CN104531644A - 一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法，属于蛋白纯化技术领域。本发明依次采用了硫酸铵分布沉淀、透析、阴离子交换层析(Q FF)和凝胶过滤层析(Superdex 75)对来源于野生菌株Bacillus sp.BBE201108的具有降解大豆蛋白过敏原作用的蛋白酶进行分离纯化。该蛋白酶被成功分离纯化得到，为该酶的酶学性质、氨基酸序列分析以及实现异源表达研究奠定了基础。

Description

一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法，属于蛋白纯化技术领域。
背景技术
大豆具有丰富的必需氨基酸组分，是人和畜禽的优质植物性蛋白源，具有很高的营养价值，此外，大豆蛋白还具有优越的加工性能如乳化性和起泡性等，以及良好的生理功能，能降低胆固醇、减少患心脏疾病的危险等。随着大豆蛋白分离技术的改进，大豆蛋白作为营养性和功能性成分得到了广泛的应用，以大豆蛋白为基础的加工食品是目前食品工业中增长最快的一类。但是，大豆蛋白也是八大类主要致敏原之一，全球有近0.3％-0.4％的人口对大豆过敏。研究发现，约有0.3％-0.4％的婴幼儿会对大豆蛋白过敏，而且随着大豆蛋白制品被广泛使用，成人对大豆蛋白过敏的发病率也在不断地攀升。大豆过敏症状表现出多种不同形式，常见的包括湿疹、过敏性皮炎和哮喘等。此外，大豆蛋白作为动物饲料的主要蛋白源，其致敏成分会损伤动物肠道，不利于动物的生长。
大豆蛋白分为15S球蛋白、11S球蛋白、7S球蛋白和2S球蛋白，其中11S球蛋白和7S球蛋白约占大豆蛋白总量的70％。β-伴大豆球蛋白是7S组分的主要成分，由α'(76kDa)，α(72kDa)和β(52-54kDa)亚基组成的分子量为150kDa的三聚体化合物，约占大豆蛋白总量的20％-30％。Ogawa等按照致敏能力和蛋白含量，把Gly m Bd 60K、Gly m Bd 30K和Gly m Bd28K作为主要大豆致敏原。Gly m Bd 60K即β-伴大豆球蛋白的α亚基，是一种糖蛋白，可被25％左右的大豆敏感患者的血清识别。Krishnan等发现Gly m Bd 60K、α'亚基和β亚基都是能引发大豆过敏反应的潜在致敏原。引起过敏反应的过敏原阈值水平通常很低，很少量的致敏原就足以引发过敏反应。据报道，大豆致敏原阈值水平范围一般为0.0013-500mg。因而，如何有效降解大豆蛋白中的过敏原就成为了一个必须解决的问题。
当前对酶解法降解大豆蛋白过敏原的研究中利用的酶都集中于商品化的酶，很少有针对降解大豆过敏原而筛选得到的菌株及其产酶的分离纯化的研究。虽然现已从降解大豆过敏原为出发点筛选得到了一株能够降解其的野生菌，但是由于没能从该菌株产物中分离纯化得到其中能够降解大豆过敏原的酶，从而对该酶的认识却是少之又少。
发明内容
本发明提供了一种能够降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的纯化方法。该蛋白酶来源于一株可降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌。
所述芽孢杆菌保藏中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC M 2012165，分类学命名为Bacillus sp.BBE201108。
所述可降解的过敏原包括：β-伴大豆球蛋白的α亚基和β-伴大豆球蛋白的α'亚基。
所述方法，是使用三步法，即依次利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱，从Bacillus sp.BBE201108的发酵液中获得了电泳纯的蛋白酶。
所述方法，具体包括：(1)硫酸铵分级沉淀：在发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末至饱和度为35-80％，离心去上清；然后再缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度为50-85％，离心取沉淀，将沉淀的蛋白复溶；(2)透析：将上述复溶后的蛋白进行透析；(3)阴离子交换层析：将透析后的蛋白进行阴离子交换层析，初始上样缓冲液为10-100mM的缓冲液，pH 8.0-10.0，洗脱液为上样缓冲液中加入0.1-1.0mol/L NaCl，洗脱；(4)凝胶过滤层析：利用凝胶过滤层析柱进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。
所述硫酸铵分级沉淀，在本发明的一种实施方式中，是在0-10℃下完成的。
所述硫酸铵分级沉淀，在本发明的一种实施方式中，是先添加硫酸铵粉末至饱和度为50％，离心取上清后再添加到饱和度为80％。
所述透析，在本发明的一种实施方式中，透析缓冲液为阴离子交换层析柱(Q FF)的上样缓冲液。
所述透析，在本发明的一种实施方式中，是在0-10℃下完成的。
所述阴离子交换层析，在本发明的一种实施方式中，为Q FF，购自GE Health公司。
所述阴离子交换层析中的缓冲液为以下任意一种：Tris-HCl、磷酸钠缓冲液、Gly-NaOH缓冲液。
所述阴离子交换层析，在本发明的一种实施方式中，初始上样缓冲液为25mM的Tris-HCl，pH 9.0。
所述洗脱，在本发明的一种实施方式中，是线性洗脱或者梯度洗脱。
所述凝胶过滤层析柱，在本发明的一种实施方式中，为Superdex 7510/300GL或HiLoad16/60Superdex 200prep grade。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括：
1)硫酸铵分级沉淀：于4℃下向发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末，至饱和度为50％，于4℃，7000rpm离心取上清液；向上述获得的上清液中于4℃下缓慢添加硫酸铵粉末，至饱和度为80％，于4℃，7000rpm离心取沉淀，将沉淀后的蛋白复溶；
2)透析：将上述复溶后的蛋白于4℃下进行透析，透析缓冲液为阴离子交换层析柱(Q FF)的上样缓冲液，即25mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0；
3)阴离子交换层析方法，初始上样缓冲液为25mM的Tris-HCl，pH 9.0，洗脱液为上样缓冲液中加入1mol/LNaCl，线性洗脱；
4)利用凝胶过滤层析柱(Superdex 75)进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。
本发明还提供一种利用所述蛋白酶降解大豆蛋白过敏原的方法，是将纯化后的蛋白酶与0.1-8％的大豆分离蛋白(soy protein isolates，SPI)按照每1mL SPI溶液添加30-500U蛋白酶，于20-60℃反应5-30min。
所述降解大豆蛋白过敏原的方法，在本发明的一种实施方式中，是按照每1mL的1％SPI溶液中添加250U的蛋白酶。
所述降解大豆蛋白过敏原的方法，在本发明的一种实施方式中，反应温度为50℃。
本发明依次采用了硫酸铵分布沉淀、透析、阴离子交换层析(Q FF)和凝胶过滤层析(Superdex 75)对来源于野生菌株Bacillus sp.BBE201108的具有降解大豆蛋白过敏原作用的蛋白酶进行分离纯化。通过硫酸铵分级沉淀试验，发现该蛋白酶主要集中于50-80％硫酸铵饱和度沉淀下来，能有效地去除杂蛋白，保留目的蛋白，回收率及纯化倍数高于其他硫酸铵饱和度下沉淀下来的蛋白。本发明采用阴离子交换层析，能够克服采用阳离子交换层析导致的酶液活力降低，甚至完全丧失的问题，也能克服采用疏水柱会导致的纯化重复性较差、稳定性低的问题。采用pH 8-10的上样缓冲液，能够克服挂不上柱或挂柱不稳的问题。凝胶过滤层析的进一步使用，得到了高纯度的酶液。
本发明的有益效果：(1)本发明方法充分结合了硫铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析，条件温和、方法易控制、高效，纯化后的该酶的比酶活较高，达到2575.45U/mg，纯化倍数为10.55；(2)纯化后得到的酶：最适反应pH和温度分别为pH 8.0和50℃；在pH 7.0-9.0以及30-40℃下的稳定较好，该纯酶在pH 7.0-9.0的范围内于25℃保温60min后，仍能维持80％以上的酶活力；该纯酶于30-40℃保温60min，稳定性较好，酶活力仍能够维持80％以上；Ca2+存在的情况下，酶活提高了5％左右，而Mn2+、Fe2+和Cu2+对该蛋白酶有明显抑制作用；苯甲基磺酰氟(PMSF)对该蛋白酶的抑制作用较为显著，二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)对该蛋白酶无抑制作用，推测其为丝氨酸蛋白酶。该蛋白酶的Km为4.19g/L，Vmax为4.04g/(L·s)，Kcat为107.73s-1，Kcat/Km为25.71L/(g·s)；(3)该蛋白酶被成功分离纯化得到，为该酶的氨基酸序列分析以及实现异源表达研究奠定了基础。
附图说明
图1为该蛋白酶分离纯化后得到的SDS-PAGE图；
图2为纯化后的蛋白酶对大豆分离蛋白过敏原的降解效果验证，泳道1为marker，泳道2为处理前的大豆蛋白，泳道3为处理后的大豆蛋白。
具体实施方式
实施例1蛋白酶酶活测定
1.L-酪氨酸标准曲线绘制：L-酪氨酸标准溶液按表1配制
表1
分别取上述溶液各1.00mL(须做平行试验)，各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL，福林试剂使用液1.00mL，置于50±0.2℃水浴中显色20min，用分光光度计于波长660nm，5mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线。
2.蛋白酶的酶活测定
取4只试管编号为1、2、3、4。其中1号试管为对照。将2％酪蛋白溶解在pH 8.0的PBS(磷酸二氢钠-磷酸氢二钠)中，然后在50℃下预热。首先将已预热的酶液加入到4只试管中，向1号试管中加入2mL 0.4moL/L的三氯乙酸，2、3、4号试管中各加入1ml预热后的酪蛋白，精确计时10min后，在1号试管中加入1ml预热后的酪蛋白，2、3、4号试管中各加入2mL 0.4moL/L的三氯乙酸，于50℃下保温20min后离心取上清，取4只试管，将上述反应液上清各取1mL后加入到对应的试管中，4只试管中分别依次加入5mL 0.4moL/L的碳酸钠，以及1mL的福林酚在50℃下保温20min后，用分光光度计波长660nm处，用5mm比色皿测定其吸光度值。对照标准曲线，计算出L-酪氨酸的含量。酶活力定义为：1mL酶液在pH 8.0，50℃下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以“U/mL”来表示。
实施例2蛋白酶的纯化
发酵液于4℃经7000rpm离心20min后获得发酵上清，于4℃缓慢添加硫酸铵粉末，至发酵上清硫酸铵饱和度达到50％，于4℃，7000rpm离心20min后收集上清，继续加入硫酸铵，使其终浓度达到80％的饱和度，于4℃下静置1h后于4℃，7000rpm离心收集沉淀。并将沉淀后的蛋白溶解在含有25mmol/L，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中。利用阴离子交换层析纯化，洗脱条件为：平衡液：25mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 9.0；洗脱液：含有1mol/LNaCl的平衡液；线性洗脱，流速为1mL/min，收集15％左右洗脱液洗脱下来的蛋白即为目的蛋白酶液，然后将酶液用凝胶过滤层析柱(Superdex 75)进一步分离纯化，流速为0.8mL/min，目的蛋白约在12mL处被洗脱下来，最终获得目的蛋白酶。目标蛋白的SDS-PAGE如图1所示，可以看出该蛋白酶的分子量在46kDa。
分离纯化时，该蛋白酶集中在50-80％的硫酸铵饱和度时沉淀下来，离子交换层析时应选用阴离子交换层析，实验过程发现，若采用阳离子交换层析会对酶的活力有较大影响，上样缓冲液pH若较低，会出现挂不上柱或挂柱不稳的情况。
纯化后得到的蛋白酶的比酶活达到2575.45U/mg，纯化倍数为10.55，回收率为6.48％。
实施例3蛋白酶的酶学性质
对纯化后的蛋白酶进行酶学性质研究，发现：在pH 7.0-9.0以及30-40℃下的稳定较好，该纯酶在pH 7.0-9.0的范围内于25℃保温60min后，仍能维持80％以上的酶活力；该纯酶于30-40℃保温60min，稳定性较好，酶活力仍能够维持80％以上。Ca2+存在的情况下，酶活提高了5％左右，而Mn2+、Fe2+和Cu2+对该蛋白酶有明显抑制作用；苯甲基磺酰氟(PMSF)对该蛋白酶的抑制作用较为显著，二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)对该蛋白酶无抑制作用，推测其为丝氨酸蛋白酶。该蛋白酶的Km为4.19g/L，Vmax为4.04g/(L·s)，Kcat为107.73s-1，Kcat/Km为25.71L/(g·s)。
1酶的最适反应pH和温度
(1)最适反应pH：纯化后的蛋白酶分别在pH 6.0-10.0不同缓冲液体系下测定酶活，最高酶活者设为100％。实验所用缓冲液：pH 6.0-8.0，磷酸钠缓冲液；pH 9.0-10.0，Gly-NaOH缓冲液。(2)最适反应温度：在最适反应pH的条件下，于30℃-70℃不同温度下测定蛋白酶酶活，酶活力最高者设为100％。
2酶的pH和温度稳定性
(1)pH稳定性：将纯酶置于25mM，pH 6.0-10.0不同缓冲液中，于25℃下保温0-60min，每10min取样，在最适反应温度和pH下测定其剩余酶活力，未保温直接测定酶液，所测得的酶活设为100％。实验所用缓冲液：pH 6.0-8.0，磷酸钠缓冲液；pH 9.0-10.0，Gly-NaOH缓冲液。(2)温度稳定性：将纯酶置于pH 8.0(25mM，磷酸钠缓冲液)分别于30℃，40℃，50℃和60℃下保温0-60min，每隔10min取样，在最适反应温度和pH下测定其剩余酶活。未保温直接测定酶液，所测得的酶活设为100％。
3金属离子对酶活力的影响
分别向酶液中添加Mn2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、K+和Li+，终浓度达到0mM，1mM，5mM和10mM，于pH 8.0，25℃下保温60min，测定其剩余酶活。未添加任何金属离子样品的酶活为100％。
4酶抑制剂对酶活力的影响
分别向酶液中添加苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA、碘乙酰胺(Iodoacetamide)和二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)，达到0mM，1mM，5mM和10mM，于pH 8.0，25℃下保温60min，测定其剩余酶活。未添加任何酶抑制剂样品的酶活为100％。
5酶动力学参数测定
纯酶在最适反应温度和pH下，以不同浓度的酪蛋白溶液为底物，测定产物甘氨酸的产量，计算相应的反应速度，用双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)作图，求得Km和Vmax。再根据酶浓度计算Kcat值，算出Kcat/Km值。
实施例4纯酶液对大豆蛋白过敏原β-伴大豆球蛋白的α亚基和α'亚基的降解
将纯化后得到的蛋白酶与1％的大豆分离蛋白按照1：1(v/v)的比例添加，即1mL的1％SPI溶液中添加约250U的酶，于pH 8.0下，50℃反应30min后，利用SDS-PAGE验证对大豆分离蛋白过敏原蛋白的降解。结果如图2所示，从泳道2(处理前的大豆分离蛋白)可以看出，存在β-伴大豆球蛋白的α亚基和β-伴大豆球蛋白的α亚基条带，泳道3(处理后的大豆分离蛋白)上β-伴大豆球蛋白的α亚基和β-伴大豆球蛋白的α亚基条带消失，说明纯化得到的蛋白酶能够降解大豆蛋白过敏原β-伴大豆球蛋白的α亚基和α'亚基。该纯酶对降解大豆过敏原有着较好的专一性。
实施例5蛋白酶的纯化
从Bacillus sp.BBE201108的发酵上清液中，具体使用以下方法进行纯化：
(1)硫酸铵分级沉淀：在10℃条件下，向发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末至饱和度为35％，离心去上清；然后再缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度为60％，离心取沉淀，将沉淀的蛋白复溶；(2)透析：将上述复溶后的蛋白进行透析；(3)阴离子交换层析：将透析后的蛋白进行阴离子交换层析，初始上样缓冲液为10mM的磷酸钠缓冲液，pH 8.0，洗脱液为上样缓冲液中加入0.1mol/L NaCl，线性洗脱；(4)凝胶过滤层析：利用凝胶过滤层析柱HiLoad16/60Superdex 200prep grade进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。
该方法得到的蛋白酶的比酶活达到1800.64U/mg，纯化倍数为9.38，回收率为2.07％，且能保持降解大豆过敏原的活性。
实施例6蛋白酶的纯化
从Bacillus sp.BBE201108的发酵上清液中，具体使用以下方法进行纯化：
发酵液于0℃经7000rpm离心20min后获得发酵上清，于0℃缓慢添加硫酸铵粉末，至发酵上清硫酸铵饱和度达到75％，于4℃，7000rpm离心20min后收集上清，继续加入硫酸铵，使其终浓度达到85％的饱和度，于4℃下静置0.5h后于4℃，7000rpm离心收集沉淀。并将沉淀后的蛋白溶解在含有100mmol/L，pH 10.0的Gly-NaOH缓冲液中。利用阴离子交换层析纯化，洗脱条件为：平衡液：100mmol/L的Gly-NaOH缓冲液，pH 10.0；洗脱液：含有0.5mol/L NaCl的平衡液；线性洗脱，流速为1mL/min，收集目的蛋白酶液，然后将酶液用凝胶过滤层析柱进一步分离纯化，最终获得目的蛋白酶。
该方法得到的蛋白酶为电泳纯，其比酶活达到2134.78U/mg，纯化倍数为8.23，回收率为1.76％，且能保持降解大豆过敏原的活性。
实施例7蛋白酶的应用
将实施例5得到的纯化后的蛋白酶用于降解大豆蛋白过敏原。在0.1-8％的大豆分离蛋白SPI溶液中，按照每1mL SPI溶液添加30-500U蛋白酶，于20-60℃反应5-30min。利用SDS-PAGE验证对大豆分离蛋白过敏原蛋白的降解，结果发现大豆蛋白过敏原β-伴大豆球蛋白的α亚基和α'亚基发生了降解。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种分离纯化能够降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法，其特征在于，是从一株可降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌发酵上清液中，依次利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱，来纯化得到蛋白酶；所述方法，具体包括：(1)硫酸铵分级沉淀：在发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末至饱和度为35-80％，离心去上清；然后再缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度为50-85％，离心取沉淀，将沉淀的蛋白复溶；(2)透析：将上述复溶后的蛋白进行透析；(3)阴离子交换层析：将透析后的蛋白进行阴离子交换层析，初始上样缓冲液为10-100mM的缓冲液，pH 8.0-10.0，洗脱液为上样缓冲液中加入0.1-1.0mol/L NaCl，线性洗脱；(4)凝胶过滤层析：利用凝胶过滤层析柱进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌保藏中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC M 2012165，分类学命名为Bacillus sp.BBE201108。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵分级沉淀是在0-10℃下完成的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵分级沉淀，是先添加硫酸铵粉末至饱和度为50％，离心取上清后再添加到饱和度为80％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的初始上样缓冲液为25mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0，洗脱液为上样缓冲液中加入1mol/L NaCl，线性洗脱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，具体包括：
1)硫酸铵分级沉淀：于4℃下向发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末，至饱和度为50％，于4℃，7000rpm离心取上清液；向上述获得的上清液中于4℃下缓慢添加硫酸铵粉末，至饱和度为80％，于4℃，7000rpm离心取沉淀，将沉淀后的蛋白复溶；
2)透析：将上述复溶后的蛋白于4℃下进行透析，透析缓冲液为25mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0；
3)阴离子交换层析方法，初始上样缓冲液为25mM的Tris-HCl，pH 9.0，洗脱液为上样缓冲液中加入1mol/LNaCl，线性洗脱；
4)利用凝胶过滤层析柱Superdex 75进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。
7.一种利用权利要求1所述方法得到的蛋白酶。
8.权利要求7所述蛋白酶在降解大豆蛋白过敏原方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，是将纯化后的蛋白酶与0.1-8％的大豆分离蛋白SPI溶液按照每1mL SPI溶液添加30-500U蛋白酶，于20-60℃反应5-30min。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述方法是在每1mL的1％SPI溶液中添加250U的酶。
CN201410779545.7A 2014-12-16 2014-12-16 一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法 Pending CN104531644A (zh)

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