CN102827788A

CN102827788A - 一株降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN102827788A
Application number: CN2012101933488A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 张娟; 朱婷; 堵国成; 谈铭
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-06-13
Also published as: CN102827788B

Abstract

本发明公开了一株降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌，本发明的降解菌Bacillus sp.BBE201108是从预制备豆制品原料（大豆粉糟）中筛选所得。其筛选步骤为：微生物的富集，微生物的分离，透明圈法，SDS-PAGE验证，得到一株降解性能较好的菌株。该菌株能有效降解大豆主要过敏原Gly m Bd 60K。因此，能在一定程度上降低大豆蛋白致敏性，为保障大豆制品在人类食品和畜禽饲料中安全与高效利用提供参考。

Description

一株降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌及其应用

技术领域：

本发明涉及一株芽孢杆菌及其应用，特别是一株能降解大豆主要过敏原Gly m Bd 60K芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

目前，90%以上的过敏反应是蛋、鱼、贝壳、奶、花生、大豆、坚果和小麦八类食物引起的。根据估计全世界人口将近有0.5%对大豆过敏，大豆继牛奶、鸡蛋、花生后，是第四种导致幼儿过敏的常见致敏食物。上述八大致敏原中，大豆是我国种植最广且消费最多的植物蛋白，这是由其营养性及其在食品加工过程中的功能性所决定的。我国是大豆的故乡，各类大豆制品也是中国的主要营养来源。而且随着中国加入WTO，人们生活水平的提高，食品工业的发展也必将与国际接轨，这就需要我们必须重视食品中蛋白质的过敏问题，规范产品标签，同时研究开发低致敏性食品。

大豆蛋白中较为突出的3种致敏蛋白分别为：Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K、Gly m Bd60K。Gly m Bd 60K即是β-伴大豆球蛋白的α-亚基。它能被25%的对大豆敏感的过敏性皮炎患者的血清识别。

大豆β-伴大豆球蛋白约占大豆籽粒总蛋白含量的25％，是影响大豆籽粒蛋白营养品质及加工品质的重要组分。大豆β-伴大豆球蛋白由α’-(76kDa)，α-(72kDa)和β-(52~54kDa)亚基组成的分子量为150kDa的三聚体化合物。α-亚基与α’-亚基和β-亚基在氨基酸序列上有高度的同源性，其中α亚基与α’亚基的相似性更是超过90％。他们都是潜在的过敏原。

大豆所含的致敏蛋白是限制大豆在食品和饲料加工中广泛利用的关键因素，因此，能降低、去除大豆致敏蛋白就成为提高大豆蛋白品质，是保障大豆制品在人类食品和畜禽饲料中安全与高效利用的关键性问题。

发明内容:

本发明要解决的技术问题是提供一种降解大豆主要过敏原Gly m Bd 60K的芽孢杆菌BBE201108，筛选自预制备豆制品原料（大豆粉糟），其分类学命名为芽孢杆菌Bacillus sp.BBE201108，于2012年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2012165，保藏地址：中国武汉、武汉大学。

16SrDNA结果鉴定其为芽孢杆菌。

所述芽孢杆菌能够降解大豆分离蛋白的菌株。

所述芽孢杆菌应用于降解大豆蛋白主要过敏原也是本发明要求保护的范围。降解过敏原的方案为：将菌株发酵上清应用于含1%大豆分离蛋白0.1M pH 8.0PB缓冲液,经SDS-PAGE检验，能够有效的降解大豆蛋白主要过敏原Gly m Bd 60K。

本发明提供的芽孢杆菌BBE201108发酵24小时后蛋白酶活最高可达10.5U/mL，收集发酵上清液，能在0min到2h时间段内降解大豆蛋白主要过敏原Gly m Bd 60K。

附图说明

图1芽孢杆菌BBE201108在大豆分离蛋白培养基上产生透明圈（大豆分离蛋白培养基组成为大豆分离蛋白3.5%，氯化钠1%，琼脂2%）

图2定时取发酵液上清进行SDS-PAGE图（1泳道：标准分子量蛋白；2泳道：

SPI-PB液未添加发酵上清液；3~9泳道：SPI-PB液添加发酵上清液，酶解反应时间依次为2h、1h、50min、40min、30min、20min、10min。）

具体实施方式:

实施例1一株降解大豆主要过敏原Gly m Bd 60K芽孢杆菌的定性初筛方法

（一）样品来源

采样来源为预制备豆制品的原料（大豆粉糟）

（二）培养方法

取采样所得大豆粉糟10g，加入90mL的无菌生理盐水，摇床(200rpm)震荡2h。

（三）定性初筛

采用大豆分离蛋白平板法。组成如下：大豆分离蛋白3.5%，氯化钠1%，琼脂2%。将富集培养后的悬液稀释至不同的梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。涂布大豆分离蛋白平板，37℃培养2天，挑取能产生透明圈的单菌落。效果如图1

实施例2酶活测定

（一）酪氨酸标准曲线的绘制

按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液。

表1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液

取18支试管分成6组(每组3支)编号，按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4mol/L的碳酸钠5mL，再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min，在721型分光光度计上进行测定(波长660nm)，测三次，取平均值。将1~6号管所测得的光密度（OD）减去1号管（蒸馏水空白试验）所测得的光密度为净OD数。以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线。

（二）样品酶活的测定

酶液适当稀释。取试管3支编号，每管内加入酶液1mL，置于40℃水浴中预热2min，再加入经同样预热的大豆分离蛋白1mL，精确保温10min，时间到后，立即再加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，以终止反映，置于冰上20min，使残余蛋白质沉淀后离心，然后另取试管3支编号，每管内加入滤液1mL，再加入0.4mol/L碳酸钠5mL，已稀释的福林酚试剂1mL，摇匀，40℃保温发色20min后进行光密度（OD）测定。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。

空白试验也取试管3支，编号，测定方法同上，唯在加大豆分离蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入大豆分离蛋白。

在40℃下每分钟水解大豆分离蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。

将初筛的菌株接到基本培养基（MSM）中，组成如下：大豆蛋白胨1%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，氯化钠1%，调pH至7.0经蛋白酶活测定发现，发酵24小时后蛋白酶活最高可达10.5U/mL。

实施例3芽孢杆菌的定性复筛方法

（一）实验试剂

基本培养基（MSM）组成：大豆蛋白胨1%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，氯化钠1%，调pH至7.0

（二）定性复筛

将初筛的菌株接到基本培养基（MSM）中，摇床37℃200rpm培养24h，4℃8000rpm离心5min取发酵上清；将大豆分离蛋白SPI溶于0.1M pH 8.0PB缓冲液，形成1%SPI-PB液；发酵上清与1%SPI-PB液按1∶3混合，50℃水浴定时(10min、20min、30min、40min、50min、1h、2h)取样，沸水煮沸10min后得到的样品进行SDS-PAGE验证。效果如图2。研究表明，当发酵上清与SPI-PB液比例为1∶3时，在10min时，Gly m Bd 60K就得到较好的降解，只有少量残余。1h左右Gly m Bd 60K被完全降解，而与之同源性很高β-伴大豆球蛋白的α’-亚基在2h左右也被完全降解。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一株降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌，于2012年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012165。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于筛选自预制备豆制品原料。

3.权利要求1所述的芽孢杆菌应用于筛选能够降解大豆分离蛋白的菌株。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌应用于降解大豆蛋白主要过敏原Gly m Bd 60K。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于该菌株发酵上清应用于含1%大豆分离蛋白0.1M pH 8.0PB缓冲液,经SDS-PAGE检验，能够有效的降解大豆蛋白主要过敏原Gly m Bd60K。