JPH101498A - 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 副作用が無く、少量で、広範囲の微生物に対
して抗菌作用を有する特定のアミノ酸配列を有する新規
な抗菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分と
して含有する抗菌剤を提供する。 【解決手段】 ウシ胎児血清より単離される配列番号１
に記載のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチド、このペ
プチドの薬学的に許容される誘導体、このペプチドの薬
学的に許容される塩類、またはこれらの２以上の混合物
を有効成分として含有する抗菌剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、抗菌性ペプチド
および抗菌剤に関するものである。さらに詳しくは、こ
の発明は、副作用が無く、少量で、広範囲の微生物に対
して抗菌作用を有する新規な抗菌性ペプチドと、この抗
菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、脊椎動物、昆虫、植物等に由
来するタンパク質およびペプチドのなかには抗菌性を有
するものが数多く存在することが知られている。例え
ば、脊椎動物に由来するものとしては、リゾチーム［プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ロイヤル・ソサイエティ
・オブ・ロンドン（Proceedings of the Royal Society
of London）、第９３巻、第３０６〜３１７ページ、１
９２２年、およびブレティン・デ・ラ・ソシエーテ・デ
・キミー・ビオロジーク（Bulletin de la SocieteChim
ie Biologique）、第５０巻、第２５４３〜２５５１ペ
ージ、１９８６年］、ラクトペルオキシダーゼ［ヨーロ
ピアン・ジャ−ナル・オブ・バイオケミストリー（Euro
pean Journal of Biochemistry）、第１９８巻、第７３
３〜７３９ページ、１９９１年、およびディーエヌエー
・セル・バイオロジー（DNA Cell Biology）、第９巻、
第４９９〜５０９ページ、１９９０年］、ラクトフェリ
ン［ブリティッシュ・ジャーナル・メディシン（Britis
h Journal of Medicine ）、第１巻、第６９〜７２ペー
ジ、１９７２年、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン（Journal of Experimental Medicin
e）、第１３巻、第５５９〜５７０ページ、１９７０
年、およびインフェクション・アンド・イミュニティ
（Infection and Immunity）、第５１巻、第３７３〜３
７７ページ、１９８６年］等のタンパク質、および分子
量が３〜４キロダルトンのディフェンシン［ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（European Journ
al of Haematology）、第４４巻、第１〜８ページ、１
９９０年、およびブラッド（Blood ）第７６巻、第２１
６９〜２１８１ページ、１９９０年］等のペプチド等に
ついて、その構造および殺菌作用等が知られている。ま
た、昆虫に由来するものとしては、セクロピンまたはデ
ィフェンシン［バイオエッセイズ（BioEssays ）第１３
巻、第６５７〜６６３ページ、１９９１年、プロシーデ
ィングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Proceedings of
the National Academy of Science of U.S.A.）、第８
６巻、第２６２〜２６６ページ、１９８９年、およびビ
オキミカ・ビオフィジカ・アクタ（Biochimica Biophys
ica Acta）、第１１３２巻、第２０３〜２０６巻、１９
９２年］等の抗菌性のペプチドが知られ、さらに、植物
の種子からも抗菌性のペプチドが単離されている［グッ
ド・ジャミー（Goode Jamie ）編、「アンチマイクロバ
イアル・ペプチズ（Antimicrobial Peptides) 」、第９
１〜１０６ページ、ワイリー(Wiley) 社、１９９４
年］。

【０００３】ウシ由来の抗菌性ペプチドについても、従
来いくつかの報告がなされている。例えば、乳由来とし
ては、ラクトフェリンをペプシンで消化した際に生じる
Ｎ末端領域のペプチドであるラクトフェリシン（登録商
標）Ｂ［ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロ
ジー（Journal of Applied Bacteriology ）、第７３
巻、第４７２〜４７９ページ、１９９２年］、カゼイン
から生じるカソシジン−Ｉ［フェブス・レターズ（FEBS
letters）、第３７２巻、第１８５〜１８８ページ、１
９９５年］、精液から単離されたセミナルプラスミン
［ネイチャー（Nature）、第２７９巻、第７２５〜７２
８ページ、１９７９年］、および好中球由来のインドリ
シジン［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Journal of Biological Chemistry ）、第２６７
巻、第４２９２〜４２９５ページ、１９９２年］、バク
テネシン［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Journal of Biological Chemistry ）、第２６
３巻、第９５７３〜９５７５ページ、１９８８年］、イ
ンフェクション・アンド・イミュニティ（Infection an
d Immunity）、第５７巻、第３１４２〜３１４６ペー
ジ、１９８９年］等が抗菌性ペプチドとして知られてい
る。

【０００４】一方、従来から種々の微生物に対して抗菌
作用を有するペプチドについては多数の発明が知られて
いる。例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に有効
なホスホノトリペプチド（特開昭５７−１０６６８９号
公報）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭５８−１３
５９４号公報）、環状ペプチド誘導体（特開昭５８−２
１３７５５号公報）、抗菌および抗ウイルス作用を示す
ペプチド（特開昭５９−５１２４７号公報）、酵母に有
効なポリペプチド（特開昭６０−１３０５９９号公
報）、グラム陽性菌に有効な糖ペプチド誘導体（特開昭
６０−１７２９９８号公報、特開昭６１−２５１６９９
号公報、特開昭６３−４４５９８号公報）、グラム陽性
菌に有効なオリゴペプチド（特開昭６２−２２７９８号
公報）、ペプチド系抗生物質（特開昭６２−５１６９７
号公報、特開昭６３−１７８９７号公報）、その他、北
米産カブトガニの血球から抽出した抗菌性ペプチド（特
開平２−５３７９９号公報）、蜂蜜の血リンパから単離
した抗菌性ペプチド（特開平２−５０００８４号公報）
等である。

【０００５】ところで、血清中にはコレステロール、コ
レステロールエステル、トリグリセリド、リン脂質、遊
離脂肪酸等の脂質が存在する。これらの脂質はそのまま
では血清には溶解しないので、アポリポタンパク質と結
合したリポタンパク質の微粒子として血清中に存在して
いる。アポリポタンパク質は、アポＡからＥまでの５つ
に分類され、さらにアポＡはＡ−Ｉ、Ａ−IIに、アポＣ
はＣ−Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−IIIに分かれる（日経メディカ
ル・日経バイオテク編、「日経バイオテクノロジー最新
用語辞典」、第９ページ、日経マグロウヒル社、１９８
５年）。一方、血清中のリポタンパク質は、トリグリセ
リドを主要脂質とするカイロミクロン（乳状脂粒）、エ
ステル型コレステロールを主要脂質とする超低比重リポ
タンパク質（ＬＤＬ）、およびリン脂質を主要脂質とす
る高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）等に分類されている
［野間惟道編、「医科学大辞典」、第４９巻、第８４〜
８５ページ、講談社、１９８４年］。

【０００６】従来、ヒト・アポリポプロテインＡ−Ｉを
含むリポタンパク質画分に抗菌性があることが報告され
ている［モレキュラー・セル・バイオケミストリー（Mo
lecular Cell Biochemistry ）、第１１９巻、第１７１
〜１７８ページ、１９９３年、および特公平８−５７９
８号公報］。しかしながら、ウシ血清中から単離され、
特定のアミノ酸配列を有するペプチドの抗菌作用につい
ては、文献が皆無であり、従来知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前記従来技術から明ら
かなとおり、各種の抗菌性ペプチドが知られているが、
適用対象毎の抗菌性ペプチドの選択の余地を増大する目
的から、さらに、望ましくない副作用（例えば、抗原性
等）がなく、耐熱性があり、かつ強い抗菌作用を有する
抗菌性ペプチドを自然界から見い出すことが望まれてい
た。特に、安価なウシ血清等の原料より大量に調製が可
能で、かつ細菌および真菌（カビ、酵母）等の微生物に
対して抗菌作用を有し、動物細胞に対しては抗菌作用が
ない動物組織培養用培地添加剤として有用な抗菌性ペプ
チドが望まれていた。

【０００８】この発明は、以上のとおりの従来技術の状
況に鑑みてなされたものであり、副作用が無く、少量
で、広範囲の微生物に対して抗菌作用を有する新規な抗
菌性ペプチドと、この抗菌性ペプチドを有効成分として
含有する抗菌剤を提供することを目的としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記の課題
を解決するものとして、配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有する抗菌性ペプチドを提供する。また、この発明
は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、このペプチドの薬学的に許容される誘導体、このペ
プチドの薬学的に許容される塩類、またはこれらの２以
上の混合物を有効成分として含有する抗菌剤を提供す
る。

【００１０】なお、この発明の抗菌性ペプチドおよび抗
菌剤においては、前記ペプチドが、ウシ胎児血清より単
離されたペプチドであることを好ましい態様としてい
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】この発明の抗菌性ペプチドの出発
原料はウシ血清であり、例えば、市販の成牛血清、ウシ
新生児血清、ウシ胎児血清を例示することができ、特に
ウシ胎児血清が望ましい。これらの出発原料からこの発
明の抗菌性ペプチドを常法により容易に単離精製するこ
とができる。例えば、ウシ胎児血清を、疎水クロマトグ
ラフ、ゲル濾過、および逆相クロマトグラフ等の順序で
処理し、抗菌活性を有することが確認されている画分を
順次に精製することによって、この発明の特定アミノ酸
配列を有する抗菌性ペプチドを単離精製することができ
る。

【００１２】使用する疎水クロマトグラフ用樹脂は、ブ
チル基を有する樹脂が望ましく、例えば、市販のブチル
・トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）、ブチル・トヨパ
ール６５０Ｓ（東ソー社製）、ブチル・セファロース４
ＦＦ（ファルマシア社製）等を例示することができる。
使用するゲル濾過用担体は、５００キロダルトンの排除
限界分子量を有する担体が望ましく、例えば、市販のＴ
ＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）、Ａｓａｈｉｐ
ａｋ ＧＦＡ−５０Ｆ（旭化成社製）、ＰＲＯＴＥＩＮ
ＰＡＫ ３００（日本ウォターズ社製）等を例示する
ことができる。

【００１３】使用する逆相クロマトグラフ用担体は、リ
ガンドとして炭素数４の直鎖状炭化水素が望ましく、例
えば、市販のＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４（ＶＹＤＡＣ社
製）、マイクロボンダスフェアーＣ₄ （日本ウォターズ
社製）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ₄（ワイエムシィ社製）
等を例示することができる。以上のようにして単離精製
した抗菌性ペプチドは、後記する試験例２に示すとお
り、配列番号１に記載の特定のアミノ酸配列を有してお
り、また、試験例１に示すとおり、細菌および真菌（酵
母）に対する抗菌作用を有している。なお、この発明の
抗菌性ペプチドは、そのアミノ酸配列からウシ由来アポ
リポプロテイン様物質であるものと予測されたが、前記
ヒト・アポリポプロテインＡ−Ｉとは、そのアミノ酸配
列において全く異なる物質であった。

【００１４】次に、この発明の抗菌剤について説明す
る。この発明の抗菌剤は、前記のとおりに単離精製した
抗菌性ペプチド、このペプチドの薬学的に許容される誘
導体、このペプチドの薬学的に許容される塩類（以下、
これらをまとめて「ペプチド類」と記載することがあ
る）、またはこれらの２以上の混合物を有効成分として
含有する。抗菌性ペプチドの誘導体は、抗菌性ペプチド
の一部置換体または付加化合物等のペプチド誘導体であ
り、例えば、カルボキシル基をアミド化またはアシル化
した誘導体を例示することができる。また、抗菌性ペプ
チドの塩類は、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ク
エン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の酸付加塩を例示するこ
とができる。

【００１５】この発明の抗菌剤は、一般的な医薬製剤の
形態でヒトまたは動物に投与することができ、例えば、
静注、皮下注、または経口によりヒトまたは動物に投与
することができる。特に、この発明の抗菌剤の有効成分
であるペプチド類は、毒性が極めて低く、ＬＤ₅₀は１０
０ｍｇ／体重ｋｇ以上であるため、ヒトまたは動物に対
して安全に使用することができ、経口投与による抗下痢
剤としても使用することができる。

【００１６】この発明の抗菌剤は、ペプチド類またはこ
れらの２以上の混合物を５ｍｇ／ｇ以上の濃度で含有さ
せて製剤化することができ、その他の成分としては、医
薬製造分野で通常使用される各種の担体、例えば充填
剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑
沢剤の希釈剤または賦形剤等を用いることができる。ま
た、医薬製剤として、各種の剤形が使用目的、使用対象
に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸
剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、
坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。錠剤
の形態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、
白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭
酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の
賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、
ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメ
チルセルロース、メチルセルロース、リン酸カルシウ
ム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、
カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸
カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス
テル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグ
リセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリ
ン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級
アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促
進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳
糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸
着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエ
チレングリコール等の滑沢剤等を使用することができ
る。さらに錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠
剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸用被錠フィルム
コーティング錠または二重錠、多層錠とすることができ
る。注射剤として調製される場合は、液剤、乳剤および
懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好まし
く、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として
例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、
エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イ
ソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステル類等を使用することができる。なお、
この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、
ブドウ糖、グリセリン等を製剤中に含有させてもよく、
また、溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合してもよ
い。上記各形態の医薬製剤中には、さらに必要に応じて
慣用される着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を
配合することができ、また、他の医薬品有効成分を含有
させることもできる。

【００１７】この発明の抗菌剤は、医薬品としてのみな
らず、食品、飼料、化粧品等のようにヒトまたは動物の
体内に摂取され、または体表面に適用される製品、その
他一般に細菌の増殖を防止または抑制することが望まれ
るあらゆる製品に配合して使用することができ、またこ
の発明の抗菌剤により、それらの製品または原料素材を
処理することができる。すなわち、食品（例えば、チュ
ウインガム等）、医薬品（例えば、目薬、乳房炎治療
剤、下痢防止剤、水虫薬等）、医薬部外品（例えば、口
中洗浄剤、制汗剤、養毛剤等）、各種化粧品（例えば、
整髪料、クリーム、乳液等）、各種歯磨用品（例えば、
歯磨、歯ブラシ等）、各種生理用品、各種ベビー用品
（例えば、オムツ等）、各種高齢者用品（例えば、入れ
歯固定剤、オムツ等）、各種洗剤（例えば、石鹸、薬用
石鹸、シャンプー、リンス、洗濯用洗剤、キッチン用洗
剤、住宅用洗剤等）、各種除菌用品（キッチン用除菌ペ
ーパー、トイレット用除菌ペーパー等）、飼料（例え
ば、ペットフード等）、それらの原料となる素材、その
他一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる
物品に添加、配合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行って
もよく、またその他一般に微生物の増殖の防止、抑制が
望まれるあらゆる物品の処理に用いることができる。特
に、この発明の抗菌剤は、有効成分であるペプチド類が
哺乳動物（ウシ）由来であり、動物細胞に対して有害な
作用を持たないため、動物組織培養用培地添加剤として
有用である。

【００１８】さらに、この発明の抗菌剤は、必要に応じ
て、他の抗菌剤と併用して使用することもできる。次
に、試験例を示してこの発明を詳述する。 試験例１ この試験は、この発明の抗菌性ペプチドの抗菌作用を調
べるために行った。 （１）試料の調製 実施例１と同一の方法により、ウシ胎児血清より単離し
た配列番号１のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチド
を、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、それ
ぞれ０．１μｇ／μｌ、０．２５μｇ／μｌ、０．５μ
ｇ／μｌ、１．０μｇ／μｌ、１．５μｇ／μｌ、およ
び２μｇ／μｌの各濃度で溶解し、試料溶液として用い
た。 （２）試験菌株懸濁液の調製 各試験菌株懸濁液を下記のとおり調製した。 エシェリキア・コリ懸濁液の調製 エシェリキア・コリ［Escherichia coli ATCC 25922
（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより
分譲）］を保存スラントから１白金耳採取し、これを２
％ペプトン；１％酵母エキス；２％グルコースからなる
増殖培地５ｍｌに接種し、３０℃、２日間振とう培養
し、この培養液０．１ｍｌを新しい増殖培地５ｍｌに接
種し、３０℃で６時間振とう培養した。培養後に集菌
し、蒸留水で洗浄、遠心分離を２回繰り返し、さらに蒸
留水に懸濁した。菌数は血球計算盤を用いて計数し、細
胞数を４〜６×１０⁴ 細胞／１０μｌに調整し、これを
エシェリキア・コリ懸濁液として用いた。 スタヒロコッカス・アウレウス懸濁液の調製 スタヒロコッカス・アウレウス［Staphylococcus aureu
s IFO 12732 （発酵研究所より分譲］を用い、増殖培地
として１％ペプトン；０．２％酵母エキス；０．１％硫
酸マグネシウム・七水和物からなる増殖培地を用いたこ
とを除き、前記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と
同一の方法により懸濁液を調製し、これをスタヒロコッ
カス・アウレウス懸濁液として用いた。 サッカロミセス・セレビシエ懸濁液の調製 サッカロミセス・セレビシエ［Saccharomyces cerevisi
ae A364A（イ−スト・ジェネティック・ストック・セン
タ−より分譲］を用いたことを除き、前記エシェリキア
・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法により懸濁液を調
製し、これをサッカロミセス・セレビシエ懸濁液として
用いた。 カンジダ・アルビカンス懸濁液の調製 カンジダ・アルビカンス［Candida albicans ATCC 1025
9 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションよ
り分譲）］を用い、増殖培地として１％ポリペプトン；
２％グルコースからなる増殖培地を用たことを除き、前
記エシェリキア・コリ懸濁液の調製方法と同一の方法に
より懸濁液を調製し、これをカンジダ・アルビカンス懸
濁液として用いた。 （３）試験方法 各試験菌株懸濁液１０μｌと各濃度試料溶液４０μｌと
を混合し、３７℃で２時間保温した。その後、混合液を
寒天培地（前記各試験菌株毎の増殖培地に１．５％の寒
天を添加した培地）にまき、各試験菌株毎の最適培養条
件でそれぞれ培養し、生じたコロニー数を計測した。各
試験菌株毎の最適培養条件は、エシェリキア・コリは、
培養温度３０℃、培養時間１４時間とし、スタヒロコッ
カス・アウレウスおよびサッカロミセス・セレビシエ
は、培養温度３０℃、培養時間２日間とし、カンジダ・
アルビカンスは、培養温度３０℃、培養時間１日間とし
た。 （４）試験結果 この試験の結果は、図１および表１に示すとおりであ
る。図１は、抗菌性ペプチド濃度と生菌数との関係を示
し、図中縦軸および横軸は、それぞれ生菌数［ＣＦＵ
（colony foming unit）は細胞のコロニー形成単位を示
す］および抗菌性ペプチドの濃度を示し、●、■、△お
よび◇は、それぞれエシェリキア・コリ、スタヒロコッ
カス・アウレウス、サッカロミセス・セレビシエおよび
カンジダ・アルビカンスを示す。

【００１９】図１から明らかなとおり、抗菌性ペプチド
濃度が増加するとともに生菌数は著しく減少した。図１
から求められる各試験菌株に対する抗菌性ペプチドの最
小阻止濃度を示した表１から明らかなとおり、この発明
の抗菌性ペプチドは、１．６μｇ／μｌという低い濃度
で、この試験に使用された全ての試験菌株に対して強い
抗菌作用を示した。

【００２０】

【表１】

【００２１】試験例２ この試験は、試験例１で使用した抗菌性ペプチドのアミ
ノ酸配列を決定するために行った。試験例１で使用した
抗菌性ペプチド０．２ｍｇに蒸留水１６０μｌを添加
し、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む
２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を４
０μｌ添加して溶解し、これにピログルタミン酸アミノ
ペプチダーゼ溶液（０．５Ｕ／ｍｌ）を８μｌ添加して
３７℃で８時間酵素処理した。その後、この反応液にク
ロロホルム：メタノール（２：１）溶液を１０ｍｌ添加
して沈殿させ、遠心分離によって沈殿物を回収した。こ
の沈殿物に、さらにエタノール：エーテル（３：２）溶
液を１０ｍｌ添加して遠心分離を行い、沈殿物を回収し
た。

【００２２】回収した沈殿物の一部（８０μｇ）を６Ｍ
尿素を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１
００μｌで溶解し、さらに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）を２００μｌ添加し、のちリシルエンド
ペプチダーゼ溶液（１μｇ／５０μｌ）を５０μｌ添加
して３７℃で８時間酵素処理した。これとは別に、沈殿
物の一部（８０μｇ）を６Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌで溶解し、さ
らに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を
２００μｌ添加し、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ溶液
（０．４ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加して３７℃で８時間
反応させた。

【００２３】前記リシルエンドペプチダーゼおよびエン
ドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎの２種の反応液中のペプチド
断片をＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィーに
よりそれぞれ精製し、得られたペプチド断片のアミノ酸
配列を気相式自動アミノ酸シーケンサー（パーキンエル
マー・アプライドバイオシステムズ社製）を用いて測定
した。

【００２４】その結果、それぞれのペプチド断片のアミ
ノ酸配列から、ペプチド全体のアミノ酸配列を決定し、
この抗菌性ペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配
列を有することを確認した。次に実施例を示し、この発
明をさらに具体的に説明するが、この発明は、以下の例
に限定されるものではない。

【００２５】

【実施例】

実施例１ 市販のウシ胎児血清（シグマ社製）４００ｍｌに、５Ｍ
塩化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製）１００ｍｌ
を添加し、これを疎水クロマト樹脂［ブチル・トヨパー
ル６５０Ｍ（東ソー社製）］に添加して吸着させ、この
吸着樹脂をカラムに充填し、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液
で洗浄し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液および蒸留
水で溶出し、得られた抗菌活性を有する蒸留水溶出画分
を、ゲル濾過担体［ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソ
ー社製）］を使用し、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）を移動相に用いたゲ
ル濾過を行い、分子量約１０キロダルトン付近の抗菌活
性を有する画分を回収した。

【００２６】さらに、この画分を、逆相クロマト担体
［ＰＲＯＴＥＩＮ Ｃ４（ＶＹＤＡＣ社製）］を使用
し、０．１％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製）を
含む３２〜５６％アセトニトリル（和光純薬工業社製）
を用いた直線濃度勾配溶出法による逆相クロマトグラフ
法により、アセトニトリル濃度４８〜５０％に溶出され
る抗菌活性を有するピークを回収した。

【００２７】この回収液を凍結乾燥し、抗菌性ペプチド
の精製標品約２．４ｍｇを得た。この抗菌性ペプチドの
精製標品は、ＳＤＳ電気泳動において単一バンドを示
し、前記試験例２と同一の方法によりアミノ酸配列を決
定した結果、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有して
いた。 実施例２ 実施例１と同一の方法で得た抗菌性ペプチド５ｍｇを、
メチルセルロ−ス５ｍｇおよび精製水１ｇの混合液に溶
解し、抗菌剤を製造した。 実施例３ 次の組成の点眼薬を常法により製造した。なお、抗菌性
ペプチド以外の成分はいずれも市販品である。

【００２８】 ホウ酸 １．６（％） 実施例１の抗菌性ペプチド １．０ メチルセルロース ０．５ 精製水 ９６．９ 実施例４ 次の組成の歯磨を常法により製造した。なお、抗菌性ペ
プチド以外の成分は、いずれも市販品である。

【００２９】 第二リン酸カルシウム・二水和物 ３６．０（％） ソルビトール ４５．０ グリセリン １５．０ カルボキシメチルセルロース・ナトリウム １．５ ソルビタン脂肪酸エステル ０．５ サッカリンナトリウム １．０ 実施例１の抗菌性ペプチド １．０ 実施例５ 次の組成の皮膚洗浄剤を常法により製造した。この皮膚
洗浄剤は、使用時水で５０倍に希釈して使用する。な
お、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品であ
る。

【００３０】 塩化ナトリウム ８．０（％） 実施例１の抗菌性ペプチド ０．７ 精製水 ９１．３ 実施例６ 次の組成の防黴剤を常法により製造した。なお、抗菌性
ペプチド以外の成分は、いずれも市販品である。

【００３１】 エチルアルコール ２０．０（％） 実施例１の抗菌性ペプチド ０．６ 精製水 ７９．４ 実施例７ 次の組成の動物組織培養用培地をにより製造した。な
お、抗菌性ペプチド以外の成分は、いずれも市販品であ
る。

【００３２】 塩化カリウム ０．０４（％） リン酸二水素カリウム ０．００６ 塩化ナトリウム ０．８ 炭酸水素ナトリウム ０．０３５ リン酸水素二ナトリウム・七水和物 ０．００９ グルコース ０．１ 実施例１の抗菌性ペプチド ０．５ 精製水 ９８．５１

【００３３】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、哺乳動物（ウシ）に由来し、広範囲の微生物に
対して抗菌作用を示す新規な抗菌性ペプチドと、この抗
菌性ペプチドを有効成分とする抗菌剤が提供される。こ
の抗菌剤によって、ヒトまたは動物、あるいは各種物品
を安全かつ効果的に抗菌処理することが可能となる。

【００３４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド。次の配列において、１番
のXaa はピログルタミン酸（pyr-Glu ）である。 配列： Xaa Ala Glu Glu Ser Asn Leu Gln Ser Leu Val Ser Gln Tyr Phe 1 5 10 15 Gln Thr Val Ala Asp Tyr Gly Lys Asp Leu Val Glu Lys Ala Lys 20 25 30 Gly Ser Glu Leu Gln Thr Gln Ala Lys Ala Tyr Phe Glu Lys Thr 35 40 45 Gln Glu Glu Leu Thr Pro Phe Phe Lys Lys Ala Gly Thr Asp Leu 50 55 60 Leu Asn Phe Leu Ser Ser Phe Ile Asp Pro Lys Lys Gln Pro Ala 65 70 75 Thr

【図面の簡単な説明】

【図１】抗菌性ペプチド濃度と生菌数との関係を示すグ
ラフ図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
   る抗菌性ペプチド。
2. 【請求項２】 ウシ胎児血清から単離されたペプチドで
   ある請求項１の抗菌性ペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
   るペプチド、このペプチドの薬学的に許容される誘導
   体、このペプチドの薬学的に許容される塩類、またはこ
   れらの２以上の混合物を有効成分として含有する抗菌
   剤。
4. 【請求項４】 ペプチドが、ウシ胎児血清から単離され
   たペプチドである請求項３の抗菌剤。