WO2017104729A1 - 発酵乳製品及びその製造方法 - Google Patents

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WO2017104729A1
WO2017104729A1 PCT/JP2016/087327 JP2016087327W WO2017104729A1 WO 2017104729 A1 WO2017104729 A1 WO 2017104729A1 JP 2016087327 W JP2016087327 W JP 2016087327W WO 2017104729 A1 WO2017104729 A1 WO 2017104729A1
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milk
protease
fermented
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raw
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PCT/JP2016/087327
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佐藤　智子
吉川　潤
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合同酒精株式会社
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    • A23C9/127—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using microorganisms of the genus lactobacteriaceae and other microorganisms or enzymes, e.g. kefir, koumiss
    • A23C9/1275—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using microorganisms of the genus lactobacteriaceae and other microorganisms or enzymes, e.g. kefir, koumiss using only lactobacteriaceae for fermentation in combination with enzyme treatment of the milk product; using enzyme treated milk products for fermentation with lactobacteriaceae
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea

Definitions

  • the present invention relates to a fermented milk product and a method for producing the same.
  • fermented milk There are two main types of fermented milk. One is a pre-fermentation type, in which raw milk is fermented in a large production tank, and the fermented milk obtained is crushed and then filled into individual food containers. The other is a post-fermentation type, which is fermented after filling raw milk, lactic acid bacteria, etc. in a single-meal container. In any type, fermented milk filled and fermented in a single food container is placed on a distribution channel and delivered to the final consumer.
  • pre-fermentation type in which raw milk is fermented in a large production tank, and the fermented milk obtained is crushed and then filled into individual food containers.
  • post-fermentation type which is fermented after filling raw milk, lactic acid bacteria, etc. in a single-meal container.
  • fermented milk filled and fermented in a single food container is placed on a distribution channel and delivered to the final consumer.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose a method of adding an enzyme when producing fermented milk.
  • Patent Document 1 discloses a method using peroxidase
  • Patent Document 2 discloses a method using transglutaminase.
  • Patent Document 1 describes that when peroxidase is added to produce fermented milk, smoothness and water retention are improved, and hardness decreases.
  • Patent Document 2 when transglutaminase is added to produce fermented milk, a network between milk proteins and within milk proteins (intermolecular and intramolecular) is formed (gelled) by the enzymatic action of transglutaminase.
  • Patent Document 2 does not describe the hardness of the obtained fermented milk, but it is presumed that the hardness of the fermented milk increases from the mechanism of action of the above transglutaminase.
  • Patent Document 1 or 2 it is expected to reduce or increase the hardness of fermented milk.
  • either enzyme only reduces or increases the hardness of the fermented milk.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a fermented dairy product, which can adjust the hardness of the fermented dairy product to a desired value while maintaining the original smoothness of the fermented dairy product.
  • the present inventors have found that by adding a specific protease to milk and fermenting, the hardness of the curd of the fermented dairy product can be adjusted, and the inside thereof becomes more uniform and smooth. Was completed.
  • Protease whose molecular weight is estimated to be 32,000-34,000 Da by SDS polyacrylamide gel electrophoresis; [7] Furthermore, one or more selected from lactase, glucose isomerase, glucose oxidase, transglutaminase, lipase, cellulase, amylase, inulinase, laccase, peroxidase, and protease other than the protease described above as raw material milk and / or Or the method for producing a fermented dairy product according to any one of the above [1] to [6], comprising a step of adding to the mixed solution; [8] A fermented milk product containing a protease derived from the genus Penibacillus, Fermented dairy products characterized in that the breaking point of the curd when measured using a creep meter is 0.002 to 1.0 N; [9] A method for producing a fermented milk product containing a protease derived from the genus Penibacillus
  • a fermented milk product capable of adjusting the hardness of the fermented milk product to a desired value while maintaining the original smoothness of the fermented milk product, and a method for producing the fermented milk product.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of a rupture strength analysis using a creep meter for panel A with yogurts in Production Examples 1 and 5, and panel B with yogurts in Production Examples 2 and 6.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of texture analysis using a creep meter for panel A with the yogurts of Production Examples 1 and 5, and panel B with the yogurts of Production Examples 2 and 6.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of a rupture strength analysis using a creep meter for the yogurts of Production Example 3 and Production Example 7.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of texture analysis using a creep meter for the yogurts of Production Example 3 and Production Example 7.
  • FIG. 5 is a diagram showing results of breaking strength analysis by a creep meter for the yogurts of Production Example 4 and Production Example 8.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of a rupture strength analysis using a creep meter for panel A with yogurts in Production Examples 1 and 5, and panel B with yogurts in Production Examples 2 and 6.
  • FIG. 3 is a diagram showing the
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of texture analysis using a creep meter for the yogurts of Production Example 4 and Production Example 8.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of a rupture strength analysis by a creep meter when the amount of enzyme added is changed.
  • FIG. 8 is a diagram showing the time-dependent change of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis with respect to the fermentation time in the fermentation reaction with the protease of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of the pH dependence of a protease suitable for the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing a result of breaking strength analysis by a creep meter and a lactose decomposition rate when a protease and lactase suitable for the present invention are used in combination.
  • the method for producing a fermented dairy product according to the present invention essentially uses a protease derived from the genus Penibacillus, a lactic acid bacteria starter, and raw milk, and optionally uses additives such as stabilizers.
  • a protease derived from the genus Penibacillus a lactic acid bacteria starter
  • raw milk a lactic acid bacteria starter
  • additives such as stabilizers.
  • (1) raw material of fermented milk product and its (2) addition amount, (3) property of fermented milk product, (4) manufacturing method of fermented milk product, (5) use will be described in this order.
  • the protease that can be suitably used in the present invention has the following properties. (1) produced by bacteria belonging to the genus Penibacillus, (2) Decomposes ⁇ -casein and hemoglobin in the neutral range; (3) The optimum pH is 7.0 to 8.0, (4) a neutral protease that is stable at pH 5.5 to 9.0, (5) It operates at 20 to 75 ° C, and the optimum temperature is 55 ° C. (6) The molecular weight by electrophoresis is estimated to be 32,000-34,000 Da.
  • Penibacillus was formerly classified as the genus Bacillus, but has recently been reclassified and proposed as a new genus. Proteases having the above properties can be obtained from another species including Penibacillus polymixer or Penibacillus sp. Re-identified from Bacillus polymixer. Although it may be displayed as a Bacillus polymixer depending on documents etc., it is synonymous.
  • the protease that can be used in the present invention has the following properties.
  • ⁇ -casein and ⁇ -casein show almost no proteolytic action even in the neutral pH range.
  • C Optimum pH and stable pH range a) Optimum pH: The optimum pH for the proteolytic action on ⁇ -casein is 7.0 to 8.0. B Stable pH range: Extremely stable in the range of 5.5 to 9.0.
  • D Range of optimum temperature of action The temperature is in the range of 20 ° C to 75 ° C, and the optimum temperature is 50 to 60 ° C. The optimum temperature is 55 ° C.
  • E Deactivation conditions due to pH, temperature, etc. At pH 3.0 or lower and pH 10.0 or higher, the activity is completely lost. Further, it is completely deactivated by heat treatment at 65 ° C.
  • Proteases are classified into the following five types according to their catalytic sites. Acid protease (catalytic site; aspartic acid, eg; pepsin), metalloprotease (catalytic site; metal), serine protease (catalytic site; serine, eg; trypsin), cysteine protease (catalytic site; SH group such as cysteine) Amino acids such as papain), and mixed types in which at least two of these are mixed (eg, actinase AS).
  • the protease derived from the genus Penibacillus used in the present invention is classified as a neutral metalloprotease. As will be described later, in the case of a neutral protease, it is deactivated by lowering the pH of the milk by fermentation, so that the protease is inactivated in the dairy product using the present invention.
  • the protease of the present invention is an endo-type neutral metalloprotease.
  • the endo-type protease has an action of roughly degrading a protein and reducing its molecular weight.
  • proteases are allowed to act on milk proteins, they often have a bitter taste.
  • the protease according to the present invention described above is allowed to act on milk protein, no bitter taste is produced, and the taste and smell are not affected.
  • ⁇ -Casein a component of milk casein, plays an important role in the formation of casein micelles.
  • the above protease specifically degrades this ⁇ -casein, and improves the texture (smoothness) of the obtained fermented dairy product without causing other structural changes to other casein proteins. Can do.
  • protease (Type of raw material) Proteases have been isolated from a very wide range of organisms, including microorganisms.
  • a preferred protease is a microorganism-derived protease in terms of cost and reactivity.
  • proteases include the genus Bacillus or Paenibacillus, Geobacillus, Aspergillus, Rhizopus, Rhizomucor, Streptomyces. ) -Derived proteases, lactic acid bacteria-derived proteases, and the like.
  • the protease that can be used as the enzyme of the present invention is a protease derived from the genus Paenibacillus.
  • preferred proteases are Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus macerans, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae, Paenibacillus thiaminolyticus, Paenibacillus validus, Paenibacillus validus, Paenibacillus validus, Paenibacillus validus, Paenibacillus , Paenibacillus kobensis, Paenibacillus lautus, Paenibacillus alginolyticus, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus chitinolyticus, Paenibacillus chondroitinus, Paenibacillus curdlanolyticus, Paenibacillus durus, Paenibacillus is there.
  • the enzyme may be in any form such as a purified enzyme, semi-purified enzyme, crude enzyme, crushed cell body (preferably lyophilized product) and the like, as long as it has a ⁇ -casein degrading action. Because many proteases that degrade are susceptible to bitterness and off-flavour, they belong to the genus Paenibacillus, particularly Paenibacillus polymyxa, or the Paenibacillus genus whose homology of 16S rDNA is 98% or more compared to the sequence of Paenibacillus polymyxa. A metal protease having the aforementioned properties derived from the microorganism (bacteria) to which it belongs is preferred. Even when added to milk, metalloproteases derived from these genera have an action of degrading ⁇ -casein contained in milk, and the processed milk does not have a bitter taste or off-flavor.
  • a metal protease suitable for the present invention has a residual activity of 10% or less when reacted for 1 hour at pH 4.5 using azocasein as a substrate at 43 ° C., which is a general fermentation temperature of fermented milk products. This property prevents the protease activity from remaining in the fermentation preparation and prevents the protease from adversely affecting the fermentation preparation during storage.
  • the metalloprotease used in the present invention can be recovered from a microorganism and purified by a conventional general method. Therefore, the production of the protease can be performed by genetic recombination or non-genetic recombination.
  • Paenibacillus polymyxa NBRC 15309 strain can be obtained as a culture supernatant obtained by culturing in a nutrient medium or the like manufactured by Difco and filtering or centrifuging from the culture.
  • the obtained culture supernatant can be appropriately purified by column chromatography, ammonium sulfate fractionation, or the like.
  • the shape of the obtained enzyme solution may be liquid or sprayed or freeze-dried. In that case, you may add the stabilizer and the excipient
  • the metalloprotease is preferably added in the range of 0.05 to 10.0 PU / g based on the total mass of the raw milk. More preferably, it can be added in the range of 0.25 to 5.0 PU / g. If it is within this range, the unevenness of the hardness inside the card of the fermented milk product is reduced, and the texture becomes smooth. Also, by changing the amount of addition, the hardness inside the card can be changed and adjusted. For example, even if 4.0 PU / g protease is added to raw milk with a relatively high milk fat content (for example, more than 1.5% to 5.0% or less), the shape of the card can be maintained.
  • a relatively high milk fat content for example, more than 1.5% to 5.0% or less
  • the card can be used suitably for post-fermentation type fermented milk products, and by adding 0.25 PU / g or more, sufficient softness can be imparted to the curd.
  • moderate hardness of the card can be imparted to low-fat milk and non-fat milk (for example, 1.5% or less) by adding the protease of the present invention. That is, in order to obtain a fermented dairy product having a desired curd hardness, the amount of milk fat and the amount of protease added using the milk fat content in the raw milk and the amount of the Proba genus derived from the genus Penibacillus as indicators. ⁇ E.g., to examine the amount of protease added to the raw milk for a certain amount of milk fat in advance and determine the amount added (create a calibration curve, etc.) ⁇ etc. What is necessary is just to perform a process.
  • the addition amount (enzyme amount) of the above metal protease can be calculated as the enzyme activity per enzyme mass based on the enzyme amount of 1.0 PU defined by the following method.
  • the reaction is stopped by adding 5 mL of anhydrous sodium acetate, 1.8% trichloroacetic acid, 1.98% acetic acid), and further allowed to stand at 30 ° C. for 30 minutes. After filtration, the absorbance at 275 nm is measured.
  • the amount of enzyme that releases an amino acid corresponding to 1 ⁇ g of tyrosine per minute under these conditions (enzyme activity) is defined as 1 PU (Protease Unit).
  • lactic acid bacteria starter in its production method.
  • lactic acid bacteria to be used are not particularly limited, and conventionally used lactic acid bacteria such as Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei can be used.
  • commercially available products that are generally available can be purchased, or strains that are uniquely isolated can also be used.
  • a plurality of the same type of lactic acid bacteria may be used in combination, or a plurality of different types of lactic acid bacteria may be used in combination.
  • a probiotic bacterium such as bifidobacteria may be added simultaneously with the starter and used.
  • the amount of lactic acid bacteria starter added is not particularly limited. Common amounts can be added. For example, when using a Christian Hansen freeze-dried starter, the amount is 0.1 to 0.5 mg / g based on raw milk, but the amount added is particularly limited as long as it is an amount capable of growing lactic acid bacteria. Not.
  • ⁇ Raw milk> Although it does not specifically limit as raw material milk, It is the liquid and powder solution containing milk components, such as raw milk, raw milk, whole fat milk, skim milk, whey, butter, These can be used in combination.
  • the milk fat content contained in the raw milk is preferably 0 to 10% by mass. More preferably, the content is 0.1 to 5.0% by mass, and still more preferably 1.0 to 5.0% by mass.
  • the lower the milk fat content the greater the hardness of the fermented milk product.
  • the higher the milk fat content the lower the hardness of the fermented milk product.
  • the milk fat content contained in the raw milk differs depending on the type of milk, but it is possible to adjust the milk fat content by adding butter or the like.
  • the non-fat milk solid content contained in the raw milk is preferably 3.0 to 20% by mass. If it is less than the lower limit or exceeds the upper limit, the smoothness of the fermented milk product may be insufficient. If it is less than the lower limit, the fermented milk product is hard to solidify, and if it exceeds the upper limit, the fermented milk product may be too hard.
  • the dairy product of the present invention is not limited to a solid (for example, cheese) and a gel (for example, yogurt), but also includes liquid and sol (for example, drink-type yogurt). In that case, the non-fat milk solid content may be less than the lower limit (3.0%).
  • the non-fat milk solid content includes proteins mainly composed of casein, sugars mainly composed of lactose, salts mainly composed of various inorganic salts, and the like.
  • the ratio of the milk fat content (mass%) contained in the raw milk to the added amount (PU / g) of the protease derived from the genus Penibacillus is 50: 1 to 1:10.
  • the hardness change by the value of the said ratio and the addition amount of protease is that the hardness of fermented milk products falls by the addition of the said protease compared with the fermented milk products without an addition, so that the said ratio is relatively high ( Tend to be soft).
  • the ratio is relatively low, the hardness of the fermented milk product tends to increase (harden) by the addition of the protease as compared to the additive-free fermented milk product.
  • ⁇ Optional component> Various components can be added to the method for producing a dairy product of the present invention as necessary. Specific examples include metal salts that contribute to the stabilization of dairy products, various sugars, ascorbic acid, glycerin, etc., starch, dextrin, mineral salts having a buffering action, and milk-derived components, which are excipients for improved usability Examples thereof include lactose, whey, milk proteins, gelling agent agar, gelatin, pectin and the like.
  • a lactase product such as a lactase solution can be added.
  • the lactase solution or the like is not particularly limited, and a commercially available product can be used.
  • enzyme products such as liquid and powder can be added.
  • this enzyme product is not particularly limited, for example, it is one or a plurality selected from glucose isomerase, glucose oxidase, transglutaminase, lipase, cellulase, amylase, inulinase, and second protease, and a commercially available product is used. Can do.
  • a protease derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, Geobacillus, Aspergillus, Rhizopus, Rhizomucor, Streptomyces, Proteases derived from lactic acid bacteria can be used.
  • preferred proteases are selected from the group consisting of Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus samyloliquefaciens, Bacillus sp., Geoacillus caldoproteolyticus, Aspergillus sp., Aspergillus oryzae, Aspergillus melleus, Lactobacillus helveticm It is a protease derived from microorganisms.
  • the “smoothness” of the texture can be evaluated based on the linearity of the waveform by a creep meter. It can be said that the texture is smoother because there is no disturbance in the waveform (close to a straight line).
  • Viscosity Viscosity (thread drawability: texture analysis) can be evaluated by visual observation and the inclination of a tangent when the plunger is raised, which will be described later. If the inclination of the tangent becomes smaller, it is considered that the fermented milk product is more viscous, has a richer feeling, and can give the fermented milk product a better sense in the mouth.
  • curd of the fermented milk product of this invention can be evaluated by the breaking strength analysis mentioned later.
  • the load (N) at the time when the card collapses is defined as the “breaking point” (a value automatically calculated by the creep meter) and its hardness.
  • the hardness of the fermented milk product of the present invention can be adjusted to a desired hardness and is not particularly limited.
  • the preferred hardness (breaking point) is 0.002 to 1.0 N, and more preferably, 0.005 to 0.5N.
  • the ratio of the fractions of each band is obtained by drying the gel after electrophoresis subjected to SDS-PAGE and capturing it as a gray scale image with a scanner GT-X820 manufactured by EPSON Corporation.
  • ImageJ software (NIH, Bethesda, MD) Thus, it can be calculated by measuring the concentration (protein amount) of each band.
  • the fraction of bands other than about 25 kDa by SDS-PAGE electrophoresis after fermentation for 5 hours at 20 to 60 ° C. is compared with that before fermentation.
  • the fluctuation does not vary greatly. It is estimated that such characteristics can prevent other original flavors and the like from being damaged by the enzyme treatment while adjusting the card hardness and smoothness of the fermented milk product.
  • the molecular weight of each band by SDS-PAGE electrophoresis can be calculated by a known method, and the molecular weight range of each band area can be similarly calculated by a known method.
  • the method for producing a dairy product of the present invention sequentially performs a first step of mixing raw milk and lactic acid bacteria to obtain a mixed solution, and a second step of fermenting the mixed solution, and the second step is completed.
  • a specific production method is not particularly limited as long as it includes a step of adding a protease derived from the genus Penibacillus to the raw milk and / or the mixed solution (protease addition step).
  • the production method includes (1) simultaneously adding lactic acid bacteria starter and metal protease to milk at a predetermined concentration, and (2) stirring at 43 ° C. for about 10 to 15 minutes. (3) Dispensing the obtained mixed solution into a glass container and fermenting it at 43 ° C for 5 hours, (4) The obtained fermentation preparation is stored refrigerated at 4-5 ° C for 1 day or more. Is included.
  • the pre-fermentation type can be used as a drink type or fruit yogurt.
  • the post-fermentation type can be used for plain yogurt and the like. Moreover, since it does not affect the activity of lactase, it is possible to obtain a dairy product to which lactase is added.
  • Lactic acid bacteria starter Lactic acid bacteria powder FD-DVS YF-L812 Yo-Flex (manufactured by Christian Hansen: Lactobacillus delbrueckii subsp. And Streptococcus thermophilus mixed). (Production method) 450 g of milk was placed in a sterilized glass container, and lactic acid bacteria starter YF-L812 and neutral protease were added simultaneously. The starter addition concentration was 0.1 mg / g based on the raw material milk, and the neutral protease addition concentration was 1.0 (PU / g). The milk to which the starter and neutral protease had been added was stirred for about 10 to 15 minutes at 43 ° C. in a constant temperature water bath.
  • Production Example 2 was conducted in the same manner as in Production Example 1, except that the lactic acid bacteria starter was FD-DVS YC-380 Yo-Flex (manufactured by Christian Hansen: Lactobacillus delbrueckii subsp. And Streptococcus thermophilus). Got yogurt.
  • the lactic acid bacteria starter was FD-DVS YC-380 Yo-Flex (manufactured by Christian Hansen: Lactobacillus delbrueckii subsp. And Streptococcus thermophilus). Got yogurt.
  • ⁇ Production Example 3 Production example as in Production Example 1 except that the milk was low-fat milk (UHT pasteurized milk: Meiji delicious low-fat milk, 1.2% by weight milk fat, 11 ⁇ 1.0% by weight milk solids) Three yogurts were obtained.
  • UHT pasteurized milk Meiji delicious low-fat milk, 1.2% by weight milk fat, 11 ⁇ 1.0% by weight milk solids
  • ⁇ Production Example 4 Manufactured in the same manner as in Production Example 1 except that the milk was non-fat milk (UHT pasteurized milk: Koiwai non-fat milk, milk fat content 0.1 mass%, milk solid content 8.8 ⁇ 0.2 mass%) The yogurt of Example 4 was obtained.
  • UHT pasteurized milk Koiwai non-fat milk, milk fat content 0.1 mass%, milk solid content 8.8 ⁇ 0.2 mass%
  • the press-fitting speed of the plunger was set to 1 mm / s, the sample thickness was set to 47 mm, the plunger shape was a round shape having a diameter of 16 mm, the measurement distortion was set to 40%, and the load cell standard was set to 2N.
  • the slope of the tangent line was determined as follows using Excel (registered trademark). An approximate straight line was drawn in the range of 14% distortion from the point where the waveform load was minimized, and the slope of the tangent line was obtained from the obtained approximate straight line. Details are shown in Table 1. Due to this viscosity, the mouthfeel has a sense of cohesion in the mouth, making it rich and smooth.
  • the curd hardness increased when neutral protease was added.
  • the hardness inside the card is uneven (solid-line uneven waveform).
  • the hardness unevenness inside the card is reduced (dotted waveform), and the texture becomes smooth.
  • Texture analysis Texture analysis was performed in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in FIG. When neutral protease was added, adhesion (area under zero load) was increased as compared to no enzyme addition (Production Example 8). Although not shown in the table, the inclination of the tangent line hardly changed, but as a result of sensory evaluation due to the increase in hardness and adhesion, the texture had a sense of being gathered in the mouth and became rich and smooth.
  • the hardness inside the card is uneven (thick solid line uneven waveform), but when neutral protease of 0.05 PU / g or more is added, the hardness inside the card is reduced and the texture is reduced. It is understood that becomes smooth.
  • BIO-RAD # 161-0313 was used as the molecular weight standard (lane M).
  • the gel after electrophoresis was subjected to protein staining with a CBB staining solution (APRO SP-4010) for 1 hour.
  • the result of electrophoresis is shown in FIG. Table 3 shows the results of band analysis by ImageJ.
  • band area A (100 to 40 kDa)
  • band area B (33 to 26 kDa)
  • band area C (26 to 23 kDa)
  • band area D (20 to 18 kDa)
  • Area E (16.5 to 15 kDa)
  • band area F (14 to 10 kDa) correspond to the bands A to F shown on the right side of FIG.
  • Example 7 (Change in protease activity with pH change)> A neutral protease pH stability test was performed. Neutral protease was diluted to about 1,000 PU / mL with 50 mM MES and 1 mM Ca acetate (pH 6.5). After dilution, pH was adjusted with 1N hydrochloric acid, and heated at 43 ° C. for 1 hour. Protease was measured, and the residual activity was determined when the unheated sample without pH adjustment was taken as 100%. Protease activity was measured as follows. Azocasein (SIGMA A2765) was dissolved in 5% in 50 mM MES and 1 mM Ca acetate (pH 6.5) to prepare a substrate.
  • SIGMA A2765 Azocasein
  • ⁇ Test Example 8 (Combination of neutral protease and lactase solution)> Regarding the combined use of a neutral protease and a lactase solution, changes in food texture and the effect of lactase on the rate of lactose degradation were examined.
  • yogurt was produced at a starter addition concentration of 0.1 mg / g and a neutral protease addition concentration of 1 PU / g. Similar to the above-described breaking strength analysis, softness and unevenness inside the card (smoothness) were examined. The results are shown in panel A of FIG. The milk added with the starter and neutral protease was stirred at 43 ° C.
  • the neutral protease is a protease
  • lactase when added simultaneously with lactase, the effect of lactase is not canceled and lactose intolerance preventing effect and sweetness improving effect by lactose decomposition can be expected.
  • lactase since lactase does not negate the effect of neutral protease, it can be said that smooth fermented milk can be produced.

Abstract

原料乳と、乳酸菌と、を混合し、混合液を得る第１工程と、前記混合液を発酵させる第２工程と、を順次行う発酵乳の製造方法であって、第２工程が終了する前に、原料乳及び／又は混合液にペニバチルス属由来のプロテアーゼを添加する工程（プロテアーゼ添加工程）を行うことを特徴とする発酵乳製品の製造方法が提供される。この製造方法によれば、発酵乳製品本来の滑らかさを維持した上で、発酵乳製品の硬度を所望の値に調節することができる。

Description

発酵乳製品及びその製造方法
　本出願は２０１５年１２月１６日に出願した日本出願特願２０１５－２４４８５５号に基づく優先権を主張し、その内容の全ては参照により本願に組み込まれるものとする。本発明は、発酵乳製品及びその製造方法に関する。
　発酵乳には、大きく二つのタイプがある。一つは前発酵タイプであり、大型の製造タンク内で原料乳を発酵させ、得られた発酵乳を破砕した後、個食容器に充填したものである。もう一つは後発酵タイプであり、個食容器に原料乳及び乳酸菌等を充填した後、発酵させたものである。いずれのタイプにおいても、個食容器に充填・発酵された発酵乳は流通経路に乗せて、最終消費者に届けられる。
　従来、流通経路において、個食容器内の発酵乳が崩れてしまう問題や、果肉物を添加した発酵乳の場合、個食容器の底部に果肉物が沈降してしまう問題が生じていた。この問題を防ぐ方法として、発酵乳に寒天、ゼラチン等のゲル化剤を添加し、発酵乳の硬度を増大させる方法が挙げられる。しかしながら、ゲル化剤を添加すると発酵乳が崩れにくくなる一方、発酵乳本来の滑らかな食感が失われる問題があった。
　上記の問題を解決するために発酵乳を製造する際に、酵素を添加する方法が提案されている（例えば、特許文献１、２）。特許文献１にはパーオキシダーゼを使用する方法、特許文献２にはトランスグルタミナーゼを使用する方法が開示されている。
特許第３１４５８２９号 特許第３１８２９５４号
　特許文献１には、パーオキシダーゼを添加して発酵乳を製造すると、滑らかさや保水性の向上が図られると共に、硬度が低下することが記載されている。
　特許文献２には、トランスグルタミナーゼを添加して発酵乳を製造すると、トランスグルタミナーゼの酵素作用により乳タンパク質間及び乳タンパク質内（分子間及び分子内）のネットワークが形成（ゲル化）されることが記載されている。特許文献２には、得られた発酵乳の硬度について記載はないが、上記のトランスグルタミナーゼの作用機序からすると、発酵乳の硬度が増大することが推測される。
　特許文献１又は２の発明によって、発酵乳の硬度を低下又は増大させることが期待される。しかしながら、いずれの酵素も発酵乳の硬度を低下させるだけであるか、又は増大させるだけであるにすぎない。従来の技術では、１つの酵素によって、発酵乳本来の滑らかさを維持した上で、発酵乳の硬度を所望の値に調節することは困難であった。
　そこで、本発明は、発酵乳製品本来の滑らかさを維持した上で、発酵乳製品の硬度を所望の値に調節することができる発酵乳製品の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、特定のプロテアーゼを乳に添加して発酵することにより、発酵乳製品のカードの硬度を調節することができ、またその内部がより均一でなめらかとなることを見出し、本発明を完成した。
　従って、本発明によれば、
〔１〕　原料乳と、乳酸菌と、を混合し、混合液を得る第１工程と、
　前記混合液を発酵させる第２工程と、
　を順次行う発酵乳製品の製造方法であって、
　上記第２工程が終了する前に、前記原料乳及び／又は前記混合液にペニバチルス属由来のプロテアーゼを添加する工程（プロテアーゼ添加工程）を行うことを特徴とする発酵乳製品の製造方法；
〔２〕　前記原料乳に含まれる乳脂肪分（質量％）と、前記プロテアーゼの添加量（ＰＵ／ｇ）との比（前記乳脂肪分：前記プロテアーゼの添加量）が、５０：１～１：１０である、前記［１］記載の発酵乳製品の製造方法；
［３］　前記プロテアーゼの添加量が、前記原料乳の全質量を基準として０．０５～１０．０ＰＵ／ｇである、前記［１］又は［２］記載の発酵乳製品の製造方法；
［４］　前記原料乳に含まれる乳脂肪分が０～１０質量％である、前記［１］記載の発酵乳製品の製造方法；
［５］　前記原料乳に含まれる無脂乳固形分が３．０～２０質量％である、前記［１］～［４］記載の発酵乳製品の製造方法；
［６］　前記プロテアーゼが、下記の（１）～（５）の性質を有することを特徴とする［１］～［５］のいずれか記載の発酵乳製品の製造方法。
　（１）ペニバチルス属に属する細菌により産生され、
　（２）中性範囲でκ－カゼイン及びヘモグロビンを分解し、
　（３）ｐＨ５．５～９．０で安定であり、至適ｐＨが７．０～８．０であり、
　（４）２０～７５℃で作用し、至適温度が５０～６０℃であり、
　（５）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が３２，０００～３４，０００Ｄａと推定されるプロテアーゼ；
［７］　更にラクターゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、イヌリナーゼ、ラッカーゼ、パーオキシダーゼ、及び、前記プロテアーゼ以外のプロテアーゼから選択される１種又は複数種を上記原料乳及び／又は上記混合液に添加する工程を含む、前記［１］～［６］のいずれか記載の発酵乳製品の製造方法；
［８］　ペニバチルス属由来のプロテアーゼを含有する発酵乳製品であって、
　クリープメータを用いて測定した場合のカードの破断点が、０．００２～１．０Ｎであることを特徴とする発酵乳製品；
［９］　発酵乳製品の製造方法であって、
　原料乳と、乳酸菌と、を混合し、混合液を得る第１工程と、
　上記混合液を発酵させる第２工程と、
　上記第２工程が終了する前に、上記原料乳及び／又は上記混合液にペニバチルス属由来のプロテアーゼを添加する工程（プロテアーゼ添加工程）と
を含み、
　所望の前記発酵乳製品のカード硬さと、原料乳に含まれる乳脂肪分と、ペニバチルス属由来プロテーゼの添加量と、を指標として、当該乳脂肪分と当該プロテアーゼの添加量を決定し、発酵工程を行うことを特徴とする発酵乳製品の製造方法
が提供される。
　本発明により、発酵乳製品の本来のなめらかさを維持した上で、発酵乳製品の硬度を所望の値に調節することができる発酵乳製品及びその製造方法を提供することが可能となる。
図１は、パネルＡが製造例１及び製造例５のヨーグルト、パネルＢが製造例２及び製造例６のヨーグルトについて、クリープメータによる破断強度解析の結果を示す図である。 図２は、パネルＡが製造例１及び製造例５のヨーグルト、パネルＢが製造例２及び製造例６のヨーグルトについて、クリープメータによるテクスチャ解析の結果を示す図である。 図３は、製造例３及び製造例７のヨーグルトについてクリープメータによる破断強度解析の結果を示す図である。 図４は、製造例３及び製造例７のヨーグルトについてクリープメータによるテクスチャ解析の結果を示す図である。 図５は、製造例４及び製造例８のヨーグルトについてクリープメータによる破断強度解析の結果を示す図である。 図６は、製造例４及び製造例８のヨーグルトについてクリープメータによるテクスチャ解析の結果を示す図である。 図７は、酵素添加量を変化させた場合のクリープメータによる破断強度解析の結果を示す図である。 図８は、本発明のプロテアーゼによる発酵反応における発酵時間に対するＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動の経時変化を示す図である。 図９は、本発明に好適なプロテアーゼのｐＨ依存性の結果を示す図である。 図１０は、本発明に好適なプロテアーゼとラクターゼを併用した場合のクリープメータによる破断強度解析の結果及び乳糖分解率を示す図である。
　本発明に係る発酵乳製品の製造方法は、ペニバチルス属由来のプロテアーゼ、乳酸菌スターター及び原料乳を必須的に用い、安定剤等の添加剤を任意で用いる。以下、（１）発酵乳製品の原材料、及びその（２）添加量、（３）発酵乳製品の性質、（４）発酵乳製品の製造方法、（５）用途、の順で説明する。
≪発酵乳製品の原材料≫
＜中性プロテアーゼ＞
　本発明において好適に使用することができるプロテアーゼは、以下の性質を有する。
（１）ペニバチルス属に属する細菌により産生され、
（２）中性範囲でκ－カゼイン、ヘモグロビンを分解し、
（３）至適ｐＨは７．０～８．０であり、
（４）ｐＨ５．５～９．０で安定である中性プロテアーゼであり、
（５）２０～７５℃で作用し、至適温度が５５℃であり、
（６）電気泳動法による分子量が３２，０００～３４，０００Ｄａと推定される。
　ペニバチルス属は旧来バチルス属に分類されていたが、近年再分類され、新たな属として提案された。上記の性質を有するプロテアーゼは、バチルス・ポリミキサから再同定されたペニバチルス・ポリミキサ或いはペニバチルス・エスピーを含む別の種から得ることができる。文献等によっては、バチルス・ポリミキサと表示されている場合があるが、同義である。
　本発明において使用することができるプロテアーゼは、詳細には、次の性質を有する。
（ａ）作用
　中性プロテアーゼとしての一般的性質を示し、ｐＨの中性範囲でカゼイン、ヘモグロビンなどの蛋白質を分解してペプチド乃至遊離のアミノ酸を生成する。
　酸化インシュリンのＢ鎖に対してはＰｈａ（１）－Ｖａｌ（２）、Ｈｉｓ（５）－Ｌｅｕ（６）、Ｈｉｓ（１０）－Ｌｅｕ（１１）、Ｇｌｕ（１３）－Ａｌａ（１４）、Ａｌａ（１４）－Ｌｅｒ（１５）、Ｌｅｒ（１５）－Ｔｙｒ（１６）、Ｔｙｒ（１６）－Ｌｅｕ（１７）、Ｌｅｕ（１７）－Ｖａｌ（１８）、Ｇｌｙ（２３）－Ｐｈｅ（２４）、Ｐｈｅ（２４）－Ｐｈｅ（２５）、Ｐｈｅ（２５）－Ｔｙｒ（２６）及びＬｙｓ（２９）－Ａｌａ（３０）の１２ヶ所のペプチド結合を切断することが確認されている。
（ｂ）基質特異性
　κ－カゼインに対し、ｐＨの中性範囲において温和な蛋白分解作用を示す。α－カゼイン及びβ－カゼインに対しては、ｐＨの中性範囲においても蛋白分解作用をほとんど示さない。
（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
　イ　至適ｐＨ：κ－カゼインに対する蛋白分解作用の至適ｐＨは、７．０～８．０である。
　ロ　安定のｐＨ範囲：５．５～９．０の範囲で極めて安定である。
（ｄ）作用適温の範囲
　２０℃～７５℃の範囲で作用し、至適温度は５０～６０℃である。最適温度は５５℃である。
（ｅ）ｐＨ、温度などによる失活の条件
　ｐＨ３．０以下及びｐＨ１０．０以上では、活性は完全になくなる。また、６５℃、１０分間の加熱処理により、完全に失活する。
（ｆ）阻害、活性化及び安定化
　エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、クエン酸、０－フェナンスロリン、２，２－ジピリジル、フッ化ソーダのごとき、金属キレート剤、及びＮ－ブロモサクシニイミド（ＮＢＳ）、沃素のごとき酸化剤によって阻害される。
　カルシウムイオンにより安定化され、活性には亜鉛イオンが必要である。
（ｇ）分子量
　電気泳動法による分子量は、３２，０００～３４，０００Ｄａと推定される。
　プロテアーゼは、その触媒部位により、以下の５種類に分類される。酸性プロテアーゼ（触媒部位；アスパラギン酸、例；ペプシン）、金属プロテアーゼ（触媒部位；金属）、セリンプロテアーゼ（触媒部位；セリン、例；トリプシン）、システインプロテアーゼ（触媒部位；システインのようなＳＨ基をもつアミノ酸、例えば、パパイン）、及び、これらのうち少なくとも２つを混合した混合型（例えば、アクチナーゼＡＳ）である。本発明で使用するペニバチルス属由来のプロテアーゼは、中性金属プロテアーゼに分類される。後述するように、中性プロテアーゼの場合、発酵によって乳のｐＨが低下することで失活するため、本発明を使用した乳製品中においてプロテアーゼは失活している状態となる。
　本発明のプロテアーゼはエンド型の中性金属プロテアーゼである。エンド型のプロテアーゼは、タンパク質を大まかに分解し、低分子化する作用を有する。乳タンパク質にプロテアーゼを作用させると、多くの場合において、苦味を呈する。しかし、上記の本発明に係るプロテアーゼを乳タンパク質に作用させても苦味は生じず、味や匂いに対して影響しない。
　牛乳カゼインの一成分であるκ－カゼイン（カッパーカゼイン）は、カゼインミセル形成のうえで重要な役割を果たしている。上記のプロテアーゼは、特にこのκ－カゼインを特異的に分解し、他のカゼインタンパクには構造上の大きな変化を与えることなく、得られた発酵乳製品の食感（なめらかさ）を改善することができる。
（原料生物の種類）
　プロテアーゼは、微生物を含む、非常に広範囲の生物から単離されている。好ましいプロテアーゼは、価格や反応性の面から微生物由来プロテアーゼである。例えば、このようなプロテアーゼとしては、バチルス(Bacillus)属又はペニバチルス属（paenibacillus）、ジオバチルス属（Geobacillus）、アスペルギルス(Aspergillus)属、リゾプス属（Rhizopus）、リゾムコール属（Rhizomucor）ストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する微生物由来のプロテアーゼ、乳酸菌由来のプロテアーゼなどが挙げられる。本発明の酵素として使用できるプロテアーゼは、ペニバチルス属（paenibacillus）由来のプロテアーゼであり、具体的には、好ましいプロテアーゼは、Paenibacillus polymyxa、Paenibacillus macerans、Paenibacillus pabuli、Paenibacillus peoriae、Paenibacillus thiaminolyticus、Paenibacillus validus、Paenibacillus glucanolyticus、Paenibacillus kobensis、Paenibacillus lautus、Paenibacillus alginolyticus、Paenibacillus alvei、Paenibacillus amylolyticus、Paenibacillus chitinolyticus、Paenibacillus chondroitinus、Paenibacillus curdlanolyticus、Paenibacillus durus、Paenibacillus ehimensis、Paenibacillus sp.からなる群から選択される微生物（細菌）に由来するプロテアーゼである。
　酵素は、精製酵素、半精製酵素、粗製酵素、破砕菌体（好ましくは凍結乾燥品）などのいずれの形態でもよく、κ－カゼインの分解作用を有していればよいが、κ－カゼインを分解する多くのプロテアーゼは苦味や異味を生じやすいという理由から、ペニバチルス(Paenibacillus)属、特にPaenibacillus polymyxa、又は、１６Ｓ ｒＤＮＡの相同性がPaenibacillus polymyxaの配列と比較して９８％以上であるPaenibacillus属に属する微生物（細菌）、に由来する前述の性質を有する金属プロテアーゼであることが好ましい。これらの属に由来する金属プロテアーゼは、乳に添加した場合であっても、乳に含まれるκ－カゼインを分解する作用を有し、かつ、処理乳に苦味や異味が生じない。
　本発明に好適な金属プロテアーゼは、発酵乳製品の一般的な醗酵温度である４３℃において、アゾカゼインを基質としてｐＨ４．５で、１時間反応させた場合の残存活性が１０％以下である。当該性質により、醗酵調製物に当該プロテアーゼ活性が残存せず、保存時に、当該プロテアーゼが醗酵調製物に悪影響を与えないことが可能となる。
（金属プロテアーゼの製法）
　本発明に使用される金属プロテアーゼは、従来の一般的な方法で微生物から回収され、精製されたものであることができる。従って、当該プロテアーゼの生産は、遺伝子組換え又は非遺伝子組換えによって実施することができる。例えばPaenibacillus polymyxa　ＮＢＲＣ １５３０９株をＤｉｆｃｏ社製ニュートリエント培地等で培養し、培養物からろ過又は遠心した培養上清として得ることができる。また、得られた培養上清液をカラムクロマトグラフィーや硫安分画などによって適宜精製して用いることもできる。得られた酵素液の形状は液状の他、スプレードライや凍結乾燥により粉末状にしても良い。その際には日常的に用いられる安定剤や賦形剤を添加しても良い。
（金属プロテアーゼの添加量）
　金属プロテアーゼは、原料乳の全質量を基準として、０．０５～１０．０ＰＵ／ｇの範囲で添加することが好適である。より好適には０．２５～５．０ＰＵ／ｇの範囲で添加することができる。本範囲内であれば、発酵乳製品のカード内部の硬さのムラが減少し、食感がなめらかになるからである。また、その添加量を変化させることにより、カード内部の硬さを変化させ、調節することが可能となる。例えば、比較的乳脂肪分の高い原料乳（例えば、１．５％超５．０％以下）に対し、４．０ＰＵ／ｇのプロテアーゼを添加しても、カードの形状を保つことができるため、後発酵タイプの発酵乳製品に好適に使用でき、更に、０．２５ＰＵ／ｇ以上添加することにより、カードにより十分な柔らかさを付与できる。他方、低脂肪乳や無脂肪乳（例えば、１．５％以下）に対しては、本発明のプロテアーゼを添加することで、カードの適度な硬さを付与することが可能となる。即ち、所望のカード硬さの発酵乳製品を得るためには、原料乳に含まれる乳脂肪分と、ペニバチルス属由来プロテーゼの添加量と、を指標として、当該乳脂肪分と当該プロテアーゼの添加量を決定し｛例えば、ある乳脂肪分の原料乳に対し、事前にプロテアーゼの添加量を振って検討し、当該添加量を決定する（検量線等を作成して決定する）｝等として、発酵工程を行えばよい。
　上記の金属プロテアーゼの添加量（酵素量）は、以下の方法により定義される酵素量１．０ＰＵに基づいて酵素質量当たりの酵素活性として算出することができる。０．６％カゼイン水溶液（ｐＨ７．５、２ｍＭ酢酸カルシウム含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液）に酵素希釈液１ｍＬを添加し、３０℃で１０分間反応後、トリクロロ酢酸試薬（ｐＨ４．０、１．８％無水酢酸ナトリウム、１．８％トリクロロ酢酸、１．９８％酢酸）５ｍＬを加えて反応を停止し、更に３０℃で３０分静置し、濾過後、２７５ｎｍの吸光度を測定する。この条件下で１分間に１μｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量（酵素活性）を１ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）と定義する。
＜乳酸菌スターター＞
　本発明の乳製品は、その製造方法において乳酸菌スターターを用いる。本発明において、使用する乳酸菌としては、特に限定はされないが、例えば、Lactobacillus.delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus，Lactobacillus casei，Lactobacillus paracaseiなど従来使用されている乳酸菌が使用できる。これら乳酸菌スターターの入手方法としては、一般に流通している市販品を購入することができるし、独自に分離した菌株を使用することもできる。尚、同一種の乳酸菌を複数組み合わせて使用しても、或いは、異なる種の乳酸菌を複数組み合わせて使用してもよい。また、スターターと同時にビフィズス菌などのプロバイオティクス菌を同時に添加して使用してもよい。
（乳酸菌スターターの添加量）
　乳酸菌スターターの添加量としては、特に限定はされない。一般的な量を添加することができる。例えば、クリスチャン・ハンセン社凍結乾燥スターターを使用する場合、原料乳を基準として、０．１～０．５ｍｇ／ｇであるが、乳酸菌の生育が可能な添加量であれば、添加量は特に限定されない。
＜原料乳＞
　原料乳としては、特に限定されないが、生乳、原乳、全脂乳、脱脂乳、ホエイ、バターなどの乳成分を含む液体及び粉末の溶解液であり、これらを組み合わせて使用することができる。
　原料乳に含まれる乳脂肪分は、０～１０質量％であることが好ましい。より好ましくは、０．１～５．０質量％であり、更に好ましくは、１．０～５．０質量％である。中性プロテアーゼの存在下において、乳脂肪分が低くなるほど、発酵乳製品の硬度が増大する傾向にある。中性プロテアーゼの存在下において、乳脂肪分が高くなるほど、発酵乳製品の硬度を低下させることができる。原料乳に含まれる乳脂肪分は、乳の種類によって異なるが、バター等を添加することによって乳脂肪分を調節することが可能である。
　原料乳に含まれる無脂乳固形分は、３．０～２０質量％であることが好ましい。
　下限値未満でも上限値超でも、発酵乳製品の滑らかさが不足するおそれがある。下限値未満では発酵乳製品が固まり難く、上限値超では発酵乳製品が固まりすぎてしまう可能性がある。また、本発明の乳製品は、固形物（例えば、チーズ）及びゲル状の物（例えば、ヨーグルト）に限定されず、液体状及びゾル状の物（例えば、ドリンクタイプのヨーグルト）も含まれるが、その場合、上記無脂乳固形分は、下限値（３．０％）未満であってもよい。無脂乳固形分には、カゼインを主成分とするタンパク質、乳糖を主成分とする糖、各種無機塩を主成分とする塩類等が含まれる。
　原料乳に含まれる乳脂肪分（質量％）とペニバチルス属由来のプロテアーゼの添加量（ＰＵ／ｇ）との比（前記乳脂肪分：前記プロテアーゼの添加量）が、５０：１～１：１０であることが好ましい｛即ち、乳脂肪分（質量％）をａとし、プロテアーゼの添加量（ＰＵ／ｇ）をｂとした場合、ａ／ｂ（質量％・ｇ／ＰＵ）が５０～０．１となる｝。また、当該比の値とプロテアーゼの添加量による硬度変化は、当該比が相対的に高い程、無添加の発酵乳製品と比較して、当該プロテアーゼの添加により、発酵乳製品の硬度が下がる（柔らかくなる）傾向にある。他方、当該比が相対的に低い程、無添加の発酵乳製品と比較して、当該プロテアーゼの添加により、発酵乳製品の硬度が上がる（硬くなる）傾向を示す。
＜任意成分＞
　本発明の乳製品の製造方法には、必要に応じ、各種成分を添加することができる。具体例としては、乳製品の安定化に寄与する金属塩類、各種糖類、アスコルビン酸、グリセリン等、使い勝手をよくするための賦形剤である澱粉、デキストリン、緩衝作用を有する無機塩類、乳由来成分である乳糖、乳清、乳タンパク類、ゲル化剤である寒天、ゼラチン、ペクチン等を挙げることができる。
（ラクターゼ）
　本発明の乳製品の製造方法においては、ラクターゼ溶液等のラクターゼ製品を添加することもできる。このラクターゼ溶液等は、特に限定されず、市販の製品を用いることができる。
（他酵素）
　本発明の乳製品の製造方法においては、液状、粉末状等の各種酵素製品を添加することもできる。この酵素製品は特に限定されないが、例えば、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、イヌリナーゼ、第２のプロテアーゼから選択される１種又は複数種であり、市販の製品を用いることができる。
　第２のプロテアーゼとしては、バチルス(Bacillus)属、ジオバチルス属（Geobacillus）、アスペルギルス(Aspergillus)属、リゾプス属（Rhizopus）、リゾムコール属（Rhizomucor）ストレプトマイセス属（Streptomyces）に属する微生物由来のプロテアーゼ、乳酸菌由来のプロテアーゼなどを使用できる。具体的には、好ましいプロテアーゼは、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus sp.、Geoacillus caldoproteolyticus、Aspergillus sp.、Aspergillus oryzae、Aspergillus melleus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus bulgaricus及びStreptococcus thermophilusからなる群から選択される微生物に由来するプロテアーゼである。
≪乳製品の性質≫
＜食感の評価＞
　本発明の発酵乳製品の有する食感（なめらかさ、粘性）、硬度の評価（破断強度解析）については、株式会社山電社製、クリープメータ（ＲＥ２－３３００５Ｃ）を使用した物性値に基づいて行うことができる。
（なめらかさ）
　食感における「なめらかさ」については、クリープメータによる波形の直線性に基づき、評価をすることができる。より波形に乱れがない（直線に近い）ことにより、食感として、よりなめらかであるといえる。
（粘性）
　粘性（糸引き性：テクスチャ解析）については目視及び後述するプランジャー上昇時の接線の傾きで評価できる。接線の傾きがより小さくなれば、発酵乳製品がより粘性を有し、より濃厚感を有し、発酵乳製品に口中でよりまとまる感覚を付与できると考えられる。
（硬度）
　本発明の発酵乳製品のカードの硬度としては、後述する破断強度解析により、評価することができる。具体的な物性値として、カードをくずさずクリープメータによりプランジャーを押し下げた場合に、カードが崩れる時点の荷重（Ｎ）を「破断点」（クリープメータにより自動計算される値）として、その硬度を評価することが可能である。本発明の発酵乳製品の硬度としては、所望の硬さに調節可能であり、特に限定されないが、例えば、好ましい硬度（破断点）として、０．００２～１．０Ｎであり、より好ましくは、０．００５～０．５Ｎである。
（発酵によるタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの変化）
　本発明の金属プロテアーゼを含む原料乳を発酵させた場合に、その前後においてκ－カゼイン以外の乳タンパクの変化が最小限であることが好適である。味や風味等を変化させることなく食感を改善させることが可能となるからである。このことは、発酵前後の発酵物をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、その表れる各バンドの変化によって確認できる。
　ここで、各バンドの画分の割合は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した泳動後のゲルを乾燥後、ＥＰＳＯＮ社製スキャナＧＴ‐Ｘ８２０でグレースケールの画像として取り込み、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）により、各バンドの濃度（タンパク量）を測定することで算出することができる。
　本発明では、本発明に係る金属プロテアーゼを原料乳に添加後、２０～６０℃において、５時間発酵後の、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動による約２５ｋＤａ以外のバンドの画分が、発酵前と比較して、大きく変動しないことが好ましい。このような特性により、発酵乳製品のカード硬さやなめらかさ等を調整しながら、その他の本来の風味等を酵素処理により損なうことを防ぐことができると推定される。尚、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動による各バンドの分子量は公知の方法により算出することができ、各バンドエリアの分子量範囲についても、同様に公知の方法により算出することができる。
≪乳製品の製造方法≫
　本発明の乳製品の製造方法は、原料乳と、乳酸菌と、を混合し、混合液を得る第１工程と、混合液を発酵させる第２工程と、を順次行い、第２工程が終了する前に、前記原料乳及び／又は前記混合液にペニバチルス属由来のプロテアーゼを添加する工程（プロテアーゼ添加工程）を含むものであればよく、具体的な製造方法は特に限定されない。例えば、乳製品が発酵乳である場合には、その製造方法は（１）牛乳に乳酸菌スターターと金属プロテアーゼを所定の濃度で同時に添加する、（２）４３℃で１０～１５分間程度撹拌する、（３）得られた混合液をガラス容器に分注し、４３℃で５時間発酵させる、（４）得られた発酵調整物は１日以上４～５℃で冷蔵保存する、等の工程を含むものである。
≪乳製品の用途≫
　前発酵タイプはドリンクタイプやフルーツヨーグルト等に用いることができる。後発酵タイプはプレーンヨーグルト等に用いることができる。また、ラクターゼの活性に影響を与えないため、ラクターゼを添加した乳製品とすることも可能である。
　以下、実施例及び比較例によって、本発明を説明するが、本発明は実施例、比較例に限定されるものではない。
≪発酵乳製品の製造≫
＜製造例１＞
（材料）
牛乳：明治おいしい牛乳（乳脂肪分３．８±０．３質量％、無脂乳固形分８．６±０．３質量％）
中性プロテアーゼ：Paenibacillus  polymyxa　ＮＢＲＣ １５３０９株をＤｉｆｃｏ社製ニュートリエント液体培地に植菌し、３０℃で２日間培養した培養液を１００００ｇで１０分間遠心した上清を透析によって脱塩して用いた。尚、当該プロテアーゼは、前述の（ａ）～（ｇ）の性質を有するものであった。
乳酸菌スターター：乳酸菌粉末ＦＤ－ＤＶＳ　ＹＦ－Ｌ８１２　Ｙｏ－Ｆｌｅｘ（クリスチャン・ハンセン社製：Lactobacillus．delbrueckii subsp．及びStreptococcus．thermophilusの混合である）。
（製造方法）
　牛乳４５０ｇを滅菌済みガラス容器に入れ、乳酸菌スターターＹＦ－Ｌ８１２と中性プロテアーゼを同時に添加した。スターター添加濃度は原料乳を基準として０．１ｍｇ／ｇ、中性プロテアーゼ添加濃度は１．０（ＰＵ／ｇ）とした。スターター、中性プロテアーゼを添加した牛乳は、恒温水槽中において４３℃で１０～１５分程度撹拌した。続いて、ガラス容器（ダイソー社製、２２０ｍｌ）に分注し、４３℃で５時間醗酵した。醗酵調製物は１日以上冷蔵保存（４～５℃）し、製造例１のヨーグルトを得た。
＜製造例２＞
　乳酸菌スターターをＦＤ－ＤＶＳ　ＹＣ－３８０　Ｙｏ－Ｆｌｅｘ（クリスチャン・ハンセン社製：Lactobacillus．delbrueckii subsp．及びStreptococcus．thermophilusの混合である。）とした以外は、製造例１と同様にして、製造例２のヨーグルトを得た。
＜製造例３＞
　牛乳を低脂肪牛乳（ＵＨＴ殺菌牛乳：明治おいしい低脂肪乳　乳脂肪分１．２質量％、乳固形分１１±１．０質量％）とした以外は、製造例１と同様にして、製造例３のヨーグルトを得た。
＜製造例４＞
　牛乳を無脂肪乳（ＵＨＴ殺菌牛乳：小岩井無脂肪牛乳　乳脂肪分０．１質量％、乳固形分８．８±０．２質量％）とした以外は、製造例１と同様にして、製造例４のヨーグルトを得た。
＜製造例５＞
　中性プロテアーゼを添加しなかった以外は、製造例１と同様にして、製造例５のヨーグルトを得た。
＜製造例６＞
　中性プロテアーゼを添加しなかった以外は、製造例２と同様にして、製造例６のヨーグルトを得た。
＜製造例７＞
　中性プロテアーゼを添加しなかった以外は、製造例３と同様にして、製造例７のヨーグルトを得た。
＜製造例８＞
　中性プロテアーゼを添加しなかった以外は、製造例４と同様にして、製造例８のヨーグルトを得た。
≪評価≫
＜試験例１（食感についての物性評価）＞
（破断強度解析）
　製造例１（実施例）及び製造例２（実施例）のヨーグルト並びに製造例５（比較例）及び製造例６（比較例）のヨーグルトについて、物性の測定を行った。物性の測定は、山電社製のクリープメータ（ＲＥ２－３３００５Ｃ）を使用して行った。破断強度解析は、カードを崩さずに行った。結果を図１に示す。破断強度解析においては、プランジャーの圧入速度を１ｍｍ／ｓ、サンプル厚さを４７ｍｍ、プランジャ形状を径１６ｍｍの丸型、測定歪率を４０％、ロードセルの規格を２Ｎに設定した。
　図１に示されるように、中性プロテアーゼを添加するとカードの硬さが減少する。酵素無添加の場合、カード内部の硬さにムラがある（実線の凸凹波形）ことが分かる。一方、中性プロテアーゼを添加するとカード内部の硬さのムラが減少し（点線の波形）、食感がなめらかになると解される。
（テクスチャ解析）
　テクスチャ解析は、スプーンで十分に撹拌してカードを崩し、専用カップに入れて測定した。テクスチャー解析においては、プランジャーの圧入速度を５ｍｍ／ｓ、サンプル厚さを１５ｍｍ、プランジャ形状を径１６ｍｍの丸型、測定歪率を６６．６６％、ロードセルの規格を２Ｎに設定した。この設定により、テクスチャー解析では、プランジャーをカード内に１０ｍｍ挿入し、続いてプランジャーを上昇させ、プランジャーへの荷重変化が測定された。結果を図２に示す。プランジャーの挿入により増加した荷重は、プランジャーの上昇に伴いマイナス値を示し、プランジャーがカードの界面から離れると、糸引き様となった。中性プロテアーゼを添加した場合、酵素無添加と比較して付着性（荷重ゼロ以下の面積）が減少しているが、糸引き様の粘性が増加した。糸引き様の粘性は、プランジャーが上昇する際に逆に引っ張られるために荷重の上昇がなだらかになり、波形に接線を引いた場合、酵素無添加の接線（接線１及び接線３、実線）と比較して中性プロテアーゼ添加の接線（接線２及び接線４、破線）の傾きが小さくなる。接線の傾きは、エクセル（登録商標）を使用して以下のように求めた。波形の荷重が最少となった点より歪率１４％の範囲で近似直線を引き、得られた近似直線より接線の傾きを求めた。詳細を表１に示す。この粘性のため食感は口中でまとまる感覚があり、濃厚かつなめらかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜試験例２（低脂肪乳における食感についての物性評価）＞
（破断強度解析）
　製造例３（実施例）、及び製造例７（比較例）のヨーグルトについて、試験例１と同様にして、破断強度解析を行った。結果を図３に示す。
　図３に示されるように、中性プロテアーゼを添加するとカードの硬さが増加した。酵素無添加（製造例７）の場合、カード内部の硬さにムラがある（実線の凸凹波形）ことが分かる。一方、中性プロテアーゼを添加するとカード内部の硬さのムラが減少し（点線の波形）、食感がなめらかになると解される。
（テクスチャ解析）
　テクスチャ解析を試験例１と同様に行った。結果を図４に示す。中性プロテアーゼを添加した場合、酵素無添加と比較して付着性（荷重ゼロ以下の面積）は増加し、表にはしていないが、接線の傾きは減少し、糸引き様の粘性が増加した。この粘性のため食感は口中でまとまる感覚があり、濃厚かつなめらかになった。
＜試験例３（無脂肪乳における食感についての物性評価）＞
（破断強度解析）
　製造例４（実施例）及び製造例８（比較例）のヨーグルトについて、試験例１と同様にして、破断強度解析を行った。結果を図５に示す。
　図５に示されるように、中性プロテアーゼを添加するとカードの硬さが増加した。酵素無添加（製造例８）の場合、カード内部の硬さにムラがある（実線の凸凹波形）ことが分かる。一方、中性プロテアーゼを添加するとカード内部の硬さのムラが減少し（点線の波形）、食感がなめらかになると解される。
（テクスチャ解析）
　テクスチャ解析を試験例１と同様に行った。結果を図６に示す。中性プロテアーゼを添加した場合、酵素無添加（製造例８）と比較して付着性（荷重ゼロ以下の面積）が増加した。表にはしていないが、接線の傾きは殆ど変化がなかったが、硬さと付着性の増加により、官能評価の結果、食感は口中でまとまる感覚があり、濃厚かつなめらかになった。
＜試験例４（濃度依存性）＞
　テクスチャ改変効果が見られる本発明の中性金属プロテアーゼの添加濃度を製造例１の発酵乳について添加濃度を変えて（０．０５、０．１０、０．２５、１．０、２．０及び４．０ＰＵ／ｇ）検討した。破断強度解析は、カードを崩さずに行った。結果を図７に示す。０．２５ＰＵ／ｇ以上の中性プロテアーゼを添加するとカードの硬さが減少する。４．０ＰＵ／ｇの中性プロテアーゼを添加してもカードの形状を保っており、後醗酵タイプの醗酵乳に使用可能であると考えられた。酵素無添加の場合、カード内部の硬さにムラがある（太実線の凸凹波形）が、０．０５ＰＵ／ｇ以上の中性プロテアーゼを添加するとカード内部の硬さのムラが減少し、食感がなめらかになると解される。
＜試験例５（食感についての官能試験）＞
　被験者１０人について、中性プロテアーゼを添加したヨーグルト（製造例１）と無添加のヨーグルト（製造例５）について、以下の評価基準に基づいて、次の４つの基準において官能試験を行った。その結果を表２に示す。
（評価基準）
　評価基準としては、ヨーグルトの食感を、なめらかさ、口当たり、風味、濃厚感の４つの評価項目に分け、４段階の評価（とても良い＝３点、良い＝２点、普通＝１点、悪い＝０点）とし、平均点（○＝２～３点、△＝１～２点、×＝０～１点）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜試験例６（発酵前後のＳＤＳ‐ＰＡＧＥにおけるバンドの変化）＞
（発酵方法）
　製造例１と同様に中性プロテアーゼの添加濃度を１．０ＰＵ／ｇとして４３℃で１０～１５分程度撹拌した後に、１５ｍＬ容遠沈管に分注し、４３℃で５時間発酵した。発酵前、発酵１、２、３、４及び５時間後の発酵液について、発酵過程のタンパク質変化を下記の方法に従い、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。
（ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
　上記得られた発酵溶液を超純水で２０倍に希釈し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．０１２５％ ブロモチモールブルー、２０％ グリセリン、２．５％ ＳＤＳ、２．５％ ２-メルカプトエタノール）と１：１に混合し、９５℃、５分間の加熱処理により泳動用サンプルを調製した。１２．５％アクリルアミドゲル（４％スタッキングゲル、ゲル厚１ｍｍ、泳動距離５０ｍｍ）に分子量スタンダード及び泳動用サンプルを供し、マリソル産業泳動漕にて、スタッキング１０ｍＡ定電流、セパレーティング２０ｍＡにて泳動前線がゲル下端付近に達するまで泳動した。分子量スタンダード（レーンＭ）にはＢＩＯ－ＲＡＤ＃１６１－０３１３（プレステインド）を使用した。泳動後のゲルは、ＣＢＢ染色液（ＡＰＲＯ　ＳＰ－４０１０）によるタンパク染色を１時間行った。泳動結果を図８に示す。また、ＩｍａｇｅＪによるバンドの解析結果を表３に示す。
　尚、表３に示すＩｍａｇｅＪによるバンドの解析結果におけるバンドエリアＡ（１００～４０ｋＤａ）、バンドエリアＢ（３３～２６ｋＤａ）、バンドエリアＣ（２６～２３ｋＤａ）、バンドエリアＤ（２０～１８ｋＤａ）、バンドエリアＥ（１６．５～１５ｋＤａ）、バンドエリアＦ（１４～１０ｋＤａ）は、泳動結果を示した図８右に示したＡ～Ｆのバンドに対応している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　発酵開始１時間目より、κ－カゼインのバンド｛約２５ｋＤａ（バンドエリアＣ）｝が特異的に消失し、バンドエリアＤ及びＦのバンドが増加した。醗酵開始２時間目以降、各バンドエリアの濃度に大きな変化はみられず、その他の乳由来タンパクの濃度は、発酵５時間後においても大きな変化が見られなかった。従って、本発明の製造方法によれば、食感以外には、乳の性質を大きく変化させることなく、その食感を改善させることができることが推認される。
＜試験例７（ｐＨ変化に伴うプロテアーゼ活性の変化）＞
　中性プロテアーゼのｐＨ安定性試験を行った。中性プロテアーゼを５０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ 酢酸Ｃａ含有（ｐＨ６．５）で約１，０００ ＰＵ／ｍＬに希釈し、希釈後に１Ｎ塩酸でｐＨ調製を行い、４３℃、１時間加温した。プロテアーゼを測定し、ｐＨ未調整未加熱のサンプルを１００％とした時の残存活性を求めた。プロテアーゼ活性は以下のように測定した。５０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ 酢酸Ｃａ含有（ｐＨ６．５）にAzocasein（ＳＩＧＭＡ　Ａ２７６５）を５％に溶解し、基質とした。１００ μＬの５％ Azocaseinに３００ μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ 酢酸Ｃａ含有（ｐＨ６．５）及び１００ μＬの希釈酵素液を添加し、４３℃、３０分反応した後に、５００ μＬの１０％ トリクロロ酢酸により反応を停止した。遠心上清に等量の１Ｎ ＮａＯＨを添加して混合し、ＯＤ４２８ｎｍの吸光度を測定した。結果を図９に示した。発酵乳の一般的な醗酵温度である４３℃において、中性プロテアーゼはｐＨ４．５、１時間で失活した。従って、醗酵調製物に中性プロテアーゼ活性が残存せず、保存時に、中性プロテアーゼが醗酵調製物に悪影響を与えないことが予想される。
＜試験例８（中性プロテアーゼとラクターゼ溶液の併用）＞
　中性プロテアーゼとラクターゼ溶液との併用について、食感の変化、及び、ラクターゼによる乳糖分解率への影響について検討した。製造例１と同様に、スターター添加濃度は０．１ｍｇ／ｇ、中性プロテアーゼ添加濃度は１ＰＵ／ｇとし、ヨーグルトを製造した。上述した破断強度解析と同様に柔らかさ及びカード内部のムラ（なめらかさ）について検討した。結果を図１０のパネルＡに示す。尚、スターター、中性プロテアーゼを添加した牛乳は、４３℃で１０～１５分程度撹拌した後にガラス容器に分注し、４３℃で５時間醗酵した。醗酵調製物は１日以上冷蔵保存し、物性測定を行った。破断強度解析は、カードを崩さずに行った。結果を図１０のパネルＢに示す。
　中性プロテアーゼはプロテアーゼであるにもかかわらず、ラクターゼと同時に添加した時に、ラクターゼの効果を打ち消すことはなく、乳糖分解による乳糖不耐症防止効果や甘味向上効果が期待できる。一方、ラクターゼも中性プロテアーゼの効果を打ち消さないので、なめらかな醗酵乳を製造可能であるといえる。

Claims (9)

  1. 　原料乳と、乳酸菌と、を混合し、混合液を得る第１工程と、
    　前記混合液を発酵させる第２工程と、
    　を順次行う発酵乳製品の製造方法であって、
    　上記第２工程が終了する前に、前記原料乳及び／又は前記混合液にペニバチルス属由来のプロテアーゼを添加する工程（プロテアーゼ添加工程）を行うことを特徴とする発酵乳製品の製造方法。
  2. 　前記原料乳に含まれる乳脂肪分（質量％）と前記プロテアーゼの添加量（ＰＵ／ｇ）との比（前記乳脂肪分：前記プロテアーゼの添加量）が、５０：１～１：１０である、請求項１記載の発酵乳製品の製造方法。
  3. 　前記プロテアーゼの添加量が、前記原料乳の全質量を基準として０．０５～１０．０ＰＵ／ｇである、請求項１又は２記載の発酵乳製品の製造方法。
  4. 　前記原料乳に含まれる乳脂肪分が０～１０質量％である、請求項１記載の発酵乳製品の製造方法。
  5. 　前記原料乳に含まれる無脂乳固形分が３．０～２０質量％である、請求項１～４のいずれか一項記載の発酵乳製品の製造方法。
  6. 　前記プロテアーゼが、下記の（１）～（５）の性質を有することを特徴とする請求項１～５のいずれか一項記載の発酵乳製品の製造方法。
    　（１）ペニバチルス属に属する細菌により産生され、
    　（２）中性範囲でκ－カゼイン及びヘモグロビンを分解し、
    　（３）ｐＨ５．５～９．０で安定であり、至適ｐＨが７．０～８．０であり、
    　（４）２０～７５℃で作用し、至適温度が５０～６０℃であり、
    　（５）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が３２，０００～３４，０００Ｄａと推定されるプロテアーゼ。
  7. 　更にラクターゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、イヌリナーゼ、ラッカーゼ、パーオキシダーゼ、及び、前記プロテアーゼ以外のプロテアーゼから選択される１種又は複数種を上記原料乳及び／又は上記混合液に添加する工程を含む、請求項１～６のいずれか一項記載の発酵乳製品の製造方法。
  8. 　ペニバチルス属由来のプロテアーゼを含有する発酵乳製品であって、
    　クリープメータを用いて測定した場合のカードの破断点が、０．００２～１．０Ｎであることを特徴とする発酵乳製品。
  9. 　発酵乳製品の製造方法であって、
    　原料乳と、乳酸菌と、を混合し、混合液を得る第１工程と、
    　上記混合液を発酵させる第２工程と、
    　上記第２工程が終了する前に、上記原料乳及び／又は上記混合液にペニバチルス属由来のプロテアーゼを添加する工程（プロテアーゼ添加工程）と
    を含み、
    　所望の前記発酵乳製品のカード硬さと、原料乳に含まれる乳脂肪分と、ペニバチルス属由来プロテーゼの添加量と、を指標として、当該乳脂肪分と当該プロテアーゼの添加量を決定し、発酵工程を行うことを特徴とする発酵乳製品の製造方法。
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