CN107734973A - 方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备发酵奶产品的方法。该方法包括用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质、并且允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品的步骤。

Description

方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年1月30日提交的、标题为“方法”的英国专利申请号1501565.4，和2015年7月17日提交的、标题为“方法”的美国临时专利申请号62/193738的优先权和权益。

通过引用并入序列表

将2016年1月26日创建并同时提交的、以大小为68,480字节、名称为“20160126_NB40714PCT_ST25.txt”的文件形式提供的序列表通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本发明涉及制备发酵奶产品的方法。该方法包括用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质、并且允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品的步骤。

背景技术

酸奶是一种全世界各地生产的凝乳，是通过富含乳蛋白、并且有时是富含糖和增稠剂的奶基的乳酸发酵获得的(Sodini等人(2004).Critical Reviews in Food Scienceand Nutrition[食品科学和营养学中的关键评论]，44(2),113-137页)。酸奶的最重要品质属性之一是质地。可以通过添加蛋白，例如酪蛋白酸盐或乳清蛋白，通过添加调质剂(增稠剂、胶凝剂)，例如淀粉、果胶或明胶或其他食品级聚合物，或通过利用原位产生的外泌多糖(EPS)，来改性质地(Queguiner等人的US2005/0095317)。在一些国家，禁止将源自植物和动物来源的水状胶体(果胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、明胶、酪蛋白)添加至发酵奶制品，并且其可用量不足以满足需求(Prasanna等人(2012)Food Research International[国际食品研究]，47(1),6-12页)。

因此，对于用于在奶制品中使用，具体地用于在发酵奶产品，例如酸奶中使用的进一步改进的质地改性剂存在需求。

能够合成EPS的乳酸菌(LAB)已经长久用于食品加工，从而改进发酵产品，例如酸奶和奶基甜点、奶酪、和酸面团面包的物理特性和质地(Mende等人，(2013)FoodHydrocolloids[食品水状胶体]，32(1),178-185页)。仍未完全了解EPS影响乳凝胶特性的机制，但是该特性常与它们的结构特征，例如单糖构成、电荷、摩尔质量、支化度、链刚性相关，并且还与它们与乳蛋白的分子间相互作用相关(Mende等人，(2013))。此外，用于奶酪制造的高度特异性天冬氨酸内肽酶，凝乳酶(chymosin)，可以应用于使新鲜发酵产品质地化。某些酪蛋白水解酶，像凝乳酶是已知的，因为它们的凝固作用诱导大量脱水收缩(乳清的渗出)现象，在制造酸奶和发酵奶期间，这些现象是不希望的(Queguiner等人，同上和DeGreeftrial等人的US 2005/0095316)。US 2005/0095317进一步证实了酪蛋白，至少是κ-酪蛋白的蛋白质水解化改进了酸奶和发酵奶的质地并且增加了它们的黏度，其结果不诱导脱水收缩。但是应以受控的方式进行κ-酪蛋白水解，这就是说，初级蛋白水解反应不应继续将酪蛋白水解为它的不同氨基酸和它们的寡聚体，而应在将酪蛋白水解为肽、多肽或蛋白的大小的片段后停止，否则会产生苦味(Queguiner等人，同上)。最近，也已经报道了N-和O-连接的糖苷酶增加了新鲜发酵产品的黏度(Jakobsen等人的WO 2012/069546 A1)。WO2012/069546 A1示出，可以通过去糖基化去除聚糖，来改进新鲜发酵产品的凝胶硬度和黏度。

因此，对于易于使用的质地改性剂存在需求，该质地改性剂易于开源，改进了质地而不引起脱水收缩，可以与糖苷酶结合使用，符合文化和伦理要求(例如，素食主义)，并且不使奶制品和发酵奶产品变得味道不佳。

发明内容

在广泛的方面，本发明提供了提供奶制品，确切地说是发酵奶产品的方法。

具体地，本发明提供了提供发酵奶产品的方法，该方法包括：(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品。

在一个优选实施例中，对低pH敏感的肽酶是金属蛋白酶。

在一个优选实施例中，对低pH敏感的肽酶不是凝乳酶或凝乳酶样酶。

在最优选实施例中，用于本发明的方法的对低pH敏感的肽酶是金属蛋白酶并且属于酶委员会(E.C.)No.3.4.17或3.4.24，和/或来自M4家族。

在最优选实施例中，本发明提供了提供发酵奶产品的方法，该方法包括：(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；并且其中对低pH敏感的肽酶是细菌肽酶、真菌肽酶、古细菌肽酶或人工肽酶。

在最优选实施例中，本发明提供了提供发酵奶产品的方法，该方法包括：(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；并且其中对低pH敏感的肽酶是金属蛋白酶。在优选实施例中，所述金属蛋白酶是细菌金属蛋白酶、真菌金属蛋白酶、古细菌金属蛋白酶或人工金属蛋白酶。

优选地，对低pH敏感的肽酶是食品级肽酶。优选地，对低pH敏感的肽酶具有GRAS(通常认为安全)状态。最优选地，对低pH敏感的肽酶是NP7L。在优选实施例中，NP7L获得自或可获得自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。优选地，NP7L包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，或与其具有至少75％序列同一性。

在本发明的另一个方面，提供了通过本发明的方法获得的发酵奶产品。优选地，所述发酵奶产品是发酵奶、酸奶、搅拌型酸奶或凝固型酸奶。

在一个另外的方面，在发酵奶产品的生产中提供了对低pH敏感的肽酶的用途，其中所述发酵奶产品具有以下特征中的一个或多个：

(a)改进的黏度；

(b)改进的胶凝强度；

(c)改进的质地；

(d)改进的凝乳的硬度；

(e)较早的发酵开始；

(f)较早的凝胶化开始；

(g)较早的发酵结束；

(h)减少的脱水收缩；

(i)改进的保质期；

(j)减小的黏性；或

(k)(a)至(i)的任何组合。

一些优点

本发明的方法是有利的，因为归因于以下改进中的一个或多个，所述方法提供了具有改进的味道和/或口感的发酵奶产品：改进的黏度、改进的胶凝强度、改进的质地、改进的凝乳的硬度、较早的发酵开始、较早的凝胶化开始、较早的发酵结束、减少的脱水收缩、和/或增加的保质期。

在储存期间，在食品产品中，确切地说在发酵奶产品中，保留活性的酶，例如蛋白酶，继续进一步水解食品。已知这一点破坏质地，降低黏度，并且产生苦味肽。因此，此类蛋白酶极大减小产品可以在腐败之前储存的持续时间。换言之，保质期被缩短。此外，在食品中留下的活性酶将需要特殊标记，从而符合食品标准要求。

本发明涵盖使用对低pH敏感的肽酶制备的发酵奶产品。在优选实施例中，所述肽酶是金属蛋白酶。

在优选实施例中，在本发明的组合物和方法中使用的对低pH敏感的肽酶是外源肽酶。如在此使用的术语“外源的”意指该肽酶不天然存在于奶中。因此，必须将对低pH敏感的肽酶添加至奶基质。

在进一步优选的实施例中，外源对低pH敏感的肽酶不天然存在于用于发酵所处理的奶基质的微生物中，和/或不是由该微生物产生。

优选地，在本发明的方法期间，在发酵期间，有机酸(例如乳酸)的产生降低了pH，并且灭活了对低pH敏感的肽酶。因此，在储存之前或期间蛋白水解活性停止，并且当使用其他蛋白酶时，看上去并未发生质地、黏度和味道变化。

金属蛋白酶视用于活性稳定性的金属二价离子而定，并且这些金属离子易于解离。具体地，如果存在pH降低，则损失金属离子。因此，在发酵期间，金属蛋白酶被灭活。

此外，用于在本发明的方法中使用的对低pH敏感的肽酶不需要是动物来源的。这允许消费如下饮食的消费者，例如素食者、纯素食者、犹太教徒和伊斯兰教徒能够消费所得产品。

本发明还允许产生可以包含较少蛋白的不那么酸的发酵奶产品，特别是酸奶。在生产中，发酵可以更早停止，因此减小了生产发酵奶产品的生产成本和所用时间。此外，发酵奶产品仍具有以下特征中的一个或多个：改进的黏度、改进的胶凝强度、改进的质地、改进的凝乳的硬度、较早的发酵开始、较早的凝胶化开始、较早的发酵结束、减少的脱水收缩、减小的黏性和/或增加的保质期。

附图

图1：在应用YO-Mix 465，储存14天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，43℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图2：在应用YO-Mix 532，储存5天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，43℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图3：在应用YO-Mix 860，储存5天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，43℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图4：在应用YO-Mix 414，储存5天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，43℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图5：使用用于搅拌和冷却的试验工厂设备，在储存28天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(5l规模，YO-Mix465，43℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图6：在储存5天后，NP7L添加对凝固型酸奶的酸奶凝乳刚性的影响的图解说明。(100ml规模，43℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图7：在应用嗜常温生物培养物Probat505，储存5天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，27℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图8：在应用嗜常温生物培养物Choozit 220，储存5天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，27℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图9：在应用嗜常温生物培养物Choozit 230，储存5天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，27℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图10：在应用43℃的发酵温度，储存6天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，YO-Mix 465，43℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图11：在应用37℃的发酵温度，储存6天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，YO-Mix 465，37℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图12：在应用37℃的发酵温度储存6天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的储能模量的影响的图解说明。(100ml规模，YO-Mix 465，37℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图13：在应用不同发酵温度，储存5天后，NP7L添加对凝固型酸奶的凝乳刚性的影响的图解说明。(100ml规模，43℃、37℃和30℃，pH＝4.6，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图14：与在pH 4.6停止的参比相比，在pH 4.8停止发酵，储存6天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，YO-Mix 860，43℃，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图15：在应用不同蛋白含量，储存5天后，NP7L添加对搅拌型酸奶的剪切应力的影响的图解说明。(100ml规模，YO-Mix 465，37℃，标准化脱脂乳(0.1％脂肪))。

图16：NP7L添加启动酸奶的凝胶化的作用的图解说明。(40ml规模，YO-Mix 465，43℃，标准化脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪))。

图17：储存1天后，与对照相比，Protex 7L和Marzyme 10对酸奶的影响的图解说明。

图18：储存6天后，与对照相比，NP14L对酸奶的影响的图解说明。

图19：关于对酪蛋白的乳蛋白的凝固作用，真菌金属蛋白酶GOI269的测试的照片。在37℃过夜孵育后拍摄的照片。

图20：说明实例10，即真菌金属蛋白酶GOI269对奶的凝固作用的测试的结果的照片。

图21：(SEQ ID NO:1)来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的NP7L的全氨基酸序列。

图22：(SEQ ID NO:2)短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(马铃薯杆菌(Bacillusmesentericus))中性蛋白酶NprE的氨基酸序列。

图23：(SEQ ID NO:3)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)肽酶M4的氨基酸序列。

图24：(SEQ ID NO:4)NP14L嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillusthermoproteolyticus)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。

图25：(SEQ ID NO:5)来自草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)的GOI269的全氨基酸序列。

图26：(SEQ ID NO:6)来自草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)的GOI269的基因序列。

图27：(SEQ ID NO:7)来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的金属蛋白酶的全氨基酸序列。

图28：草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的两个金属蛋白酶序列的比对。

图29：(SEQ ID NO:8)编码NP7L的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

图30：(SEQ ID NO:9)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中性蛋白酶NprE的氨基酸序列。

图31：(SEQ ID NO:10)来自和平号空间站伊丽莎白菌(Elizabethkingiamiricola)(和平号空间站金黄杆菌(Chryseobacterium miricola))的N-糖酰胺酶A(PNGase A，肽-N(4)-(N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶F)的氨基酸序列

图32：(SEQ ID NO:11)来自脑膜败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)(脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum))的N-糖酰胺酶F的氨基酸序列

图33：(SEQ ID NO:12)来自褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)的内切糖苷酶H(内切-β-N-乙酰葡糖胺酶H)的氨基酸序列

图34：(SEQ ID NO:13)来自日本血吸虫的N-乙酰半乳糖胺酶α的氨基酸序列

图35：使用实例1a中的N-CBZ-甘氨酸对硝基苯基酯，在NP7L中的活性蛋白的量化的图解说明。

图36：按照实例1b，使用BVGApNA作为底物，分别在pH 4.6和6.7下，酸奶和鲜奶的pH下，NP7L的测定的图解说明。

图37：按照实例1c，使用Abz-AAFFAA-Anb作为底物并且监测荧光，测定NP7L的图解说明(关键词：Y＝酸奶；Y+NP7L，已经用NP7L处理的酸奶；ng＝52.5ul NP7L测定混合物中的纳克活性酶蛋白)。

图38：(SEQ ID NO:14)来自多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的M4成员分散酶(EC＝3.4.24.28)的氨基酸序列。

图39：(SEQ ID NO:15)来自液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)的金属肽酶M10家族成员粘质沙雷氏菌酶(Serralysin，EC 3.4.24.40)的氨基酸序列。

图40：(SEQ ID NO:16)来自黑曲霉(Aspergillus niger)的金属蛋白酶M4家族成员的氨基酸序列。

图41：(SEQ ID NO:17)来自土曲霉(Aspergillus terreus)的金属蛋白酶M4家族成员的氨基酸序列。

图42：(SEQ ID NO:18)来自白曲霉(Aspergillus kawachii)IFO 4308的金属蛋白酶MEP1的氨基酸序列。

图43：(SEQ ID NO:19)来自米曲霉(Aspergillus oryzae)(菌株ATCC 42149/RIB40)的金属蛋白酶的氨基酸序列。

图44：(SEQ ID NO:20)来自娄地青霉(Penicillium roqueforti)的细胞外金属蛋白酶的氨基酸序列。

图45：使用在embnet.vital-it.ch/software/LALIGN_form.html下的服务器，NP7L(Seq1，图21的SEQ ID NO:1)与NP14L(Seq2，图24)的比对示出这些序列具有38.4％同一性(65.7％相似)。

图46：添加有或未添加NP7L，包含5％(w/w)脂肪的酸性稀奶油中表观黏度的增加(上升曲线)。

图47：添加有或未添加NP7L，包含9％(w/w)脂肪的酸性稀奶油中表观黏度的增加(上升曲线)。

图48：用或不用NP7L的酸性稀奶油发酵物在口中的预测稠度。

图49：用或不用NP7L的酸性稀奶油发酵物在口中的预测黏性。

图50：包含有和不包含NP7L的添加的含18％(w/w)脂肪的酸性稀奶油的感官评估的蜘蛛图(***全部两种酶化的样品都不同于非酶化的样品(p□0.05))。

发明详述

在一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品。

优选地，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中该对低pH敏感的肽酶不是凝乳酶或凝乳酶样酶。

最优选地，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；其中所述发酵奶产品具有改进的黏度。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有改进的胶凝强度。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有改进的质地。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有改进的凝乳的硬度。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有较早的发酵开始。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有较早的凝胶化开始。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有较早的发酵结束。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有减少的脱水收缩。

在另一个方面，本发明提供了一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品；

其中所述发酵奶产品具有改进的保质期。

在另一个方面，本发明提供了使用对低pH敏感的肽酶制备的发酵奶产品及其用途，优选地，其中所述对低pH敏感的肽酶是金属肽酶，最优选地，属于M4家族的金属肽酶。

在另一个方面，本发明提供了使用对低pH敏感的肽酶制备的发酵奶产品及其用途，优选地，其中所述对低pH敏感的肽酶不是凝乳酶或凝乳酶样酶。

在优选实施例中，在本发明的组合物和方法中使用的对低pH敏感的肽酶是外源的。在进一步优选的实施例中，外源对低pH敏感的肽酶不天然存在于用于发酵处理的奶基质的微生物中，和/或不是由该微生物产生。

发酵奶产品

“发酵奶产品”是一种产品，优选地，是一种食用产品，它也可以称为“食品产品”或“喂养产品”。发酵奶产品是在如在此所述的本发明的方法的步骤(b)之后，赋予所得产品的名称。换言之，它是通过用微生物(如以下限定)发酵产生的产品。

发酵奶产品是奶制品，优选酸奶，冻酸奶，奶酪(例如酸凝乳干酪、硬质奶酪、半硬质奶酪、村舍式干酪)，黄油，酪乳，夸克奶酪，酸性稀奶油，开菲尔，发酵乳清基饮料，乳酒，乳饮料，酸奶饮料，发酵奶，熟奶油，清爽干酪，奶，发酵奶，凝乳，奶制品残余物，加工奶酪，村舍式干酪，奶油甜点，或婴儿乳。

在优选实施例中，发酵奶产品是酸奶，优选是凝固型酸奶或搅拌型酸奶。

搅拌型酸奶已经在发酵后搅拌了至少5至60秒。最优选地，搅拌型酸奶已经在发酵后搅拌了至少10秒。最优选地，搅拌型酸奶已经在发酵后搅拌了至少20秒。在优选实施例中，搅拌型酸奶已经在发酵后搅拌了至少30秒。可以用手动混合器或电动混合器进行搅拌。

凝固型酸奶不在发酵后进行搅拌。在发酵后，可以将凝固型酸奶冷却并且然后储存。不经搅拌就进行这一点。

如以上使用的短语“发酵后”意指当发酵结束时。在优选实施例中，“发酵后”意指在本发明的方法的步骤(b)后。当达到发酵培养物的特定pH时，优选地结束步骤(b)(发酵)。该pH优选在3和6之间，最优选在4和5之间。在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.1。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.2。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.3。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.4。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.5。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.6。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.8。在另一个实施例中，发酵结束时的pH是4.9。

优选地，在灭活或降低本发明中使用的对低pH敏感的肽酶的活性的pH后，发酵结束。这时pH是4.6-4.8。

如在此使用，术语“酸奶(yoghurt)”是“酸乳(yogurt)”的可替代性拼写，具有同一含义。

在优选实施例中，在发酵步骤(b)期间或之后搅拌发酵奶产品。优选地，搅拌进行至少5至60秒，或多于60秒。在一个实施例中，搅拌进行至少10至30秒。在另一个实施例中，搅拌进行至少12至20秒。在优选实施例中，搅拌进行至少15秒。可以用手动混合器或电动混合器进行搅拌。

在一个实施例中，在步骤(b)后，发酵奶产品被冷却，优选地立即冷却。例如，可以使用水浴或热交换器来进行这一冷却。优选地,发酵奶产品被冷却至20℃-30℃。最优选地，发酵奶产品被冷却至约25℃或冷却至25℃。

可替代地，在一个实施例中，在本发明的方法的步骤(b)后，发酵奶产品被冷却至1℃-10℃、最优选4℃-6℃的更低温度。在一个实施例中，通过将发酵奶产品放置在冷室或冰箱中，来缓慢进行这一冷却。

在优选实施例中，在步骤(b)后，立即将发酵奶产品冷却至20℃-30℃，最优选冷却至约25℃，或冷却至25℃。然后将发酵奶产品第二次冷却，但是这次冷却至1℃-10℃，最优选4℃-6℃。在一个实施例中，发酵奶产品被第二次冷却至3℃。在另一个实施例中，发酵奶产品被第二次冷却至4℃。在另一个实施例中，发酵奶产品被第二次冷却至5℃。

在优选实施例中，缓慢进行第二次冷却，例如经历10至48小时。在一个实施例中，冷却进行12至20小时。在优选实施例中，冷却进行15至20小时。在最优选实施例中，冷却进行10小时，或冷却进行15小时。最优选地，在冷室或冰箱中进行这一第二冷却。

在一个实施例中，在步骤(b)后并且在任何冷却步骤前，立即进行上述搅拌。还可以在两个冷却步骤之间进行搅拌。

本发明的方法可以进一步包括在步骤(b)后的储存步骤。这可以在搅拌和/或冷却(一次或多次)后，优选在这二者后进行。

通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有以下特征中的一个或多个(以下进一步限定)：

(a)改进的黏度；

(b)改进的胶凝强度；

(c)改进的质地；

(d)改进的凝乳的硬度；

(e)较早的发酵开始；

(f)较早的凝胶化开始；

(g)较早的发酵结束；

(h)减少的脱水收缩；

(i)改进的保质期；

(j)减小的黏性；或

(k)(a)至(i)的任何组合。

在一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有改进的黏度。

在一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有改进的胶凝强度。

在一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有改进的质地。

在另一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有改进的凝乳的硬度。

在一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有较早的发酵开始。

在另一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有较早的凝胶化开始。

在优选实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有较早的发酵结束。

在一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有减少的脱水收缩。

在优选实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有改进的保质期。

在优选实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有减小的黏性。

这些特征改变了发酵奶产品，优选酸奶的质地，并且还改变了口感和味道。

与不是通过本发明的方法产生的、和/或不是使用对低pH敏感的肽酶产生的、或未用对低pH敏感的肽酶处理产生的发酵奶产品、最优选酸奶相比，本发明的发酵奶产品具有更长的保质期。

如在此使用，“更长保质期”意指发酵奶产品可以储存更长时间，而没有质地、口感或味道的改变，或产品的脱水收缩的增加。

优选地在低温，优选小于10℃，最优选0-10℃，并且更优选4℃-6℃进行储存。

在优选实施例中，与不是通过本发明的方法产生的、和/或不是使用对低pH敏感的肽酶产生的、或未用对低pH敏感的肽酶处理产生的发酵奶产品相比，通过本发明的方法产生的发酵奶产品、最优选酸奶的保质期增加了5至28天。

在优选实施例中，与不是通过本发明的方法产生的、和/或不是使用对低pH敏感的肽酶产生的、或未用对低pH敏感的肽酶处理产生的发酵奶产品相比，通过本发明的方法产生的发酵奶产品的保质期增加了5至28天。

当比较两种发酵奶产品时，例如将通过本发明的方法产生的产品与通过其他方法产生的产品相比，它们应是相同类型的发酵奶产品，例如酸奶。将在实例中对其进行说明。

奶基质

如在此使用，术语“奶基质”可以涵盖任何奶或奶制品。具体地，奶基质可以具有动物来源，具体地是牛奶、绵羊奶或山羊奶。在一个实施例中，奶基质可以是减脂奶，1％脂肪奶，0.1％脂肪奶，半脱脂奶(semi-skimmed milk)或脱脂奶(skimmed milk)(也分别称为半脱脂乳(semi-skim milk)和脱脂乳(skim milk))。奶基质还可以是混合奶。

奶基质是如在此所述的本发明的方法应用于其的起始材料。

如在此使用，“接种的奶基质”意指向其中添加了乳酸菌(LAB)的奶基质。

奶基质可以是标准化的或均质化的。例如，可以按1％至10％或更高蛋白重量体积比(w/v)将奶基质标准化。在一个实施例中，可以按3％-7％蛋白w/v将奶基质标准化。在优选实施例中，可以按3.5％或约3.5％蛋白w/v将奶基质标准化。在另一个实施例中，可以按3.6％或约3.6％蛋白w/v将奶基质标准化。在最优选实施例中，可以按约4％或按4％蛋白w/v将奶基质标准化。

例如，可以按0至5％或更高脂肪w/v将奶基质标准化。在一个实施例中，可以按0-1％脂肪w/v将奶基质标准化。在优选实施例中，可以按约0.1％或按0.1％脂肪w/v将奶基质标准化。在另一个实施例中，可以按约0.025％至0.05％脂肪w/v将奶基质标准化。在另一个实施例中，可以按约0.025％至0.05％脂肪w/v将奶基质标准化。在另一个实施例中，可以按约1％至5％脂肪w/v将奶基质标准化。在优选实施例中，可以按约2％至4％脂肪w/v将奶基质标准化。在另一个实施例中，可以按约3％脂肪w/v将奶基质标准化。

可以将奶基质的脂肪含量和蛋白含量二者标准化。在优选实施例中，可以按3％-7％蛋白和0-1％脂肪v/w将奶基质标准化。在最优选实施例中，可以按3.0％至5.0％蛋白w/v和0至10％脂肪v/w，或约3.0至5.0％蛋白w/v和约0至10％脂肪v/w，最优选按4.0％蛋白w/v和0.1％脂肪w/v，或约4.0％蛋白w/v和约0.1％脂肪w/v，将奶基质标准化。

奶基质可以被浓缩、缩合、热处理、蒸发或过滤。它还可以被干燥自或产生自奶粉或干奶粉，或其他干奶制品。它可以是UHT奶。它可以再水合。

优选地，将奶基质巴氏消毒和/或预巴氏消毒。巴氏消毒法涉及将奶基质加热到至少72℃，持续至少15秒，优选持续25秒或更长时间。在一个实施例中，在至少73℃下进行巴氏消毒法，持续至少15秒。在一个实施例中，在至少75℃下进行巴氏消毒法，持续至少15秒。在另一个实施例中，在至少85℃下进行巴氏消毒法，持续至少15秒。在另一个实施例中，在至少90℃下进行巴氏消毒法，持续至少15秒。在另一个实施例中，在至少95℃下进行巴氏消毒法，持续至少15秒。

可以进行巴氏消毒法，持续至少30秒。在一个实施例中，可以进行巴氏消毒法，持续至少1分钟。在另一个实施例中，可以进行巴氏消毒法，持续至少2-15分钟。在另一个实施例中，可以进行巴氏消毒法，持续至少3-10分钟。在另一个实施例中，可以进行巴氏消毒法，持续至少15分钟或更长。可以在高压釜中进行巴氏消毒法。

在最优选实施例中，在至少95℃下进行巴氏消毒法，持续4-6分钟。

在一个实施例中，进行预巴氏消毒法和巴氏消毒法二者。在标准化之前，对生奶进行预巴氏消毒法。优选地，在72℃-80℃下，最优选72℃-75℃下，最优选72℃下，进行预巴氏消毒法。在一个实施例中，进行预巴氏消毒法，持续15-25秒，最优选持续15秒。

在本发明的一个方面，在标准化后，将奶基质巴氏消毒。优选地，这是在上述温度下进行的，并且持续上述时间。在优选实施例中，在约90℃进行标准化后的巴氏消毒法，持续约10分钟，优选在90℃下，持续10分钟。

还可以在不存在标准化的情况下进行如上所述的巴氏消毒法。

在一个方面，奶基质具有6-8的pH(发酵前)，最优选地，具有pH6-7或约pH 6-7，并且在一些实施例中，具有pH 6.7-6.8或约pH 6.7-6.8。

用对低pH敏感的肽酶处理奶基质。如在此使用，术语“进行处理(treating)”和“经处理(treated)”可以涵盖添加至...、与...一起混合、与...接触、与...一起孵育、与...一起搅拌、与...一起发酵、与...接种、与...掺合和应用至...。因此，用对低pH敏感的肽酶和微生物“处理”奶基质可以是指一种方法，其中将对低pH敏感的肽酶和微生物添加至该奶基质。

肽酶

如在此使用，术语“肽酶”与“蛋白酶(protease)”和“朊酶(protease)”可互换地使用。

如在此使用，术语“肽酶”是指催化肽、蛋白胨或它们的衍生物水解为氨基酸及其寡聚体和聚合物的任何酶。如在此使用的，在肽酶的背景下，术语“肽酶活性”、“蛋白酶活性”、“酶活性”、或简单地“活性”是指水解肽键的能力。

在又一个方面，优选地在此使用的肽酶优选水解P1和P1’位置之间的氨基酸残基(使用Schechter和Berger，1967的P4-P3-P2-P1-↓-P1-P2-P3-P4’命名法，其中“↓”表示水解的键)。最优选地，在此使用的肽酶水解多个肽，其中存在位于P1位置处的甘氨酸残基，如针对NP7L的情况。

肽酶的底物特异性通常根据底物中具体氨基酸之间优选的键裂解来定义。典型地，底物肽中的氨基酸位置相对于易裂解键的位置(即肽酶裂解的位置)来定义：

NH₂-……P3-P2-P1*P1’-P2’-P3’……-COOH

使用上述假想的肽进行说明，易裂解键由星号(*)表示，而氨基酸残基由字母‘P’表示，其中N末端至易裂解键的残基从P1开始，并且当远离易裂解键朝向N末端移动时编号增加。C末端至易裂解键的氨基酸残基从P1'开始，并且随着朝向C末端移动，残基编号增加。

基于其底物特异性，肽酶通常也可以细分为两个大组。第一组是内切蛋白酶的肽酶，它是能够裂解朝向底物的中部定位的氨基酸的肽键(即非末端肽键，不是朝向肽或蛋白底物的C端或N端定位)的蛋白水解肽酶。内切蛋白酶的实例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。相比之下，第二组肽酶是外肽酶，它裂解朝向底物的C端或N端定位的氨基酸之间的肽键(即蛋白的末端的或次末端的肽键，其中该过程释放单个氨基酸或二肽)。

配制和包装

可以将本发明中使用的对低pH敏感的肽酶，和/或本发明的起子培养物配制为任何适合的形式。

配制可以包括造粒、胶囊、囊片、压片、共混、包衣、分层、形成咀嚼片或可溶解片，配制成剂量控制包，配制成棒形包装(stick pack)，以及粉化。

配制还可以包括添加其他成分至本发明中使用的对低pH敏感的肽酶，和/或本发明的起子培养物。例如，适合的成分包括食品成分、糖、碳水化合物、和奶制品。

在一个实施例中，配制不包括添加任何另外的微生物。在优选实施例中，配制不包括添加任何另外的微生物，例如乳酸菌的另外的菌株。

可以对本发明中使用的对低pH敏感的肽酶，和/或本发明的起子培养物进行包装。

在一个实施例中，包装发生在冷冻和/或干燥和/或混合本发明中使用的对低pH敏感的肽酶，和/或本发明的起子培养物之后。

适合地，包装可以包括真空包装、囊剂、盒、泡罩包装、棒形包装、或罐头。

如在本发明中使用，对低pH敏感的肽酶可以与载体混合，优选与不可溶性载体混合。在最优选实施例中，对低pH敏感的肽酶可以与载体混合，从而获得浆料。可以将该浆料干燥，从而获得干燥酶粉。这可以用作起子培养物或用于起子培养物。

在优选实施例中，这一干燥浆料粉包含有颗粒，这些颗粒具有大于10-30pm，最优选大于30pm的体积平均直径，并且基于干燥酶粉的重量，在干燥酶粉中的不可溶性载体的含量是至少10％(w/w)和至多90％(w/w)。不可溶性载体优选地选自下组，该组由以下各项组成：聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、微晶纤维素、和小麦淀粉、麦芽糊精，优选微晶纤维素，并且它可以包含崩解剂。已经在WO/2014/177644 A1，实例1-13中描述了这些。

可以使用试剂盒进行本发明的方法。优选地，这样一个试剂盒包括对低pH敏感的肽酶和微生物，该微生物可以处于起子培养物的形式，和/或如上所述进行配制和/或包装。

金属蛋白酶

如在此使用，术语“金属蛋白酶”是指具有蛋白酶活性的酶，其中该酶的催化机制涉及金属，典型地在活性位点中具有金属离子。在优选实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶可以是金属蛋白酶。

金属蛋白酶的金属离子或离子可以是任何金属离子。最优选地，如在此使用的金属蛋白酶包含一种或多种金属离子，这些金属是锌、钙，或锌和钙的组合。

用螯合剂处理去除了金属离子，并且灭活了金属蛋白酶。例如，EDTA是从金属蛋白酶去除必要的锌并且因此灭活该酶的金属螯合剂。

优选地，如在此使用的金属蛋白酶在活性位点处具有二价离子，或两种二价离子，或多于两种二价离子。

优选地，如在此使用的金属蛋白酶在活性位点中具有锌离子，最优选地具有Zn²⁺。在一些优选金属蛋白酶中，可以存在一个锌离子，在其他金属蛋白酶中，可以存在两个或更多个锌离子。

优选地，金属蛋白酶包含His-Glu-Xaa-Xaa-His基序(其中“Xaa”是任何氨基酸)，该基序形成金属离子结合位点或其一部分。

在优选实施例中，其中金属蛋白酶是谷氨酸锌蛋白(GluZincin)超家族的成员，通过氨基酸基序His-Glu-Xaa-Xaa-His加上另外的谷氨酸结合锌离子。优选地，它包含1个锌离子和2个钙离子。

最优选地，金属蛋白酶选自M4家族，或谷氨酸锌蛋白超家族。

M4酶家族特征在于此家族中的所有酶结合单个催化性锌离子。如在金属蛋白酶的很多其他家族中，存在His-Glu-Xaa-Xaa-His基序。在Biochem.J.[生物化学杂志]290:205-218(1993)中进一步定义了M4家族。

优选地，本发明中使用的金属蛋白酶采用类似于蛋白数据库结构1BQB(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)金属蛋白酶)、1EZM(铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)金属蛋白酶)和1NPC(蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)金属蛋白酶)的3D结构。在优选实施例中，金属蛋白酶具有同种自溶位点。这意味着金属蛋白酶可以引起自身溶解。

如在此使用，术语“金属蛋白酶(metalloprotease)”可以与“金属肽酶”、“金属朊酶(metalloproteinase)”和“中性蛋白酶”可互换地使用。

对低pH敏感

如在此使用，术语“对低pH敏感”是指肽酶的最佳pH值与鲜奶的pH(pH 6.5-6.7)相同或接近，并且与在pH 6.5-6.7相比，在pH 4.6-4.8，肽酶的活性降低至少2倍。

在优选实施例中，与pH 6.5-6.7相比，在4.6-4.8，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶具有至少10倍更低，并且最优选至少15倍更低的活性。

在优选实施例中，在本发明的方法期间，在发酵期间，有机酸(例如乳酸)的产生降低了pH，并且灭活了对低pH敏感的肽酶。

优选地，用4.6-4.8的低pH不可逆地灭活对低pH敏感的肽酶。在优选实施例中，通过发酵造成了减少或灭活本发明中使用的肽酶的低pH。最优选地，这一低pH是通过将糖微生物发酵成有机酸，例如将乳糖发酵成乳酸造成的。最优选地，灭活是永久的，并且因此所得发酵奶产品包含极少量的、没有、或仅痕量的活性肽酶。优选地，通过结束本发明的方法的步骤(b)，或在储存之前或期间，降低蛋白水解活性，最优选低，停止蛋白水解活性。

在优选实施例中，在储存之前或期间蛋白水解活性停止，并且当使用其他肽酶时，看上去并未发生质地、黏度和味道变化。例如，当使用来自Worthington BiochemicalCorporation公司的半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶(worthington-biochem.com/PAP/default.html)(Hoover等人(1947))，和来自罗氏生命科学公司(Roche Life Science)的来自Tritiachium album的丝氨酸蛋白酶Proteinase K(technical-support.roche.com/product.aspx？productId＝2874)(Ebeling等人(1974)和Petrotchenko等人(2012))，以及天冬氨酸蛋白酶Protex 15L(fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-foods-gen/documents/docum ent/ucm269518.pdf)(Nascimento等人(2008)，Clarkson等人(2012))时，看到这些变化。

在对于对低pH敏感的肽酶而言的低pH下，活性的降低优选地是由金属离子的解离造成的。如上所述，对于酶的功能，这些金属离子是必要的。

如在此使用，在肽酶的背景下，术语“减少的活性”意指与在pH6.5-6.7的活性最大值处的肽酶活性的单位相比，蛋白酶活性(也称为“肽酶活性”、“酶活性”、“内肽酶活性”或“外肽酶活性”)减少了2倍或更多个肽酶活性单位。在优选实施例中，“减少的活性”是指小于pH 6.5-6.7的活性最大值的50％的活性。

如在此使用，在肽酶的背景下，术语“灭活”意指与在pH 6.5-6.7的活性最大值处的肽酶活性的单位相比，蛋白酶活性减少了2倍或更多个肽酶活性单位。在优选实施例中，“灭活的”是指小于pH 6.5-6.7的活性最大值的90％的活性。

一个内肽酶活性单位被定义为由如在实例1中描述的在450nm下，1ug(微克)NP7L活性蛋白引起的，每分钟的吸光度增加(Omondi等人(2001))。

在一个优选实施例中，对低pH敏感的肽酶是热稳定肽酶。如在此使用，术语“热稳定”意指在大于30℃，优选30℃-60℃的温度下，酶具有蛋白酶活性。

在本发明的一个实施例中，对低pH敏感的肽酶属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶是嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、NprE分子、蛋白水解素、金葡菌溶素、Gentlyase或分散酶，或与这样一种酶具有高百分比同一性的肽酶。

本发明中使用的对低pH敏感的肽酶不是凝乳酶或凝乳酶样的(即，不具有凝乳酶样活性并且不特异性地裂解Met105-Phe106键)，并且不属于E.C.No.3.4.23.4。优选地，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶不裂解Met105-Phe106键，并且最优选地，不只严格地裂解Met105-Phe106键。

在本发明的一个方法中，使用的肽酶由排除了任何信号序列的成熟蛋白组成，或包含该成熟蛋白。在另一个实施例中，肽酶由包含信号序列的全长蛋白组成，或包含该全长蛋白。

对低pH敏感的肽酶优选地具有非哺乳动物来源，并且最优选地，具有非动物来源。在优选实施例中，对低pH敏感的肽酶是细菌肽酶、真菌肽酶、古细菌肽酶或人工肽酶。在最优选实施例中，对低pH敏感的肽酶是细菌金属蛋白酶、真菌金属蛋白酶、古细菌金属蛋白酶或人工金属蛋白酶。

人工肽酶是其中已经突变、取代、缺失或另外改变了一个或多个氨基酸，所以酶的氨基酸序列不同于野生型的酶，其中野生型是可从活生物体获得的。人工肽酶还可以被称为变体肽酶。

优选地，如在此使用，细菌来源的肽酶获得自或可获得自芽孢杆菌属物种(Bacillus)，最优选地是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。最优选地，对低pH敏感的肽酶是NP7L，或与NP7L具有高百分比同一性，NP7L也称为NprE、Protex 7L、FoodPro PNL、芽孢杆菌溶素或中性蛋白酶。这样一种肽酶示出为SEQ ID NO:1(图21)，并且由SEQ ID NO:8(图29)的核苷酸序列编码。NP7L是金属蛋白酶。

如在此使用，细菌来源的肽酶还可以是NP14L(SEQ ID NO:4，图24)，或与NP14L具有高百分比同一性，NP14L也称为嗜热菌蛋白酶和Protex 14L。NP14L也是金属蛋白酶。

优选地，如在此使用，真菌来源的肽酶获得自或可获得自青霉属(Penicillium)的(参见例如SEQ ID NO:5，图25)，曲霉属(Aspergillus)的(参见例如SEQ ID NO:7，图27)，光杆菌属(Photorhabdus)的或木霉属(Trichoderma)的物种。

优选地，如在此使用，古细菌来源的肽酶来自硫叶菌属(Sulfolobus)，最优选地来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽，或其功能变体。例如，这样一种多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽，或其功能变体。例如，这样一种多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽，或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽，或其功能变体。例如，这样一种多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽，或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽，或其功能变体。例如，这样一种多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽，或其功能变体。例如，这样一种多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽，或具有一个或若干个氨基酸缺失、取代和/或添加的多肽，或其功能变体。例如，这样一种多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸缺失、取代和/或添加。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

在一个实施例中，如在此使用，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽，或其功能变体。

如在此使用，肽酶的“功能变体”意味着不管如何改变，例如取代、缺失、突变、丢失的或另外的结构域和其他修饰，该酶依然具有肽酶活性。

如在此使用，金属蛋白酶的“功能变体”意味着不管如何改变，例如取代、缺失、突变、丢失的或另外的结构域和其他修饰，该酶依然具有金属蛋白酶活性。

在一个实施例中，对低pH敏感的肽酶包含全长酶，该全长酶包含信号肽(也称为信号序列)。信号序列引导多肽穿过特定的原核细胞或真核细胞膜分泌。在一个实施例中，对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、缺少信号序列的多肽。在一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。在另一个实施例中，本发明中使用的对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列、但是缺少信号序列的多肽。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、7、9或14-20具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性、缺少信号肽的氨基酸序列，或其功能变体。在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、7、9、或14-20具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性并且还缺少信号肽的氨基酸序列，或其功能变体。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

在另一个实施例中，对低pH敏感的肽酶由具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽组成。

肽酶，像所有蛋白一样，可以由具有核苷酸序列的核酸编码。本发明中使用的对低pH敏感的肽酶可以获得自或可获得自核酸，例如，如编码SEQ ID NO:1的SEQ ID NO:8或其变体，或编码SEQ ID NO:5的SEQ ID NO:6或其变体所展示的。可以在宿主细胞中表达所述核酸。所述核酸可以获得自或可获得自宿主细胞。

剂量

优选地，对低pH敏感的肽酶的剂量是在0.1μg至1000μg活性酶蛋白/千克奶基质的范围中，更优选地，它在1μg至100μg活性酶蛋白/kg奶制品的范围中，更优选地，它是5-15μg活性酶/kg奶基质，并且甚至更优选地，它是10ug活性酶蛋白/kg奶基质。在最优选实施例中，对低pH敏感的肽酶的剂量是0.1-1μg活性酶蛋白/kg奶基质。

在另一个实施例中，在一个方面，如在实例1中限定，本发明的方法使用0.01-100个肽酶单位/100ml接种的奶基质的剂量。一个肽酶活性单位被定义为在450nm下，由1ug的活性肽酶，优选是NP7L活性肽酶引起的每分钟的吸光度增加(Omondi等人(2001))。

在优选实施例中，在一个方面，本发明的方法使用0.01-30个肽酶单位的剂量。在最优选实施例中，在一个方面，本发明的方法使用00.1-10个肽酶单位的剂量。在最优选实施例中，本发明的方法使用0.1-1个肽酶单位的剂量。最优选地，使用约或精确的0.9个肽酶单位/100ml接种的奶基质。

可替代地，肽酶剂量可以被测量为每千克的奶基质的量。例如，在优选实施例中，本发明的方法使用向1千克的奶基质给予的高达1-10000μg的剂量(即酶浓度是在1-10000ppb，十亿分之率的范围中)。最优选地，肽酶剂量是高达1-100ppb的量。

如果酶的剂量太低，则不会造成希望的效果，而过量(>100mg酶蛋白/千克奶基质)会导致将呈聚合物的乳蛋白转化为寡聚体，并且甚至转化为氨基酸的过度水解。过量将会改变酸奶产品的质地、凝胶化、降低的黏度、硬度。

已经用肽酶处理的奶基质或发酵奶产品还可以被称为“酶化的”。

发酵

如在此使用，如在此使用的术语“发酵”是指使用微生物，例如酵母和细菌，或其任何组合，将碳水化合物(例如糖)转化为醇和CO₂或有机酸。通常在厌氧条件下进行发酵。

已经使用发酵产生了发酵产品。

在本发明的发酵奶产品的情况下，优选地，它们获得自用乳酸菌，或具有GRAS状态并且可以通过将奶的碳水化合物发酵来酸化奶的任何微生物接种的奶基质。例如，嗜热生物培养物，例如YO-Mix 465、532、860或414，或嗜常温生物培养物，例如Choozit 220、Choozit 230或Probat505，这些培养菌株可商购自杜邦公司(DuPont)(E.I.duPont deNemours and Company,Inc.公司，威明顿市，特拉华州，美国)。

在一个实施例中，在35℃-55℃，优选40℃-50℃发酵奶基质。对于嗜热微生物或嗜热生物培养物，这一温度范围是优选的。最优选地，对于嗜热微生物或嗜热生物培养物，发酵温度是41℃。在优选实施例中，发酵温度是42℃。在一个实施例中，发酵温度是43℃。在另一个实施例中，发酵温度是44℃。在一个实施例中，发酵温度是45℃。

在另一个实施例中，在15℃-30℃，优选20℃-25℃发酵奶基质。对于嗜常温微生物或嗜常温生物培养物，这一温度范围是优选的。最优选地，对于嗜常温微生物或嗜常温生物培养物，发酵温度是21℃。在优选实施例中，发酵温度是22℃。在一个实施例中，发酵温度是23℃。在另一个实施例中，发酵温度是24℃。在一个实施例中，发酵温度是25℃。

发酵温度的实例包括30℃、37℃和43℃。发酵温度可以影响所得发酵奶产品的特性(参见实例)。

优选地，在水浴或热交换器中进行发酵。最优选地，在发酵罐或烧杯中进行发酵。具体地，在用于搅拌型酸奶的发酵罐中或在用于凝固型酸奶的烧杯中进行发酵。

在优选实施例中，为本发明方法的步骤(b)的发酵在达到特定pH时结束。优选地，这一pH是比奶基质的起始pH更酸的pH，最优选地，3和6之间，更优选地，4和5之间的pH。

在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.5-4.8。

在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.7。

最优选地，发酵结束时的pH是约4.6。

最优选地，当pH降低引起对低pH敏感的肽酶的活性减小，或完全灭活对低pH敏感的肽酶时，发酵结束。

在一个实施例中，如上所述，在发酵(步骤(b))后，将发酵奶产品冷却，优选地立即冷却(参见标题为“发酵奶产品”的部分)。取决于优选的产品，这可以在搅拌之前或之后进行，或可以不发生搅拌。例如，可以使用水浴来进行这一冷却。如上所述，可以分一个或两个步骤来进行冷却。优选地,发酵奶产品被冷却至20℃-30℃。最优选地，发酵奶产品被冷却至约25℃或冷却至25℃。可替代地，在一个实施例中，在本发明的方法的步骤(b)后，发酵奶产品被冷却至1℃-10℃、最优选4℃-6℃的更低温度。在一个实施例中，通过将发酵奶产品放置在冷室或冰箱中，来缓慢进行这一冷却。可替代地，可以一个接一个地应用这些冷却步骤中的全部两个(如上所述)。

可以通过冷却，或通过可以抑制或杀死发酵培养物的微生物的pH，来停止发酵。

冷却停止了发酵过程。如以上进一步描述，优选地，可以在4℃-6℃下，储存发酵奶产品。

微生物

根据在此所述的方法使用微生物。这是出于发酵目的。

优选地，所述微生物是乳酸菌。

如在此使用，术语“乳酸菌”(LAB)是指产生作为碳水化合物发酵的终产物乳酸的任何细菌。在具体实施例中，LAB选自下组，该组由以下物种组成：链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、假明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacteriu)、肠球菌属(Enterococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、和双岐杆菌属(Bifidobacterium)或其任何组合，及其任何菌株。

适合的微生物菌株的实例包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsplactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp cremoris)、乳酸乳球菌双乙酰亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis)、肠膜状明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subspcremoris)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp)。

将微生物(特别是LAB)的菌落发酵或另外生长，可以称为“培养物”。

在一个方面，LAB是嗜常温生物培养物。优选地，在15℃-30℃，最优选地，20℃-25℃，进行这样一种LAB的发酵。

例如，嗜常温生物培养物可以是Probat 505、Choozit 220或Choozit230。这些培养物可商购自杜邦公司(DuPont)。

在另一个方面，LAB是嗜热生物培养物。优选地，在30℃-55℃，最优选地，37℃-43℃，并且最优选地，在43℃，进行这样一种LAB的发酵。

例如，嗜热生物培养物可以是YO-MIX 414、532和860。这些培养物可商购自杜邦公司(DuPont)。

具体地，在接种物或起子培养物中，乳酸菌(LAB)可以用于共混培养物。

起子培养物

乳酸菌(LAB)可以用于起子培养物。

在具体实施例中，本发明的起子培养物包含LAB和如上所述的对低pH敏感的肽酶。

本发明的起子培养物可以是冷冻的、干燥的(例如喷雾干燥的)、冷冻干燥的、液体的、固体的、呈球粒或冷冻球粒的形式、或呈粉末或干燥粉末。可以如上所述配制和/或包装起子培养物。

起子培养物还可以包含多于一种LAB菌株。

在具体实施例中，所述LAB起子培养物具有在10⁷至10¹¹CFU之间的，并且最优选地，至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰或至少10¹¹CFU/g的起子培养物的LAB的浓度。

本发明还提供了如上定义的起子培养物的用途。

本发明的起子培养物优选用于产生发酵奶产品，具体地，产生本发明的发酵奶产品。通过添加起子培养物至奶基质并且允许处理的奶基质发酵，可以获得以及可获得本发明的发酵奶产品。

糖苷酶

可以另外地用一种或多种糖苷酶处理奶基质。可以在任何点，包括在本发明的方法的步骤(a)之前，或在本发明的方法的步骤(b)之后，进行这一处理。可以在发酵期间添加一种或多种糖苷酶。在一个实施例中，可以在本发明的方法的步骤(a)期间，和/或在本发明的方法的步骤(b)期间，添加一种或多种糖苷酶。在一个实施例中，可以在该方法的步骤(a)和(b)之间，添加糖苷酶。

糖苷酶水解糖苷键。

在本发明的一个方面，糖苷酶是N-连接的或O-连接的糖苷酶。

在优选实施例中，糖苷酶是N-糖酰胺酶F，属于酶委员会(E.C.)3.5.1.52。

在另一个实施例中，糖苷酶是内切糖苷酶H，属于E.C.3.2.1.96。

在另一个实施例中，糖苷酶是N-糖酰胺酶A，属于E.C.3.5.1.52。

在另一个实施例中，糖苷酶是神经氨酸酶(NaNase),属于E.C.3.2.1.18。

优选地，糖苷酶选自SEQ ID NO.10，它是N-糖酰胺酶A((肽-N(4)-(N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶，EC 3.5.1.52)；SEQ ID NO:11，它是N-糖酰胺酶F；SEQ IDNO:12，它是内切糖苷酶H(内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H，EC 3.2.1.96)或SEQ ID NO:13，它是N-乙酰基乙酰半乳糖胺酶；或与其中任一个具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％序列同一性的糖苷酶。

优选地，糖苷酶包含具有SEQ ID NO.10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:13的氨基酸序列的多肽，或与其中任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97、98％、99％序列同一性的糖苷酶。

优选地，糖苷酶包含具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的多肽，或与其中任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97、98％、99％序列同一性的糖苷酶。

优选地，糖苷酶包含具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的多肽，或与其中任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97、98％、99％序列同一性的糖苷酶。

优选地，糖苷酶包含具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的多肽，或与其中任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97、98％、99％序列同一性的糖苷酶。

优选地，糖苷酶包含具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列的多肽，或与其中任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97、98％、99％序列同一性的糖苷酶。

用途

本发明的方法产生发酵奶产品。本发明涵盖这些发酵奶产品的用途。所述发酵奶产品具有如下所述的出人意料的特性。

优选地，本发明的发酵奶产品具有改进的黏度。优选地，所述发酵奶产品具有改进的胶凝强度。优选地，所述发酵奶产品具有改进的质地。在一个实施例中，所述发酵奶产品具有改进的凝乳的硬度。优选地，所述发酵奶产品具有较早的发酵开始和/或较早的凝胶化开始和/或较早的发酵结束。在优选实施例中，所述发酵奶产品具有减少的脱水收缩。在最优选实施例中，所述发酵奶产品具有改进的保质期。

在一个实施例中，本发明的发酵奶产品具有以下特征中的一个或多个：

(a)改进的黏度；

(b)改进的胶凝强度；

(c)改进的质地；

(d)改进的凝乳的硬度；

(e)较早的发酵开始；

(f)较早的凝胶化开始；

(g)较早的发酵结束；

(h)减少的脱水收缩；以及

(i)改进的保质期。

具体地，本发明包括对低pH敏感的肽酶在如上讨论的发酵奶产品的生产中的用途。

具体地，本发明涵盖对低pH敏感的肽酶在发酵奶产品的生产中用于以下各项的用途：

(a)改进黏度；

(b)改进胶凝强度；

(c)改进质地；

(d)改进凝乳的硬度；

(e)提供较早的发酵开始；

(f)提供较早的凝胶化开始；

(g)提供较早的发酵结束；

(h)减少脱水收缩；

(i)改进保质期；或

(j)(a)至(i)的任何组合。

具体地，通过本发明的方法产生的发酵奶产品与已经通过其他方法产生的相同类型的发酵奶产品是相当的。例如，当与不同酸奶，优选地该酸奶是在相同条件下，使用相同LAB培养物但是不使用对低pH敏感的肽酶制造的，本发明的酸奶可以示出以上列出的特征(a)至(i)中的任一个或多个。将在实例中对其进行说明。

具体地，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有所有特征(a)-(i)，还没有增加的酸化或味道的改变或口感的改变。具体地，它们没有苦味的增加。

在优选实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有如上所述的所有特征(a)-(i)，而无论培养物的大小(体积和/或质量)如何。将在实例中对其进行证明。

以上特征(a)-(i)，并且具体地是(a)-(d)，允许发酵奶产品在不影响质地或口感的更高的pH下、但是在更低酸度下产生。这减小了产品的酸度,并且特别是酸的或涩的味道。

(a)改进的黏度

在一个实施例中，通过本发明的方法产生的发酵奶产品具有改进的黏度。

改进的黏度优选地意指增加的黏度，也称为高黏度。最优选地，与未用对低pH敏感的肽酶处理的和/或未用本发明的方法产生的发酵奶产品相比，本发明的发酵奶产品具有高黏度。

可以通过增加的剪切应力来证实增加的黏度。例如，这可以被测量为每单位面积的剪切力，使用计算方法进行；其中

＝剪切应力；

F＝施加的力；

A＝具有平行于施加的力向量的区域的材料的横断面积。

使用配置有一次性铝杯(C-CC27/D/AL)、量杯架(H-CC27/D)和叶片搅拌器(ST22/4V/40)的系统的安东帕(Anton Paar)，Physica MCR302流变仪分析如在此示例的酸奶的剪切应力。生产后，立即将酸奶样品保藏在铝杯中，并且在测量前静置至少24小时。以受控的应变模式测量流动曲线，其结果表示为，应力相对于应变的函数。在测量期间，应变从0.1s^-1对数增加至350s^-1，并且随后分50个步骤，经8分钟20秒的一个时段从350s^-1降低至0.1s^-1。在10℃测量样品，并且在进行测量前，静置3min，以便在流变仪中平衡。

在优选实施例中，剪切应力的增加是至少5％-30％。在一个实施例中，剪切应力的增加是至少10％-20％。在优选实施例中，剪切应力的增加是大于30％。

最优选地，在高达28天的储存后，证实了黏度的增加。在优选实施例中，在高达14天，或最优选地5-7天的储存后，证实了增加的黏度。最优选地，在6天的储存后，证实了增加的黏度。

在优选实施例中，增加的剪切应力可测量为200-400[1/s]的剪切速率增加，最优选地，处于350[1/s]的增加或在该增加左右。

(b)改进的胶凝强度

改进的凝胶强度优选地意指增加的凝胶强度，也称为高凝胶强度。

最优选地，与未用对低pH敏感的肽酶处理的和/或未用本发明的方法产生的发酵奶产品相比，本发明的发酵奶产品具有高凝胶强度。

在优选实施例中，凝胶强度的增加是至少5％-150％。在一个实施例中，凝胶强度的增加是至少10％-50％。在一个实施例中，凝胶强度的增加是至少100％，或最优选地，150％或更大。

最优选地，在高达28天的储存后，证实了凝胶强度的增加。在优选实施例中，在高达14天，或最优选地5-7天的储存后，证实了增加的凝胶强度。

可以使用储能模量大小或质地谱分析来表示凝胶强度。储能模量是其中已经强加形变(例如正弦振荡剪切)的材料中储存的能量的度量。换言之，储能模量可以被描述为归因于弹性形变的材料的总刚度的比例。典型地按帕斯卡(Pa)测量储能模量。

(c)改进的质地

作为发酵奶产品的其他特征的结果，发生改进的质地。它使得产品令人更愉快地消费(具有改进的口感)。可以使用质地谱分析仪来证实改进的质地。

质地是发酵奶产品的物理特征的组合，物理特征可以例如包括黏度、凝胶强度、凝乳的硬度、发酵时间、凝胶化和脱水收缩的量，这些特征有助于提升发酵奶产品的口感。

(d)改进的凝乳的硬度

改进的凝乳的硬度优选地意指凝乳的增加的硬度。

最优选地，与未用对低pH敏感的肽酶处理的和/或未用本发明的方法产生的发酵奶产品相比，本发明的发酵奶产品具有增加的凝乳硬度。

凝乳硬度具体地是凝固型产品，例如凝固型酸奶的特征。

可以通过穿透发酵奶产品所需要的力来测量凝乳硬度。例如，可以使用质地谱分析仪来测量这一力。

在优选实施例中，凝乳硬度的增加是至少1％-60％。在一个实施例中，凝乳硬度的增加是至少2％-50％。在优选实施例中，凝乳硬度的增加是至少5％-20％。在另一个实施例中，凝乳硬度的增加是至少10％-15％。在一个实施例中，凝乳硬度的增加最优选地是60％或更大。

最优选地，在高达28天的储存后，证实了凝乳硬度的增加。在优选实施例中，在高达14天，或最优选地5-7天的储存后，证实了增加的凝乳硬度。

(e)较早的发酵开始

与未用对低pH敏感的肽酶处理的和/或未用本发明的方法产生的奶基质相比，对于本发明的奶基质(它将变为发酵奶产品)，发酵可以更快地开始。

在优选实施例中，在已经将微生物和对低pH敏感的肽酶添加至培养物，并且应用适当的温度后，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，发酵的开始要早至少20-180分钟。在一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，发酵的开始要早至少30分钟。在另一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，发酵的开始要早至少40分钟。在另一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，发酵的开始要早至少60分钟。T

在本发明的方法中使用对低pH敏感的肽酶，因为它在多个位置裂解肽。已知凝乳酶仅在Met105和Phe106之间，在κ-酪蛋白(乳蛋白)上造成一个单个特异性切割。凝乳酶消化的产物是两个大肽：对位κ-酪蛋白1-105和糖基化的酪蛋白巨肽106-169。与本发明的方法相比，这些分子因为太大而不能被吸收并且被LAB同化，因此发酵会被延迟并且进展缓慢。

由本发明的对低pH敏感的肽酶产生的肽还可以为LAB提供有利的渗透平衡的环境，这促进发酵。其他方法会导致接种后的渗透压休克，这延迟了发酵的开始。

(f)较早的凝胶化开始

与未用对低pH敏感的肽酶处理的和/或未用本发明的方法产生的发酵奶产品相比，对于本发明的发酵奶产品，发酵期间的凝胶化可以更快地开始。在优选实施例中，与对照相比，发酵期间的凝胶化的开始要早20-180分钟。

在一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，凝胶化的开始要早至少30分钟。在另一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，凝胶化的开始要早至少40分钟。在另一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，凝胶化的开始要早至少60分钟。

在优选实施例中，较早的凝胶化开始导致在更短的发酵时间(例如与没有对低pH敏感的肽酶的对照相比，短20-180分钟)后，酸奶凝胶，特别是凝固型酸奶凝胶的更高刚性。这减少了酸奶的发酵时间，并且因此提高了生产率。

(g)较早的发酵结束

如上所述，当达到特定pH时，发酵结束。所述pH不再支持发酵，例如，它会抑制或杀死培养物的微生物。可替代地，当达到特定pH，或出于使得希望停止发酵的任何另一个理由而停止时，可以主动停止发酵。如上所述，通常通过冷却来实现这一点。

在优选实施例中，本发明的发酵奶产品达到一个pH，在该pH处，与不是使用本发明的方法制造的，优选地，不是使用对低pH敏感的肽酶制造的发酵奶产品相比，发酵终止得更快。在一个实施例中，发酵的结束要早20-180分钟。

在一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，发酵的结束要早至少30分钟。在另一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，发酵的结束要早至少40分钟。在另一个实施例中，与缺少对低pH敏感的肽酶的对照培养物相比，发酵的结束要早至少60分钟。

在优选实施例中，发酵(它是本发明的方法的步骤(b))是在达到特定pH时结束的。该pH优选在3和6之间，最优选在4和5之间。

在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.5-4.8。

在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.7。在一个实施例中，发酵结束时的pH是4.7。

最优选地，发酵结束时的pH是约4.6。

最优选地，当pH降低引起对低pH敏感的肽酶的活性减小，或完全灭活对低pH敏感的肽酶时，发酵结束。

(h)脱水收缩(从凝胶去除液体，这可以形成凝乳)

当液体从凝胶分离时，发生脱水收缩。在奶制品中，这可以形成凝乳。脱水收缩还可以引起令人不悦的口感、令人不悦的质地和反感。

在优选实施例中，经5-28天，与不是通过本发明的方法产生的、和/或不是使用对低pH敏感的肽酶产生的、或未用对低pH敏感的肽酶处理产生的发酵奶产品相比，通过本发明的方法产生的发酵奶产品、最优选酸奶的脱水收缩减少。在最优选实施例中，经5-28天，最优选地经5-21天，发酵奶产品的脱水收缩减少。在优选实施例中，经5-10天，最优选地经5-7天，发酵奶产品的脱水收缩减少。

如在此使用，术语“减少的脱水收缩”意指与不使用对低pH敏感的肽酶制造的另外相同的发酵奶产品相比，从本发明的发酵奶产品的凝胶分离的液体的体积减少。

(i)改进的保质期

如在此使用，“改进的保质期(shelf life或shelf-life)”意指更长的保质期。这意指发酵奶产品可以储存更长时间，而没有质地、口感或味道的改变，或产品的脱水收缩的增加。具体地，“改进的保质期”意指发酵奶产品可以储存更长时间，而没有发酵奶产品的苦味或苦味道的增加。这是由于对低pH敏感的肽酶变得更没有活性或被灭活，这停止了乳蛋白的水解。优选地在低温，优选小于10℃，最优选0-10℃，并且更优选4℃-6℃进行储存。可替代地，储存需要在0℃或更低温度下冷冻。在一个实施例中，为了产生冷冻产品，在0至-30℃或更低温度下进行储存。在优选实施例中，为了产生冷冻产品，在-18℃或更低温度下进行储存。

在优选实施例中，与不是通过本发明的方法产生的、和/或不是使用对低pH敏感的肽酶产生的、或未用对低pH敏感的肽酶处理产生的发酵奶产品相比，通过本发明的方法产生的发酵奶产品、最优选酸奶的保质期增加了5至28天。

在一个实施例中，保质期增加了高达21天或高达14天。在优选实施例中，保质期增加了5-10天，最优选地5-7天。

最大保质期或保质期的全范围是在消费或腐败之前，发酵奶产品在本发明的方法的步骤(b)后可以储存的总时间。

氨基酸序列

本发明的范围还涵盖具有如本文所定义的特定特性的酶的用途。所述酶具有酶的特定氨基酸序列。如本文所使用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，如在此使用，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，如在此使用，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或者其可以通过合成制得或者其可以通过利用重组DNA技术制备。

在本发明中使用的蛋白质可以与其他蛋白质(特别是酶)一起使用。因此，本发明还覆盖蛋白质的组合的用途，其中该组合包含本发明的酶和另一种酶(其可以是用于根据本发明所述的用途的另一种酶)。这个方面在后面部分讨论。

优选地，当与本发明的范围本身有关或当由本发明的范围本身所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，如在此使用，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且当其已经由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。

序列同一性或序列同源性

本发明还涵盖与具有本文所定义的特定特性的多肽的一个或多个氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这样的多肽的任何核苷酸序列(下文称为“一个或多个同源序列”)的用途。如在此使用，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。如在此使用，术语“同源性”可等同于“同一性”。

该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。

在本发明上下文中，同源序列意在包括与主题序列可以具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的氨基酸或核苷酸序列。典型地，同源物将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。

在一个实施例中，同源序列意在包括与主题序列相比具有一个或若干个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。

在一个实施例中，本发明涉及其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质的用途：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。

适合地，关于氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上、优选在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上确定。

在一个实施例中，本发明涉及一种核酸序列(或基因)的用途，该核酸序列(或基因)编码其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或编码通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。

在本发明上下文中，同源序列意在包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。

同源性比较可以通过眼睛，或更通常地借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同源性。

可以在连续序列上计算％同源性，即将一个序列与其他序列进行比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，此类无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其没有考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分值。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对-反映两个比较序列之间更高的相关性-将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。通常使用“仿射空位成本(affinegap cost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位罚分将会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进行序列比较时使用默认值。

因此，最大％同源性或％同一性的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这样的比对的适合的计算机程序是Vector NTI(英杰公司(Invitrogen))。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于：例如，BLAST程序包(Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology[简明分子生物学试验方案]，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物通讯]1999，174(2):247-50；FEMSMicrobiol Lett[FEMS微生物通讯]1999，177(1):187-8；以及FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]403-410)以及AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等人，1999，第7-58页至7-60页)，例如像在基因组查询(GenomeQuest)检索工具(genomequest.com)中。

尽管最终的％同源性可以按照同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于全或无配对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵(scaled similarity score matrix)，该矩阵基于化学相似性或进化距离对每一成对比较赋予分值。通常使用的这样的矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用，优选的是使用Vector NTI程序包的默认值。

可替代地，基于类似于CLUSTAL的一种算法，可以使用Vector NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多重比对特征计算同源性百分比(Higgins DG和Sharp PM(1988)，Gene[基因]73(1),237-244)。

一旦软件已经产生最佳比对就可以计算％同源性，优选％序列同一性。典型地，作为序列比较的一部分软件进行此计算，并且生成数值结果。

当确定序列同一性时应该使用空位罚分，然后优选地使用如下参数用于成对比对：

在一个实施例中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。

适合地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上、优选在至少30个连续核苷酸上、优选在至少40个连续核苷酸上、优选在至少50个连续核苷酸上、优选在至少60个连续核苷酸上、优选在至少100个连续核苷酸上确定。

适合地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上、优选在至少200个连续核苷酸上、优选在至少300个连续核苷酸上、优选在至少400个连续核苷酸上、优选在至少500个连续核苷酸上、优选在至少600个连续核苷酸上、优选在至少700个连续核苷酸上、优选在至少800个连续核苷酸上确定。

适合地，关于核苷酸序列的同一性程度可以在整个序列上确定。

适合地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上确定。

适合地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可以在本文教导的整个序列上确定。

在本发明的上下文中，术语“查询序列”意指与主题序列比对以便看看其是否属于本发明的范围内的同源序列或外源序列。因此，这样的查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。

在一个优选的实施例中，序列通过全局比对程序进行比对，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。

在一个实施例中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何适合的比对程序，使用默认打分矩阵和默认空位罚分，将这两个序列进行对比，2)鉴定精确匹配数，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上鉴定出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)用精确匹配数除以主题序列的长度。

在又进一步的优选实施例中，全局比对程序选自下组，该组由以下各项组成：CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。

序列还可以具有产生沉默改变和导致功能上等价的物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要保留物质的二级结合活性，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的含不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

例如根据下表，可以进行保守取代。第二列相同框中的氨基酸，优选第三列相同行的氨基酸可以彼此取代。

本发明还涵盖可能出现的同源取代(取代和替换两者在本文中用于意指现有氨基酸残基与替代性残基的互换)，即对等取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可能发生非同源取代，即从一类残基至另一类氨基酸或可替代地包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡喃丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。

替换也可以通过合成氨基酸(如非天然氨基酸)进行，包括；α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯基丙氨酸*、p-Br-苯基丙氨酸*、p-I-苯基丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε^#-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜^#*、L-正亮氨酸*、L-戊氨酸*、缬氨酸，对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸和L-Phe(苄基)*。出于上面论述的目的(与同源性或非同源性取代相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。

变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(例如甘氨酸或β-丙氨酸残基)之外的烷基基团，例如甲基、乙基或丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基团在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS[美国国家科学院院刊](1992)89(20),9367-9371以及Horwell DC，Trends Biotechnol.[生物技术趋势](1995)13(4),132-134。

用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行此类修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。

本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列。

不与用于本发明中的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且此类同源物及其片段通常将能够选择性杂交至本文序列表中所示的序列。此类序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格条件下用包含于随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针来探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。

变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，GCG威斯康星PileUp程序是广泛使用的。

简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格条件低的严格条件下使用。

可替代地，此类多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其他序列改变可能是希望的以便引入限制性酶识别位点，或以便改变多核苷酸编码的多肽的特性或功能。

用于本发明中的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、替代性的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealing label)的探针)，或者可将多核苷酸克隆进载体中。此类引物、探针和其他片段的长度将为至少15个，优选至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明多核苷酸所涵盖。

用于根据本发明所述的用途的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。

一般地，引物可以通过合成方法制备，包括一次一个核苷酸地逐步制备希望的核酸序列。利用自动化技术完成该工艺的技术是本领域轻易获得的。

较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有适合的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进适合的克隆载体中。

杂交

本发明还涵盖与用于本发明中的核酸序列互补的序列或能够杂交至用于本发明中的序列或杂交至与用于本发明中的序列互补的序列的序列的用途。

如本文所使用的，术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。

实例

酸奶的最重要品质属性之一是其质地。这些实例证实了金属蛋白酶NP7L(SEQ IDNO:1)和NP14L(SEQ ID NO:4)对质地的影响，但是不旨在受限于这些低pH敏感金属蛋白酶或受限于测试的特定发酵奶产品。使用标准化的并且巴氏消毒的脱脂乳(4％蛋白，0.1％脂肪)和不同的嗜热和嗜常温的培养物。在4℃下储存5、14和28天后，分析样品。示出通过添加NP7L，在搅拌型酸奶和凝固型酸奶中的凝乳的黏度和刚性增加。应用嗜常温培养物示出约60％的剪切应力的增加，对于嗜热培养物，增加是在10％-20％之间。然而在30℃和37℃的较低发酵温度下，在应用嗜热培养物后，检测到约30％的更高黏度和凝乳刚性。此外，在添加NP7L后，储能模量可以增加约100％。经保质期(28天)，示出正效应，并且对于两种酸奶类型，都没有观察到增加的脱水收缩形成。此外，证实采用NP7L，产生更温和(较不酸)的搅拌型酸奶的可能性。对于在pH 4.6停止的非酶化酸奶，和在pH 4.8停止的酶化酸奶获得了相当的黏度。此外，这些实例证实，与非酶化酸奶乳相比，在酶化酸奶乳中，凝胶形成的开始较早。

实例1a：采用偶氮酪蛋白测定和使用N-CBZ-甘氨酸对硝基苯基酯的NP7L的测定进行的内肽酶活性测定

如Iversen和(1995)所述(具有小的修改)进行偶氮酪蛋白测定。将缀合至偶氮染料的酪蛋白用作蛋白水解酶的底物。优选地，偶氮酪蛋白是来自麦格酶公司(Megazyme)的Protazyme片剂，并且使用麦格酶公司(Megazyme)的程序(megazyme.com)。酪蛋白的降解释放了然后可以被分析的染料。将250μl的溶解在具有6.7的pH的20mM MES缓冲液中的0.25％(w/v)偶氮酪蛋白添加至1.5ml反应管中。随后，将50μl的适当预稀释的内肽酶添加至预孵育的偶氮酪蛋白(其中所述预孵育是在40℃下进行)，并且在40℃下孵育5至60min(在恒温混匀仪中摇动，800rpm)。通过添加2M TCA(50μl)终止反应，并且将反应管在15,000rpm下离心5min。随后，将195μl的所得上清液转移至微量滴定板中并且与1M NaOH(1M NaOH)结合。在MTP酶标仪中，在450nm下，测量吸光度。

一个内肽酶活性单位被定义为在450nm下，由1μg NP7L活性蛋白引起的每min的吸光度增加。使用这一测定来确定本发明中使用的肽酶的活性。也可以使用替代测定，例如中性蛋白酶测定(如在以下文献中详细描述：Worthington Enzyme Manual[沃星顿酶手册]-Worthington,K.，等人(1993)和(2011).如在2014年12月5日(worthington-biochem.com/pap/default.html))。

为了在不存在酯酶和脂肪酶活性的情况下，更具体地确定NP7L的活性，在96MTP中包含5mM CaCl₂和0.1％(w/v)吐温80的0.25M Mops-NaOH(pH 7.0)中，反应混合物包含0.4mM N-CBZ-甘氨酸对硝基苯基酯(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号C-7626)和NP7L(20.3mg活性蛋白/ml)，NP7L范围为在0.1ml的反应体积中20至200纳克(ng)活性蛋白。在30℃预孵育5min后，通过添加底物开始反应，n＝5。每一分钟在410nm下跟踪反应，持续25min。初速度表示为mOD/min(图35)。从图35可以看出，这一方法可以测定具有范围为20至200ng/0.1ml(0.2-2微克/ml)的NP7L活性蛋白的样品。将这一方法用于本发明，以确定在包含NP7L的P1处，具有甘氨酸残基的高偏好的酶。对于NP7L，从图35可看出，100ng活性蛋白导致了30.27mOD/min的反应速率。

实例1b：在酸奶的pH(pH 4.6)和鲜奶的pH(pH 6.7)下，内肽酶活性测定包括采用显色底物Z-Val-Gly-Arg-pNA进行的NP7L测定。

反应混合物包含85ul 0.1M乙酸盐(pH 4.6)或50mM甘氨酸-50mM乙酸盐-50mMTris(4.6)、或0.1M Mes-NaOH(pH 4.6)、或0.1M Mes-NaOH(pH 6.7)、1ul 500mM CaCl2、5ul10mM显色底物Z-Val-Gly-Arg-pNA(BVGApNA)乙酸盐(目录号L-1555，Bachem.com)。通过添加在12mM CaCl2中稀释的10μl 25倍稀释的NP7L产品(20.3mg活性酶蛋白/g产品)，开始反应。在30℃下，每一分钟跟踪OD410nm。对于对照，用10ul 12mM CaCl2替换10μl酶(Levine等人，(2008))。

在图36中，这一实验的结果示出，在测定条件下，使用具有pH 4.6(与酸奶相同的pH)的乙酸盐缓冲液或甘氨酸-乙酸盐-tris缓冲液或0.1M Mes-NaOH，NP7L具有低活性，而在pH 6.7(鲜奶的pH)下的Mes缓冲液中，作为肽BVGApNA的水解的结果，它具有相当高的活性，在410nm下呈线性增加。图36示出，在Mes-NaOH缓冲液中，在pH 4.6和6.7下，NP7L对BVGApNA的活性。在反应的线性部分中，pH 6.7至pH 4.6的斜率比为16(图36)。作为一种理想的酸奶酶，它应该在鲜奶的pH(pH 6.7)下最具活性，并且当pH达到4.6的酸奶的pH时活性最低。

实例1c：内肽酶活性测定，包括采用荧光底物Abz-AAFFAA-Anb的NP7L测定

反应混合物在96MTP中包含2.5ul 10mM Abz-AAFFAA-Anb荧光底物(谢弗-N公司(Schafer-N)，哥本哈根，丹麦)，包含5mM CaCl₂和0.1％(w/v)吐温80的50ul 0.25M Mops-NaOH(pH 7.0)或50ul酸奶0.22um滤液。在40℃预孵育5min后，通过添加底物开始反应，n＝2。使用来自美国分子仪器公司(Molecular Devices Inc.)(美国)的SpectraMax M5酶标仪，通过每一分钟在320nm激发持续60min，反应被跟踪为在420nm的发射下的RFU(相对荧光单位)(Filippova等人，(1996))。在图37中的每个数据点是来自2个酸奶样品的4个读取点的平均值。最大标准偏差值为900RFU。初速度表示为RFU/min(图37)。

在图37中使用的酸奶样品：低脂肪散装乳被标准化为4％蛋白，在90℃下巴氏消毒持续10min，并且在5℃储存过夜。在玻璃烧杯中，将该乳用Yo-Mix 860(2ml接种乳/L)接种，并且给予Protex 7L，使得每千克奶基质的最终NP7L浓度为8.9、16.9、33.8、50.7、67.6和101.4ug(微克)。在43℃下进行发酵，并且当pH达到4.60时停止发酵。此后，用手动混合器将烧杯搅拌15秒，并且在5℃储存过夜。在冷藏库(5℃)中20小时后，在第二天进行黏度测量。与无酶对照相比，每100g酸奶26.4ul的剂量给出10％的黏度的最高增加。

从图37可以看出，荧光测定方法具有2ppb的检出限(52.5ul中0.12ng)。此外，可以看出，通过比较相同量的活性NP7L酶蛋白的反应初速度，与在pH 7.0下的缓冲系统(具有5mM CaCl2和0.1％吐温80的0.25M Mops-NaOH)中相比，在完成的发酵酸奶产品中，在pH4.6下，NP7L具有低至少15倍的活性。从图37可以进一步看出，对于在40℃下，60min的反应时间，与具有很小可测定活性的无酶对照相比，0.54ng的NP7L的剂量(0.54ng/50ul酸奶的活性酶蛋白)给出了10％的黏度的增加。

实例2：应用NP7L的搅拌型酸奶的质地化

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)，并且储存在4℃-6℃。在蛋白(4.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。随后，将该乳冷却至43℃，并且在100ml玻璃烧杯中等分，并且分别用YO-Mix 465、532、860抑或414(每一者20DCU；杜邦公司培养物单位(DuPont Culture Units))接种。已知这些可商购培养物具有不同质地。同时，每100ml接种的乳添加0.9单位NP7L(参见实例1)。在43℃，在水浴中进行发酵。

一旦达到pH 4.6，用手动混合器(IdeenWelt，罗斯曼，德国)搅拌发酵奶精确地持续15s。随后，在水浴中将酸奶冷却至25℃，并且随后在冷室中冷却至4℃-6℃。将搅拌型酸奶储存28天，而在储存5-7、14和28天后，测量流动曲线。

应用来自安东帕公司(Anton Paar)的MCR302流变仪(叶片ST22-4V-40-SN30845)分析流动曲线，其中采用和 的剪切速率。在图1-4中示出表观黏度的结果。

对于所有应用的起子培养物，经保质期，获得酶化酸奶的更高的黏度。应用培养物YO-Mix 465，在储存14天后，在350[1/s]的剪切速率下，检测到20％剪切应力的增加(图1)。在6和28天后，分别确定了12％和10％更高的剪切应力。应用培养物YO-Mix 532、860和414，可测量到相似结果。剪切应力的增加各自是在10％和20％之间(图2-4)。在NP7L存在下，未检测到味道缺陷或酸化速率的改变。

实例3：应用NP7L的搅拌型酸奶的质地化-按比例放大至5L

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)，并且储存在4℃-6℃。在蛋白(4.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。随后，将该乳冷却至43℃，在5l大桶中等分，并且用YO-Mix 465(20DCU；杜邦公司培养物单位)接种。同时，每5l接种的乳添加45个单位的NP7L(参见实例1)。在43℃，在水浴中进行发酵。

将实验工厂设备用于搅拌和冷却，代替手动混合器和水浴。一旦达到pH 4.6，在43℃搅拌发酵奶，并且使用具有稳定阀(smoothening valve)的特制板式热交换器(ServiceTeknik，兰讷斯，丹麦)，采用2巴背压，将奶冷却至25℃。随后，在烧杯(100ml)中将酸奶等分，并且随后在冷室中冷却至4℃-6℃。将搅拌型酸奶储存28天，而在5-7、14和28天后，测量流动曲线。

应用来自安东帕公司(Anton Paar)的MCR302流变仪(叶片ST22-4V-40-SN30845)分析流动曲线，其中采用和 的剪切速率。在图5中示出储存28天后表观黏度的结果。

在从100ml按比例放大至5l后，在储存6、14和28天后，在350[1/s]的剪切速率下，剪切应力分别增加了11％、12％和29％。

实例4：应用NP7L的凝固型酸奶

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)，并且储存在4℃-6℃。在蛋白(4.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。随后，将该乳冷却至43℃，并且在100ml玻璃烧杯中等分，并且分别用YO-Mix 413、465、495、511抑或860(每一者20DCU；杜邦公司培养物单位)接种。同时，每100ml接种的乳添加0.9单位NP7L(参见实例1)。在43℃，在水浴中进行发酵。

一旦达到pH 4.6，在水浴中将酸奶冷却至25℃，并且随后在冷室中冷却至4℃-6℃。将酸奶储存28天，而在5-7、14和28天后，测量质地谱分析。

经由质地谱分析仪(TA-XT2i质地分析仪，Stable Micro System公司，戈德尔明，萨里郡，英国)，采用几何结构SMS-P/0.5R，测量穿透凝固型酸奶所需要的力。将在TPA期间出现的正区的最高峰用作穿透酸奶所需要的力的指标。在图6中示出储存5天后的结果。

对于经保质期(28d)的所有应用的培养物，获得酶化酸奶的酸奶凝乳的更高刚性。在发酵期间存在NP7L并没有导致脱水收缩的形成。

实例5：结合嗜常温培养物，应用NP7L

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)，并且储存在4℃-6℃。在蛋白(4.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。随后，将该乳冷却至25℃，并且在100ml玻璃烧杯中等分，并且分别用Choozit 220、Choozit 230或Probat505(每一者20DCU；杜邦公司培养物单位)接种。这些都是可商购的接种物。同时，每100ml接种的乳添加0.9单位NP7L(参见实例1)。在27℃，在水浴中进行发酵。

一旦达到pH 4.6，用手动混合器(IdeenWelt，罗斯曼，德国)搅拌发酵奶严格地持续15s。随后，将酸奶在冷室中冷却至4℃-6℃。在储存5天后，测量流动曲线。

应用来自安东帕公司(Anton Paar)的MCR302流变仪(叶片产品编号ST22-4V-40-SN30845)分析流动曲线，其中采用和的剪切速率。在图7-9中示出结果。

对于所有嗜常温培养物，获得酶化酸奶的更高的黏度。在储存5天后，对于所有嗜常温培养物，在350[1/s]的剪切速率下，检测到增加约60％的剪切应力。

实例6：在搅拌型酸奶和凝固型酸奶中，在30℃-43℃下，结合嗜热YO-Mix 465培养物，应用NP7L

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)，并且储存在4℃-6℃。在蛋白(4.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。随后，将该乳冷却至43℃、37℃或30℃，在100ml玻璃烧杯中等分，并且分别用YO-Mix 465(20DCU；杜邦公司培养物单位)接种。同时，每100ml接种的乳添加0.9个单位的NP7L(参见实例1)。在30℃、37℃或43℃，在水浴中进行发酵。

一旦达到pH 4.6，用手动混合器(IdeenWelt，罗斯曼，德国)搅拌发酵奶精确地持续15s。随后，在水浴中将酸奶冷却至25℃，并且随后在冷室中冷却至4℃-6℃。以相同方式，立即将凝固型酸奶冷却至25℃。将所有酸奶储存28天，而在5-7、14和28天后，对于搅拌型酸奶和凝固型酸奶，分别测量流动曲线和质地谱分析。

应用来自安东帕公司(Anton Paar)的MCR302流变仪(叶片ST22-4V-40-SN30845)分析流动曲线，其中采用和 的剪切速率。在1Hz的频率下，将应变扫描的振荡设置为0.01％-500％。采用质地谱分析仪(TA-XT2i质地分析仪，table Micro Systems公司，戈德尔明，萨里郡，英国)(TPA)，采用几何结构SMS-P/0.5R，测量穿透凝固型酸奶所需要的力。将在TPA期间出现的正区的最高峰用作穿透酸奶所需要的力的指标。在图10-12中示出非酶化的和酶化的搅拌型酸奶的所得剪切应力，连同凝固型酸奶的凝乳刚性。

分别与在37℃和30℃的发酵温度下增加27％和34％相比，在43℃下发酵，酶化的搅拌型酸奶的剪切应力增加了6％(图10和11)。此外，与在37℃下的参比相比，储能模量(G’)增加了高约150％的储能模量G’，表示酶化的搅拌型酸奶的增加的凝胶硬度(图12)。用谱质地分析获得了相似结果(图13)。检测到应用较低发酵温度，酶化酸奶的更高凝乳刚性。对于两个酸奶类型，搅拌型和凝固型，没有观察到增加的脱水收缩形成。

因此可见，本发明的发酵奶产品具有增加的凝胶强度和黏度。

实例7：在43℃应用NP7L，以产生更温和的搅拌型酸奶(pH 4.8，代替4.6)

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦),并且储存在4℃-6℃。在蛋白(4.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。随后，将该乳冷却至43℃，在100ml玻璃烧杯中等分，并且分别用YO-Mix 860(20DCU；杜邦公司培养物单位)接种。同时，每100ml接种的乳添加0.9个单位的NP7L(参见实例1)。在43℃，在水浴中进行发酵。

一旦达到希望的pH(pH 5.0、4.9、4.8、4.7或4.6)，用手动混合器(IdeenWelt，罗斯曼，德国)搅拌酸奶精确地持续15秒。随后，在水浴中将酸奶冷却至25℃，并且随后在冷室中冷却至4℃-6℃。将酸奶储存28天，而在5-7、14和28天后，测量流动曲线。

应用来自安东帕公司(Anton Paar)的MCR302流变仪(叶片ST22-4V-40-SN30845)分析流动曲线，其中采用和 的剪切速率。在图14中示出表观剪切应力的结果。图14清晰地示出，与其中在pH 4.6停止发酵的未处理的酸奶相比，其中在pH 4.8停止发酵的NP7L处理的酸奶具有相同剪切强度。在较不酸的酸奶中的这一结果具有相同剪切强度，它的产生也更快。应用培养物YO-Mix 860(没有酶化)，在储存5天后，检测到约400Pa的剪切应力。在pH 4.8、而不是pH 4.6停止的酶化酸奶中，获得了相当的剪切应力。对于在pH4.8、而不是pH 4.6停止的非酶化酸奶，在350[1/s]的剪切速率下，观察到低约10％的剪切应力。

这一实例证实，本发明的方法可以令人惊讶地用于产生较不酸的发酵奶产品，但是另外具有与未用对低pH敏感的肽酶处理的发酵奶产品相似的特性。

实例8：应用NP7L的蛋白替换

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)，并且储存在4℃-6℃。在蛋白(5.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。为了实现3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％或4.2％的希望的蛋白含量，在巴氏消毒法后，用无菌H₂O溶解该乳。随后，将该乳冷却至37℃，在100ml玻璃烧杯中等分，并且分别用YO-Mix465(20DCU；杜邦公司培养物单位)接种。同时，每100ml接种的乳添加适当量的NP7L(它已调节为每个具体的蛋白浓度)，(0.9个单位，参见实例1)。在37℃，在水浴中进行发酵。

一旦达到pH 4.6，用手动混合器(IdeenWelt，罗斯曼，德国)搅拌酸奶精确地持续15s。随后，在水浴中将酸奶冷却至25℃，并且随后在冷室中冷却至4℃-6℃。将酸奶储存28天，而在5-7、14和28天后，测量流动曲线。

应用来自安东帕公司(Anton Paar)的MCR302流变仪(叶片ST22-4V-40-SN30845)分析流动曲线，其中采用和 的剪切速率。在图15中示出表观剪切应力的结果。

应用3.8％蛋白标准化的低脂乳(0.1％脂肪)和培养物YO-Mix 465(没有酶化)，在储存5天后，检测到约250Pa的剪切应力。应用3.6％、而不是3.8％蛋白，在酶化酸奶中获得了相当的剪切应力。因此，本发明清晰地减小了所需的蛋白的百分比。为了制造具有相同质地的产品而不使用肽酶，需要增加的蛋白，优选4％蛋白。

实例9：模拟发酵-形成酸奶凝胶

获得预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合脱脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)，并且储存在4℃-6℃。在蛋白(4.0％(w/v))和脂肪(0.1％(w/v))方面，预先将该脱脂乳标准化。标准化乳经受在高压釜中的巴氏消毒法(90℃；10min)。随后，将该乳冷却至43℃，用YO-Mix 465(20DCU；杜邦公司培养物单位)接种，并且在铝杯(流变仪设备,安东帕公司(Anton Paar),奥斯特菲尔登,德国)中等分，每杯40ml。同时，每40ml接种的乳添加0.36个单位的NP7L(参见实例1)。使用来自安东帕公司(Anton Paar)的流变仪MCR302(叶片ST22-4V-40-SN30845)模拟发酵。在43℃，经6h进行模拟，而应用γ＝0.02％并且f＝1Hz的振荡。每分钟检测储能模量G’。在图16中示出结果。

与非酶化酸奶乳相比，在酶化酸奶乳中，酸奶凝胶的形成的开始要早约1.5h。

实例10-与凝乳酶相比

将储存在4℃-6℃的预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合低脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)关于蛋白(4％(w/v))和脂肪(1.5％(w/v))标准化。此后，标准化乳在高压釜中经受巴氏消毒法(90℃；10min)，并且储存在4℃-6℃。将该冷乳分配进100ml玻璃烧杯中，并且用Yo-Mix 860接种，接种率为20DCU/100L。同时，每100ml的乳分别添加0.9个单位的NP7L或100μL Marzyme 10。在43℃进行发酵。Marzyme 10是真菌来源的凝乳酶型酶。这是用于乳酪制造的特定天冬氨酸内肽酶。

一旦达到pH 4.6，用手动混合器(IdeenWelt，罗斯曼，德国)搅拌发酵奶精确地持续15s。在水浴中将所得酸奶冷却至25℃，并且随后保持在6℃进行储存。

用MCR302流变仪(安东帕公司(Anton Paar GmbH)，美国)和叶片ST22-4V-40-SN30845分析流动曲线，其中采用剪切速率 和在图17中示出获得自流变仪的结果。如所示，在图17中，与对照(无酶)相比，两种酶都增加了动态黏度。

实例11-应用NP14L的搅拌型酸奶的质地化

按照实例2，将储存在4℃-6℃的预巴氏消毒(72℃，15s)的散装混合低脂乳(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，布拉布兰，丹麦)关于蛋白(4％(w/v))和脂肪(1.5％(w/v))标准化。此后，标准化乳在高压釜中经受巴氏消毒法(90℃；10min)，并且储存在4℃-6℃。将该冷乳分配进100ml玻璃烧杯中，并且用Yo-Mix 465接种，接种率为20DCU/100L。同时,添加26.4μL(200倍稀释的)Protex 14L。在43℃进行发酵。

一旦达到pH 4.6，用手动混合器(IdeenWelt，罗斯曼，德国)搅拌发酵奶精确地持续15s。在水浴中将所得酸奶冷却至25℃，并且随后保持在6℃储存6天。

用MCR302流变仪(安东帕公司(Anton Paar GmbH)，德国)和叶片ST22-4V-40-SN30845分析流动曲线，其中采用剪切速率 和在图18中示出获得自流变仪的结果。如所示，在图18中，在储存6天后，与对照(无酶)相比，Protex 14L确实增加了黏度。

Protex 14L仅具有与NP7L的48.1％的同一性(参见图45)，仍在酸奶中示出相似特性。

真菌肽酶实例

实例12-分离和测试真菌肽酶

针对使乳蛋白酪蛋白凝固，检查了真菌金属蛋白酶GOI269。在图19中示出结果。琼脂糖平板具有于0.1M McIlvaine缓冲液(pH 6.0)中1％琼脂糖里的1％酪蛋白。将10ulGOI269(蛋白浓度，0.81mg/ml)上样至该孔。在37℃过夜孵育后，拍摄照片。可见，GOI269可以很好地水解酪蛋白并且显影了一个发白的光晕。

实例13-用于使乳凝固的真菌金属蛋白酶

针对使乳凝固，进一步检查了真菌金属蛋白酶GOI269。向96MTP的A1至H2的孔中添加具有指示的pH的5ul缓冲液、0.2M EDTA或水(表1)，以及5μl GOI269，混合并且在水浴中，在40℃孵育90min。在孵育结束时，将190μl来自爱氏晨曦公司(Arla)(www.arla.dk)的包含0.1％脂肪、4.7％糖和3.5％蛋白的低脂乳添加至孔A1-H2中，混合并且在37℃孵育过夜。在该板已经抵靠薄纸倒置，使得具有未凝固的乳的孔被纸吸收后，拍摄照片。对于孔A5-H6，在混合5μl GOI269与5μl的表1中指示的溶液后，添加190μl低脂乳，并且其余程序与孔A1-H2相同。

表1

结果：对于图20中的A5-F6和H5-H6的孔，在GOI269存在下使低脂乳凝固，即，在乳的pH下，GOI269蛋白酶是具活性的。对于具有5mM的最终浓度的EDTA的孔G5-G6，该乳并未凝固。熟知螯合剂，像EDTA，可以很好地抑制具有用于催化和维持3D结构的二价金属离子的金属蛋白酶。

孔A1-H2(在图20中示出)与孔A5-H6的处理相同，除了在40℃将混合物预孵育90min，之后添加乳并且进一步在37℃孵育过夜。可见，仅D1-D2的孔(pH 5.55)、E1-E2的孔(pH 6.01)和孔H1-H2(水)具有凝固的乳。这表明GOI269在pH 4.14至5.01下是不稳定的。高度希望金属蛋白酶的针对酸奶的此类特性。即，金属蛋白酶应该在乳的pH下，对于使乳凝固是具活性的(孔H1-2)，并且它应该在通过产生有机酸(包括来自乳糖的乳酸)的起子培养物的生长和发酵达到pH5或更低时被灭活(孔A1-C2)。

实例14-真菌金属蛋白酶GOI269的表达和产生

如在其他杜邦公司/杰能科公司(Genencor)专利申请，例如WO2009/100183，实例4-8；和US 2012/0225469 A1，实例1-3中所述，在里氏木霉中克隆和表达来自草酸青霉菌的细胞外金属蛋白酶AO090012001025(图25，针对氨基酸序列；和图26，针对基因序列)。将发酵液超滤，以去除细胞，并且将其用于这些测试。在对照中，里氏木霉发酵液不给出此类反应。

在图25中的草酸青霉菌金属肽酶GOI269序列与来自米曲霉的细胞外金属蛋白酶AO090012001025(www.uniprot.org/uniprot/Q2UBF0)具有58.8％同一性(图28)。

实例15-与其他酶类比较

表2列出了在黏度增加方面，无法改进酸奶质地的蛋白酶、糖酶和脂肪酶。这一表给出了在黏度增加方面，无法改进酸奶质地的酶的阴性实例。“0”意指在黏度增加方面没有作用。

从表2可见，不是所有酶都将在酸奶中起作用，即使在酸奶产生过程中存在这些酶的底物。例如，来自黑曲霉的脂肪酶未发现赋予酸奶增加的黏度，并且来自黑曲霉抑或里氏木霉的α-半乳糖苷酶也未发现赋予任何正效应，即使已经假定α-半乳糖苷酶可以水解乳蛋白的碳水化合物部分，并且由此降低其溶解性并且增加奶制品黏度(Jacobsen等人，2012)。此外，表2中列出了蛋白酶，它们代表了3个主要蛋白酶家族，即天冬氨酸蛋白酶家族、半胱氨酸蛋白酶家族和丝氨酸蛋白酶家族，所有这些都不能增加酸奶黏度。

在表2中测试的酶不是对低pH敏感的。例如，来自杜邦公司的里氏木霉的食品级酸性真菌蛋白酶Protex 15L(US 2012/0225469 A1)可能在鲜奶中活性不足，因为其最佳pH是约pH 3.8。对于其他蛋白酶，例如木瓜蛋白酶，失败可能是由于其在pH4.6下的更高活性。例如，与pH6.7相比，在pH 4.6下，食品级蛋白酶木瓜蛋白酶保留大于70％的其活性(Hoover和Kokes，1947)。对于蛋白酶K，其在多个位点水解乳蛋白，导致广泛水解，将乳蛋白聚合物转化为具有降低的黏度的寡聚体的广泛底物特异性，可能是其失败机制(Petrotchenko等人，2012)。

表2

实例16

采用NP7L，酸性稀奶油中的质地增加

按照脂肪(5.0％(w/w)和9.0％(w/w))，将预巴氏消毒的脱脂乳(72℃；15sec)标准化，其中奶油38％脂肪(w/w)，这导致对于包含5％和9％脂肪的酸性稀奶油基，蛋白含量分别为3.7％和3.5％。在另一个试验中，将该乳标准化为4.2％(w/w)蛋白和5％(w/w)脂肪，连同4.2％(w/w)蛋白和9％(w/w)脂肪的蛋白和脂肪。标准化乳在板式热交换器中经受巴氏消毒法(PHE；95℃；6min)。随后，将该乳冷却至4℃，以便储存过夜，并且稍后重新加热至45℃，并且冷却至22℃，以避免脂肪结晶，并且分别用Probat^TM 505(7DCU/100L；杜邦公司培养物单位)和乳酸乳球菌乳脂亚种(3克/100L)接种。同时，每100ml接种的乳添加适当量的NP7L(6.3-8.5U*l^-1)(它已调节为每个具体的蛋白浓度)。在5升大桶中，在水浴中，在22℃进行发酵，持续约16-18小时。一旦达到pH 4.6，终止酸性稀奶油发酵，手动搅拌并且通过与调节至水平5(5％)的Ytron-Z 1.50FC-2.0.1(YTRON Process technology GmbH公司，BadEnsdorf，德国)串联的板式热交换器稳定化，随后填充进杯中，并且在冷室中，在4℃-6℃下储存。将酸性稀奶油样品储存28天，而在14天后，使用锥板法测量流动曲线。

应用NP7L后，通过添加NP7L，表观黏度(图46和47)，连同预测的“口中的稠度”(在10s*^-1的剪切速率下提取的剪切应力；图48)显著增加。总体而言，产生的酸性稀奶油的稠度(33-160s*^-1的剪切速率范围的线性回归的斜率)支配了产品的质地。此外，口中的黏性显著减小，这归因于以下事实：与非酶化的参比相比，酶化酸性稀奶油的斜率具有负斜率或较不陡峭(图49)。也观察到NP7L剂量和最终酸性稀奶油黏度之间的直接相关(数据未示出)。

实例17

添加有和未添加NP7的酸性稀奶油的感官分析

如下制造包含18％(w/w)脂肪的酸性稀奶油基。在45℃，在良好搅拌下，混合脱脂奶(约3166g)和奶油38％脂肪(约2834g)，并且将其经受均质化和巴氏消毒法(在95℃持续6分钟)(P1：65℃；均质化80巴P2：80℃；P3：95℃持续6分钟)。在巴氏消毒法后，将该乳冷却至22℃，并且添加起子培养物混合物(10DCU/100L Probat^TM M7和乳酸乳球菌乳脂亚种(3克/100L))。同时，添加5.1和8.5U/L之间的NP7L。在22℃进行发酵，直至测量到pH 4.60。接下来，使酸性稀奶油穿过与调节至水平5(5％)的Ytron-Z 1.50FC-2.0.1(YTRON Processtechnology GmbH公司，Bad Ensdorf，德国)串联的板式热交换器，随后填充进杯中，并且在冷室中，在4℃-6℃下储存。最终产品具有17.95％(w/w)的脂肪含量和2.90％(w/w)的蛋白含量。将酸性稀奶油样品储存至少5天，但是不超过14天，并且由感官小组进行评估。

为了描述感官可感知的产品属性，选择描述性感官分析。描述性分析的基础是ISO13299“Sensory analysis-Methodology-General guidance for establishing asensory profile[感官分析-方法学-确立感觉曲线的通用指南]”。在感官描述性分析中，在具有表示低和高强度的两个锚点的直线标度上分别评估每个描述符的强度。在训练/校准会议中，将低和高的锚点教导给小组。一式三份评估所有样品。感官小组由7个人组成，在参与这一分析的描述性分析之前，在小组接受他们之前，这些人都已经通过基础感官筛选测试。在产品属性的识别和强度标度化方面，对小组成员进行了训练。在表3中可以找到属性的定义。

表3：在感官评估中，测试的属性的定义

如所示，在图50中，在18％脂肪(w/w)酸性稀奶油中，在应用NP7L后，保留的粗糙表面、香味丰满性、甜、苦、酸、脂肪感觉和软的/绒状的感官属性不显著。然而，涉及黏度的所有属性，即搅拌抗性、稠流勺和力-颚显著增加(p□0.05)。在应用NP7L后，苦味不变。

文献

在此引用了以下文件，并且将其通过引用全部结合：-

Ausubel et al(1999)Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed-Chapter 18

Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.403-410

Clarkson KA,Dunn-Coleman N,Lantz SE,Pilgrim CE,van Solingen P,WardM.Acid Fungal Proteases,United States Patent Application Publication,US 2012/0225469A1

De Greeftrial,N.,Queguiner,C.,Grugier,F.,&Paquet,D.(2005).US PatentPublication No.US2005/0095316A1

Ebeling W,Hennrich N,Klockow M,Metz H,Hans Orth HD,and Lang H(1974),Proteinase K from Tritirachium album Limber.Eur.J.Biochem.47,91-97.

Filippova et al.,(1996)Analytical Biochemistry 234,113-118

Horwell DC,(1995)Trends Biotechnol.13(4),132-134

Hoover SR,Kokes EL(1947).Effect of pH upon proteolysis by papain.JBiol Chem.Jan；167(1):199-207.

Iversen,S.L.and M.H.Jorgensen(1995)."Azocasein assay for alkalineprotease in complex fermentation broth.Biotechnology Techniques9(8):573-576.

Jakobsen,J.,Wind,S.L.,&Qvist,K.B.(2012).PCT publication No.WO 2012/069546 A1.

Levine et al.,(2008)Molecules,13,204-211.

Mende,S.,Peter,M.,Bartels,K.,Rohm,H.,&Jaros,D.(2013).Addition ofpurified exopolysaccharide isolates from S.thermophilus to milk and theirimpact on the rheology of acid gels.Food Hydrocolloids,32(1),178-185.

Nascimento AS,Krauchenco S,.Golubev AM,Gustchina A,Wlodawer A,andPolikarpov I(2008),Statistical Coupling Analysis of Aspartic ProteinasesBased on Crystal Structures of the Trichoderma reesei Enzyme and Its Complexwith Pepstatin A.J Mol Biol.October 10；382(3):763-778

Omondi JG and Stark JR(2001)Studies on Digestive Proteases fromMidgut Glands of a Shrimp,Penaeus indicus,and a Lobster,Nephrops norvegicus:part 1.App.Biochem.and Biotec.90,137-153

Petrotchenko EV,Serpa JJ,Hardie DB,Berjanskii M,Suriyamongkol BP,Wishart DS,Borchers CH(2012).Use of proteinase K nonspecific digestion forselective and comprehensive identification of interpeptide cross-links:application to prion proteins.Mol Cell Proteomics.Jul；11(7):M111.013524.doi:10.1074/mcp.M111.013524 page 1-13.Epub 2012 Mar21.

Prasanna,P.H.P.,Grandison,A.S.,&Charalampopoulos,D.(2012).Effect ofdairy-based protein sources and temperature on growth,acidification andexopolysaccharide production of Bifidobacterium strains in skim milk.FoodResearch International,47(1),6-12.

Queguiner,C.,De Greeftrial,N.,Grugier,F.,&Paquet,D.(2005).US PatentPublication No.US 2005/0095317 A1.

Rawlings,N.D.,&Barrett A.J,(1993)Evolutionary Families ofPeptidases.Biochem.J.290,205-218.

Schechter and Berger,(1967)On the size of the active site inproteases.I.Papain.Biochem Biophys Res Commun,27(2):157-162.

Simon RJ et al.,(1992)PNAS 89(20),9367-9371

Sodini,I.,Remeuf,F.,Haddad,C.,&Corrieu,G.(2004).The Relative Effectof Milk Base,Starter,and Process on Yogurt Texture:A Review.Critical Reviewsin Food Science and Nutrition,44(2),113-137.

Tran,L.,Wu,X.C.,&Wong,S.L.,(1991).Cloning and expression of a novelprotease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillussubtilis.J.Bacteriol.173(20),6364-6372.

Worthington Enzyme Manual-Worthington,K.,and Worthington,V.,Eds.(1993)and Worthington,K.,and Worthington,V.(2011).Worthington BiochemicalCorporation.As of 5 December 2014(worthington-biochem.com/pap/default.html).

Claims (38)

1.一种制备发酵奶产品的方法，该方法包括：

(a)用对低pH敏感的肽酶和微生物处理奶基质；并且

(b)允许所处理的奶基质发酵来产生该发酵奶产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶来自M4家族。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶是金属蛋白酶。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶包含排除了信号序列的成熟蛋白，或其中该对低pH敏感的肽酶包含含有信号序列的全长蛋白。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶是细菌肽酶、真菌肽酶、古细菌肽酶、人工肽酶或其功能变体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶是细菌金属蛋白酶、真菌金属蛋白酶、古细菌金属蛋白酶、人工金属蛋白酶或其功能变体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的多肽、与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽、或其功能变体。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的多肽、与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽、或其功能变体。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶包含具有SEQID NO:3的氨基酸序列的多肽、与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽、或其功能变体。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶包含具有SEQID NO:4的氨基酸序列的多肽、与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽、或其功能变体。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该对低pH敏感的肽酶包含缺少信号序列的多肽。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该微生物是乳酸菌。

14.根据权利要求13所述的方法，其中该微生物属于链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、假明串珠菌属(Pseudoleuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)或其任何组合。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中另外地用糖苷酶处理该奶基质。

16.根据权利要求15所述的方法，其中该糖苷酶是N-连接的糖苷酶或O-连接的糖苷酶。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中该糖苷酶选自SEQ ID NO.10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13，以及与其中任一个具有至少75％序列同一性的糖苷酶。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该肽酶按0.1ug至1000ug/千克奶基质的量给予，优选为1-100ug/kg，并且最优选为10ug/kg。

19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该肽酶按0.1-1000个肽酶活性单位/100mL接种的奶基质的量给予，优选为1-100个单位，并且最优选为0.1-1个单位。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，将该奶基质巴氏消毒至少一次。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在发酵步骤(b)期间或之后，搅拌该发酵奶产品。

22.根据权利要求21所述的方法，其中在搅拌之后，冷却该发酵奶产品。

23.一种发酵奶产品，通过根据权利要求1至22中任一项所述的工艺可获得(或获得)。

24.一种发酵奶产品，包含对低pH敏感的肽酶和微生物。

25.根据权利要求24所述的发酵奶产品，其中该对低pH敏感的肽酶属于酶委员会(E.C.)编号3.4.17、3.4.21或3.4.24。

26.根据权利要求24或25所述的发酵奶产品，其中该对低pH敏感的肽酶来自M4家族。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的发酵奶产品，其中该对低pH敏感的肽酶是金属蛋白酶。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的发酵奶产品，其中该对低pH敏感的肽酶是细菌肽酶、真菌肽酶、古细菌肽酶、人工肽酶或其功能变体。

29.根据权利要求24至27中任一项所述的发酵奶产品，其中该对低pH敏感的肽酶是细菌金属蛋白酶、真菌金属蛋白酶、古细菌金属蛋白酶、人工金属蛋白酶或其功能变体。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的发酵奶产品，其中该对低pH敏感的肽酶包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽、或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽，或其功能变体。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的发酵奶产品，其中该微生物是乳酸菌。

32.根据权利要求31所述的发酵奶产品，其中该微生物属于链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、丙酸杆菌属、肠球菌属、短杆菌属、和双岐杆菌属或其任何组合。

33.根据权利要求24至32中任一项所述的发酵奶产品，该发酵奶产品另外地包含糖苷酶。

34.根据权利要求33所述的发酵奶产品，其中该糖苷酶是N-连接的糖苷酶或O-连接的糖苷酶。

35.根据权利要求33或权利要求34所述的发酵奶产品，其中该糖苷酶选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、和SEQ ID NO:13，或与其中任一个具有至少75％序列同一性的糖苷酶。

36.根据权利要求23至35中任一项所述的发酵奶产品，该发酵奶产品是酸奶、酸性稀奶油或发酵奶。

37.对低pH敏感的肽酶在发酵奶产品的生产中用于以下各项的用途：

(a)改进黏度；

(b)改进胶凝强度；

(c)改进质地；

(d)改进凝乳的硬度；

(e)提供较早的发酵开始；

(f)提供较早的凝胶化开始；

(g)提供较早的发酵结束；

(h)减少脱水收缩；

(i)改进保质期；

(j)减小黏性；或

(k)(a)至(i)的任何组合。

38.一种参考实例中的任一个、基本如上文所描述的方法、发酵奶产品或用途。