JP3734885B2 - 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 - Google Patents
抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3734885B2 JP3734885B2 JP15273096A JP15273096A JP3734885B2 JP 3734885 B2 JP3734885 B2 JP 3734885B2 JP 15273096 A JP15273096 A JP 15273096A JP 15273096 A JP15273096 A JP 15273096A JP 3734885 B2 JP3734885 B2 JP 3734885B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- antibacterial
- amino acid
- antibacterial peptide
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、抗菌性ペプチドおよび抗菌剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、副作用が無く、少量で、広範囲の微生物に対して抗菌作用を有する新規な抗菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、脊椎動物、昆虫、植物等に由来するタンパク質およびペプチドのなかには抗菌性を有するものが数多く存在することが知られている。例えば、脊椎動物に由来するものとしては、リゾチーム［プロシーディングス・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイエティ・オブ・ロンドン（Proceedings of the Royal Society of London）、第９３巻、第３０６〜３１７ページ、１９２２年、およびブレティン・デ・ラ・ソシエーテ・デ・キミー・ビオロジーク（Bulletin de la Societe Chimie Biologique）、第５０巻、第２５４３〜２５５１ページ、１９８６年］、ラクトペルオキシダーゼ［ヨーロピアン・ジャ−ナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）、第１９８巻、第７３３〜７３９ページ、１９９１年、およびディーエヌエー・セル・バイオロジー（DNA Cell Biology）、第９巻、第４９９〜５０９ページ、１９９０年］、ラクトフェリン［ブリティッシュ・ジャーナル・メディシン（British Journal of Medicine ）、第１巻、第６９〜７２ページ、１９７２年、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）、第１３巻、第５５９〜５７０ページ、１９７０年、およびインフェクション・アンド・イミュニティ（Infection and Immunity）、第５１巻、第３７３〜３７７ページ、１９８６年］等のタンパク質、および分子量が３〜４キロダルトンのディフェンシン［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（European Journal of Haematology ）、第４４巻、第１〜８ページ、１９９０年、およびブラッド（Blood ）第７６巻、第２１６９〜２１８１ページ、１９９０年］等のペプチド等について、その構造および殺菌作用等が知られている。また、昆虫に由来するものとしては、セクロピンまたはディフェンシン［バイオエッセイズ（BioEssays ）第１３巻、第６５７〜６６３ページ、１９９１年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Proceedings of the National Academy of Science of U.S.A.）、第８６巻、第２６２〜２６６ページ、１９８９年、およびビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochimica Biophysica Acta）、第１１３２巻、第２０３〜２０６巻、１９９２年］等の抗菌性のペプチドが知られ、さらに、植物の種子からも抗菌性のペプチドが単離されている［グッド・ジャミー（Goode Jamie ）編、「アンチマイクロバイアル・ペプチズ（Antimicrobial Peptides) 」、第９１〜１０６ページ、ワイリー(Wiley) 社、１９９４年］。
【０００３】
ウシ由来の抗菌性ペプチドについても、従来いくつかの報告がなされている。例えば、乳由来としては、ラクトフェリンをペプシンで消化した際に生じるＮ末端領域のペプチドであるラクトフェリシン（登録商標）Ｂ［ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology ）、第７３巻、第４７２〜４７９ページ、１９９２年］、カゼインから生じるカソシジン−Ｉ［フェブス・レターズ（FEBS letters）、第３７２巻、第１８５〜１８８ページ、１９９５年］、精液から単離されたセミナルプラスミン［ネイチャー（Nature）、第２７９巻、第７２５〜７２８ページ、１９７９年］、および好中球由来のインドリシジン［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry ）、第２６７巻、第４２９２〜４２９５ページ、１９９２年］、バクテネシン［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry ）、第２６３巻、第９５７３〜９５７５ページ、１９８８年］、インフェクション・アンド・イミュニティ（Infection and Immunity）、第５７巻、第３１４２〜３１４６ページ、１９８９年］等が抗菌性ペプチドとして知られている。
【０００４】
一方、従来から種々の微生物に対して抗菌作用を有するペプチドについては多数の発明が知られている。例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に有効なホスホノトリペプチド（特開昭５７−１０６６８９号公報）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭５８−１３５９４号公報）、環状ペプチド誘導体（特開昭５８−２１３７５５号公報）、抗菌および抗ウイルス作用を示すペプチド（特開昭５９−５１２４７号公報）、酵母に有効なポリペプチド（特開昭６０−１３０５９９号公報）、グラム陽性菌に有効な糖ペプチド誘導体（特開昭６０−１７２９９８号公報、特開昭６１−２５１６９９号公報、特開昭６３−４４５９８号公報）、グラム陽性菌に有効なオリゴペプチド（特開昭６２−２２７９８号公報）、ペプチド系抗生物質（特開昭６２−５１６９７号公報、特開昭６３−１７８９７号公報）、その他、北米産カブトガニの血球から抽出した抗菌性ペプチド（特開平２−５３７９９号公報）、蜂蜜の血リンパから単離した抗菌性ペプチド（特開平２−５０００８４号公報）等である。
【０００５】
ところで、血清中にはコレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質が存在する。これらの脂質はそのままでは血清には溶解しないので、アポリポタンパク質と結合したリポタンパク質の微粒子として血清中に存在している。アポリポタンパク質は、アポＡからＥまでの５つに分類され、さらにアポＡはＡ−Ｉ、Ａ−IIに、アポＣはＣ−Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−IIIに分かれる（日経メディカル・日経バイオテク編、「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第９ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年）。一方、血清中のリポタンパク質は、トリグリセリドを主要脂質とするカイロミクロン（乳状脂粒）、エステル型コレステロールを主要脂質とする超低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、およびリン脂質を主要脂質とする高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）等に分類されている［野間惟道編、「医科学大辞典」、第４９巻、第８４〜８５ページ、講談社、１９８４年］。
【０００６】
従来、ヒト・アポリポプロテインＡ−Ｉを含むリポタンパク質画分に抗菌性があることが報告されている［モレキュラー・セル・バイオケミストリー（Molecular Cell Biochemistry ）、第１１９巻、第１７１〜１７８ページ、１９９３年、および特公平８−５７９８号公報］。
しかしながら、ウシ血清中から単離され、特定のアミノ酸配列を有するペプチドの抗菌作用については、文献が皆無であり、従来知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術から明らかなとおり、各種の抗菌性ペプチドが知られているが、適用対象毎の抗菌性ペプチドの選択の余地を増大する目的から、さらに、望ましくない副作用（例えば、抗原性等）がなく、耐熱性があり、かつ強い抗菌作用を有する抗菌性ペプチドを自然界から見い出すことが望まれていた。特に、安価なウシ血清等の原料より大量に調製が可能で、かつ細菌および真菌（カビ、酵母）等の微生物に対して抗菌作用を有し、動物細胞に対しては抗菌作用がない動物組織培養用培地添加剤として有用な抗菌性ペプチドが望まれていた。
【０００８】
この発明は、以上のとおりの従来技術の状況に鑑みてなされたものであり、副作用が無く、少量で、広範囲の微生物に対して抗菌作用を有する新規な抗菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記の課題を解決するものとして、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドを提供する。
また、この発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、このペプチドの薬学的に許容される誘導体、このペプチドの薬学的に許容される塩類、またはこれらの２以上の混合物を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【００１０】
なお、この発明の抗菌性ペプチドおよび抗菌剤においては、前記ペプチドが、ウシ胎児血清より単離されたペプチドであることを好ましい態様としている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明の抗菌性ペプチドの出発原料はウシ血清であり、例えば、市販の成牛血清、ウシ新生児血清、ウシ胎児血清を例示することができ、特にウシ胎児血清が望ましい。これらの出発原料からこの発明の抗菌性ペプチドを常法により容易に単離精製することができる。例えば、ウシ胎児血清を、疎水クロマトグラフ、ゲル濾過、および逆相クロマトグラフ等の順序で処理し、抗菌活性を有することが確認されている画分を順次に精製することによって、この発明の特定アミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドを単離精製することができる。
【００１２】
使用する疎水クロマトグラフ用樹脂は、ブチル基を有する樹脂が望ましく、例えば、市販のブチル・トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）、ブチル・トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）、ブチル・セファロース４ＦＦ（ファルマシア社製）等を例示することができる。
使用するゲル濾過用担体は、５００キロダルトンの排除限界分子量を有する担体が望ましく、例えば、市販のＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦＡ−５０Ｆ（旭化成社製）、ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＡＫ ３００（日本ウォターズ社製）等を例示することができる。
【００１３】
使用する逆相クロマトグラフ用担体は、リガンドとして炭素数４の直鎖状炭化水素が望ましく、例えば、市販のＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４（ＶＹＤＡＣ社製）、マイクロボンダスフェアーＣ4 （日本ウォターズ社製）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ4 （ワイエムシィ社製）等を例示することができる。
以上のようにして単離精製した抗菌性ペプチドは、後記する試験例２に示すとおり、配列番号１に記載の特定のアミノ酸配列を有しており、また、試験例１に示すとおり、細菌および真菌（酵母）に対する抗菌作用を有している。なお、この発明の抗菌性ペプチドは、そのアミノ酸配列からウシ由来アポリポプロテイン様物質であるものと予測されたが、前記ヒト・アポリポプロテインＡ−Ｉとは、そのアミノ酸配列において全く異なる物質であった。
【００１４】
次に、この発明の抗菌剤について説明する。この発明の抗菌剤は、前記のとおりに単離精製した抗菌性ペプチド、このペプチドの薬学的に許容される誘導体、このペプチドの薬学的に許容される塩類（以下、これらをまとめて「ペプチド類」と記載することがある）、またはこれらの２以上の混合物を有効成分として含有する。抗菌性ペプチドの誘導体は、抗菌性ペプチドの一部置換体または付加化合物等のペプチド誘導体であり、例えば、カルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体を例示することができる。また、抗菌性ペプチドの塩類は、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩を例示することができる。
【００１５】
この発明の抗菌剤は、一般的な医薬製剤の形態でヒトまたは動物に投与することができ、例えば、静注、皮下注、または経口によりヒトまたは動物に投与することができる。特に、この発明の抗菌剤の有効成分であるペプチド類は、毒性が極めて低く、ＬＤ50は１００ｍｇ／体重ｋｇ以上であるため、ヒトまたは動物に対して安全に使用することができ、経口投与による抗下痢剤としても使用することができる。
【００１６】
この発明の抗菌剤は、ペプチド類またはこれらの２以上の混合物を５ｍｇ／ｇ以上の濃度で含有させて製剤化することができ、その他の成分としては、医薬製造分野で通常使用される各種の担体、例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤の希釈剤または賦形剤等を用いることができる。また、医薬製剤として、各種の剤形が使用目的、使用対象に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用することができる。さらに錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸用被錠フィルムコーティング錠または二重錠、多層錠とすることができる。注射剤として調製される場合は、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を製剤中に含有させてもよく、また、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合してもよい。上記各形態の医薬製剤中には、さらに必要に応じて慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を配合することができ、また、他の医薬品有効成分を含有させることもできる。
【００１７】
この発明の抗菌剤は、医薬品としてのみならず、食品、飼料、化粧品等のようにヒトまたは動物の体内に摂取され、または体表面に適用される製品、その他一般に細菌の増殖を防止または抑制することが望まれるあらゆる製品に配合して使用することができ、またこの発明の抗菌剤により、それらの製品または原料素材を処理することができる。すなわち、食品（例えば、チュウインガム等）、医薬品（例えば、目薬、乳房炎治療剤、下痢防止剤、水虫薬等）、医薬部外品（例えば、口中洗浄剤、制汗剤、養毛剤等）、各種化粧品（例えば、整髪料、クリーム、乳液等）、各種歯磨用品（例えば、歯磨、歯ブラシ等）、各種生理用品、各種ベビー用品（例えば、オムツ等）、各種高齢者用品（例えば、入れ歯固定剤、オムツ等）、各種洗剤（例えば、石鹸、薬用石鹸、シャンプー、リンス、洗濯用洗剤、キッチン用洗剤、住宅用洗剤等）、各種除菌用品（キッチン用除菌ペーパー、トイレット用除菌ペーパー等）、飼料（例えば、ペットフード等）、それらの原料となる素材、その他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行ってもよく、またその他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品の処理に用いることができる。特に、この発明の抗菌剤は、有効成分であるペプチド類が哺乳動物（ウシ）由来であり、動物細胞に対して有害な作用を持たないため、動物組織培養用培地添加剤として有用である。
【００１８】
さらに、この発明の抗菌剤は、必要に応じて、他の抗菌剤と併用して使用することもできる。
次に、試験例を示してこの発明を詳述する。
試験例１
この試験は、この発明の抗菌性ペプチドの抗菌作用を調べるために行った。
（１）試料の調製
実施例１と同一の方法により、ウシ胎児血清より単離した配列番号１のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドを、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、それぞれ０．１μｇ／μｌ、０．２５μｇ／μｌ、０．５μｇ／μｌ、１．０μｇ／μｌ、１．５μｇ／μｌ、および２μｇ／μｌの各濃度で溶解し、試料溶液として用いた。
（２）試験菌株懸濁液の調製
各試験菌株懸濁液を下記のとおり調製した。
▲１▼エシェリキア・コリ懸濁液の調製
エシェリキア・コリ［Escherichia coli ATCC 25922 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲）］を保存スラントから１白金耳採取し、これを２％ペプトン；１％酵母エキス；２％グルコースからなる増殖培地５ｍｌに接種し、３０℃、２日間振とう培養し、この培養液０．１ｍｌを新しい増殖培地５ｍｌに接種し、３０℃で６時間振とう培養した。培養後に集菌し、蒸留水で洗浄、遠心分離を２回繰り返し、さらに蒸留水に懸濁した。菌数は血球計算盤を用いて計数し、細胞数を４〜６×１０4 細胞／１０μｌに調整し、これをエシェリキア・コリ懸濁液として用いた。
▲２▼スタヒロコッカス・アウレウス懸濁液の調製
スタヒロコッカス・アウレウス［Staphylococcus aureus IFO 12732 （発酵研究所より分譲］を用い、増殖培地として１％ペプトン；０．２％酵母エキス；０．１％硫酸マグネシウム・七水和物からなる増殖培地を用いたことを除き、前記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法により懸濁液を調製し、これをスタヒロコッカス・アウレウス懸濁液として用いた。
▲３▼サッカロミセス・セレビシエ懸濁液の調製
サッカロミセス・セレビシエ［Saccharomyces cerevisiae A364A（イ−スト・ジェネティック・ストック・センタ−より分譲］を用いたことを除き、前記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法により懸濁液を調製し、これをサッカロミセス・セレビシエ懸濁液として用いた。
▲４▼カンジダ・アルビカンス懸濁液の調製
カンジダ・アルビカンス［Candida albicans ATCC 10259 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲）］を用い、増殖培地として１％ポリペプトン；２％グルコースからなる増殖培地を用たことを除き、前記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法により懸濁液を調製し、これをカンジダ・アルビカンス懸濁液として用いた。
（３）試験方法
各試験菌株懸濁液１０μｌと各濃度試料溶液４０μｌとを混合し、３７℃で２時間保温した。その後、混合液を寒天培地（前記各試験菌株毎の増殖培地に１．５％の寒天を添加した培地）にまき、各試験菌株毎の最適培養条件でそれぞれ培養し、生じたコロニー数を計測した。各試験菌株毎の最適培養条件は、エシェリキア・コリは、培養温度３０℃、培養時間１４時間とし、スタヒロコッカス・アウレウスおよびサッカロミセス・セレビシエは、培養温度３０℃、培養時間２日間とし、カンジダ・アルビカンスは、培養温度３０℃、培養時間１日間とした。
（４）試験結果
この試験の結果は、図１および表１に示すとおりである。図１は、抗菌性ペプチド濃度と生菌数との関係を示し、図中縦軸および横軸は、それぞれ生菌数［ＣＦＵ（colony foming unit）は細胞のコロニー形成単位を示す］および抗菌性ペプチドの濃度を示し、●、■、△および◇は、それぞれエシェリキア・コリ、スタヒロコッカス・アウレウス、サッカロミセス・セレビシエおよびカンジダ・アルビカンスを示す。
【００１９】
図１から明らかなとおり、抗菌性ペプチド濃度が増加するとともに生菌数は著しく減少した。図１から求められる各試験菌株に対する抗菌性ペプチドの最小阻止濃度を示した表１から明らかなとおり、この発明の抗菌性ペプチドは、１．６μｇ／μｌという低い濃度で、この試験に使用された全ての試験菌株に対して強い抗菌作用を示した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
試験例２
この試験は、試験例１で使用した抗菌性ペプチドのアミノ酸配列を決定するために行った。
試験例１で使用した抗菌性ペプチド０．２ｍｇに蒸留水１６０μｌを添加し、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を４０μｌ添加して溶解し、これにピログルタミン酸アミノペプチダーゼ溶液（０．５Ｕ／ｍｌ）を８μｌ添加して３７℃で８時間酵素処理した。その後、この反応液にクロロホルム：メタノール（２：１）溶液を１０ｍｌ添加して沈殿させ、遠心分離によって沈殿物を回収した。この沈殿物に、さらにエタノール：エーテル（３：２）溶液を１０ｍｌ添加して遠心分離を行い、沈殿物を回収した。
【００２２】
回収した沈殿物の一部（８０μｇ）を６Ｍ尿素を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌで溶解し、さらに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２００μｌ添加し、のちリシルエンドペプチダーゼ溶液（１μｇ／５０μｌ）を５０μｌ添加して３７℃で８時間酵素処理した。
これとは別に、沈殿物の一部（８０μｇ）を６Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌで溶解し、さらに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μｌ添加し、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加して３７℃で８時間反応させた。
【００２３】
前記リシルエンドペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎの２種の反応液中のペプチド断片をＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィーによりそれぞれ精製し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を気相式自動アミノ酸シーケンサー（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社製）を用いて測定した。
【００２４】
その結果、それぞれのペプチド断片のアミノ酸配列から、ペプチド全体のアミノ酸配列を決定し、この抗菌性ペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列を有することを確認した。
次に実施例を示し、この発明をさらに具体的に説明するが、この発明は、以下の例に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
実施例１
市販のウシ胎児血清（シグマ社製）４００ｍｌに、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製）１００ｍｌを添加し、これを疎水クロマト樹脂［ブチル・トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）］に添加して吸着させ、この吸着樹脂をカラムに充填し、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液および蒸留水で溶出し、得られた抗菌活性を有する蒸留水溶出画分を、ゲル濾過担体［ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）］を使用し、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）を移動相に用いたゲル濾過を行い、分子量約１０キロダルトン付近の抗菌活性を有する画分を回収した。
【００２６】
さらに、この画分を、逆相クロマト担体［ＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４（ＶＹＤＡＣ社製）］を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製）を含む３２〜５６％アセトニトリル（和光純薬工業社製）を用いた直線濃度勾配溶出法による逆相クロマトグラフ法により、アセトニトリル濃度４８〜５０％に溶出される抗菌活性を有するピークを回収した。
【００２７】
この回収液を凍結乾燥し、抗菌性ペプチドの精製標品約２．４ｍｇを得た。この抗菌性ペプチドの精製標品は、ＳＤＳ電気泳動において単一バンドを示し、前記試験例２と同一の方法によりアミノ酸配列を決定した結果、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有していた。
実施例２
実施例１と同一の方法で得た抗菌性ペプチド５ｍｇを、メチルセルロ−ス５ｍｇおよび精製水１ｇの混合液に溶解し、抗菌剤を製造した。
実施例３
次の組成の点眼薬を常法により製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分はいずれも市販品である。
【００２８】
ホウ酸 １．６（％）
実施例１の抗菌性ペプチド １．０
メチルセルロース ０．５
精製水 ９６．９
実施例４
次の組成の歯磨を常法により製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００２９】
第二リン酸カルシウム・二水和物 ３６．０（％）
ソルビトール ４５．０
グリセリン １５．０
カルボキシメチルセルロース・ナトリウム １．５
ソルビタン脂肪酸エステル ０．５
サッカリンナトリウム １．０
実施例１の抗菌性ペプチド １．０
実施例５
次の組成の皮膚洗浄剤を常法により製造した。この皮膚洗浄剤は、使用時水で５０倍に希釈して使用する。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００３０】
塩化ナトリウム ８．０（％）
実施例１の抗菌性ペプチド ０．７
精製水 ９１．３
実施例６
次の組成の防黴剤を常法により製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００３１】
エチルアルコール ２０．０（％）
実施例１の抗菌性ペプチド ０．６
精製水 ７９．４
実施例７
次の組成の動物組織培養用培地をにより製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００３２】
塩化カリウム ０．０４（％）
リン酸二水素カリウム ０．００６
塩化ナトリウム ０．８
炭酸水素ナトリウム ０．０３５
リン酸水素二ナトリウム・七水和物 ０．００９
グルコース ０．１
実施例１の抗菌性ペプチド ０．５
精製水 ９８．５１
【００３３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、哺乳動物（ウシ）に由来し、広範囲の微生物に対して抗菌作用を示す新規な抗菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分とする抗菌剤が提供される。この抗菌剤によって、ヒトまたは動物、あるいは各種物品を安全かつ効果的に抗菌処理することが可能となる。
【００３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】抗菌性ペプチド濃度と生菌数との関係を示すグラフ図である。
【発明の属する技術分野】
この発明は、抗菌性ペプチドおよび抗菌剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、副作用が無く、少量で、広範囲の微生物に対して抗菌作用を有する新規な抗菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、脊椎動物、昆虫、植物等に由来するタンパク質およびペプチドのなかには抗菌性を有するものが数多く存在することが知られている。例えば、脊椎動物に由来するものとしては、リゾチーム［プロシーディングス・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイエティ・オブ・ロンドン（Proceedings of the Royal Society of London）、第９３巻、第３０６〜３１７ページ、１９２２年、およびブレティン・デ・ラ・ソシエーテ・デ・キミー・ビオロジーク（Bulletin de la Societe Chimie Biologique）、第５０巻、第２５４３〜２５５１ページ、１９８６年］、ラクトペルオキシダーゼ［ヨーロピアン・ジャ−ナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）、第１９８巻、第７３３〜７３９ページ、１９９１年、およびディーエヌエー・セル・バイオロジー（DNA Cell Biology）、第９巻、第４９９〜５０９ページ、１９９０年］、ラクトフェリン［ブリティッシュ・ジャーナル・メディシン（British Journal of Medicine ）、第１巻、第６９〜７２ページ、１９７２年、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）、第１３巻、第５５９〜５７０ページ、１９７０年、およびインフェクション・アンド・イミュニティ（Infection and Immunity）、第５１巻、第３７３〜３７７ページ、１９８６年］等のタンパク質、および分子量が３〜４キロダルトンのディフェンシン［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（European Journal of Haematology ）、第４４巻、第１〜８ページ、１９９０年、およびブラッド（Blood ）第７６巻、第２１６９〜２１８１ページ、１９９０年］等のペプチド等について、その構造および殺菌作用等が知られている。また、昆虫に由来するものとしては、セクロピンまたはディフェンシン［バイオエッセイズ（BioEssays ）第１３巻、第６５７〜６６３ページ、１９９１年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Proceedings of the National Academy of Science of U.S.A.）、第８６巻、第２６２〜２６６ページ、１９８９年、およびビオキミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochimica Biophysica Acta）、第１１３２巻、第２０３〜２０６巻、１９９２年］等の抗菌性のペプチドが知られ、さらに、植物の種子からも抗菌性のペプチドが単離されている［グッド・ジャミー（Goode Jamie ）編、「アンチマイクロバイアル・ペプチズ（Antimicrobial Peptides) 」、第９１〜１０６ページ、ワイリー(Wiley) 社、１９９４年］。
【０００３】
ウシ由来の抗菌性ペプチドについても、従来いくつかの報告がなされている。例えば、乳由来としては、ラクトフェリンをペプシンで消化した際に生じるＮ末端領域のペプチドであるラクトフェリシン（登録商標）Ｂ［ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology ）、第７３巻、第４７２〜４７９ページ、１９９２年］、カゼインから生じるカソシジン−Ｉ［フェブス・レターズ（FEBS letters）、第３７２巻、第１８５〜１８８ページ、１９９５年］、精液から単離されたセミナルプラスミン［ネイチャー（Nature）、第２７９巻、第７２５〜７２８ページ、１９７９年］、および好中球由来のインドリシジン［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry ）、第２６７巻、第４２９２〜４２９５ページ、１９９２年］、バクテネシン［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry ）、第２６３巻、第９５７３〜９５７５ページ、１９８８年］、インフェクション・アンド・イミュニティ（Infection and Immunity）、第５７巻、第３１４２〜３１４６ページ、１９８９年］等が抗菌性ペプチドとして知られている。
【０００４】
一方、従来から種々の微生物に対して抗菌作用を有するペプチドについては多数の発明が知られている。例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に有効なホスホノトリペプチド（特開昭５７−１０６６８９号公報）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭５８−１３５９４号公報）、環状ペプチド誘導体（特開昭５８−２１３７５５号公報）、抗菌および抗ウイルス作用を示すペプチド（特開昭５９−５１２４７号公報）、酵母に有効なポリペプチド（特開昭６０−１３０５９９号公報）、グラム陽性菌に有効な糖ペプチド誘導体（特開昭６０−１７２９９８号公報、特開昭６１−２５１６９９号公報、特開昭６３−４４５９８号公報）、グラム陽性菌に有効なオリゴペプチド（特開昭６２−２２７９８号公報）、ペプチド系抗生物質（特開昭６２−５１６９７号公報、特開昭６３−１７８９７号公報）、その他、北米産カブトガニの血球から抽出した抗菌性ペプチド（特開平２−５３７９９号公報）、蜂蜜の血リンパから単離した抗菌性ペプチド（特開平２−５０００８４号公報）等である。
【０００５】
ところで、血清中にはコレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質が存在する。これらの脂質はそのままでは血清には溶解しないので、アポリポタンパク質と結合したリポタンパク質の微粒子として血清中に存在している。アポリポタンパク質は、アポＡからＥまでの５つに分類され、さらにアポＡはＡ−Ｉ、Ａ−IIに、アポＣはＣ−Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−IIIに分かれる（日経メディカル・日経バイオテク編、「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第９ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年）。一方、血清中のリポタンパク質は、トリグリセリドを主要脂質とするカイロミクロン（乳状脂粒）、エステル型コレステロールを主要脂質とする超低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、およびリン脂質を主要脂質とする高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）等に分類されている［野間惟道編、「医科学大辞典」、第４９巻、第８４〜８５ページ、講談社、１９８４年］。
【０００６】
従来、ヒト・アポリポプロテインＡ−Ｉを含むリポタンパク質画分に抗菌性があることが報告されている［モレキュラー・セル・バイオケミストリー（Molecular Cell Biochemistry ）、第１１９巻、第１７１〜１７８ページ、１９９３年、および特公平８−５７９８号公報］。
しかしながら、ウシ血清中から単離され、特定のアミノ酸配列を有するペプチドの抗菌作用については、文献が皆無であり、従来知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術から明らかなとおり、各種の抗菌性ペプチドが知られているが、適用対象毎の抗菌性ペプチドの選択の余地を増大する目的から、さらに、望ましくない副作用（例えば、抗原性等）がなく、耐熱性があり、かつ強い抗菌作用を有する抗菌性ペプチドを自然界から見い出すことが望まれていた。特に、安価なウシ血清等の原料より大量に調製が可能で、かつ細菌および真菌（カビ、酵母）等の微生物に対して抗菌作用を有し、動物細胞に対しては抗菌作用がない動物組織培養用培地添加剤として有用な抗菌性ペプチドが望まれていた。
【０００８】
この発明は、以上のとおりの従来技術の状況に鑑みてなされたものであり、副作用が無く、少量で、広範囲の微生物に対して抗菌作用を有する新規な抗菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記の課題を解決するものとして、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドを提供する。
また、この発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、このペプチドの薬学的に許容される誘導体、このペプチドの薬学的に許容される塩類、またはこれらの２以上の混合物を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。
【００１０】
なお、この発明の抗菌性ペプチドおよび抗菌剤においては、前記ペプチドが、ウシ胎児血清より単離されたペプチドであることを好ましい態様としている。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明の抗菌性ペプチドの出発原料はウシ血清であり、例えば、市販の成牛血清、ウシ新生児血清、ウシ胎児血清を例示することができ、特にウシ胎児血清が望ましい。これらの出発原料からこの発明の抗菌性ペプチドを常法により容易に単離精製することができる。例えば、ウシ胎児血清を、疎水クロマトグラフ、ゲル濾過、および逆相クロマトグラフ等の順序で処理し、抗菌活性を有することが確認されている画分を順次に精製することによって、この発明の特定アミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドを単離精製することができる。
【００１２】
使用する疎水クロマトグラフ用樹脂は、ブチル基を有する樹脂が望ましく、例えば、市販のブチル・トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）、ブチル・トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）、ブチル・セファロース４ＦＦ（ファルマシア社製）等を例示することができる。
使用するゲル濾過用担体は、５００キロダルトンの排除限界分子量を有する担体が望ましく、例えば、市販のＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＦＡ−５０Ｆ（旭化成社製）、ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＡＫ ３００（日本ウォターズ社製）等を例示することができる。
【００１３】
使用する逆相クロマトグラフ用担体は、リガンドとして炭素数４の直鎖状炭化水素が望ましく、例えば、市販のＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４（ＶＹＤＡＣ社製）、マイクロボンダスフェアーＣ4 （日本ウォターズ社製）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ4 （ワイエムシィ社製）等を例示することができる。
以上のようにして単離精製した抗菌性ペプチドは、後記する試験例２に示すとおり、配列番号１に記載の特定のアミノ酸配列を有しており、また、試験例１に示すとおり、細菌および真菌（酵母）に対する抗菌作用を有している。なお、この発明の抗菌性ペプチドは、そのアミノ酸配列からウシ由来アポリポプロテイン様物質であるものと予測されたが、前記ヒト・アポリポプロテインＡ−Ｉとは、そのアミノ酸配列において全く異なる物質であった。
【００１４】
次に、この発明の抗菌剤について説明する。この発明の抗菌剤は、前記のとおりに単離精製した抗菌性ペプチド、このペプチドの薬学的に許容される誘導体、このペプチドの薬学的に許容される塩類（以下、これらをまとめて「ペプチド類」と記載することがある）、またはこれらの２以上の混合物を有効成分として含有する。抗菌性ペプチドの誘導体は、抗菌性ペプチドの一部置換体または付加化合物等のペプチド誘導体であり、例えば、カルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体を例示することができる。また、抗菌性ペプチドの塩類は、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩を例示することができる。
【００１５】
この発明の抗菌剤は、一般的な医薬製剤の形態でヒトまたは動物に投与することができ、例えば、静注、皮下注、または経口によりヒトまたは動物に投与することができる。特に、この発明の抗菌剤の有効成分であるペプチド類は、毒性が極めて低く、ＬＤ50は１００ｍｇ／体重ｋｇ以上であるため、ヒトまたは動物に対して安全に使用することができ、経口投与による抗下痢剤としても使用することができる。
【００１６】
この発明の抗菌剤は、ペプチド類またはこれらの２以上の混合物を５ｍｇ／ｇ以上の濃度で含有させて製剤化することができ、その他の成分としては、医薬製造分野で通常使用される各種の担体、例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤の希釈剤または賦形剤等を用いることができる。また、医薬製剤として、各種の剤形が使用目的、使用対象に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用することができる。さらに錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸用被錠フィルムコーティング錠または二重錠、多層錠とすることができる。注射剤として調製される場合は、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を製剤中に含有させてもよく、また、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合してもよい。上記各形態の医薬製剤中には、さらに必要に応じて慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を配合することができ、また、他の医薬品有効成分を含有させることもできる。
【００１７】
この発明の抗菌剤は、医薬品としてのみならず、食品、飼料、化粧品等のようにヒトまたは動物の体内に摂取され、または体表面に適用される製品、その他一般に細菌の増殖を防止または抑制することが望まれるあらゆる製品に配合して使用することができ、またこの発明の抗菌剤により、それらの製品または原料素材を処理することができる。すなわち、食品（例えば、チュウインガム等）、医薬品（例えば、目薬、乳房炎治療剤、下痢防止剤、水虫薬等）、医薬部外品（例えば、口中洗浄剤、制汗剤、養毛剤等）、各種化粧品（例えば、整髪料、クリーム、乳液等）、各種歯磨用品（例えば、歯磨、歯ブラシ等）、各種生理用品、各種ベビー用品（例えば、オムツ等）、各種高齢者用品（例えば、入れ歯固定剤、オムツ等）、各種洗剤（例えば、石鹸、薬用石鹸、シャンプー、リンス、洗濯用洗剤、キッチン用洗剤、住宅用洗剤等）、各種除菌用品（キッチン用除菌ペーパー、トイレット用除菌ペーパー等）、飼料（例えば、ペットフード等）、それらの原料となる素材、その他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行ってもよく、またその他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品の処理に用いることができる。特に、この発明の抗菌剤は、有効成分であるペプチド類が哺乳動物（ウシ）由来であり、動物細胞に対して有害な作用を持たないため、動物組織培養用培地添加剤として有用である。
【００１８】
さらに、この発明の抗菌剤は、必要に応じて、他の抗菌剤と併用して使用することもできる。
次に、試験例を示してこの発明を詳述する。
試験例１
この試験は、この発明の抗菌性ペプチドの抗菌作用を調べるために行った。
（１）試料の調製
実施例１と同一の方法により、ウシ胎児血清より単離した配列番号１のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドを、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、それぞれ０．１μｇ／μｌ、０．２５μｇ／μｌ、０．５μｇ／μｌ、１．０μｇ／μｌ、１．５μｇ／μｌ、および２μｇ／μｌの各濃度で溶解し、試料溶液として用いた。
（２）試験菌株懸濁液の調製
各試験菌株懸濁液を下記のとおり調製した。
▲１▼エシェリキア・コリ懸濁液の調製
エシェリキア・コリ［Escherichia coli ATCC 25922 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲）］を保存スラントから１白金耳採取し、これを２％ペプトン；１％酵母エキス；２％グルコースからなる増殖培地５ｍｌに接種し、３０℃、２日間振とう培養し、この培養液０．１ｍｌを新しい増殖培地５ｍｌに接種し、３０℃で６時間振とう培養した。培養後に集菌し、蒸留水で洗浄、遠心分離を２回繰り返し、さらに蒸留水に懸濁した。菌数は血球計算盤を用いて計数し、細胞数を４〜６×１０4 細胞／１０μｌに調整し、これをエシェリキア・コリ懸濁液として用いた。
▲２▼スタヒロコッカス・アウレウス懸濁液の調製
スタヒロコッカス・アウレウス［Staphylococcus aureus IFO 12732 （発酵研究所より分譲］を用い、増殖培地として１％ペプトン；０．２％酵母エキス；０．１％硫酸マグネシウム・七水和物からなる増殖培地を用いたことを除き、前記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法により懸濁液を調製し、これをスタヒロコッカス・アウレウス懸濁液として用いた。
▲３▼サッカロミセス・セレビシエ懸濁液の調製
サッカロミセス・セレビシエ［Saccharomyces cerevisiae A364A（イ−スト・ジェネティック・ストック・センタ−より分譲］を用いたことを除き、前記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法により懸濁液を調製し、これをサッカロミセス・セレビシエ懸濁液として用いた。
▲４▼カンジダ・アルビカンス懸濁液の調製
カンジダ・アルビカンス［Candida albicans ATCC 10259 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲）］を用い、増殖培地として１％ポリペプトン；２％グルコースからなる増殖培地を用たことを除き、前記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法により懸濁液を調製し、これをカンジダ・アルビカンス懸濁液として用いた。
（３）試験方法
各試験菌株懸濁液１０μｌと各濃度試料溶液４０μｌとを混合し、３７℃で２時間保温した。その後、混合液を寒天培地（前記各試験菌株毎の増殖培地に１．５％の寒天を添加した培地）にまき、各試験菌株毎の最適培養条件でそれぞれ培養し、生じたコロニー数を計測した。各試験菌株毎の最適培養条件は、エシェリキア・コリは、培養温度３０℃、培養時間１４時間とし、スタヒロコッカス・アウレウスおよびサッカロミセス・セレビシエは、培養温度３０℃、培養時間２日間とし、カンジダ・アルビカンスは、培養温度３０℃、培養時間１日間とした。
（４）試験結果
この試験の結果は、図１および表１に示すとおりである。図１は、抗菌性ペプチド濃度と生菌数との関係を示し、図中縦軸および横軸は、それぞれ生菌数［ＣＦＵ（colony foming unit）は細胞のコロニー形成単位を示す］および抗菌性ペプチドの濃度を示し、●、■、△および◇は、それぞれエシェリキア・コリ、スタヒロコッカス・アウレウス、サッカロミセス・セレビシエおよびカンジダ・アルビカンスを示す。
【００１９】
図１から明らかなとおり、抗菌性ペプチド濃度が増加するとともに生菌数は著しく減少した。図１から求められる各試験菌株に対する抗菌性ペプチドの最小阻止濃度を示した表１から明らかなとおり、この発明の抗菌性ペプチドは、１．６μｇ／μｌという低い濃度で、この試験に使用された全ての試験菌株に対して強い抗菌作用を示した。
【００２０】
【表１】
試験例２
この試験は、試験例１で使用した抗菌性ペプチドのアミノ酸配列を決定するために行った。
試験例１で使用した抗菌性ペプチド０．２ｍｇに蒸留水１６０μｌを添加し、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を４０μｌ添加して溶解し、これにピログルタミン酸アミノペプチダーゼ溶液（０．５Ｕ／ｍｌ）を８μｌ添加して３７℃で８時間酵素処理した。その後、この反応液にクロロホルム：メタノール（２：１）溶液を１０ｍｌ添加して沈殿させ、遠心分離によって沈殿物を回収した。この沈殿物に、さらにエタノール：エーテル（３：２）溶液を１０ｍｌ添加して遠心分離を行い、沈殿物を回収した。
【００２２】
回収した沈殿物の一部（８０μｇ）を６Ｍ尿素を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌで溶解し、さらに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２００μｌ添加し、のちリシルエンドペプチダーゼ溶液（１μｇ／５０μｌ）を５０μｌ添加して３７℃で８時間酵素処理した。
これとは別に、沈殿物の一部（８０μｇ）を６Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌで溶解し、さらに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μｌ添加し、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加して３７℃で８時間反応させた。
【００２３】
前記リシルエンドペプチダーゼおよびエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎの２種の反応液中のペプチド断片をＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィーによりそれぞれ精製し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を気相式自動アミノ酸シーケンサー（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社製）を用いて測定した。
【００２４】
その結果、それぞれのペプチド断片のアミノ酸配列から、ペプチド全体のアミノ酸配列を決定し、この抗菌性ペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列を有することを確認した。
次に実施例を示し、この発明をさらに具体的に説明するが、この発明は、以下の例に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
実施例１
市販のウシ胎児血清（シグマ社製）４００ｍｌに、５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製）１００ｍｌを添加し、これを疎水クロマト樹脂［ブチル・トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）］に添加して吸着させ、この吸着樹脂をカラムに充填し、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液および蒸留水で溶出し、得られた抗菌活性を有する蒸留水溶出画分を、ゲル濾過担体［ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）］を使用し、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）を移動相に用いたゲル濾過を行い、分子量約１０キロダルトン付近の抗菌活性を有する画分を回収した。
【００２６】
さらに、この画分を、逆相クロマト担体［ＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４（ＶＹＤＡＣ社製）］を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製）を含む３２〜５６％アセトニトリル（和光純薬工業社製）を用いた直線濃度勾配溶出法による逆相クロマトグラフ法により、アセトニトリル濃度４８〜５０％に溶出される抗菌活性を有するピークを回収した。
【００２７】
この回収液を凍結乾燥し、抗菌性ペプチドの精製標品約２．４ｍｇを得た。この抗菌性ペプチドの精製標品は、ＳＤＳ電気泳動において単一バンドを示し、前記試験例２と同一の方法によりアミノ酸配列を決定した結果、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有していた。
実施例２
実施例１と同一の方法で得た抗菌性ペプチド５ｍｇを、メチルセルロ−ス５ｍｇおよび精製水１ｇの混合液に溶解し、抗菌剤を製造した。
実施例３
次の組成の点眼薬を常法により製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分はいずれも市販品である。
【００２８】
ホウ酸 １．６（％）
実施例１の抗菌性ペプチド １．０
メチルセルロース ０．５
精製水 ９６．９
実施例４
次の組成の歯磨を常法により製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００２９】
第二リン酸カルシウム・二水和物 ３６．０（％）
ソルビトール ４５．０
グリセリン １５．０
カルボキシメチルセルロース・ナトリウム １．５
ソルビタン脂肪酸エステル ０．５
サッカリンナトリウム １．０
実施例１の抗菌性ペプチド １．０
実施例５
次の組成の皮膚洗浄剤を常法により製造した。この皮膚洗浄剤は、使用時水で５０倍に希釈して使用する。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００３０】
塩化ナトリウム ８．０（％）
実施例１の抗菌性ペプチド ０．７
精製水 ９１．３
実施例６
次の組成の防黴剤を常法により製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００３１】
エチルアルコール ２０．０（％）
実施例１の抗菌性ペプチド ０．６
精製水 ７９．４
実施例７
次の組成の動物組織培養用培地をにより製造した。なお、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。
【００３２】
塩化カリウム ０．０４（％）
リン酸二水素カリウム ０．００６
塩化ナトリウム ０．８
炭酸水素ナトリウム ０．０３５
リン酸水素二ナトリウム・七水和物 ０．００９
グルコース ０．１
実施例１の抗菌性ペプチド ０．５
精製水 ９８．５１
【００３３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、哺乳動物（ウシ）に由来し、広範囲の微生物に対して抗菌作用を示す新規な抗菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分とする抗菌剤が提供される。この抗菌剤によって、ヒトまたは動物、あるいは各種物品を安全かつ効果的に抗菌処理することが可能となる。
【００３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】抗菌性ペプチド濃度と生菌数との関係を示すグラフ図である。
Claims (4)
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチド。
- ウシ胎児血清から単離されたペプチドである請求項１の抗菌性ペプチド。
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、このペプチドの薬学的に許容される誘導体、このペプチドの薬学的に許容される塩類、またはこれらの２以上の混合物を有効成分として含有する抗菌剤。
- ペプチドが、ウシ胎児血清から単離されたペプチドである請求項３の抗菌剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15273096A JP3734885B2 (ja) | 1996-06-13 | 1996-06-13 | 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15273096A JP3734885B2 (ja) | 1996-06-13 | 1996-06-13 | 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH101498A JPH101498A (ja) | 1998-01-06 |
| JP3734885B2 true JP3734885B2 (ja) | 2006-01-11 |
Family
ID=15546913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15273096A Expired - Fee Related JP3734885B2 (ja) | 1996-06-13 | 1996-06-13 | 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3734885B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3705574B2 (ja) | 1999-09-30 | 2005-10-12 | 株式会社タニタ | 生体電気インピーダンス測定装置 |
| CN104662146A (zh) * | 2012-09-26 | 2015-05-27 | 东洋制罐集团控股株式会社 | 食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法 |
-
1996
- 1996-06-13 JP JP15273096A patent/JP3734885B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH101498A (ja) | 1998-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0563222B1 (en) | Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments | |
| KR101899552B1 (ko) | 전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물 | |
| EP0652230A1 (en) | Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments | |
| US5260280A (en) | Bacterial toxin neutralizer | |
| KR20100108526A (ko) | 지방산 및 우유 단백질을 포함하는 항균성 조성물 | |
| JPH09509175A (ja) | 広域スペクトル抗菌化合物と使用方法 | |
| US6111081A (en) | Lactoferrin variants and uses thereof | |
| US5338724A (en) | Antimicrobial proteins, compositions containing same and uses thereof | |
| US5466669A (en) | Immunostimulatory agent | |
| CA2388910C (en) | Antimicrobial activity of the first cationic cluster of human lactoferrin | |
| US5576292A (en) | Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments | |
| JP3734885B2 (ja) | 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 | |
| JP6872188B2 (ja) | 脂肪酸組成物およびその製造方法、ならびに該脂肪酸組成物を含有する皮膚外用剤、医薬部外品および化粧品 | |
| JP4431036B2 (ja) | 抗菌及び／又は抗真菌性を有するカチオン性線状ペプチド | |
| JPH05310594A (ja) | 抗菌剤とこの抗菌剤を用いて物品を処理する方法 | |
| US10105414B2 (en) | Peptides derived from RS1 which down-regulate glucose absorption after a glucose rich meal and increase insulin sensitivity | |
| KR102250981B1 (ko) | 항균 활성, 용혈 안정성 및 혈청 내 안정성이 증진된 항균 펩타이드 유도체 | |
| US7060677B1 (en) | Antimicrobial activity of the first cationic cluster of human lactoferrin | |
| KR101980897B1 (ko) | Ll37 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 | |
| JP3661549B2 (ja) | 抗菌及び抗真菌ペプチド | |
| KR20190033837A (ko) | Hp1404 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 | |
| CN117999273A (zh) | 源自凤仙花的抗菌肽及包含该抗菌肽的抗菌用组合物 | |
| US7041647B2 (en) | Synthetic peptide having an ionophoric and antimicrobial activity | |
| JP2021046451A (ja) | 脂肪酸組成物およびその製造方法、ならびに該脂肪酸組成物を含有する皮膚外用剤、医薬部外品および化粧品 | |
| CA2102509C (en) | Immunostimulatory agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050628 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050927 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051020 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091028 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101028 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111028 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111028 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121028 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121028 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131028 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |