CN104662146A - 食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法 - Google Patents

食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法 Download PDF

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Abstract

能够利用同一培养基同时适当地使包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌增殖。食物中毒菌的培养基的构成为：含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁。另外，食物中毒菌的检测方法为下述方法：利用含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基，使至少包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌同时增殖，由所增殖的多种食物中毒菌提取DNA，将用于对多种食物中毒菌的DNA的扩增对象区域进行特异性扩增的引物加入至PCR用溶液，通过PCR使扩增对象区域扩增，对所得到的扩增产物进行检测。

Description

食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法
技术领域
本发明涉及培养食物中毒菌的技术，尤其涉及在同一培养基中同时培养多种食物中毒菌的技术。
背景技术
近年来，每年会发生超过千件的食物中毒事件。在发生食物中毒事件的情况下，为了对成为原因的食物中毒菌进行确定，要进行增殖对象菌以判定其种类的操作。在增殖对象菌时，基于保健站的技师的经验，对被推测为原因的对象菌全部进行单一培养。该单一培养中，需要对每种对象菌考虑多种培养基及培养条件等。
在这种现有方法中，存在食物中毒菌的培养及其检测需要花费大量的时间和成本、劳力的问题。
因此，以食物中毒菌的培养及检测中的省力化及迅速化、减少消耗品废弃为目的，正在研究开发在同一培养基中同时培养多种食物中毒菌的技术。
例如，根据专利文献1中记载的方法，能够同时培养金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、弧菌、蜡状芽孢杆菌及李斯特菌这6种食物中毒菌。
另外，在专利文献2中记载的方法中，记载了能够同时培养包含难以增殖的李斯特菌在内的多种食物中毒菌。
专利文献1：日本特开2008-48670号公报
专利文献2：日本专利第4621919号公报
发明内容
发明要解决的课题
但是，专利文献1中使用的培养基存在难以稳定地培养对象菌的问题。特别是，在含有倍增速率快的对象菌或杂菌等非对象菌的情况下，存在会因其影响而使一部分对象菌的倍增速率变慢、无法适当增殖的问题。
另外，专利文献2中使用的培养基存在无法充分增殖金黄色葡萄球菌、无法适当地检测出金黄色葡萄球菌的问题。
此外，专利文献1及2中，目的在于使对象菌增殖为103cfu/ml以上，因此，存在对于用于迅速检验法等而言灵敏度不足、缺乏通用性的问题。
于是，本发明人进行了深入研究，成功开发出了能够同时增殖在食品检验、流行病学环境检验、环境检验及临床试验、家畜卫生中重要的4种食物中毒细菌即大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、及副溶血弧菌的培养基。
此处，一般的迅速检验法(免疫层析法、ELISA法等)的检测下限为105cfu/ml，因此，若考虑作为这些检验法的培养基进行利用的情况，则希望在实用的培养时间内将对象菌增殖为105cfu/ml以上。另外，对于食物中毒菌来说，在生物化学试验中需要进行毒素产生的评价，在过去的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的食物中毒发生事例中，对象菌以105cfu/ml以上存在时会产生毒素，引起食物中毒。因此，从这种观点出发，也希望将对象菌增殖为105cfu/ml以上。
此外，在同时检验多种食物中毒菌时，不同种类的食物中毒菌间的菌数之差很重要。即，在使用了多重PCR等的迅速检验法中，若菌数之差高至103cfu/ml以上，则在同时扩增多种食物中毒菌的情况下，相对较少的菌无法适当地扩增，难以检测。因此，希望按照菌数之差小于103cfu/ml的方式使其增殖。
本发明是鉴于上述情况进行的，其目的在于提供能够同时适当地增殖包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌的食物中毒菌的培养基、以及食物中毒菌的检测方法。
用于解决课题的方案
为了达到上述目的，本发明的食物中毒菌的培养基的构成为：含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁。
另外，本发明的食物中毒菌的检测方法为下述方法：利用含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基，使至少包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌同时增殖，由所增殖的食物中毒菌提取DNA，将用于对食物中毒菌的DNA的扩增对象区域进行特异性扩增的引物加入至PCR用溶液，通过PCR使扩增对象区域扩增，对所得到的扩增产物进行检测。
发明的效果
根据本发明，能够利用同一培养基同时适当地增殖包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌。
附图说明
图1是示出对本发明实施方式的合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基进行了验证的试验1的结果的图。
图2是示出对本发明实施方式的培养基的最佳蛋白胨浓度进行了验证的试验2的结果的图。
图3是示出对本发明实施方式的培养基的最佳氯化钠浓度进行了验证的试验3的结果的图。
图4是示出对本发明实施方式的培养基的最佳糖浓度进行了验证的试验4的结果的图。
图5是示出对本发明实施方式的培养基的最佳pH进行了验证的试验5的结果的图。
图6是示出对利用本发明实施方式的培养基和现有培养基的培养结束时的菌数进行了验证的试验6的结果的图。
图7是示出对在本发明实施方式的培养基中混入有杂菌时的培养基进行了验证的试验7的结果的图。
图8是示出对在本发明实施方式的培养基中添加了食品时的培养基进行了验证的试验8的结果的图。
图9是示出用于对各试验中使用的食物中毒菌的DNA中的扩增对象区域进行特异性扩增的引物的碱基序列的图。
图10是示出通过电泳检测利用试验1中培养的食物中毒菌的DNA进行多重PCR所得到的特异性扩增产物的结果的图。
图11是示出通过电泳检测利用试验3中培养的食物中毒菌的DNA进行多重PCR所得到的特异性扩增产物的结果(氯化钠浓度0～1.5％)的图。
图12是示出通过电泳检测利用试验3中培养的食物中毒菌的DNA进行多重PCR所得到的特异性扩增产物的结果(氯化钠浓度2.0～3.5％)的图。
具体实施方式
下面，对本发明实施方式的食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法进行详细说明。
本发明实施方式的食物中毒菌的培养基的特征在于，其含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁。根据本实施方式的食物中毒菌的培养基，通过这种构成，可以同时增殖至少包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌，尤其可以同时适当地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
[检测对象菌]
(大肠杆菌)
大肠杆菌(Escherichia coli)是革兰氏阴性、兼性厌氧性的杆菌。其为肠内细菌的一种，大多大肠杆菌是无害的，但是存在一部分会引起腹痛或腹泻等的大肠杆菌，这些被称为致病性大肠杆菌。O157等有名的肠出血性大肠杆菌(EHEC、enterohemorrhagic E.coli)的生长pH(最佳pH)为4.4～9.0(6.0～7.6)、生长温度(最佳温度)为7.0～46.0(35～40)。作为培养基，一般使用mEC培养基。
(沙门氏菌)
沙门氏菌(Salmonella sp.)是革兰氏阴性、兼性厌氧性的杆菌，是肠内细菌的一种，存在一部分会引起感染型食物中毒的沙门氏菌。沙门氏菌的生长pH(最佳pH)为3.8～9.5(7.0～7.5)、生长温度(最佳温度)为5.2～46.2(35～43)。作为培养基，一般使用缓冲蛋白胨水溶液。
(金黄色葡萄球菌)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是葡萄球菌的一种，为革兰氏阳性、兼性厌氧性的球菌。常存在于人体的皮肤或鼻腔、肠内，对健康人类也会引起疾病，但如果菌少的话，通常其毒性较弱。除了引起食物中毒外，还是表皮感染症、肺炎、脑膜炎等各种感染症的病因菌。金黄色葡萄球菌的生长pH(最佳pH)为4.2～9.3(7.0～7.5)、生长温度(最佳温度)为6.5～46.0(30～37)。作为培养基，一般使用添加了食盐的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic soy broth medium)。
(副溶血弧菌)
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性、嗜盐性的杆菌。主要生活在海水中，若人感染副溶血弧菌，则会发生食物中毒。副溶血弧菌的生长pH(最佳pH)为5.5～9.6(7.6～8.0)、生长温度(最佳温度)为10.0～43.0(35～37)。作为培养基，一般使用碱性蛋白胨水溶液。
在这些食物中毒菌中，只有金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，与革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性菌的增殖速度慢，因此，以往非常难以利用同一培养基同时对它们进行培养。
即，若利用同一培养基同时培养这些多种食物中毒菌，则大肠杆菌和沙门氏菌先大量增殖，其结果，金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的生长受到抑制，尤其存在金黄色葡萄球菌无法充分增殖的问题。另外，副溶血弧菌的生长需要氯化钠，但培养基中的氯化钠浓度对其它菌的生长也有影响。
因此，为了能够均衡地进行这4种菌种的增殖，本发明实施方式的食物中毒菌的培养基在培养基的组成方面进行了钻研。
[培养基的组成]
(蛋白胨)
蛋白胨是将动物性或植物性的蛋白质水解成氨基酸、或低分子量的肽而得到的物质。在以下的实施例中，使用了日本Becton Dickinson株式会社制的Bacto蛋白胨。
本实施方式中，优选使培养基的蛋白胨浓度为1w/v％(质量相对于体积的百分率)以上。这是因为，若蛋白胨浓度小于1w/v％，则无法充分增殖副溶血弧菌。另一方面，即使蛋白胨浓度为5w/v％以上，也能够充分增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。因此，作为培养基的蛋白胨浓度，例如优选为1w/v％～5w/v％。
(酵母提取物)
酵母提取物是使酵母自溶、或者通过酶或热水处理等由酵母提取的提取物，包含氨基酸、核酸、矿物质、维生素类等。在以下的实施例中，使用了日本Becton Dickinson株式会社制的Bacto酵母提取物。
本实施方式中，优选培养基中即使少量也要含有酵母提取物，另外优选以小于0.6w/v％的浓度含有。这是因为：由于酵母提取物中含有难溶性成分，因此若培养基的酵母提取物浓度大于0.6w/v％，则会在高压灭菌后析出，对象菌无法增殖为105cfu/ml以上、或者增殖不稳定。因此，通过使培养基的酵母提取物浓度例如为0.0001w/v％～0.6w/v％，可以良好地利用同一培养基同时增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
(硫酸镁)
硫酸镁为硫酸与镁的盐，在本实施方式中使用了硫酸镁七水合物。在以下的实施例中，使用了和光纯药工业株式会社制的硫酸镁七水合物。
本实施方式中，优选在培养基中即使少量也要含有硫酸镁，另外优选以小于0.1w/v％的浓度含有。若培养基中过量含有硫酸镁，则会对食物中毒菌的生长产生不良影响。另外，硫酸镁与磷酸盐反应，发生析出。因此，若培养基的硫酸镁浓度大于0.1w/v％，则会在高压灭菌后析出，对象菌无法增殖为105cfu/ml以上、或者增殖不稳定。因此，通过使培养基的硫酸镁浓度例如为0.0001w/v％～0.1w/v％，可以良好地利用同一培养基同时增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
(氯化钠)
氯化钠(NaCl)对副溶血弧菌的生长而言是必须的。在以下的实施例中，使用了和光纯药工业株式会社制的氯化钠。
本实施方式中，优选使培养基的氯化钠浓度为0.5w/v％～3.0w/v％。这是因为，若小于0.5w/v％，则副溶血弧菌无法生长，若大于3.0w/v％，则会对大肠杆菌、沙门氏菌的生长产生影响。尤其是，若使氯化钠浓度为1.5w/v％～3.0w/v％，则可以使金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌良好地增殖，因而优选，若使氯化钠浓度为1.5w/v％～2.0w/v％，则大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的增殖的平衡变得最好，因而更优选。
(其它成分)
本实施方式中，作为培养基的其它成分，使用磷酸盐(0.35w/v％磷酸氢二钠+0.15w/v％磷酸二氢钾)。培养基中的磷酸盐的浓度只要为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌能够良好地生长的范围即可，没有特别限定。另外，关于磷酸氢二钠及磷酸二氢钾的比例，为这些食物中毒菌能够良好地生长的范围即可。
除此之外，本实施方式的培养基只要含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁就没有特别限定，也可以含有其它成分。
[培养基的pH]
本实施方式中，优选使培养基的pH为6.5～7.5。这是因为，若培养基的pH在该范围，则能够使大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌同时增殖，在pH小于或大于该范围的情况下，金黄色葡萄球菌的增殖不充分。
[培养基的制造方法]
本实施方式的培养基例如可以如下制造：将蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠及磷酸二氢钾混合，将该混合物调整为pH7.0，在121℃高压灭菌15分钟，由此制造培养基。
[培养基的使用方法]
本实施方式的培养基例如可以通过以下的方法使用。
可以举出用于将标本试样中的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌增殖至它们的检测所需要的菌数的使用方法。作为标本，可以举出食品、临床标本(粪便、呕吐物)等。
例如，在将食品作为标本的情况下，通过使用下述手法可以检验食物中毒菌的有无：向培养基225mL中加入食品标本25g，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌在37℃培养20小时，选择性地检测各食物中毒菌。此时，可以对所培养的各食物中毒菌进行菌数的计数及定性判定等。
食物中毒菌的计数可以通过下述方式进行：向各食物中毒菌的选择培养基中添加培养液的连续稀释液，培养一定时间后，对各菌的典型菌落数进行测定等等，从而可以进行计数。另外，定性判定可以通过利用培养基或免疫学选择方法对菌进行选择来进行。
[食物中毒菌的检测方法]
本发明实施方式的食物中毒菌的检测可以利用本实施方式的培养基通过以下方法进行。
即，利用含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基，使至少包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌同时增殖，由所增殖的多种食物中毒菌提取DNA，将用于对多种食物中毒菌的DNA的扩增对象区域进行特异性扩增的引物加入至PCR用溶液，通过PCR使扩增对象区域扩增，对所得到的扩增产物进行检测。
具体来说，回收进行了食物中毒菌的培养的培养基(培养液)，进行离心分离。接着，废弃上清，向所得到的沉淀中加入革兰氏阳性的溶菌所希望的溶菌酶溶液，进行溶菌处理。接着，通过进行蛋白质分解和柱纯化来得到DNA提取液，将该DNA提取液作为用于基于多重PCR的扩增的试样。
接着，制作含有引物对的PCR用反应液，该引物对能够特异性地扩增大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的DNA的扩增对象区域。作为PCR用反应液，可以使用包含缓冲液、核酸合成底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物对(正向引物、反向引物)、核酸合成酶、食物中毒菌的DNA及水的反应液。此时，作为引物对，如图9所示，在大肠杆菌用的情况下优选可以使用由与序列号1和2对应的碱基序列构成的引物对；在沙门氏菌用的情况下优选可以使用由与序列号3和4对应的碱基序列构成的引物对；在金黄色葡萄球菌用的情况下优选可以使用由与序列号5和6对应的碱基序列构成的引物对；在副溶血弧菌用的情况下优选可以使用由与序列号7和8对应的碱基序列构成的引物对。
基于PCR的基因扩增可以利用热循环仪等PCR装置进行，例如可以在下述条件下进行。
使(2)～(4)进行40个循环
接着，通过使用了微毛细管等的电泳，使由PCR得到的扩增产物进行电泳，并确认是否得到了正确的扩增产物。
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌各自的设定的扩增产物的碱基序列长如下：大肠杆菌为158bp、沙门氏菌为177bp、金黄色葡萄球菌为238bp、副溶血弧菌为380bp。此处，在对由PCR得到的扩增产物进行电泳时，由于进行电泳的装置中使用的试剂等的影响，与理论上的扩增产物的碱基序列并不完全一致，得到近似值的结果。
需要说明的是，也可以代替电泳而使用DNA芯片或DNA微阵列等来确认是否得到了正确的扩增产物。这些可以利用通常的方法进行。
根据本实施方式的食物中毒菌的培养基，能够在同一培养基中同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，由此，能够在比较短的时间内使全部这4种菌增殖为对检测而言充分的菌数。具体来说，可以使各1cfu/ml的食物中毒菌在20小时后分别生长为105cfu/ml以上。另外，可以使其按照使对象菌的菌数最多的菌与最少的菌的菌数之差小于103cfu/ml的方式生长。
因此，根据本实施方式的食物中毒菌的检测方法，能够以高精度检测出利用本实施方式的食物中毒菌的培养基同时培养的多种食物中毒菌。
实施例
<试验1：合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基的验证>
通过合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的实施例的培养基、与仅使用了这些中的一部分的比较例的培养基来同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，测定培养20小时后的菌数。
具体来说，将蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠及磷酸二氢钾分别按照以下的组成进行混合，将pH调节为7.0。需要说明的是，剩余的成分为灭菌水(以下的试验中也相同)。然后，通过高压灭菌将所得到的培养基在121℃灭菌15分钟。
(每1L)
蛋白胨：0g或10g
酵母提取物：0g或5g
硫酸镁七水合物：0g或0.5g
氯化钠：15g
磷酸氢二钠：3.5g
磷酸二氢钾：1.5g
另外，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌分别使用了以下的菌株。
·大肠杆菌Escherichia coli NCTC12923株
·沙门氏菌Salmonella enterica subsp.Enterica serovar AbonyNCTC6017株
·金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus NCTC10788株
·副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus RIMD2210050株
这些食物中毒菌的菌株由下述机构分售而得(以下的试验中也相同)。
·NCTC National Collection of Type Culture(英国国家典型菌种保藏中心)(英国)
·RIMD大阪大学微生物病研究所
将上述4种菌株各10～50cfu分别接种至实施例和比较例的各培养基250mL中。在37℃培养20小时，对各菌数进行计数。作为用于计数的选择培养基，大肠杆菌使用了Compact Dry EC(日水制药株式会社制)，沙门氏菌使用了DHL琼脂培养基(极东制药工业株式会社制)，金黄色葡萄球菌使用了卵黄甘露醇高盐琼脂培养基(极东制药工业株式会社制)，副溶血弧菌使用了TCBS琼脂培养基(极东制药工业株式会社制)。然后，向各选择培养基中添加培养液的连续稀释液，在35℃培养20～24小时(金黄色葡萄球菌为48小时)后，测定各菌的典型菌落数。将培养基组成的比例和培养后的菌数示于图1。
如该图所示，在含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的实施例1的培养基中，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌均增殖为106以上的菌数。另一方面，在缺少了酵母提取物或硫酸镁中的至少任一种的比较例1-3中，金黄色葡萄球菌的菌数小于105，未增殖为能够检测出的程度。另外，在缺少了蛋白胨的比较例4中，副溶血弧菌的菌数小于105，同样未充分增殖。
因此可知：通过使培养基中含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁，能够在同一培养基中同时良好地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
<试验2：培养基的最佳蛋白胨浓度的验证>
对使用将蛋白胨以各种浓度混合而得到的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的情况下能否良好地增殖进行验证。
具体来说，将蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠及磷酸二氢钾分别按照以下的组成混合，将pH调节为7.0，得到培养基。然后，通过高压灭菌将所得到的培养基在121℃灭菌15分钟。
(每1L)
蛋白胨：0g、10g、20g、30g、40g、50g
酵母提取物：5g
硫酸镁七水合物：0.5g
氯化钠：15g
磷酸氢二钠：3.5g
磷酸二氢钾：1.5g
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的菌株使用与试验1相同的菌株，同时培养这些食物中毒菌，与试验1同样地计测菌数。将培养基组成的比例和培养后的菌数示于图2。
如该图所示，在培养基的蛋白胨浓度为0％的情况下，副溶血弧菌的菌数小于105，未充分增殖。另一方面，可知：在培养基的蛋白胨浓度为1w/v％以上的情况下，所有菌均增殖为105以上的菌数。
因此，通过使培养基中含有1w/v％以上的蛋白胨，可知能够在同一培养基中同时良好地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
<试验3：培养基的最佳氯化钠浓度的验证>
在合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基中以各种浓度混合氯化钠，使用所得到的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，对该情况下能否良好地增殖进行验证。
具体来说，将蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠及磷酸二氢钾分别按照以下的组成混合，将pH调节为7.0，得到培养基。然后，通过高压灭菌将所得到的培养基在121℃灭菌15分钟。
(每1L)
蛋白胨：10g
酵母提取物：5g
硫酸镁七水合物：0.5g
氯化钠：0、5g、10g、15g、20g、25g、30g、35g
磷酸氢二钠：3.5g
磷酸二氢钾：1.5g
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的菌株使用与试验1相同的菌株，同时培养这些食物中毒菌，与试验1同样地计测菌数。将培养基组成的比例和培养后的菌数示于图3。
如该图所示，在培养基的氯化钠浓度为0w/v％的情况下，副溶血弧菌的菌数小于102，生长极差。另一方面，在培养基的氯化钠浓度为0.5～3.0w/v％的情况下，所有菌均增殖为105以上的菌数。并且，在培养基的氯化钠浓度为3.5w/v％的情况下，沙门氏菌的菌数小于104，未充分增殖。
因此，可知：通过使培养基中含有0.5w/v％～3.0w/v％的氯化钠，能够在同一培养基中同时良好地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。特别是，在氯化钠浓度为1.5w/v％～2.5w/v％的范围中，金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌良好地增殖。另外，在氯化钠浓度为1.5w/v％～3.0w/v％的范围中，所有菌均增殖为106以上的菌数，可以特别均衡地使这4种菌种增殖。
<试验4：培养基的最佳糖浓度的验证>
在合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基中以各种浓度混合葡萄糖，使用所得到的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，对该情况下能否良好地增殖进行验证。
具体来说，将蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾及葡萄糖分别按照以下的组成混合，将pH调节为7.0，得到培养基。然后，通过高压灭菌将所得到的培养基在121℃灭菌15分钟。
(每1L)
蛋白胨：30g
酵母提取物：5g
硫酸镁七水合物：0.5g
氯化钠：15g
磷酸氢二钠：3.5g
磷酸二氢钾：1.5g
葡萄糖：0g、5g、10g
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的菌株使用与试验1相同的菌株，同时培养这些食物中毒菌，与试验1同样地计测菌数。将培养基组成的比例和培养后的菌数示于图4。
如该图所示，在培养基的葡萄糖浓度为0w/v％的情况下，所有菌均增殖为105以上的菌数。与此相对，在培养基的葡萄糖浓度为0.5w/v％、1.0w/v％的情况下，金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌未充分增殖。认为这是因为：若培养基中的葡萄糖的浓度高，则倍增时间变快，先增殖的大肠杆菌和沙门氏菌快速地增加，代谢、发酵进行，产生有机酸等，由于其影响会使金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的增殖受到阻碍。
即，通常，为了促进增殖而在培养基中含有葡萄糖，与大肠杆菌和沙门氏菌一起在相同的培养基中同时培养金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的情况下，可知葡萄糖反而会成为阻碍增殖的因素。
因此，本发明实施方式的培养基中优选不含有葡萄糖。
<试验5：培养基的最佳pH的验证>
将合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基的pH调节为各种值，使用所得到的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，对该情况下能否良好地增殖进行验证。
具体来说，将蛋白胨、酵母提取物、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾分别按照以下的组成混合，将pH分别调节为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，得到培养基。然后，通过高压灭菌将所得到的培养基在121℃灭菌15分钟。
(每1L)
蛋白胨：30g
酵母提取物：5g
硫酸镁七水合物：0.5g
氯化钠：15g
磷酸氢二钠：3.5g
磷酸二氢钾：1.5g
pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的菌株使用与试验1相同的菌株，同时培养这些食物中毒菌，与试验1同样地计测菌数。将培养基组成的比例和培养后的菌数示于图5。
如该图所示，在培养基的pH为6.0的情况下，金黄色葡萄球菌的菌数小于105，未充分增殖。另一方面，在培养基的pH为6.5～7.5的情况下，所有菌均增殖为105以上的菌数。并且，在培养基的pH为8.0的情况下，金黄色葡萄球菌的菌数小于105，未充分增殖。
因此，可知：通过使培养基的pH为6.5～7.5，可以在同一培养基中同时良好地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
<试验6：利用本发明实施方式的培养基和现有培养基进行的培养结束时的菌数的验证>
利用本发明实施方式的食物中毒菌的培养基和现有的食物中毒菌的培养基(专利文献2的No.17的培养基、TA10Broth primaham株式会社制)，分别同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，对该情况下能否良好地增殖进行验证。
本发明实施方式的食物中毒菌的培养基和现有的食物中毒菌的培养基的组成如下所述，通过高压灭菌将分别得到的培养基在121℃灭菌15分钟。
〔本发明实施方式的食物中毒菌的培养基〕
(每1L)
蛋白胨：30g
酵母提取物：5g
硫酸镁七水合物：0.5g
氯化钠：15g
磷酸氢二钠：3.5g
磷酸二氢钾：1.5g
pH7.0
〔现有的食物中毒菌的培养基〕
(每1L)
蛋白胨：10g
酵母提取物：5g
硫酸镁七水合物：0g
氯化钠：5g
磷酸氢二钠：7g
磷酸二氢钾：15g
肉提取物：5g
葡萄糖：0.5g
盐类：0.95g
pH6.3
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的菌株使用与试验1相同的菌株，同时培养这些食物中毒菌，与试验1同样地计测菌数。将培养基组成的比例和培养后的菌数示于图6。
如该图所示，在本发明实施方式的食物中毒菌的培养基中，所有菌均增殖为105以上的菌数。与此相对，在现有的食物中毒菌的培养基中，金黄色葡萄球菌的生长变得极差。
这样，可知：在同时培养沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的情况下，现有的食物中毒菌的培养基无法充分增殖金黄色葡萄球菌，但若利用本发明实施方式的食物中毒菌的培养基，则可以在同一培养基中同时良好地增殖全部这4种菌种。
<试验7：混入了杂菌时的培养基的验证>
在合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基中接种1.2×107cfu的枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为杂菌，同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，对该情况下能否良好地增殖进行验证。培养基使用了与试验6中使用的本发明实施方式的食物中毒菌的培养基同样的培养基。
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的菌株使用了与试验1同样的菌株。并且，将这4种食物中毒菌分别以10～50cfu接种至培养基，并一起接种枯草杆菌，在该杂菌的存在下同时培养4种食物中毒菌，与试验1同样地计测菌数。将培养基组成的比例和培养后的菌数示于图7。
如该图所示，若利用本发明实施方式的食物中毒菌的培养基，所有菌均增殖为105以上的菌数。
因此，可知：若利用该培养基，即使在含有杂菌的情况下，也可以在同一培养基中同时良好地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
<试验8：添加了食品时的培养基的验证>
一般来说，若向培养基中添加食品，则由于食品夹杂物或杂菌的影响，微生物培养结束时的菌数降低。因此，对本发明实施方式的培养基即使在添加了食品的情况下能否同时充分增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌进行了验证。
培养基使用了与试验6中使用的本发明实施方式的食物中毒菌的培养基同样的培养基。
大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的菌株使用了与试验1同样的菌株。作为食品，逐个使用了生火腿、米饭、及牛奶、三文鱼、生菜。
然后，对于培养基225g添加切碎的食品25g，分别接种10～50cfu的上述4种菌株，利用Stomacher混合60秒。将其在37℃培养20小时，与试验1同样地计测菌数。将此时的培养基组成的比例和培养后的菌数示于图8。
如该图所示，若利用本发明实施方式的食物中毒菌的培养基，在添加任一种食品的情况下全部菌均增殖为105以上的菌数。
因此，可知：即使在该培养基中添加了生火腿、米饭、牛奶、三文鱼、生菜中任一种食品的情况下，也可以在同一培养基中同时良好地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌。
<试验9：利用迅速检验法的食物中毒菌的检测的验证(1)>
利用试验1的实施例1及比较例1-3的4种培养基，将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌在37℃同时培养20小时。然后，将所增殖的食物中毒菌混合至每个培养基中，提取DNA。
接着，利用用于对这些食物中毒菌的DNA的扩增对象区域进行特异性扩增的引物，通过多重PCR同时扩增各扩增对象区域，对能否检测出所得到的扩增产物进行验证。具体来说，如下进行。
分别回收各1mL培养后的上述4种培养基，以5000×g进行10分钟的离心分离。接着，废弃上清，向所得到的沉淀中加入浓度20mg/mL的溶菌酶溶液(20mM Tris-HCl、pH8.0/2mM EDTA、1.2％TritonX-100)，在37℃进行30分钟溶菌处理。此外，利用DNeasyBlood&Tissue Kit(株式会社QIAGEN制)进行柱精制，由此得到DNA提取液。将该DNA提取液作为多重PCR中使用的试样。
接着，按照以下的组成调整PCR用反应液。引物委托Sigma-Aldrich Japan合同会社进行合成，除此以外的试剂使用宝生物株式会社制的产品。
基于PCR的基因扩增使用了热循环仪ep Gradient(Eppendorf株式会社)。反应条件如下所述。
将(2)～(4)进行40个循环
接着，将PCR用反应液供至微芯片电泳装置MultiNA(株式会社岛津制作所)，进行PCR扩增产物的尺寸的分析。将其结果示于图10。
该图中，利用含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的实施例1的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下能够充分检测出全部这4种菌。即，在图10的(a)的图表中，推测碱基长为177的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为187的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为232的峰表示金黄色葡萄球菌，推测碱基长为337的峰表示副溶血弧菌。
此处，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌各自设定的扩增产物的碱基序列长如下：大肠杆菌为157bp、沙门氏菌为180bp、金黄色葡萄球菌为236bp、副溶血弧菌为380bp，虽然与上述推测碱基长相差几bp～几十bp左右，但认为这是电泳中的泳动误差导致的。
接着，利用含有蛋白胨、但不含酵母提取物和硫酸镁的比较例1的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下无法充分检测出金黄色葡萄球菌。即，在图10的(b)的图表中，推测碱基长为171的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为181的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为346的峰表示副溶血弧菌，但未看到金黄色葡萄球菌的峰。
另外，利用含有蛋白胨和酵母提取物、但不含硫酸镁的比较例2的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下无法充分检测出金黄色葡萄球菌。即，在图10的(c)的图表中，推测碱基长为171的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为182的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为347的峰表示副溶血弧菌，但未看到金黄色葡萄球菌的峰。
另外，利用含有蛋白胨和硫酸镁、但不含酵母提取物的比较例3的培养基同时培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下无法充分检测出金黄色葡萄球菌。即，在图10的(d)的图表中，推测碱基长为172的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为182的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为348的峰表示副溶血弧菌，但未看到金黄色葡萄球菌的峰。
如上所述，可知：若利用合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的本发明实施方式的食物中毒菌的培养基，则能够同时充分地培养大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，通过使用了上述的多重PCR及电泳的迅速检验法，能够检测出全部4种菌。
<试验10：利用迅速检验法的食物中毒菌的检测的验证(2)>
利用试验3的实施例7-12及参考例1、2的8种培养基在37℃将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌同时培养20小时。然后，将所增殖的食物中毒菌与每个培养基混合，提取DNA。
接着，利用用于对这些食物中毒菌的DNA的扩增对象区域进行特异性扩增的引物，通过多重PCR扩增各扩增对象区域，对能否检测出所得到的扩增产物进行了验证。除了培养基以外，与试验9同样地进行。将其结果示于图11和图12。
在图11的(a)中，利用氯化钠浓度为0％的参考例1的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下无法充分检测出副溶血弧菌。即，该图中，推测碱基长为165的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为179的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为232的峰表示金黄色葡萄球菌，但未看到副溶血弧菌的峰。
与此相对，在图11的(b)中，利用氯化钠浓度为0.5％的实施例7的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下能够全部检测出这4种菌。即，该图中，推测碱基长为165的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为180的峰表示沙门氏菌。另外，虽然与大肠杆菌和沙门氏菌相比峰较小，但推测碱基长为235的峰表示金黄色葡萄球菌，推测碱基长为369的峰表示副溶血弧菌。
另外，在图11的(c)中，利用氯化钠浓度为1.0％的实施例8的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下能够全部检测出这4种菌。即，该图中，推测碱基长为170的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为185的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为369的峰表示副溶血弧菌。另外，虽然与大肠杆菌、沙门氏菌和副溶血弧菌相比峰较小，但推测碱基长为240的峰表示金黄色葡萄球菌。
另外，在图11的(d)中，利用氯化钠浓度为1.5％的实施例9的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下能够充分地检测出全部这4种菌。即，该图中，推测碱基长为169的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为184的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为235的峰表示金黄色葡萄球菌，推测碱基长为361的峰表示副溶血弧菌。
另外，在图12的(e)中，利用氯化钠浓度为2.0％的实施例10的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下能够充分地检测出全部这4种菌。即，该图中，推测碱基长为170的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为185的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为236的峰表示金黄色葡萄球菌，推测碱基长为362的峰表示副溶血弧菌。
另外，在图12的(f)中，利用氯化钠浓度为2.5％的实施例11的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下能够充分地检测出全部这4种菌。即，该图中，推测碱基长为173的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为187的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为240的峰表示金黄色葡萄球菌，推测碱基长为364的峰表示副溶血弧菌。
另外，在图12的(g)中，利用氯化钠浓度为3.0％的实施例12的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下能够充分地检测出全部这4种菌。即，该图中，推测碱基长为171的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为186的峰表示沙门氏菌，推测碱基长为237的峰表示金黄色葡萄球菌，推测碱基长为362的峰表示副溶血弧菌。
另一方面，在图12的(h)中，利用氯化钠浓度为3.5％的参考例2的培养基同时培养了大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可知该情况下无法充分检测出沙门氏菌。即，该图中，推测碱基长为173的峰表示大肠杆菌，推测碱基长为244的峰表示金黄色葡萄球菌，推测碱基长为367的峰表示副溶血弧菌。另外，推测碱基长为189的微弱的峰表示沙门氏菌，但该峰非常小。
如上所述，在基于氯化钠浓度进行比较的情况下，特别良好地检测出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌全部4种菌种的情况是氯化钠浓度为1.5～3.0％的情况。
这样，可知：若利用本发明实施方式的食物中毒菌的培养基，则能够同时充分地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，因此，通过使用了上述的多重PCR及电泳的迅速检验法可以检测出全部这4种菌。
本发明不限定于以上的实施方式和实施例，可以在本发明的范围内实施各种变更。
工业实用性
本发明可以在食品检验、流行病学环境检验、环境检验及临床试验、家畜卫生中同时适当地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，可以优选用于至少检测出它们中的任一种的情况。

Claims (10)

1.一种培养基，其特征在于，其含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁。
2.一种培养基，其特征在于，在权利要求1所述的培养基中含有1.5w/v％～3.0w/v％的氯化钠。
3.一种培养基，其特征在于，在权利要求1或2所述的培养基中不含有糖。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的培养基，其特征在于，含有1.0w/v％以上的所述蛋白胨，进而含有磷酸氢二钠及磷酸二氢钾，且pH为6.5～7.5。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的培养基，用于使至少包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌同时增殖。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的培养基，用于使大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌同时增殖。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的培养基，其特征在于，使所述多种食物中毒菌中的各菌1cfu/ml在20小时内分别同时增殖为105cfu/ml以上。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的培养基，其特征在于，按照下述方式进行增殖：在使所述多种食物中毒菌中的各菌1cfu/ml增殖20小时时，菌数最多的菌与菌数最少的菌的菌数之差小于103cfu/ml。
9.一种食物中毒菌的检测方法，其特征在于，
利用含有蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基，使至少包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌同时增殖，
由所增殖的所述多种食物中毒菌提取DNA，将用于对所述多种食物中毒菌的DNA的扩增对象区域进行特异性扩增的引物加入至PCR用溶液，通过PCR使所述扩增对象区域扩增，对所得到的扩增产物进行检测。
10.根据权利要求9所述的食物中毒菌的检测方法，其特征在于，使所述培养基中含有1.5w/v％～3.0w/v％的氯化钠。
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