH敏感性肽酶是热稳定的肽酶。如本文所用，术语“热稳定的”意指酶在大于30℃、优选30℃-60℃的温度下具有蛋白酶活性。
在本发明的一个实施例中，该低pH敏感性肽酶属于酶委员会(E.C.)编号3.4.24.x(其中x是任何数字)。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶是嗜热菌蛋白酶、NprE分子、蛋白水解素、短梗霉素(aureolysin)、Gentlyase或分散酶(Dispase)、或与这种酶具有高百分比同一性的肽酶。
在一些实施例中，本发明中使用的低pH敏感性肽酶不是凝乳酶或类凝乳酶(即，不具有类凝乳酶活性并且不特异性切割Met105-Phe106键)，并且不属于E.C.编号3.4.23.4。本发明中使用的低pH敏感性肽酶优选不切割Met105-Phe106键，并且最优选严格仅不切割Met105-Phe106键。
在一些实施例中，使用的肽酶由不包括任何信号序列的成熟蛋白组成或包含该成熟蛋白。在另外的实施例中，该肽酶由包括信号序列的全长蛋白质组成或包含该全长蛋白质。
在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶是非哺乳动物来源的、并且最优选非动物来源的。在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶是细菌肽酶、真菌肽酶、古细菌肽酶或人工肽酶。在一些实施例中，该低pH敏感性肽酶是细菌金属蛋白酶、真菌金属蛋白酶、古细菌金属蛋白酶或人工金属蛋白酶。
人工肽酶是其中一个或多个氨基酸已被突变、取代、缺失或以其他方式改变的酶，因此该酶的氨基酸序列不同于野生型，其中该野生型从活的生物体可获得。人工肽酶还可以称为变体肽酶。
如本文所用的细菌来源的肽酶优选从芽孢杆菌属物种、最优选解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)获得或可获得。最优选地，该低pH敏感性肽酶是可从杜邦公司获得的Protex 7L(P7L)或与其具有高百分比同一性，该Protex 7L也称为NprE、P7L、FoodPro PNL、Zymstar T、芽孢杆菌溶素(Bacillolysin)、硬脂溶素(Stearolysin)、嗜热菌蛋白酶样酶、嗜热菌蛋白酶样蛋白酶、热酶(thermoase)、Protex14L或Neutrase。这种肽酶示出为SEQ ID NO:1，并且由SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码。P7L是一种金属蛋白酶。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽、或其功能变体。
在一个实施例中，如本文所用的低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽、或其功能变体。例如，这种多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。
如本文所用，肽酶的“功能变体”意指尽管存在改变诸如取代、缺失、突变、丢失或另外的结构域和其他修饰，但该酶仍具有肽酶活性。
如本文所用，金属蛋白酶的“功能变体”意指尽管存在改变诸如取代、缺失、突变、丢失或另外的结构域和其他修饰，但该酶仍具有金属蛋白酶活性。
在一个实施例中，该低pH敏感性肽酶包含包括信号肽(也称为信号序列)的全长酶。信号序列指导多肽通过特定原核或真核细胞膜的分泌。在一个实施例中，该低pH敏感性肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、缺乏信号序列的多肽。
在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％的序列同一性、缺乏信号肽的氨基酸序列、或其功能变体。在另外的实施例中，该低pH敏感性肽酶包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性并还缺乏信号肽的氨基酸序列、或其功能变体。
像所有蛋白质一样，肽酶可以由具有核苷酸序列的核酸编码。本发明中使用的低pH敏感性肽酶可以从例如如通过SEQ ID NO:2或其变体(其编码SEQ ID NO:1)所展示的核酸获得或可获得。所述核酸可以在宿主细胞中表达。所述核酸可以从宿主细胞获得或可获得。
在一些实施例中，与本文所述的一种或多种酶相比，该酶具有的氨基酸总数小于350、诸如小于340、诸如小于330、诸如小于320、诸如小于310、诸如小于300个氨基酸、诸如在200至350个氨基酸的范围内、诸如在220至345个氨基酸的范围内。
在一些实施例中，该酶的氨基酸序列具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。
氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或者其可以通过合成制成，或者其可以通过利用重组DNA技术制备。
在本发明中涵盖的蛋白质可以与其他蛋白质(特别是酶)一起使用。因此，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白酶和另一种酶(其可以是根据本发明的另一种蛋白酶)。
优选地，当与本发明的范围本身有关或当由本发明的范围本身所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且当其已经由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
本发明的优选的实施例
根据本发明的一个方面，呈现了一种用于制备基于植物的发酵产品的方法，该方法具有以下步骤：(a)用蛋白酶和微生物处理具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)或更高的植物蛋白含量的基于植物的液体底物；并且(b)允许经处理的底物发酵以产生该基于植物的发酵产品。优选地，该植物蛋白含量是6％(w/w)或更高。优选地，该植物蛋白衍生自大豆、杏仁、豌豆、菜豆、稻或燕麦。
优选地，该蛋白酶属于酶委员会(E.C.)3.4.24.x(其中x是任何数字)。更优选地，该蛋白酶来自M4家族。仍更优选地，该蛋白酶是金属蛋白酶或中性蛋白酶。又更优选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在又更优选的实施例中，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。最优选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
优选地，将该基于植物的液体底物在添加所述微生物之前用该蛋白酶处理。在其他优选的实施例中，将该蛋白酶与该微生物一起添加。在仍其他优选的实施例中，将该蛋白酶在添加该微生物之后添加。
优选地，该微生物是乳酸菌。更优选地，该蛋白酶是金属蛋白酶并且该微生物是乳酸菌。
在其他优选的实施例中，该微生物是链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属或双歧杆菌属或其任何组合中的一种或多种。
在本发明的另一个方面，呈现了一种通过上述方法可获得的基于植物的发酵产品。
在本发明的仍另一个方面，呈现了一种基于植物的发酵产品，该基于植物的发酵产品具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)或更高的植物蛋白含量并且具有一种或多种外源性蛋白酶和外源性微生物。优选地，该植物蛋白含量是6％(w/w)或更高。优选地，该植物蛋白衍生自大豆、杏仁、豌豆、菜豆、稻或燕麦。
优选地，该蛋白酶属于酶委员会(E.C.)3.4.24.x(其中x是任何数字)。更优选地，该蛋白酶来自M4家族。仍更优选地，该蛋白酶是金属蛋白酶或中性蛋白酶。又更优选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在又更优选的实施例中，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。最优选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
优选地，该微生物是乳酸菌。更优选地，该蛋白酶是金属蛋白酶并且该微生物是乳酸菌。
在其他优选的实施例中，该微生物是链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属或双歧杆菌属或其任何组合中的一种或多种。
在本发明的优选方面，该基于植物的发酵产品是高蛋白酸奶、希腊酸奶、浓缩酸奶或酸奶油。
在本发明的另一个方面，呈现了蛋白酶在生产基于植物的高蛋白发酵产品中用于以下的用途：
(a)改善粘度；(b)改善凝胶强度；(c)改善质地；(d)改善凝乳的硬度；(e)提供较早的发酵开始；(f)提供较早的凝胶化开始；(g)提供较早的发酵结束；(h)降低脱水收缩；(i)改善保质期；(j)减少后酸化；(k)改善风味；(l)降低粘性；或(m)(a)至(l)的任何组合。
在本发明的另一个方面，呈现了一种基本上如上前文参考任何一个实例所述的方法、基于植物的发酵产品或用途。
在本发明的另一个方面，呈现了一种稳定化用于在酸性食物基质中使用的基于植物的奶的方法，该方法包括用蛋白酶处理所述基于植物的奶。优选地，该基于植物的奶是大豆奶、杏仁奶、腰果奶、稻米奶、椰子奶、澳洲坚果奶或燕麦奶。优选地，该酸性食物基质是咖啡。
优选地，该蛋白酶属于酶委员会(E.C.)3.4.24.x(其中x是任何数字)。更优选地，该蛋白酶来自M4家族。仍更优选地，该蛋白酶是金属蛋白酶或中性蛋白酶。又更优选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在又更优选的实施例中，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。最优选地，该蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
实例实例1：具有中性内切肽酶的大豆和豌豆蛋白浆液的粘度的增加。
建立实验以研究大豆和豌豆蛋白在用低浓度的中性内切肽酶处理后的粘度如何改变。
为了制备8％蛋白质含量的浆液，将18.7g Supro 760IP(批号180127109，85.8％蛋白质含量)或19.3g Trupro 2000(批号G010058562，83.0％蛋白质含量)与1g NaCl在去了皮重的烧杯中混合。添加约150g水(MilliQ)和2mL 2％叠氮化钠并且用2M NaOH或HCl将pH调整至6.5。最终，用水将浆液的总重量调整至200g。
将蛋白质浆液以5g一份等分至20mL Wheaton小瓶中。将P7L预稀释在20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，并且添加至蛋白质浆液以获得图1、2和3中指示的ppm剂量(以相对于Supro 760IP或Trupro 2000的ppm给出)。最大酶添加量是270μL。较小的酶添加体积通过添加缓冲液来补偿至270μL的总添加量。将所有样品在55℃和400rpm下的磁力搅拌下在加热块中孵育3小时。通过在水浴中浸没10min将温度降低至室温。使用Gilson Viscoman管(生物实验室公司(Bio-Lab)，里斯考(Risskov)，丹麦))一式三份测量粘度。在一些情况下，给予进一步的热处理：将样品升至72℃，并且在此温度下保持30秒。随后，通过在水浴中浸泡10min将温度降至室温，然后再次测量粘度。
用不同剂量的酶处理的大豆蛋白的粘度测量值示出于图1中。清楚的是，粘度随着P7L剂量增加至0.76ppm，然后在较高剂量的P7L下粘度降低。用于产生图1和图3两者中的结果的热处理模拟了温和的巴氏灭菌。基本上看出，此热量增强了对由酶引起的粘度增加的影响。为了进一步研究此现象，用P7L的扩展剂量范围重复实验。同样，在此看出(图2)，在低剂量的酶下粘度增加，峰值粘度在0.08ppm P7L下获得。在9.15ppm的酶剂量下，粘度降低至无酶参考物以下。由于对长聚合物的分解，预期通过对蛋白质的内切肽酶处理粘度会降低。图2清楚地显示，在高于9.15ppm的剂量下，使用此酶也可以获得粘度降低。然而，在低剂量的酶下粘度的增加是令人惊讶的。此效应可能与酶的选择性有关。酶将以Leu、Val、Ile、Phe顺序优先水解疏水性氨基酸N末端侧的肽键。因此，从内部蛋白质释放疏水性斑块。假设由此产生的具有疏水性N末端的肽通过疏水相互作用而相互作用，从而在浆液中形成网络状结构。
用不同剂量的P7L处理的豌豆蛋白的粘度测量值示出于图3中。结果与图1中针对大豆蛋白所描绘的结果相似。对于豌豆蛋白，由酶引起的粘度差异小得多。然而，存在低剂量的酶将提供粘度的增加的趋势。同样，基本上看出，热处理增强了对由酶引起的粘度增加的影响。
实例2：杏仁酸奶中的减薄和增稠效应
在具有3.6％蛋白质的杏仁酸奶的发酵过程期间，与培养物添加同时地添加P7L。基料由79％城市供水、17％ AlmondGOLD ExtraSmooth杏仁黄油、3.5％蔗糖、0.1％柠檬酸钙和0.1％磷酸三钙制成。将所有成分在高搅拌下共混并且使其水合30分钟。在180°F(82.2℃)下持续7分钟完成高温短时(HTST)巴氏灭菌，并且用20DCU/100LVEGE 065在110°F(43.3℃)下进行发酵，直到4.65的目标pH。记录到目标pH的时间。在发酵期间测试以下五种不同剂量的酶：2、4.5、7、14和18ppm(基于蛋白质)。存在一个在不添加酶的情况下制成的另外酸奶样品。发酵后，将所有样品通过均质器以80-100psi剪切，并且然后在67天保质期内储存在40°F(4.4℃)下。
使用配备有6号转子的可编程布鲁克菲尔德(Brookfield)DV3T RV粘度计(布鲁克菲尔德工程实验室(Brookfield Engineering Laboratories)，米德尔伯勒(Middleboro)，马萨诸塞州，美国)确定每种酸奶的粘度。使用30秒读取，在40°F(4.4℃)、20rpm的转子转速下测量样品。粘度结果示出于图4中。
此外，在第21和67天进行关于对6名专门小组成员(年龄：23-45岁)的描述性感官。所有专门小组成员均未受过训练，这确保了符合消费者训练水平的感官。将所有样品在6盎司半透明杯中呈现给专门小组成员。要求专门小组成员用语言描述他们关于味道和口感的印象。
令人惊讶的是，发现当与不添加P7L的样品相比时，2-4.5ppm的P7L剂量将导致在整个试验期间(67天)内的粘度增加。此外，当与不添加酶的样品相比时，7ppm的剂量也将提供粘度的增加直到第28天，然后观察到减薄效果。在剂量高于7ppm的情况下，仅在第1天可以看到粘度增加，并且在测试的所有其他时间点，酶导致了减薄效应，该减薄效应在此呈现为与不添加酶的样品相比的粘度降低。
感官评价确认了各种P7L剂量的定量增稠和减薄效应，并且在第21天和67天全部被描述为“清白且似奶油，没有异味或苦味”。对于7ppm或高于其的剂量，它甚至被描述为比没有酶的对照更清白。
另外发现，达到4.65的pH的发酵时间将随着酶剂量的增加而减少(参见表1)。
表.1.达到4.65的pH的时间
实例3：替换杏仁酸奶中的果胶的P7L在HTST巴氏灭菌的情况下实现增稠效应
在发酵过程期间与培养物同时添加2ppm(基于蛋白质)的P7L。发酵的基料由3.6％蛋白质组成。基料由79％城市供水、17％AlmondGOLD ExtraSmooth杏仁黄油、3.5％蔗糖、0.1％柠檬酸钙和0.1％磷酸三钙制成。将所有成分在高搅拌下共混并且使其水合30min。制备不进行酶处理以及包括和不包括果胶(0.10％低甲氧基果胶+0.05％高甲氧基果胶)的两个另外的杏仁酸奶样品。在180°F(82.2℃)下持续7分钟完成HTST巴氏灭菌，并且用20DCU/100LVEGE 065在110°F(43.3℃)下进行发酵，直到达到pH 4.65。发酵后，将所有样品通过冷却压机以大约50psi剪切，并且然后在69天保质期内储存在40°F(4.4℃)下。在保质期内测量粘度。使用配备有6号转子的可编程布鲁克菲尔德DV3T RV粘度计(布鲁克菲尔德工程实验室，米德尔伯勒，马萨诸塞州，美国)确定粘度。使用60秒读取，在40°F(4.4℃)、20rpm的转子转速下测量样品。结果示出于图5中并且当与不添加酶或果胶的参考物相比时显示出在整个试验期间内的粘度增加。令人惊讶的是，结果还显示粘度的增加与含有果胶的样品基本上水平相当。
此外，在第69天进行关于4名专门小组成员(年龄：23-45岁)的描述性感官。所有专门小组成员均未受过训练，这确保了符合消费者训练水平的感官。将所有样品在6盎司半透明杯中呈现给专门小组成员。要求专门小组成员用语言描述他们关于味道和口感的印象，并且将他们的评论示出于表2中。当添加P7L时，未鉴定出对风味的负面效应。
表2.感官评论
实例4：替换杏仁酸奶中的果胶的P7L在槽中(VAT)巴氏灭菌的情况下实现增稠效应
在具有3.6％蛋白质的杏仁酸奶的发酵过程期间，与培养物添加同时地添加7ppm(基于蛋白质)的P7L。基料由79％城市供水、17％AlmondGOLD ExtraSmooth杏仁黄油、3.5％蔗糖、0.1％柠檬酸钙和0.1％磷酸三钙制成。制成不进行酶处理以及包括和不包括果胶(0.10％低甲氧基果胶+0.05％高甲氧基果胶)的两个另外的杏仁酸奶样品。在185°F(85.0℃)下持续30分钟完成槽中巴氏灭菌，并且用20DCU/100LVEGE 065在110°F(43.3℃)下进行发酵，直到达到pH 4.65。发酵后，将所有样品通过均质器以80-100psi剪切，并且然后在75天的保质期内储存在40°F(4.4℃)下。在保质期内测量粘度和pH。使用配备有6号转子的可编程布鲁克菲尔德DV3T RV粘度计(布鲁克菲尔德工程实验室，米德尔伯勒，马萨诸塞州，美国)确定粘度。使用30秒读取，在40°F(4.4℃)、20rpm的转子转速下测量样品。还在保质期内测量酸奶的pH以评价样品的发酵后酸化(参见图7)。
酸奶在保质期内的粘度示出于图6中。与其中7ppm的剂量将在超过21天的保质期时引起减薄效应的实验2(使用HTST巴氏灭菌)相比之下，令人惊讶地发现与参考样品相比的粘度增加在整个保质期内得以维持。因此清楚的是，酶的效应可以通过改变巴氏灭菌参数来调节。在酸奶的保质期内粘度的增加与含有果胶的样品基本上水平相当。
此外，发现添加P7L的样品与具有果胶的样品相比具有较少的后酸化，反而酶添加样品的后酸化趋势与参考样品更可比。
实例5：在槽中巴氏灭菌的情况下椰子和豌豆酸奶中的减薄和增稠效应
在椰子和豌豆蛋白酸奶的发酵过程期间，与培养物同时地添加7、25或50ppm(基于蛋白质)的P7L。基料由86％城市供水、7.9％2000豌豆蛋白浓缩物(大约6.6％总蛋白质)、3％蔗糖和3％哥伦布(Columbus)植物油76°椰子油制成。将所有成分在高搅拌下共混并且使其水合30min。作为对照，制备不进行任何酶处理的一个样品。此外，将一个样品在巴氏灭菌步骤前在冷藏条件下用18ppm P7L(基于蛋白质)处理1.25小时，并且在发酵期间不添加另外的酶。在190°F(87.8℃)下持续30分钟完成槽中巴氏灭菌，并且用20DCU/100L/>VEGE 022在110°F(43.3℃)下进行发酵，直到达到pH 4.65。发酵后，将样品冷却至70°F-80°F(21.1℃-26.7℃)并且通过均质器以80-100psi剪切，并且然后在59天保质期内储存在40°F(4.4℃)下。使用配备有6号转子的可编程布鲁克菲尔德DV3T RV粘度计(布鲁克菲尔德工程实验室，米德尔伯勒，马萨诸塞州，美国)确定粘度。使用30秒读取，在40°F(4.4℃)、10rpm的转子转速下测量样品。粘度测量的结果示出于图8中。发现，如果使用与培养物一起添加的7ppm酶(基于蛋白质)或者如果在巴氏灭菌步骤前在冷藏条件下以18ppm(基于蛋白质)的剂量预孵育1.25小时，则粘度与对照相比增加。25和50ppm的剂量导致减薄效应。
此外，在第59天进行关于4名专门小组成员(年龄：23-45岁)的描述性感官。所有专门小组成员均未受过训练，这确保了符合消费者训练水平的感官。将所有样品在6盎司半透明杯中呈现给专门小组成员。要求专门小组成员用语言描述他们关于味道和口感的印象。对照样品被描述为光滑，具有来自豌豆蛋白的异味和苦味。对于酶添加样品，确认了质地的测量增加或减少，并且风味被描述为与具有较少土味和豆腥味的对照相比更清白的味道。
实例6：发酵豌豆蛋白模型饮料中的减薄效应
将发酵豌豆蛋白饮料用4.15％或6.27％蛋白质以及4.0％蔗糖、1.8％向日葵油、0.10％脱油向日葵卵磷脂和0.04％结冷胶制成。将基料在185F-190F下高温短时(HTST)槽中巴氏灭菌6-7分钟，并且用20DCU/100LVEGE 047在110F(43.3C)下进行发酵，直到达到pH 4.6。在发酵过程期间与培养物添加一起添加P7L。向含有4.15％豌豆蛋白的样品中投配192.8ppm酶(基于蛋白质)，并且向含有6.27％豌豆蛋白的样品中投配223.3ppm酶(基于蛋白质)。也制备了不具有酶的对照样品以作为相同蛋白质水平下的参考物。发酵后，将所有样品使用高剪切混合器搅拌并且然后储存在40F(4.4C)下。在24小时后，在40F-45F下使用具有2或4号转子、60rpm、1分钟读取的布鲁克菲尔德RV粘度计测量粘度。样品的粘度示出于图9.中并且清楚地显示与没有酶的参考样品相比酶剂量如何引起酸奶的减薄效应。
实例7：大豆蛋白发酵饮料中的增稠和减薄
在用于制备具有以下的发酵大豆蛋白饮料的发酵过程期间与培养物同时地添加P7L：15、20、25-g蛋白质/296mL份以及3.5％蔗糖、1.8％向日葵油、0.10％脱油向日葵卵磷脂、0.03％甜菊、0.50％芒果风味剂和0.04％结冷胶。因此，样品含有来自XT219的5.067％、6.750％和7.802％大豆蛋白。将基料在180F-190F下高温短时(HTST)槽中巴氏灭菌6-7分钟，并且用20DCU/100L/>VEGE 047在110F(43.3C)下进行发酵，直到达到pH 4.5-5.0。对于每种大豆蛋白水平制备对照样品以及投配15.6、31.1或62.2ppm酶(基于蛋白质)的样品。发酵后，使用高剪切混合器(Thermomix)使所有样品光滑并且然后将其储存在40F(4.4C)下。在24小时后在40F-45F下使用根据样品稠度使用3、4或5号转子的布鲁克菲尔德RV粘度计(60rpm、30秒读取)测量粘度(参见图10)。数据清楚地显示出根据P7L剂量的增稠选择和减薄选择两者。/>
实例8：酶促处理的植物材料在酸性食物基质中的改善稳定性
为了制备初始燕麦基料，将320kg自来水加热至65℃并且与淀粉酶制剂FoodProALT(0.16kg)和FoodPro CGL(1.6kg)混合。随后，添加燕麦粉(80kg)。燕麦粉(全谷物燕麦细粉200，O 2000FP 200)购自菲泽谷物公司(Fazer Mills)(拉赫蒂(Lahti)，芬兰)，并且包含7.2％脂肪、56％碳水化合物、10％膳食纤维、13.5％蛋白质和0.003％盐。在连续搅拌下将混合物在65℃下孵育90min。此孵育后，将混合物加热至95℃持续10min以使酶失活，并且随后冷却至70℃。当达到70℃的温度时，将浆液泵入滗析器。将滗析器设置为6700rpm并且Δn为15.3rpm。将如此产生的燕麦基料在143℃下UHT处理4s并且在-18℃下冷却并储存直到进一步使用。为了产生燕麦咖啡师饮料(燕麦饮品)，在55℃下将6kg燕麦基料与5.66kg水混合。对于酶处理，将0.1ppm、0.5ppm或1ppm P7L添加至混合物，并且在连续搅拌下再孵育60min。以相同的方式但在不添加P7L的情况下制备没有酶的对照。孵育后，向所有样品中添加12g SOLAC SF-D、3.6g Gellan VEG 2000和8.58g氯化钠。对照另外包含0.1％(w/w)三聚磷酸钠。向如此制备的样品中添加300g向日葵油，并且以4000rpm再混合2min。随后将所有样品在140C下UHT处理5s，并且在75℃和40巴下均质化。将样品填充在250mL瓶中，冷却至10℃并且储存在5℃下直到进一步使用。
为了分析燕麦饮料的行为，使用Oracle BES980咖啡师机器(铂富(Sage)，伦敦，英国)。在供应商手册推荐的条件下产生(蒸汽加压煮出的)浓咖啡(100g，研磨37颗咖啡豆)。在咖啡师机器的标准设置下进行蒸汽起泡。自动起泡设置为最大质地并且停止了67℃的蒸汽起泡温度。
参考燕麦饮料(不进行酶处理)在将50g燕麦饮料混合至100g pH为5的(蒸汽加压煮出的)浓咖啡中之后20秒内显示出乳凝。
当在相同咖啡饮品中使用用P7L处理的燕麦饮料时，在将饮品倒入咖啡中时未发生乳凝(参见图12)。在将燕麦饮品和咖啡混合之后240(0.1ppm P7L)、90(0.5ppm P7L)和300s(1ppm P7L)可见乳凝。此外，对于经P7L处理的燕麦饮品，乳凝颗粒很小并且仍良好分散在饮料中(参见图11)。相比之下，没有P7L的对照产生大的团块，这些团块沉淀在咖啡饮品的底部。所有用P7L处理的燕麦奶在咖啡师机器中显示出蒸汽起泡特性，并且在最终的咖啡饮品中产生泡沫头(参见示例性图12)。
此外，进行关于4名专门小组成员(年龄：30-53岁)的描述性感官。所有专门小组成员均未受过训练，这确保了符合消费者训练水平的感官。将所有样品在产生后一周在6盎司半透明杯中呈现给专门小组成员。要求专门小组成员用语言描述他们关于味道和口感的印象。在直接比较中，所有用P7L制备的燕麦饮品被描述为与非酶处理对照相比具有更温和燕麦味道和更似奶油口感。
序列表
<110> 杜邦营养生物科学公司（DUPONT NUTRITION BIOSCIENCES APS）
<120> 基于植物的发酵产品的制备
<130> NB41931-US-PSP
<140> US 63/194,240
<141> 2021-05-28
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 521
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
<400> 1
Met Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Phe Met
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala Ala Glu Asn Pro Gln
20 25 30
Leu Lys Glu Asn Leu Thr Asn Phe Val Pro Lys His Ser Leu Val Gln
35 40 45
Ser Glu Leu Pro Ser Val Ser Asp Lys Ala Ile Lys Gln Tyr Leu Lys
50 55 60
Gln Asn Gly Lys Val Phe Lys Gly Asn Pro Ser Glu Arg Leu Lys Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Thr Thr Asp Asp Leu Gly Tyr Lys His Phe Arg Tyr Val
85 90 95
Pro Val Val Asn Gly Val Pro Val Lys Asp Ser Gln Val Ile Ile His
100 105 110
Val Asp Lys Ser Asn Asn Val Tyr Ala Ile Asn Gly Glu Leu Asn Asn
115 120 125
Asp Val Ser Ala Lys Thr Ala Asn Ser Lys Lys Leu Ser Ala Asn Gln
130 135 140
Ala Leu Asp His Ala Tyr Lys Ala Ile Gly Lys Ser Pro Glu Ala Val
145 150 155 160
Ser Asn Gly Thr Val Ala Asn Lys Asn Lys Ala Glu Leu Lys Ala Ala
165 170 175
Ala Thr Lys Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Ala Tyr Asp Val Thr Ile Arg
180 185 190
Tyr Ile Glu Pro Glu Pro Ala Asn Trp Glu Val Thr Val Asp Ala Glu
195 200 205
Thr Gly Lys Ile Leu Lys Lys Gln Asn Lys Val Glu His Ala Ala Thr
210 215 220
Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser Leu Asn Ile
225 230 235 240
Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser Lys Pro Thr
245 250 255
Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu Tyr Asn Leu
260 265 270
Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr Thr Ser Ser
275 280 285
Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly Lys Val Tyr Asp
290 295 300
Tyr Phe Tyr Gln Lys Phe Asn Arg Asn Ser Tyr Asp Asn Lys Gly Gly
305 310 315 320
Lys Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser Arg Tyr Asn Asn Ala Ala
325 330 335
Trp Ile Gly Asp Gln Met Ile Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Ser Phe Phe
340 345 350
Ser Pro Leu Ser Gly Ser Met Asp Val Thr Ala His Glu Met Thr His
355 360 365
Gly Val Thr Gln Glu Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Glu Asn Gln Pro Gly
370 375 380
Ala Leu Asn Glu Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Tyr Phe Asn Asp Thr
385 390 395 400
Glu Asp Trp Asp Ile Gly Glu Asp Ile Thr Val Ser Gln Pro Ala Leu
405 410 415
Arg Ser Leu Ser Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Gln Pro Asp Asn Phe Lys
420 425 430
Asn Tyr Lys Asn Leu Pro Asn Thr Asp Ala Gly Asp Tyr Gly Gly Val
435 440 445
His Thr Asn Ser Gly Ile Pro Asn Lys Ala Ala Tyr Asn Thr Ile Thr
450 455 460
Lys Ile Gly Val Asn Lys Ala Glu Gln Ile Tyr Tyr Arg Ala Leu Thr
465 470 475 480
Val Tyr Leu Thr Pro Ser Ser Thr Phe Lys Asp Ala Lys Ala Ala Leu
485 490 495
Ile Gln Ser Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Ala Ala Ser Val
500 505 510
Glu Ala Ala Trp Asn Ala Val Gly Leu
515 520
Claims (40)
1.一种用于制备基于植物的发酵产品的方法，所述方法包括：
(a)用蛋白酶和微生物处理包含c、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)或更高的植物蛋白含量的基于植物的液体底物；并且
(b)允许经处理的底物发酵以产生所述基于植物的发酵产品。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述植物蛋白含量是6％(w/w)或更高。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述植物蛋白衍生自大豆、杏仁、豌豆、菜豆、稻或燕麦。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶属于酶委员会(E.C.)3.4.24.x(其中x是任何数字)。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶来自M4家族。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述基于植物的液体底物在添加所述微生物之前用所述蛋白酶处理。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中将所述蛋白酶与所述微生物一起添加。
12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中将所述蛋白酶在添加所述微生物之后添加。
13.如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶并且其中所述微生物是乳酸菌。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物是乳酸菌。
15.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微生物包括链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、假明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)或双岐杆菌属(Bifidobacterium)或其任何组合中的一种或多种。
16.一种基于植物的发酵产品，其通过如前述权利要求中任一项所述的方法可获得。
17.一种基于植物的发酵产品，所述基于植物的发酵产品具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)或更高的植物蛋白含量并且包含一种或多种外源性蛋白酶和外源性微生物。
18.如权利要求17所述的基于植物的发酵产品，其中所述植物蛋白含量是6％(w/w)或更高。
19.如权利要求17或18所述的基于植物的发酵产品，其中所述植物蛋白衍生自大豆、杏仁、豌豆、菜豆、稻或燕麦。
20.如权利要求17至19中任一项所述的基于植物的发酵产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种属于酶委员会(E.C.)编号3.4.24.x(其中x是任何数字)。
21.如权利要求20所述的基于植物的发酵产品，其中所述属于酶委员会(E.C.)编号3.4.24.x(其中x是任何数字)的一种蛋白酶来自M4家族。
22.如权利要求17至21中任一项所述的基于植物的发酵产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是金属蛋白酶。
23.如权利要求22所述的基于植物的发酵产品，其中所述金属蛋白酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
24.如权利要求23所述的基于植物的发酵产品，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。
25.如权利要求24所述的基于植物的发酵产品，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
26.如权利要求17至20中任一项所述的基于植物的发酵产品，其中所述一种或多种蛋白酶中的一种是中性蛋白酶。
27.如权利要求17至26中任一项所述的基于植物的发酵产品，其中所述微生物是乳酸菌。
28.如权利要求17至27中任一项所述的基于植物的发酵产品，其中所述微生物包括链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属或双岐杆菌属或其任何组合中的一种或多种。
29.如权利要求17至28中任一项所述的基于植物的发酵产品，其中所述基于植物的发酵产品是高蛋白酸奶、希腊酸奶、浓缩酸奶或酸奶油。
30.蛋白酶在生产基于植物的高蛋白发酵产品中用于以下的用途：
(a)改善粘度；
(b)改善凝胶强度；
(c)改善质地；
(d)改善凝乳的硬度；
(e)提供较早的发酵开始；
(f)提供较早的凝胶化开始；
(g)提供较早的发酵结束；
(h)降低脱水收缩；
(i)改善保质期；
(j)减少后酸化
(k)改善风味；
(l)降低粘性；或
(m)(a)至(l)的任何组合。
31.一种基本上如前文参考任何一个实例所述的方法、基于植物的发酵产品或用途。
32.一种稳定化用于在酸性食物基质中使用的基于植物的奶的方法，所述方法包括用蛋白酶处理所述基于植物的奶。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述基于植物的奶是大豆奶、杏仁奶、腰果奶、稻米奶、椰子奶、澳洲坚果奶或燕麦奶。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述酸性食物基质是咖啡。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶属于酶委员会(E.C.)编号3.4.24.x(其中x是任何数字)。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述蛋白酶来自M4家族。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性。
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