CN103243081A - 一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用 - Google Patents
一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103243081A CN103243081A CN2012100330163A CN201210033016A CN103243081A CN 103243081 A CN103243081 A CN 103243081A CN 2012100330163 A CN2012100330163 A CN 2012100330163A CN 201210033016 A CN201210033016 A CN 201210033016A CN 103243081 A CN103243081 A CN 103243081A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rennin
- milk
- chymosin
- yak
- cheese
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种凝乳酶，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述的凝乳酶具备牦牛乳底物特异性，该凝乳酶可用于制备牦牛乳乳酪。本发明还提供了一种编码权利要求1所述的凝乳酶的基因，其中，其核昔酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的优点为，该种凝乳酶使牦牛乳快速凝固，可以克服传统凝乳酶不适宜牦牛乳乳酪生产的问题，作为小牛皱胃凝乳酶的替代品，在牦牛乳深加工领域具备广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种由枯草芽孢杆菌诱变株分泌的凝乳酶的基因序列及其蛋白序列与应用。
背景技术
在食品加工领域，尤其是奶酪加工领域，凝固酶是必不可少的添加剂。凝乳酶不仅可以使牛奶凝固，而且在奶酪成熟中具有不可忽视的作用(Kumar et al.，2005)。小牛皱胃凝乳酶首次被发现是一个偶然的机会，人们用动物的皮保存牛奶时，牛奶有时会出现凝固，之后小牛皱胃凝乳酶就被广泛应用在奶酪加工领域。自从1961起，由于世界乳酪业的高速发展，使得小牛凝乳酶供应持续短缺，科学家不断寻找能够替代小牛皱胃凝乳酶的蛋白酶。
之后，人们发现了一些蛋白酶具有类似的凝乳效果。这些凝乳酶广泛分布在不同的生物和组织内(Chitpinityol and Crabbe，1998)。因此，由于各类蛋白酶具有不同的理化性质、水解活性和凝乳活性，所以其用途就各不相同。人们通过向不同来源的奶液(奶牛，牦牛，山羊以及骆驼)中添加凝乳酶，并采用不同的加工手段，最终获得口味各异的奶酪。
青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)是世界海拔最高的高原，气候环境恶劣，因此其拥有许多独特的生物质资源。牦牛，就是其中最典型的一种(Zi，2003)。牦牛常年以丰富的、无污染的草料为食，因此可以为当地居民提供大量的洁净的食物(牦牛乳，肉，酥油)。藏民们通常会将牦牛乳加工成各种乳制品，牦牛奶酪就是其中最主要且最常见的一种。牦牛乳在总蛋白含量，脂肪含量，酪蛋白组成方面与牛奶具有明显的差异(Brunner，1981；Li et al.，2010)，尤其特别的是牦牛乳中含有大量的β-casein，使传统凝乳酶的凝乳速度大大降低；其次，在牦牛乳奶液的pH通常在6.0-8.0之间，而传统的动物源和真菌源的凝乳酶在pH＜5.0情况下具有最大活性，那么在中性环境下具有高凝乳活性的凝乳酶非常适合牦牛乳奶酪的生产；第三，高温处理是牦牛乳制作奶酪之前的必要步骤，如果高温处理后立即添加凝乳酶，那么就缩短了前处理时间，在奶酪制备过程中，高温环境不仅可以提高酶的反应效率，而且会减少酶的用量，节约成本。然而，传统的凝乳酶通常只能在50℃以下的环境中保持活性的稳定(Ageitos etal.，2007；Kumar et al.，2005；Nouani et al.，2009)，而在高温环境下会迅速失活，无法满足牦牛奶酪加工的需要。综上所述，传统的凝乳酶不再适用于牦牛乳奶酪的生产过程。因此，亟须开发出一种具有热稳定性的、高效凝结牦牛乳的凝乳酶。迄今为止，没有文献或专利报道过具备牦牛乳特异性、热稳定性、并在pH6.0-8.0保持高活性的微生物源凝乳酶，更没有明确这类蛋白质或其编码蛋白质的基因序列。
Ageitos，J.M.，Vallejo，J.A.，Sestelo，A.B.，Poza，M.，and Villa，T.G.(2007).Purification and characterization of amilk-clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13.J Appl Microbiol 103，2205-2213.
Brunner，J.(1981).Cow milk proteins：twenty-five years of progress.J Dairy Sci 64，1038.
Chitpinityol，S.，and Crabbe，M.(1998).Chymosin and aspartic proteinases.Food Chem 61，395-418.
Kumar，S.，Sharma，N.，Saharan，M.，and Singh，R.(2005).Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae：purification and characterization.Process Biochem40，1701-1705.
Li，H.M.，Ma，Y.，Dong，A.，Wang，J.，Li，Q.，He，S.，and Maubois，J.-L.(2010).Protein composition of yak milk.DairySci Technol 90，111-117.
Nouani，A.，Belhamiche，N.，Slamani，R.，Belbraouet，S.，Fazouane，F.，and Bellal，M.(2009).Extracellular proteasefrom Mucor pusillus：purification and characterization.Int J Dairy Technol 62，112-117.
Zi，X.(2003).Reproduction in female yaks(Bos grunniens)and opportunities for improvement.Theriogenology 59，1303-1312.
发明内容
本发明的目的是提供一种凝乳酶基因。
本发明的另一个目的是提供一种本发明的基因编码的蛋白质。
本发明的所述的凝乳酶，是指来自可高产凝乳酶的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)YB-3菌株的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。该菌种已经于2009年4月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，电话(027)68754052，传真(027)68754833，E-mail：cctccwhu.edu.cn，其保藏号为CCTCC NO：M209075。
本发明的再一个目的是提供一种本发明的蛋白质的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明对菌株Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶进行了纯化：
(1)乙醇分级沉淀法初步纯化凝乳酶。将粗酶液置于冰浴中，经过30-60％乙醇分级沉淀后，12,000g 30min离心获得的蛋白沉淀复溶于的50mM的pH 6.0的磷酸缓冲液中。经检测，沉淀中的凝乳酶活力回收达到71.4％。(2)分子筛层析法进一步纯化凝乳酶。通过SDS-PAGE电泳分析，表明：经过两步纯化，该凝乳酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为42±1kDa；最终，凝乳酶纯化倍数(表1)为9.5，回收率为19.1％，比活达到8889SU/mg。该凝乳酶，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为42±1kDa。
菌株Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶具备牦牛乳特异性，可以用于生产牦牛乳乳酪和牛乳乳酪中的应用。
这里所说的牦牛乳特异性是指，当以不同哺乳动物奶液为底物时，菌株Bacillus subtilisYB-3产生的凝乳酶对牦牛乳的凝乳活性最高，使牦牛乳最快凝固。
菌株Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶在pH5.0-8.0时，具有较高的凝乳活性，其最适反应pH是6.0。该酶在pH5.0-8.0放置一小时保持较高的稳定性，在此范围外，其凝乳活性大幅度下降。该酶在40℃-80℃内都具有较高的凝乳活性，在70℃活性最强，在0-50℃放置一小时后，仍然能保留初始活力的100％，较稳定。当温度大于等于60℃时，该酶活力随着放置时间的变化迅速失活。
Ca2+、Al3+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+对该凝乳酶有抑制作用。
丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂β-Mercaptoethanol、天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑肽剂(pepstatin)对该酶活力几乎无抑制作用，而EDTA对该酶凝乳活性有显著抑制作用。
本发明分离克隆了菌株Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶，所述凝乳酶具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。该凝乳酶的编码基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
LC/MS/MS(HPLC-mass spectrometryanalysis)分析结果显示，该凝乳酶属于金属蛋白酶家族。在NCBI上进行比对，发现该凝乳酶编码基因与Bacillus subtilis metalloprotease gene(Bacillussubtilis金属蛋白酶基因)同源性为98.97％，有16个碱基不同。CDS区域编码基因对应的氨基酸比对结果发现相似度为99.03％，有五个氨基酸不同。
本发明的优点为，1、该种凝乳酶，具有牦牛乳特异性，可以加速牦牛乳凝固，在牦牛乳酪生产领域具有广阔的应用前景。2、该种凝乳酶具备热稳定性，并在中性环境下保持高凝乳活性，所以与小牛皱胃凝乳酶相比，更适用于牦牛乳奶酪的制备。3、该酶也可以同时应用于普通牛奶的凝乳。
附图说明
图1是凝乳酶的SDS-PAGE电泳分析，其中1-标准分子量蛋白，2-粗酶液，3-乙醇分级沉淀后凝乳酶液，4-分子筛层析后凝乳酶液；
图2表示纯化凝乳酶的最适反应温度、pH和温度、pH稳定性，其中图2a表示凝乳酶的最适反应温度，图2b表示凝乳酶的温度稳定性；图2c表示凝乳酶的最适反应pH，图2d表示凝乳酶的pH稳定性。
图3表示Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶(MCE from Bacillus subtilis)对于牛奶(cowmilk)和牦牛奶(yak milk)的凝乳活性。其中以小牛皱胃凝乳酶Maxiren 1800和真菌源凝乳酶MCE from Rhizomucor pusillus作为对照凝乳酶。
图4表示纯化Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶制备牛乳乳酪和牦牛乳乳酪
图5表示Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶的指纹图谱与Bacillus pumilus金属蛋白酶(gi56405351)匹配结果。下划线为一致性序列。
具体实施方式
实施例一
Bacillus subtilis YB-3的培养及发酵液的制备。
Bacillus subtilis YB-3的摇瓶发酵在100ml三角瓶中进行，其中包含30ml的发酵培养基。发酵培养基由10g/L酪蛋白，3g/L牛肉膏，5g/LNaCl，5g/LNa2HPO4·12H2O组成，初始pH 7.0。上述培养基接种1ml的对数期的菌液，37℃，150转/分钟振荡培养。发酵结束后，发酵液离心5分钟除去菌体，离心力3020g，上清液即为粗酶液。
实施例二
凝乳酶蛋白水解活性测定和凝乳活性的测定。
凝乳酶测定方法参照IDF的方法157A：1997。
蛋白水解活性测定方法参照改良的Lorry法。
实施例三
菌株Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的纯化程序。
首先，粗酶液经过30-60％乙醇分级沉淀后，12,000g 30min离心获得的蛋白沉淀复溶于的50mM的pH 6.0的磷酸缓冲液中。
上述复溶的酶液通过Waters protein pak i-125分子筛层析柱(7.5x300mm)进一步分离纯化，上述层析柱预先用50mM pH6.0磷酸缓冲液(含有0.15M Na2SO4)平衡。分离过程中，样品检测波长为OD280，流动相采用相同的缓冲液，流速1.0ml/min，每1.0ml洗脱液作为一个组分，分部收集。
收集活性组分并通过Amicon Ultra(Milipore)超滤浓缩及脱盐。最终获得的酶浓缩液进行SDS-PAGE电泳分析(图1)。：
经过两步纯化，该凝乳酶已经达到电泳纯，其亚基分子量约为42±1kDa；最终，凝乳酶纯化倍数(表1)为9.5，回收率为19.1％，比活达到8889SU/mg。该凝乳酶，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为42±1kDa。
表1Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的纯化步骤及结果
注：蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法测定。
实施例四
纯化的菌株Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的酶学性质。
(1)最适温度、pH和温度、pH稳定性
通过测定菌株Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶在10-80℃时的凝乳活性来确定温度对其凝乳活性影响。菌株Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶热稳定性的测定过程如下所示：将浓度相同的凝乳酶溶液在0到60℃水浴中温浴1小时，每隔10分钟测定酶溶液剩余凝乳活性。
通过测定菌株Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶在pH范围5.0-11.0的凝乳活性，确定其最适反应pH。菌株Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的pH稳定性的测定过程如下所示：将等量的凝乳酶溶于不同pH值(2.0-12.0)的缓冲液中，室温静置1小时，测定剩余的凝乳活性。缓冲体系：100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0-6.0)，100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0-7.5)，100mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)，100mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0-11.0)，and 100mMKCl-NaOH缓冲液(pH 12.0).
如图2a所示，菌株Bacillus subtilis YB-3产生的凝乳酶在pH5.0-8.0时，具有较高的凝乳活性，其最适反应pH是6.0。如图2b所示，该酶在pH5.0-8.0放置一小时保持较高的稳定性，在此范围外，其凝乳活性大幅度下降。如图2c所示，该酶在40℃-80℃内都具有较高的凝乳活性，在70℃活性最强。如图2d所示，在0-50℃放置一小时后，仍然能保留初始活力的100％，较稳定。当温度大于等于60℃时，该酶活力随着放置时间的变化迅速失活。
(2)金属离子对凝乳酶活力的影响
通过将10mM的单价离子(Na+，K+，Li+)，二价离子(Ca2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+，Mg2+，Co2+)和三价离子(Al3+)加入到反应混合液中，研究各种金属离子对Bacillus subtilis YB-3凝乳活性的影响。未加入任何金属离子的反应液作为空白对照(表2)。
Ca2+、Al3+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+对该凝乳酶有抑制作用。
表2金属离子对Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的凝乳活性的影响
(3)蛋白酶抑制剂对Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的凝乳活性的影响
研究了phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)，ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)，β-mercaptoethanol和pepstatin等酶抑制剂对纯化Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶凝乳活性的影响。将纯化的Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶与不同浓度的上述抑制剂混合，于25℃静置30min，测定反应液的凝乳活性。未加入抑制剂的酶液作为空白对照(表3)。
丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂β-Mercaptoethanol、天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑肽剂(pepstatin)对该酶活力几乎无抑制作用，而EDTA对该酶凝乳活性有显著抑制作用。
表三凝乳酶抑制剂对Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的凝乳活性的影响。
(4)Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的底物特异性实验
0.5ml纯化后的Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶(1mg/ml)分别加入到5ml的10％的牛奶和复原牦牛奶中，于37℃反应并记录凝乳时间。除此之外，将1mg/ml小牛皱胃凝乳酶Maxiren 1800chymosin和真菌凝乳酶MCE from Rhizomucor pusillus作为空白对照，重复上述操作。如图3所示，当以牛奶为底物时，Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶源凝乳酶的凝乳活性略低于对照；然而当牦牛奶为底物时，Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的凝乳活性比以牛奶为底物高175％。这表明与传统的动物来源和真菌来源的凝乳酶相比，Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶对牦牛乳具有特异性。
实施例五
Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶在制备乳酪中的应用
乳品选择：巴斯德灭菌牛奶和牦牛奶，性状稳定。
发酵剂准备：纯化后的Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶。
乳酸菌准备：双歧杆菌，保加利亚乳杆菌。
奶酪制备：采用500ml离心瓶制备奶酪，离心瓶需经过110摄氏度灭菌10分钟，所有步骤均采用无菌操作。离心瓶中加入400ml的32摄氏度上述脱脂牛奶(80％)，在牛奶中加入2％(v/v)的发酵剂和3ml的凝乳酶。混匀上述溶液，放置与32摄氏度的水浴中，待牛奶凝固后，继续放置于水浴中，以获得硬度适宜的凝块。用无菌不锈钢器具切割凝块，并用其缓慢搅拌10分钟(10rpm)。之后，离心瓶用320g室温离心10分钟除去大部分水。用圆柱形器皿收集凝块，重新在1400g下30摄氏度离心1小时。再取出凝块(除去大部分乳清)，再次在1400g下30摄氏度离心30分钟。离心后，获得直径6厘米，厚2厘米的圆柱状凝块。上述凝块在32摄氏度水浴中静置，直到pH达到5.2。之后在12摄氏度下，用35ml的无菌盐水(330g/LNaCl，pH 5.4)浇筑。5分钟后，除去盐水，将凝块放在无菌滤网上，除去乳清。如图4所示，制备得到牛乳乳酪(左)牦牛乳乳酪(右)。
如图4所示，Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶制备的牦牛乳乳酪和牛乳乳酪颜色和硬度均达到要求。
Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶还可以用于除了奶酪之外的其它乳制品，例如酸奶和干酪素等。
实施例六
Bacillus subtilis YB-3所产凝乳酶的LC/MS/MS分析以及其编码基因的克隆程序。
纯化的凝乳酶经变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测，切取蛋白质单一条带(42kDa)经10ng/μl测序级修饰膜蛋白质酶(Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega)30摄氏度、pH7.5，酶解30min～1h，采用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)(Thermo Fisher Scientific Inc.，MA，USA)获得该蛋白质的多个肽段序列，总计近150个氨基酸长度，这些序列和质谱库中的Bacilluspumilus金属蛋白酶(gi56405351)序列相匹配，覆盖了其44.67％的序列(图5)。
根据质谱测序结果和基因序列比对设计引物：
5′-ATG GGT TTA GGT AAG AAA TTG TCT-3′
5′-TTA CAA TCC AAC AGC ATT CCA GGC-3′
，并以Bacillus subtilis YB-3总DNA为模板，进行PCR (94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保温)。扩增出1557bp的DNA片段，该基因的顺序如SEQID NO：1所示。
在NCBI上进行比对，发现该凝乳酶编码基因与Bacillus subtilis metalloprotease gene(Bacillus subtilis金属蛋白酶基因)同源性为98.97％，有16个碱基不同。
CDS区域编码基因编码514个氨基酸，该氨基酸的顺序如SEQ ID NO：2所示。
在NCBI上进行比对，发现该凝乳酶氨基酸序列与Bacillus subtilis metalloprotease氨基酸序列比对结果发现相似度为99.03％，有五个氨基酸不同。
Claims (9)
1.一种凝乳酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于：该凝乳酶最适凝乳pH是6.0；该酶在pH5.0-8.0放置一小时保持稳定。
3.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于：该凝乳酶最适凝乳温度70℃；在0-50℃放置一小时后，仍然能保留初始活力的100％。
4.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于：Ca2+、Al3+、K+离子对该凝乳酶有激活作用，而Fe2+、Cu2+、Zn2+对该凝乳酶有抑制作用。
5.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于：纯化后的酶的分子量按SDS-PAGE所确定为42±1kDa。
6.根据权利要求1所述的凝乳酶，其特征在于：该凝乳酶对于牦牛乳具有底物特异性。
7.根据权利要求1所述凝乳酶用于生产奶酪、干酪素以及酸奶等乳制品中的应用。
8.根据权利要求1所述凝乳酶用于生产奶酪、干酪素以及酸奶等乳制品中的应用，其特征在于：所述乳制品的原料为牛奶或牦牛奶。
9.一种编码如权利要求1所述凝乳酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210033016.3A CN103243081B (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210033016.3A CN103243081B (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103243081A true CN103243081A (zh) | 2013-08-14 |
| CN103243081B CN103243081B (zh) | 2018-04-13 |
Family
ID=48922960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210033016.3A Active CN103243081B (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103243081B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016123326A1 (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method |
| CN107201353A (zh) * | 2016-03-16 | 2017-09-26 | 兰州大学 | 一种凝乳酶的应用及其制备方法 |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109182311B (zh) * | 2018-10-11 | 2021-07-27 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种用于沂蒙黑山羊乳奶酪的凝乳酶 |
-
2012
- 2012-02-14 CN CN201210033016.3A patent/CN103243081B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHWEN-JEN SHIEH，ET AL: "Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis", 《BIOCHMICAL ENGINEERING JOURANL》 * |
| UNIPROT: "A7BJC1", 《UNIPROT》 * |
| UNIPROT: "D4FW61(Extracellular neutral metalloprotease)", 《UNIPROT》 * |
| 高岩等: "枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质（网络出版）", 《吉林农业大学学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016123326A1 (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method |
| CN107734973A (zh) * | 2015-01-30 | 2018-02-23 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 方法 |
| CN107201353A (zh) * | 2016-03-16 | 2017-09-26 | 兰州大学 | 一种凝乳酶的应用及其制备方法 |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103243081B (zh) | 2018-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chazarra et al. | Characterization of the milk-clotting properties of extracts from artichoke (Cynara scolymus, L.) flowers | |
| Albenzio et al. | Microbiological and biochemical characteristics of Canestrato Pugliese cheese made from raw milk, pasteurized milk or by heating the curd in hot whey | |
| Fox | Proteolysis during cheese manufacture and ripening | |
| Tejada et al. | Proteolysis in goats’ milk cheese made with calf rennet and plant coagulant | |
| Ahmed et al. | Novel milk-clotting enzyme from Bacillus stearothermophilus as a coagulant in UF-white soft cheese | |
| Shamtsyan et al. | Novel milk-clotting enzyme produced by Coprinus lagopides basidial mushroom | |
| Parmar et al. | Purification and production of novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory bioactive peptides derived from fermented goat milk | |
| Farkye et al. | Proteolysis and flavor development in Cheddar cheese made exclusively with single strain proteinase-positive or proteinase-negative starters | |
| CN103243081A (zh) | 一种凝乳酶基因及其编码的氨基酸序列与应用 | |
| Wehaidy et al. | Statistical optimization of B. subtilis MK775302 milk clotting enzyme production using agro-industrial residues, enzyme characterization and application in cheese manufacture | |
| US20200123494A1 (en) | Method for obtaining protein from whey or molasses | |
| FR2836015A1 (fr) | Nouveau procede de fabrication de produits laitiers fermente | |
| Artifon et al. | Biosynthesis of the acid protease produced by Lacticaseibacillus casei LBC 237 and Limosilactobacillus fermentum LBF 433 and their potential application in the bovine milk clotting | |
| CN103966131B (zh) | 一种具有高肽酶活力的植物乳杆菌及其应用 | |
| Abbas et al. | Production of white soft cheese using fungal coagulant produced by solid state fermentation technique | |
| US20240032553A1 (en) | Frozen enzyme pellets | |
| CN109182311B (zh) | 一种用于沂蒙黑山羊乳奶酪的凝乳酶 | |
| JP7401970B2 (ja) | 発酵乳製品の製造方法及び酵素含有組成物 | |
| Moschopoulou | Microbial milk coagulants | |
| Nezhad Razmjoui Akhgar et al. | Effect of slurry incorporation into retentate on proteolysis of Iranian ultrafiltered white cheese. | |
| CN105385622B (zh) | 一种干酪发酵剂及其制备方法和应用 | |
| US20200359652A1 (en) | Bacterial strain compositions and methods of using same | |
| JP2007104905A (ja) | 乳製品の製造方法 | |
| CN109182208B (zh) | 一种用于沂蒙黑山羊乳奶酪的凝乳酶及其生产菌株与应用 | |
| OHMIYA et al. | Application of immobilized alkaline protease to cheese‐making |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CHENG SHUANGLIN Free format text: FORMER OWNER: LANZHOU XIAOLIANGHE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20150819 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150819 Address after: 730000, Tianshui, Gansu, No. 222, Lanzhou University Applicant after: Cheng Shuanglin Address before: Chengguan District of Gansu city of Lanzhou province Donggang West Road 730000 No. 249 Lanzhou University Science and technology garden room 119-5 Applicant before: Lanzhou Xiaolianghe Biological Technology Co., Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |