JPH11505721A

JPH11505721A - プロテグリン

Info

Publication number: JPH11505721A
Application number: JP8535883A
Authority: JP
Inventors: レーラー，ロバート，アイ．; コクリャコブ，ブラディミール，エヌ．; ハーウィグ，シルビア，エス．，エル．
Original assignee: ユニバーシティーオブカリフォルニア，ロサンジェルス
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 1999-05-25
Also published as: EP0871654A1; EP0871654A4; ES2198488T3; CA2222475A1; AU716277B2; WO1996037508A1; US5804558A; DE69627704T2; AU5874996A; ATE238345T1; EP0871654B1; DE69627704D1

Abstract

(57)【要約】２つのシスチン橋を有するブタ白血球顆粒から単離された５種類の天然プロテグリンとして、またはシスチン橋をもたないか１つのシスチン橋をもつ種々のプロテグリン類似体として、16〜18個のアミノ酸を有しかつ０〜４個のシステインを含むカチオン性の抗微生物およびウイルス中和ペプチドが提供される。天然プロテグリンはカルボキシル末端アミド化を有する。類似体はカルボキシル末端アミド化が可能であり、また、類似体はアミノ末端アシル化型および／またはシステイン安定化型および／またはカルボキシル末端エステル化型として製造することもできる。１〜４個の天然システインのいずれかを疎水性アミノ酸または小型のアミノ酸で置換することができ、残りの12〜16位置のために各種の置換物が開示される。組換え宿主細胞および生産方法、並びに天然プロテグリンおよびそれらの類似体を含有する静菌用、ウイルス中和用および内毒素不活化用の医薬組成物および農業用組成物、およびそれらの使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】プロテグリン本発明はNIH助成金No.A122839に基づいて行われたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。技術分野本発明は抗菌性ペプチドの分野に関する。特に、本発明は広範囲の抗微生物活性を有する短いペプチドに関するものであり、それらのいくつかはブタの白血球から単離されたものである。背景技術動物および植物による感染に対する防御機構の一つは抗微生物活性および抗ウイルス活性を有するペプチドの産生である。植物および動物双方の組織から種々のクラスのそのようなペプチドが単離されてきた。そのようなペプチドのうちよく知られたクラスとしてタキプレシン(tachyplesins)があり、それが初めて単離されたのはカブトガニの血球からである(Nakamura，T.ら，J Biol Chem(1988)，263 :16709-16713)。この論文は、日本種のカブトガニから最初に単離されたタキプレシンであるタキプレシンＩを記載している。タキプレシンＩは17個のアミノ酸がアミド化されたペプチドで、その分子中に２つのシスチン結合を形成する４個のシステインを含んでいる。このグループによる後の論文では(Miyata，T.ら，J Biochem（1989）106:663-668)第二のタキプレシンであるタキプレシンIIの単離が報告されている。タキプレシンIIはＣ末端がアミド化された17残基のペプチドからなり、これも４個のシステインと２つの分子内ジスルフィド結合とを含んでいる。さらにポリフェムジン(polyphemusins)と呼ばれ、タキプレシンIIと相同性が高く、４個のシステイン残基を同じ位置に有する18-merのアミノ酸からなるペプチド２種が、アメリカ種カブトガニからさらに単離された。ポリフェムジンＩとポリフェムジンIIとは１個のアルギニン残基がリジンに置換されたことが異なるだけである。全てのペプチドは抗真菌活性および抗菌活性を有すると記載されている。Murakami，T.ら(Murakami，T.ら，Chemotherapy(1991)37:327-33 4)はその後、水胞性口内炎ウイルスに対するタキプレシンの抗ウイルス活性を報告している：Ｉ型およびII型単純ヘルペスウイルス、Ｉ型アデノウイルス、II型レオウイルス、およびＩ型ポリオウイルスはタキプレシンＩによる不活化に対して抵抗性であった。Morimoto，M.ら(Morimoto，M.ら，Chemotherapy(1991)37:20 6-211)は、タキプレシンＩがヒト免疫不全症ウイルス(HIV)に対して阻害活性があることを見出した。この抗HIV活性はポリフェムジンIIの合成類似体にもあることがNakashima，H.らによって見出された(Nakashima，H.ら，Antimicrobial A gents and Chemotherapy(1992)1249-1255)。抗ウイルス性ペプチドは、Lehrer， R.I.ら(Lehrer，R.I.ら，J Virol（1985）54:467-472)によって報告されたように、ウサギ白血球中にも見出されている。その他の重要なシステイン含有抗微生物性ペプチドのクラスとしてはデフェンシン、β-デフェンシン、および昆虫のデフェンシンがある。デフェンシンはやや長いペプチドで、６個の変異していないシステインと３つの分子内ジスルフィド結合を有することを特徴とする。デフェンシンに関しては、Lehrer，R.I.らの論文(Lehrer，R.I.ら，Cell（1991）64:229-230; Lehrer，R.I.ら，Ann Rev Imm unol (1993)11:105-128)に記載されている。哺乳類由来のデフェンシンについてはLehrer，R.I.らによってAnnual Review Immunol（1993）11:105-128に総説としてまとめられており、デフェンシンに関しては３つの特許が成立している(U.S .4,705,777、U.S．4,659,692およびU.S．4,543,252)。デフェンシンはヒトまたはその他の数種の動物の多形核好中球(PMN)中およびウサギ肺胞マクロファージ中、マウス小腸上皮(パーネト)細胞、およびヒトのそれらに対応する細胞中に見出される。 β-デフェンシンはウシの呼吸器上皮細胞中、ウシ顆粒球、およびトリ白血球中に見出される。Selasted，M.E.ら，J Biol Chem(1993)288:6641-6648、および Diamond，G.ら，Proc Natl Acad Sci(USA)（1991）88:3952-3958 を参照のこと。昆虫のデフェンシンについては、Lambert，J.ら，Proc Natl Acad Sci(1989)8 8 :262-265によって報告されている。植物中にも抗真菌性および抗菌性のペプチドおよびタンパク質が見出されており(Broekaert，W.F.ら，Biochemistry（1992）31:4308-4314)、Cornelissen，B. J.C.らによって総括されている(Plant Physiol(1993)101:709-712)。このようなペプチドを産生させるための発現系は、植物を感染から防御するための形質転換に用いられており、それについては、例えばHaln，R.ら(Haln，R.ら，Nature(19 93)361:153-156)によって述べられている。本発明は新規なクラスの抗微生物性および抗ウイルス性ペプチド類を提供するものであり、ここでそれらを「プロテグリン」と命名され、その代表的なものはブタ白血球から単離されたものである。これらのペプチドは植物および動物において抗菌剤、抗ウイルス剤、および抗真菌剤として有用なものである。本発明のプロテグリンペプチドの単離については、本出願人により論文中で報告されている(Kokrykov，V.N.ら，FEBS(1993)337:231-236(7月発行))。このグループはこの後の公表論文で、単離されたｃＤＮＡクローンから推定された新しいプロテグリン、その配列およびその前駆体の配列を報告している(Zhao，Cら，FE BS Letters （1994）346:285-288)。さらに別の論文ではブタ好中球から得たカチオン性ペプチドについてMirgorodskaya，O.A.ら(Mirgorodskaya，O.A.ら，FEBS( 1993)，330:339-342(9月号))により報告がなされている。Scorici，P.ら(Scoric i，P.ら，Biochem Biophys Res Comm(1993)196:1363-1367)は、カテリン(Cathel in)様前配列を有するブタ白血球の抗微生物性ペプチドをコードするＤＮＡ配列が得られたことを報告している。このペプチドは下記に示すプロテグリンの１種であると報告されている。プロテグリンに関する別の公表文献としては、Harwig， S.S.L.ら(Harwig，S.S.L.ら，J Peptide Sci（1995）印刷中)およびZhao，C.ら( Zhao，C.ら，FEBS-MS MB283(1995)印刷中)がある。本発明のプロテグリンは内毒素とも結合することが見出されている。内毒素はグラム陰性菌に由来するリポポリサッカライド(LPS)組成物であり、グラム陰性種に敗血症の原因となるとされている。この型の敗血症は非常に共通の症状があり、しばしば致命的である。他の研究者たちは、LPS/内毒素に結合するタンパク質を設計し研究することを試みてきた。それらの試みの実証となる報告としては、 Rustici，A.ら，Science（1993）259:361-364; Matsuzaki，K．ら，Biochemist ry (1993)，32:11704-11710; Hoess，A.ら，EMBO J（1993）12:3351-3356; およびElsbach，P.ら，Current Opinion in Immunology（1993）5:103-107がある。本発明のプロテグリンはLPSの不活化およびLPSによって引き起こされた影響の改善を行いうる新たな化合物を提供するものである。上述の事項に加え、本発明のプロテグリンは性行為感染症に関連する微生物の増殖阻害効果を有している。毎年、世界中で約1,400万人の人々がHIVに感染し、数百万人の女性が骨盤の炎症性疾患に罹患しているものと推測されている。大腸菌(E.coli)，マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)および他の感染性微生物もこの炎症性疾患の原因となっているとはいえ、クラミジア・トラコーマティス(Chlamydia trachomatis)およびナイセリア・ゴノロアエ(Neisseria gonor rhoeae)がこの炎症性疾患の半数以上の原因となっている。病原体にはウイルス、細菌、真菌およびプロトゾア病原体が含まれる。これらの感染症と闘うために使用される抗菌剤は、生理的条件下で効果を有することが非常に重要である。本発明のプロテグリンはこれらの性質を備えたものである。発明の開示１つの実施態様においては、本発明は16-18個のアミノ酸残基からなるペプチドであって、未変異の４個のシステインを持ち、塩基性および疎水性アミノ酸の特徴的なパターンで特徴づけられ、および/または動物の白血球から本発明の方法を用いて単離可能なペプチドであることによって特徴づけられている。第二の実施態様においては、本発明は上記のペプチドであって1〜4個のシステインが疎水性または小型アミノ酸で置換されたものである。これらのペプチドは全て合成で作製しうるもので、そのうちのいくつかは組換え的に作製するかまたは天然原料から単離しうるものであり、動物における感染の予防または治療のための防腐剤または医薬組成物として用いるために精製しうるものである。また別に、これらのペプチドは植物をウイルスまたは微生物感染から防御するための組成物となし得る。また別のアプローチとして、感染と闘うために、これらのペプチドをコードするＤＮＡを動物または好ましくは植物の体内で(in situ)発現させることができる。これらのペプチドはまた、抗微生物アッセイおよび内毒素結合における標準品としても有用である。したがって、１の態様においては、本発明は、単離され精製された、または組換え的に産生された化合物であって、次式の A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-C₆-A₇-C₈-A₉-A₁₀-A₁₁-A₁₂-C₁₃-A₁₄-C₁₅-A₁₆-(A₁₇-A₁₈) (1) で示され、かつ、そのＮ末端アシル化および/またはＣ末端アミド化またはエステル化型で、任意に-SH安定化された線形またはシスチン架橋形のものである。〔式中、A₁は塩基性アミノ酸であり、 A₂、A₃はそれぞれが独立に小型アミノ酸であり、 A₅、A₇、A₁₄はそれぞれが独立に疎水性アミノ酸であり、 A₄は塩基性または小型のアミノ酸であり、 A₉、A₁₂、およびA₁₆はそれぞれが独立に塩基性、疎水性、中性／極性または小型のアミノ酸であり、 A₁₀およびA₁₁はそれぞれが独立に塩基性、中性／極性、疎水性もしくは小型のアミノ酸であるか、またはプロリンであり、 A₁₇は存在しないか、または存在する場合は、塩基性、中性／極性、疎水性もしくは小型のアミノ酸であり、 A₁₈は存在しないか、または存在する場合は、塩基性、疎水性、中性／極性もしくは小型のアミノ酸であるか、または、式(1)の修飾形であって、N 末端アシル化および/またはC 末端がアミド化またはエステル化型であって、４個のシステインのうちの少なくとも１個が独立に疎水性アミノ酸または小型のアミノ酸で置換されている；但し、式(1)の化合物は+3以上の電荷を有するものでなければならない。〕また別の態様においては、本発明は、本発明のペプチドを産生するために有用な組換え体、並びにこれらのペプチドを産生する発現系を含むように改変された植物または動物である。本発明はまた、本発明のペプチドを有効成分として含有する医薬組成物および植物に適用するための組成物、もしくはペプチド産生のための発現系を含有する組成物、またはこれらのペプチドをコードするヌクレオチド配列のin situでの発現のための組成物を示している。本発明はまた、本発明のペプチドの合成によって製造する方法、これらのペプチドに特異的な抗体、およびこれらのペプチドの防腐剤としての使用についてのものでもある。別の態様においては、本発明はこれらの本発明の化合物の、抗微生物アッセイにおける標準品としての使用について示している。これらの化合物はまた、コンタクトレンズ溶液などの眼のケアに有用な溶液中で抗微生物剤として使用してもよく、または性行為感染症(STDs)治療用の局所用またはその他の医薬組成物として用いてもよい。本発明はまた、本発明の化合物の食品またはその他の生鮮品の防腐剤としての使用をも示している。本発明のペプチドは内毒素を不活化するので、本発明はまた、この特性の利点によって、本発明の化合物を用いての内毒素の不活化法およびこの性質を利用するグラム陰性敗血症の治療法をも示している。図の簡単な説明図１は、ブタ白血球の限外ろ過液の濃縮物をBiogel P10カラムにかけたときの溶出パターンを示す。図２は、図１に記載したカラムの溶出から得られたP10画分の抗菌活性を示す。図３は、図１のBiogel P10カラムからの第76-78画分をHPLCにアプライして得られた溶出パターンを示す。図４は、本発明の精製ブタプロテグリンの抗微生物活性を示す。図４ａは大腸菌に対する抗微生物活性を示す。図４ｂはリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)に対する抗微生物活性を示す。図４ｃはカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)に対する抗真菌活性を示す。図４ｄは、S .オーレウス(S．aureus)に対する抗菌活性を示す。図４ｅは、K.ニューモニア(K . pneumoneae)に対する抗菌活性を示す。図５は、抗微生物活性に対する種々の試験条件の影響を示す。図５ａは、100 μM のNaCl中でのCandida albicansに対する活性を示す。図５ｂは、100μM のN aCl中でのE．coliに対する活性を示す。図５ｃは、90%ウシ胎児血清中でのCandi da albicansに対する活性を示す。図６は線形プロテグリンの各種試験条件下での抗微生物活性を示す。図６ａは 10mMのリン酸-クエン酸緩衝液(pH6.5)中でのE．coliに対する活性を示す。図６ｂは100mMのNaClを含む同緩衝液中でのE．coliに対する活性を示す。図６ｃは、図６ａ〜６ｂで用いた緩衝液中でのL．monocytogenesに対する活性を示す。図６ｄは、100mMのNaCl を含む同緩衝液中でのL．monocytogenesに対する活性を示す。図６ｅは、10mMのリン酸の存在下でのC．albicansに対する活性を示す。図６ｆは、10mMのリン酸および100mMのNaCl存在下でのC．albicansに対する活性を示す。図７は、PG-1、PG-2、PG-3、およびPG-4の前駆体をコードするｃＤＮＡの組成を示す。図８は、本発明の抗微生物性化合物PG-1、PG-3、およびPG-5の前駆体タンパク質をコードするゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。図９は、プロテグリンゲノムＤＮＡの構成を示している。図１０は、プロテグリンPG-1からPG-5のアミノ酸配列を示している。図１１ａ〜１１ｃは、合成して製造したPG-5の抗微生物活性を、合成して製造したPG-1の活性と比較して示す。図１２ａ〜１２ｄは、各種の標的微生物に対する各種プロテグリンの効果を示す。図１３は、カイト(kite)形およびブレット(bullet)形のPG-1のグラム陽性菌に対する効果を図示したものである。図１４は、カイト形およびブレット形のPG-1のグラム陰性菌に対する効果を図示したものである。図１５は、スネーク(snake)形PG-1のグラム陽性菌に対する抗微生物活性を図示したものである。図１６は、スネーク形PG-1のグラム陰性菌に対する抗微生物活性を図示したものである。本発明の実施の形態本発明のペプチドは次式： A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-C₆-A₇-C₈-A₉-A₁₀-A₁₁-A₁₂-C₁₃-A₁₄-C₁₅-A₁₆-(A₁₇-A₁₈) (1) で示されるものおよびその定義された修飾型である。これらのペプチドは精製および単離されたものまたは組換え的に製造したものでなければならない。上記式中、A_nはそのペプチド中の指定された位置にあるアミノ酸を示す。A₁₇ およびA₁₉は存在してもしなくとも良いので、本発明のペプチドは16、17、または18個のアミノ酸を有することとなる。システイン残基の位置は式(1)中Ｃと示しており、本発明のペプチドでは未変異である。しかし、本発明の範囲に包含される式(1)のペプチドの修飾型では、これらのシステインの1-4個のうちの少なくとも１つを疎水性あるいは小型アミノ酸で置換しうる。ペプチドのアミノ末端は遊離アミノ型であったもよく、またはRCO-(Rは1〜6個の炭素原子を有するヒドロカルビル(hydroicarbyl)基を示す)で示される基でアシル化してもよい。ヒドロカルビル基は、飽和もしくは不飽和で、典型的には、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、n-ペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセン-2-yl、ヘキセン-3-yl、ヘキシン-4-ylなどである。本発明のペプチドのC 末端は、遊離酸もしくは許容しうる塩、例えば、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、またはその他の無機イオンの塩またはカフェインなどの有機イオンの塩として、非誘導体型のカルボキシル基としうる。カルボキシル末端はまた、ROHの式のアルコールとエステルを形成させた誘導体型とすることができ、または、NH₃、RNH₂、R₂NH(式中、各R はそれぞれが独立に上記で定義した炭素原子1〜6個のヒドロカルビルである)で示されるアミンによってアミド化することができる。C末端をCONH₂の式としたアミド化型ペプチドが好ましい。本発明のペプチドはかなりの数の塩基性アミノ酸を含むため、本発明のペプチドは酸付加塩の形で提供しうる。典型的な酸付加塩としては、例えば、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素などの無機イオンが挙げられ、硫酸、硝酸もしくはリン酸、または、例えば、酢酸、蟻酸、安息香酸などの有機陰イオンの塩であってもよい。これら塩類それぞれの許容性は、通常理解される様に、使用目的によって異なる。少なくとも２個のシステインを有する本発明のペプチドは、直鎖状または環状となりうる。直鎖型は環状型と相互変換可能である。環状ペプチドを作り出すためのジスルフィド結合を形成する方法は当業界では公知であり、また線形化合物を形成するためにジスルフィド結合を還元する方法も公知である。線形化合物は、ヨードアセトアミドなどの適当なアルキル化剤の添加により安定化することができる。環状型は、４個の未変異のシステイン残基の全てあるいはこれらのうちのいくつかがシスチン架橋を形成した結果である。本発明の環状型は、シスチン結合形成の全ての可能な組合わせを含む。それが起こる順序でシステインに、Ｎ末端からC₆、C₈、C₁₃およびC₁₅と番号付けするとこれらの組合わせとしては： C₆-C₈; C₆-C₁₃; C₆-C₁₅; C₈-C₁₃; C₈-C₁₅; C₁₃-C₁₅; C₆-C₈，C₁₃-C₁₅; C₆-C₁₃，C₈-C₁₅; および C₆-C₁₅，C₈-C₁₃である。 1〜4個のシステインが置換されている修飾型のペプチドでは、2〜3個のシステインが残存している場合には上記と同様の組合わせをとりうる。天然型プロテグリンは２個のシスチン結合をもっており、その一つは６位のシステインと15位のシステインの間にあり、他の一つは８位のシステインと13位のシステインの間にある。したがって、２個のシスチン架橋を有する実施態様においては、C₆-C₁₅型およびC₈-C₁₃型が好ましい。しかし、本出願の出願人によって、１個のシスチン架橋のみを有するプロテグリンは、活性であり製造しやすいことが見出されている。そのような１個のシスチン架橋を有する実施態様のうちで好ましいものは、C₆-C₁₅のみで表されるものまたはC₈-C₁₃のみで表されるものである。 C₆-C₁₅シスチンが唯一のシスチン架橋である形のものは、通常「ブレット」形プロテグリンと呼ばれ、C₈-C₁₃に唯一のシスチンがある場合には「カイト」形と呼ばれる。ブレット形およびカイト形は、シスチン架橋していない位置のシステインを中性アミノ酸、好ましくはグリシン、セリン、アラニン、またはトレオニンなどの小型のアミノ酸で置換するか、それらよりは好ましくないが中性の極性アミノ酸、例えば、アスパラギンまたはグルタミンで置換することにより最も簡便に製造しうる。したがって、ブレット形の実施態様としては、C₈とC₁₃の各々が独立にアラニン、セリン、トレオニン、またはグリシンとであるもの、好ましくは双方ともアラニンである。逆に、カイト形では、C₆とC₁₅とを同様に置換したものである。線形の天然型環状ペプチドは、例えばスルフヒドリル型システインを保持するためにヨードアセトアミド反応によって化学的に安定化された場合においてさえ、有効な活性を有するものであるので、本発明の化合物は適当な試薬で安定化した線形のものをも含む。ここに定義したとおり、本発明の「SH-安定化」型のペプチドは、ジスルフィド架橋の再形成を防止するために、標準的な試薬と反応させたスルフヒドリル基を有している。本発明の線形のプロテグリンを得るための別のアプローチとして、システイン残基をシスチン架橋を形成しないアミノ酸で置換した修飾型ペプチドの使用が含まれる。この場合もまた、6、8、13、および15位のシステインの４個全て(または少なくとも３個)が上述の極性の中性アミノ酸または小型のアミノ酸で置換される。分子内架橋の可能性を最小限とするために、４個のシステイン全てが置換されていることが望ましい。 A_nで示されるアミノ酸は、遺伝子またはその類似体でコードされるものであってもよく、またそれらのアミノ酸のD-異性体であってもよい。本発明のペプチドの好ましい実施態様の一つとして、全ての残基がＤ体であり、それにより、抗微生物活性や抗ウイルス活性を保持したまま、タンパク質分解酵素に抵抗性を持つものがある。得られたプロテグリンは、天然のL-アミノ酸含有型の鏡像異性体である。ここで用いたアミノ酸表記法は従来用いられてきたものであり下記のとおりである。遺伝子にコードされないアミノ酸についての略号は下記に述べるとおりである。本明細書中に示される特定のペプチドにおいて、D体は短剣符(†)で示されているが、それ以外は、光学異性体を有するＬ体のアミノ酸残基を示している。本発明の化合物は、アミノ酸残基の分類によって部分的に定義されるペプチドである。アミノ酸残基は通常、以下の主要なサブクラスにさらに分類される。酸性：酸性の残基は生理学的pHでは水素イオンを失っていることにより陰電荷を持ち、ペプチドが生理学的pHの水性溶媒中にあるときにはペプチドのコンホメーション中で表面の位置を求めるために、該残基が水性溶液によって誘引される。塩基性：塩基性の残基は生理学的pHでは水素イオンと会合しているため陽電荷を持ち、ペプチドが生理学的pHの水性溶媒中にあるときにはペプチドのコンホメーション中で表面の位置を求めるために、該残基が水性溶液によって誘引される。疎水性：疎水性の残基は生理学的pHでは電荷を持たず、ペプチドが水性溶媒中にあるときにはペプチドのコンホメーション中で内部の位置を求めるために、該残基が水性溶液によって反発される。中性/極性：中性/極性の残基は生理学的pHでは電荷を持たないが、ペプチドが水性溶媒中にあるときには、ペプチドのコンホメーション中で内部の位置を求める程十分に水性溶液によって反発されない。本説明において特定のアミノ酸を「小型」としているが、それは極性基は欠いているとしてもそれらの側鎖が疎水性を持つに至るのに十分な大きさでないからである。「小型」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖上にあるときには炭素原子４個以下のものであり、極性基がないときには炭素原子３個以下のものである。もちろん、各残基分子を統計学的に集めてみれば、電荷を有する分子もあれば、電荷を有しない分子もあり、水性溶媒への誘引又はそれからの反発がより高度にあるいはより軽度に起こったりすることが知られている。「電荷を有する」ことの定義に適合するためには、個々の分子の相当程度の比率(少なくとも約25％) が、生理学的pH条件で電荷を有さなければならない。極性又は無極性を分類するために必要とされる誘引又は反発の程度は任意のものであり、それ故、本発明で特に意図するアミノ酸は極性又は無極性のどちらかに分類しうる。ここで特に分類していない大部分のアミノ酸は既知の性質によって分類しうる。アミノ酸残基はさらにサブクラスに分類することができる。すなわち、それらは環状又は非環状、及び芳香族又は非芳香族に分類できるし、残基の側鎖が置換されている場合にはそのこと自体が分類となり、また大小にも分類できる。アミノ酸残基に極性の置換基が存在している場合にはカルボキシル基の炭素を含めて炭素原子数が４個以下の場合に、又、極性の置換基が存在していない場合には炭素原子数が３個以下の場合に、残基は小型とみなされる。小型の残基は当然、常に非芳香族である。天然に存在するタンパク質のアミノ酸について上記のスキームに従って次のようなサブクラスに分類される。酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸塩基性：非環状：アルギニン、リジン環状：ヒスチジン小型：グリシン、セリン、アラニン、トレオニン極性/大型：アスパラギン、グルタミン疎水性：チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン遺伝子によってコードされる第二のアミノ酸であるプロリンは、ペプチド鎖の二次構造に影響を与えることが知られており、それ故に上記のグループのどれにも属していない特別の例である。システイン残基もやはり上記の分類に含まれていない。なぜならば、システインのジスルフィド結合を形成して二次構造をとるという能力は、本発明の化合物にとっては非常に重大だからである。通常よく遭遇するある種のアミノ酸で、遺伝子コードでコードされていないものとしては、例えばβ-アラニン(beta-Ala)、又はその他のω-アミノ酸（例えば 3-アミノプロピオン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸(2,3-diaP)、4-アミノ酪酸など）、α-アミンイソ酪酸(Aib)、サルコシン(Sar)、オルニチン(Orn)、シトルリン(Cit)、t-ブチルアラニン(t-BuA)、t-ブチルグリシン(t-BuG)、N-メチルイソロイシン(N-Melle)、フェニルグリシン(Phg)、及びシクロヘキシルアラニン(Cha )、ノルロイシン(Nle)、2-ナフチルアラニン(2-Nal); 1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸(Tic); β-2-チエニルアラニン(Thi)；メチオニンスルホキシド(MSO)；及びホモアルギニン(Har)が挙げられる。これらのアミノ酸も特定のカテゴリーに分類できる。上記の定義に基づけば、 Sar、beta-Ala、2,3-diaP及びAibは小型、 t-BuA、t-BuG、N-Melle、Nle、Mvl、Cha、Phg、Nal、Thi及びTicは疎水性、 Orn、及びHarは塩基性、 Cit、Acetyl Lys及びMSOは中性/極性である。各種のω-アミノ酸はサイズによって小型(beta-Ala及び3-アミノプロピオン酸 )，又は大型及び疎水性(その他全て)に分類される。遺伝子中にコードされたアミノ酸をその他のアミノ酸で置換したものも本発明のペプチド化合物の範囲に含むことができ、それらのアミノ酸の構造に従ってこの一般的なスキームで分類し得る。本発明のペプチド全てにおいて、１つ以上のアミド結合(-CO-NH-)を場合により、同配体（isostere）である他の結合、例えば-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂CH₂、-C H=CH-（シス及びトランス）、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂- 及び -CH₂SO-などの結合で置換しうる。この置換は当業界で公知の方法で行いうる。下記の参照文献はこれらの置換しうる結合を含むペプチド類似体の調製について述べている：Spatola, A.F.，Vega Data(March 1983)，Vol.1，Issue 3，"Peptide Backbone Modificat ions"（総説）；Spatola，A.F.，"Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins"，B.Weinstein編，Marcel Dekker，New York，p.267(1 983)(総説); Morley，J.S.，Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468(総説); Hudson ，D.，ら，Int J Pept Prot Res（1979）14:177-185(-CH₂NH-、-CH₂CH₂-); Spat ola，A.F.,ら，Life Sci(1986)38:1243-1249(-CH₂-S); Hann，M.M.，J Chem Soc Perkin Trans I （1982）307-314（-CH=CH-，シス及びトランス）；Almquist，R .G.,ら，J Med Chem(1980)23:1392-1398(-COCH₂-)；Jennings-White，C.,ら，Te trahedron Lett (1982)23:2533(-COCH₂-)；Szelke，M.,ら，欧州特許出願 EP 456 65(1982)CA：97:39405(1982)(-CH(OH)CH₂-)；Holladay，M.W.,ら，Tetrahedron Lett (1983)24:4401-4404(-C(OH)CH₂-)；及びHruby,V.J.，Life Sci（1982）31:189-1 99(-CH₂-S-)。式(1)の化合物は一般に次のように定義される。任意に−ＳＨ安定化された線形またはシスチン架橋形のいずれかである式(1): A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-C₆-A₇-C₇-A₉-A₁₀-A₁₁-A₁₂-C₁₃-A₁₄-C₁₅-A₁₆-(A₁₇-A₁₈) (1)［式中、A₁が塩基性アミノ酸であり、 A₂およびA₃はそれぞれが独立に小型のアミノ酸であり、 A₅、A₇およびA₁₄はそれぞれが独立に疎水性アミノ酸であり、 A₄は塩基性又は小型のアミノ酸であり、 A₉、A₁₂及びA₁₆はそれぞれが独立に塩基性、疎水性、中性/極性、又は小型のアミノ酸であり、 A₁₀及びA₁₁はそれぞれが独立に塩基性、中性/極性、疎水性若しくは小型のアミノ酸であるか、又はプロリンであり、 A₁₇は存在しないか、または存在する場合は、塩基性、中性/極性、疎水性、若しくは小型のアミノ酸であり、 A₁₈は存在しないか、または存在する場合は、塩基性、疎水性、中性/極性、若しくは小型のアミノ酸である］で表される、＋３以上の電荷を有する化合物またはそのＮ末端アシル化および/ またはＣ末端アミド化もしくはエステル化型、または４個のシステインのうちの少なくとも１個が独立に疎水性アミノ酸または小型のアミノ酸で置換されている式(1)の修飾型またはそのＮ末端アシル化および／またはＣ末端アミド化もしくはエステル化型。本発明の化合物の好ましい実施態様においては、A₁及びA₉はそれぞれが独立に、R、K、及び Harからなる群から選択されるが、より好ましくはA₁及びA₉の両方が Rである。また別の好ましい実施態様においては、A₂及びA₃はそれぞれが独立に、G、A、 S、及びTからなる群から選択されるが、より好ましくはA₂及びA₃はGである。また別の好ましい実施態様においては、A₄はR、K、Har、G、A、S、及び Tからなる群から選択されるが、より好ましくはA₄は R又はGである。また別の好ましい実施態様においては、A₅、A₁₄及びA₁₆はそれぞれが独立に、 I、V、L、Nle及びF、好ましくはI、V、L及び Fから成る群から選択される。また別の好ましい実施態様においては、A₇及びA₁₂はそれぞれが独立に、I、V 、L、W、Y及び Fからなる群から選択されるが、好ましくはA₇が Yであり、A₁₂が I又はF である。また別の好ましい実施態様においては、A₁₀はR、G又はPである。また別の好ましい実施態様においては、A₁₁は R又はWである。 A₁₇が存在する場合には、A₁₇は好ましくはG、A、Sまたは Tであり、最も好ましくは Gである。 A₁₈が存在する場合には、A₁₈は好ましくはR、K又はHarであり、最も好ましくは Rである。上述のとおり、式(1)の化合物は環状もしくは非環状(線形)であるか、又は1-4 個のシステインが小型のアミノ酸残基又は疎水性残基又は大型の非極性のアミノ酸残基によって置換されることにより修飾されたものである。線形の式(1)の化合物を調製する場合、又は線形のそれらの修飾ペプチドが少なくとも２個のシステインを有するものである場合には、そのスルフヒドリル基を適当な試薬の添加により安定化させておくことが好ましい。システイン残基と置換する疎水性アミノ酸として好ましい実施態様は、I、V、L及びNleであり、好ましくはI、V又は L である。システイン残基と置換する小型のアミノ酸として好ましいのは、G、A、 S及び Tが挙げられるが、最も好ましいのは Gである。大型の極性アミノ酸として好ましいのは N及びQである。さらに別の実施態様においては、本発明のペプチドは式(1)で定義されるが、各場合においてAnの定義は、本発明の方法を用いた動物の白血球からのペプチドの単離性によって定められる。本発明の方法は、動物白血球溶解物の限外ろ過、及び16-18アミノ酸からなるペプチドの分離のステップを含んでなる。これらのペプチドはさらに、それらをコードするＤＮＡの、PG-1、PG-2、PG-3、PG-4およびPG-5として例示されるペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる能力によって定義しうる。特に好ましい本発明の化合物は次のとおり。非修飾型それらの直鎖型、並びに単環及び二環型の両方、さらにN末端アシル化及びC末端アミド化型を含む；修飾型それらの直鎖型及び環状型(可能であれば)の両方、さらにN末端アシル化型、C末端アミド化型を含む。特に好ましいのは、C₈及びC₁₃の間にシスチン結合を持つとともに、C₆とC₁₅とがそれぞれ独立に「X」(ここでXとは疎水性、又は小型もしくは大型の極性アミノ酸である)に置換されている４個の化合物であって、単一のシスチン結合がC₆ とC₁₅との間、又はC₈とC₁₃との間に形成されている化合物である。同様にして、単一のシスチン結合がC₈とC₁₃との間にあり、C₆とC₁₅とがそれぞれ独立に上記で定義したXで置換されているものが好ましい。また、４個のシステインの全てが上記で定義したXと置換されている「スネーク」形の本発明の化合物が好ましい。本発明のこれら化合物の特に好ましい実施態様は：カイト形−１カイト形−２カイト形−３カイト形−４カイト形−５ブレット形−１ブレット形−２ブレット形−３ブレット形−４ブレット形−５であり、ここでXとは、上記で定義されたものである。 Xの特に好ましい実施態様としては、Xが小型のアミノ酸、特に S及びA、さらに特にAである。本発明の化合物の調製本発明の化合物（ここでは「プロテグリン類」と呼ばれる場合もある）は、基本的にはペプチド骨格を有し、そのN末端又はC末端は修飾されていてもよく、また、１個又は２個のシスチンジスルフィド結合を有していてもよい。これらのペプチドはまず最初に非環状型で合成しうる。その後、これらのペプチドは必要であれば標準的なシスチン結合形成法を用いて環状型に転化できる。ここではプロテグリン類に適用されるように、「環状型」とは、ペプチド中のシステイン残基間にジスルフィド結合を形成することによって環状部分を含むようにした型を意味する。直鎖型が好ましい場合には、２個以上のシステイン残基を有する本発明のいかなるペプチドについても、そのスルフヒドリル基を安定化させることが好ましい。プロテグリン類の大きさのペプチドを合成する標準的な方法は公知である。現在最もよく使われているのは固相合成法であり、規則正しくペプチドを構成していく自動化装置が購入可能である。液相合成も用いうるが、かなり不便である。これらの標準的な手法で合成した場合には、遺伝子によってコードされていないアミノ酸やD-エナンチオマーを合成に用いることができる。このように、本発明の化合物を得るための非常に実用的な方法の一つは、これらの標準的化学合成法を使用することである。ペプチド骨格の提供に加えて、N末端及び/又はC末端を、従来から用いられている化学的手法を用いて誘導化しうる。本発明の化合物はそのアミノ末端にアシル基、好ましくはアセチル基を任意に有していてもよい。N末端の未修飾のアミノ基のアセチル化法、より一般的にはアシル化法は、当業界で一般に知られている。さらに、N末端アミノ酸はこの合成中にアシル化された形で供給されうる。カルボキシル末端ではカルボキシル基はもちろん塩の形で存在しうる。医薬組成物の場合には、製剤学的に許容しうる塩である。適当な塩としては、無機イオンとの塩、例えばNH₄₊、Na₊、K₊、Mg₊₊、Ca₊₊等、並びに有機イオンとの塩、例えばカフェイン及びその他の高度に置換されたアミン類が挙げられる。また、カルボキシル末端は、ROH(Rは上記で定義したヒドロカルビル(hydrocarbyl)(1-6C) である)のアルコールを用いてエステル化することもできる。同様にカルボキシル末端をアミド化して-CONH₂、-CONHR、又は-CONR₂(各Rはそれぞれ独立にここで定義されたヒドロカルビル(1-6C)である)とすることもできる。エステル化、アミド化及び塩基の存在下で中和して塩を形成する手法は全て、標準的な有機化学的手法である。本発明のペプチドが生理学的条件下で調製される場合には、塩基性アミノ酸の側鎖のアミノ基は適当な酸が付加した塩の形となる。もし必要があれば、ジスルフィド結合の形成は穏和な酸化剤の存在下で行われる。化学的な酸化剤を用いるか、又は化合物を空気中の酸素に暴露させることにより、これらの結合を形成させることができる。当業界では種々の方法が知られている。ジスルフィド結合形成に有用な方法については、Tam，J.P.ら，Synthes is (1979)955-957; Stewart，J.M.ら，"Solid Phase Peptide Synthesis" 第２版．Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984); Ahmed，A.K.ら，J Biol Che m （1975）250:8477-8482 及び Pennington，M.W.ら，Peptides 1990，E．Giralt ら，ESCOM Leiden，The Netherlands（1991）164-166 に述べられている。さらに別の方法が、Kamber，B.ら，Helv Chim Acta（1980）63:899-915に述べられている。固相担体上で行う方法については、Albericio（Int J Pept Protein Res （1985）26:92-97）が述べている。特に好ましい方法は分子酸素を用いる溶液酸化である。この方法は合成PG-1、アミド型または酸型のPG-3、エナンチオPG-1および２つのユニスルフィドPG-1化合物（C₆-C₁₅およびC₈-C₁₃）を再度折り返すためにここで本発明者らにより採用された。回収率は30% もある。ペプチドバックボーンが完全に遺伝子コード化アミノ酸から構成される場合、またはその部分がそのような構成である場合は、ペプチドまたは関連部分を組換えＤＮＡ法を用いて合成することもできる。本発明のペプチドをコードするＤＮＡそれ自体は市販の装置を使って合成し得る。コドンの選択は宿主の性質に応じて合成に組み込むことができる。また、あまり好都合とはいえないが、このＤＮＡは、少なくとも初期には、ここに記載するプロテグリンの配列に基づくプローブまたはＰＣＲプライマーを用いてブタ白血球から作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。これにより、天然に存在する本発明のプロテグリンをコードする配列が回収される。この天然配列の取得はプロテグリン自体の合成以外の目的には意義のあることである。天然に存在する配列の入手可能性は、他の種のプロテグリンをコードする対応ＤＮＡを得るのに有用なプローブを提供する。かくして、例えば他の動物由来の白血球のｃＤＮＡライブラリーを、好ましくは高ストリンジェントな条件下で、天然ＤＮＡを用いてスクリーニングすることができる。高ストリンジェントな条件は、Maniat isら，Molecular Cloning: a Laboratory Manual，2nd Ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)で定義されているとおりであり、その関連部分を参考としてここに組み入れる。この手法は同一の種からのこれらのペプチドの対立遺伝子変異体の回収をも可能にする。また、ブタ・プロテグリンの単離に関してここに開示したものと同じ手法を用いて、所望の動物種の白血球から単離することによりプロテグリンを調製することができる。一般に、こうした手法は、白血球の溶解物を調製し、澄明化した溶解物の上清を限外濾過し、限外濾過物を回収することを含む。その後限外濾過物をクロマトグラフィーによる分離にかける。プロテグリンに対応する抗菌および抗ウイルス活性を有するフラグメントの位置を分子量基準を用いて評価し、ここに記載するごとくその画分の所望の活性をアッセイする。これらのペプチドの天然型は環形であると考えられるが、所望により、ペプチドを還元剤で処理し、生じたスルフヒドリル基を安定化することにより線形をつくることができる。単離されたプロテグリンおよび組換え的に生産されたプロテグリンは、Ｎ末端および／またはＣ末端を修飾するために、また、単離法に応じて、上記のシスチン結合の形成を行うために、後続の誘導体化を必要とすることがある。組換え生産に用いた宿主生物およびそのタンパク質が単離された動物源に応じて、これらの変換の一部または全部はすでに達成されているかもしれない。組換え生産のために、本発明のプロテグリンをコードするＤＮＡは、意図する宿主細胞と適合する適当なプロモーターおよび他の調節配列の制御下にこれらのコード配列を位置づける発現系に挿入される。利用可能な宿主細胞の型は植物界と動物界のほぼ全範囲にわたる。したがって、本発明のプロテグリンは動物細胞、昆虫細胞、植物細胞だけでなく細菌または酵母（プロテグリンが無毒性または屈折性の形で生産されるか、耐性株を利用する場合）でも生産され得るだろう。実際、改変された植物細胞を用いて、関連する発現系を含有する植物を再生することができ、こうして得られるトランスジェニック植物はこれらの感染性の物質に対する自己防衛能をもっている。本発明のプロテグリンは、プロテグリンをコードするＤＮＡを、適当なシグナルペプチドをコードするＤＮＡに融合させることにより宿主細胞から分泌される形で生産させることができ、細胞内に生産させることもできる。また、別のアミノ酸配列との融合タンパク質としてそれらを生産させることもでき、別のアミノ酸配列はその後、これらの化合物を抗菌剤または抗ウイルス剤として使用する前に除去する必要があるかもしれないし、ないかもしれない。こうして、本発明のプロテグリンは、化学合成、組換え生産、天然源からの単離、またはこれらの技法のいくつかの組合せを含めて、種々の方法で得ることができる。天然に存在するプロテグリンクラスのこれらのメンバーは精製および単離された形で供給される。「精製および単離された」とは、（天然に存在するペプチドの場合には）そのペプチドが通常存在する環境を含まず、それが実際に使用される形態であることを意味する。したがって、「精製および単離された」形態とは、そのペプチドが実質的に純粋であること、すなわち、90% を越える純度、好ましくは95% を越える純度、より好ましくは99% を越える純度であること、または薬学的製剤の状況のような全く異なる状況にあることを意味する。抗体本発明のプロテグリンに対する抗体は、ポリクローナル抗血清を生産するための標準的な免疫学的手法を用いるか、所望により、モノクローナル抗体の供給源としての免疫宿主の抗体産生細胞を不死化することにより調製することができる。対象物質に対する抗体を得る技術は公知である。特に、本発明と同様にその物質が短鎖ペプチドである場合には、そのハプテンを担体に結合させることで物質の免疫原性を高める必要があるかもしれない。この目的に適した担体は、それ自体がハプテン−担体結合体を投与される哺乳動物において免疫応答を引き出さない物質である。慣用の担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジフテリア毒素、血清アルブミン、ロタウイルスＶＰ６のウイルスコートタンパク質などがある。ハプテンと担体との結合は、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような脱水剤の存在下で、またはPierce Chemical Company(Chicago，I L)から入手できるようなリンカーの使用により、担体とペプチドとを接触させるといった標準的手法により行われる。その後、免疫原性がある形態の本発明のプロテグリンを適当な哺乳動物宿主に注入し、血清中の抗体価をモニターする。しかしながら、いくつかの形態のプロテグリンは抗原プロセシングに対するその抵抗性のために抗体誘導に先立って修飾を必要とすることに注意すべきである。例えば、２つのシスチン橋を含む天然型のPG-1は、より大きな担体に結合させずに投与するときは免疫原性がなく、強力なアジュバントの存在下でさえ、そしてグルタルアルデヒドを介してまたはＫＬＨに結合させたときでさえ、その免疫原性は低かった。これは幾つかのマクロファージカテプシンに似ているアスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン）による攻撃に対するその抵抗性と、白血球のセリンプロテアーゼ（ヒトＰＭＮエラスターゼおよびカテプシンＧ）による攻撃に対するその抵抗性による、と考えられる。それゆえ、免疫原性の欠如は抗原提示細胞の抗原提示ポケットにはまり込める線形へのプロセシングに抵抗することから生ずる可能性がある。これらの形のプロテグリンの免疫原性はジスルフィド結合を開裂することで増強することができる。ポリクローナル抗血清は抗体価が十分に高いときに収穫することができる。あるいはまた、脾細胞や末梢血リンパ球といった宿主の抗体産生細胞を収穫して不死化してもよい。次に、不死化した細胞を個々のコロニーとしてクローニングし、所望のモノクローナル抗体の産生に関してスクリーニングする。本発明の抗体は、もちろん、プロテグリンの量または存在を測定するためのイムノアッセイに有用である。こうしたアッセイは本発明のプロテグリンを含有する組成物の品質管理生産では不可欠である。さらに、プロテグリンの組換え生産の有効性を評価したり、プロテグリンをコードする遺伝子の存在に関して発現ライブラリーをスクリーニングするにも抗体を用いることができる。プロテグリンを含有する組成物および使用方法本発明のプロテグリンは、グラム陽性およびグラム陰性細菌、酵母、原生動物、いくつかのウイルス株を含めて、広範囲の微生物およびウイルス標的を不活性化するのに有効である。したがって、それらは殺菌組成物中で、または食品、化粧品、医薬品などの物質、もしくは生物の栄養素を含有する他の物質の防腐剤として使用することができる。こうした状況下で使用するために、プロテグリンは単一のプロテグリンとして、数種類の他のプロテグリンとの混合物として、または別の抗菌剤との混合物として供給される。一般的に、これらは防腐的であるので、通常は比較的少量で、組成物全体の重量基準で5%未満、より好ましくは1%未満、さらにより好ましくは0.1%未満の量で存在する。本発明のペプチドはまた、抗微生物アッセイおよびリポ多糖類などの内毒素に結合する試験化合物の能力を測定するためのアッセイにおいて標準品として有用である。動物被験者の治療のために抗微生物剤または抗ウイルス剤として使用する場合は、本発明のプロテグリンを医薬組成物または獣医学的組成物として製剤化することができる。治療すべき被験者、投与様式、希望する処置のタイプ（例えば予防、治療）に応じて、プロテグリンはこれらのパラメーターと調和するやり方で製剤化される。このような技術の概要は、Remington's Pharmaceutical Science s, 最新版，Mack Publishing Co.，Easton，PA に載っている。プロテグリンはとりわけ、クラミジア・トラコーマチス（Chlamydia trachoma tis）、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ナイセリア・ゴノロエア（Nei sseria gonorrhoeae）、トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginalis)、単純ヘルペスタイプ２およびＨＩＶにより引き起こされるものを含めて、性的感染症の治療において有用な医薬組成物の有効成分として魅力的である。局所製剤が好適であり、これにはクリーム、軟膏、オイル、粉末、ゲルなどが含まれる。適当な局所用賦形剤は当技術分野で公知であり、当業者により特定の使用のために適応させることができる。一般に、ＳＴＤの治療または予防に使用するために、本発明のプロテグリンは単独でまたは他の抗生物質と組み合わせて、例えばエリスロマイシン、テトラサイクリン、マクロライド系（例：アジスロマイシン）およびセファロスポリン類と組み合わせて用いられる。投与様式に応じて、プロテグリンは患部への容易な投与を可能にする適当な組成物へと製剤化されるだろう。プロテグリンは１個または２個のジスルフィド橋を含む形で用いてもよいし、線形であってもよい。さらに、すべてのＤ−アミノ酸を含有する鏡像体の使用は、トリプシンやキモトリプシン（Ｌ−アミノ酸を含むプロテグリンはこれらのプロテアーゼに対する抵抗性が低い）などのプロテアーゼに対する抵抗性といった利点を付与するかもしれない。本発明のプロテグリンは単独で、数種類のプロテグリン類の混合物として、または他の薬学的に活性な成分と組み合わせて投与することができる。こうした製剤は全身投与または局所投与に適した様式で調製される。全身製剤は注射（例えば、筋肉内、静脈内、皮下注射）用に設計されたものを含み、また、経皮、経粘膜または経口投与用に調製することもできる。これらの製剤は一般に希釈剤だけでなく、いくつかの場合には、アジュバント、バッファー、防腐剤などを含むだろう。プロテグリンはまたリポソーム組成物中に保持させて、またはマイクロエマルジョンとして投与することもできる。経口的に投与する場合、本発明のプロテグリンは適当な腸溶コーティングを用いて胃の中での分解から保護しなければならない。これはＤ−アミノ酸を利用してプロテアーゼに対する抵抗性を与えることにより、ある程度は避けられるかもしれない。しかし、ペプチドは胃の酸性状態のために依然加水分解を受けやすく、それゆえ、ある程度の腸溶コーティングがまだ必要になるかもしれない。以下の実施例に記載するように、本発明のペプチドは、眼のケア製品中で常用されるホウ酸溶液中で微生物に対するその活性を保持している。また、ホウ酸緩衝生理食塩水中でリゾチームの存在下または不在下に大腸菌に対する抗菌活性を試験したとき、リゾチームの存在はPG-3の有効性を高めることがわかった。この効果はPG-3をオートクレーブ滅菌したときさらに顕著で、同様のパターンが遊離酸型とアミドの両方において得られた。したがって、プロテグリンはこのような組成物中で防腐剤として、または眼の感染症治療用の抗菌剤として使用することができる。プロテグリンが比較的高濃度の食塩水および血清の存在を含めた生理的条件下でその活性を保持するということは特に重要である。加えて、プロテグリンは高等生物の細胞に対して細胞毒性を示さない。実施例で後述されるこれらの性質により、プロテグリンはin vivo および治療的使用に特に適している。本発明のプロテグリンは植物のウイルスまたは微生物により引き起こされる病気を予防するために、植物またはそれらの環境に適用することもできる。この用途に適した組成物は一般に希釈剤だけでなく展着剤や、植物またはその環境に有益な他の補助剤を含むだろう。こうして、本発明のプロテグリンは抗微生物および／または抗ウイルス作用が必要とされるあらゆる状況下で使用することができる。この使用は完全にin vit ro使用であってもよく、また、ペプチドを生物に投与してもよい。さらに、抗微生物または抗ウイルス活性は、本発明のプロテグリンの生産に適した発現系を投与することによりin situ で引き出すこともできる。こうした発現系は公知の技法を使って植物および動物被験者に供給することができる。例えば、動物では、poxベースの発現ベクターを用いてペプチドをin situ で生産させることができる。同様に、植物細胞を発現ベクターで形質転換した後、その細胞をペプチド産生能をもつ植物体へと復元することができる。プロテグリンの特に有用な性質は血清の存在下でのその活性である。デフェンシンと違って、プロテグリンは血清の存在下でその抗微生物作用を発揮することができる。以下に示すように、プロテグリンは標準的なアッセイにおいてグラム陰性細菌由来の内毒素、すなわちリポ多糖類（ＬＰＳ）を不活性化することができる。したがって、ＬＰＳの不活性化が望まれるどのような環境でもプロテグリンを使用できる。一つのこのような事態はグラム陰性敗血症の治療または改善である。かくして、本発明のプロテグリンは次の性質のために特に有用なクラスの化合物を提供する。１）プロテグリンはウイルス（レトロウイルスを含む）、細菌、真菌、酵母、原生動物を含めて、広範囲の標的微生物系に対して抗微生物効果を有する。２）プロテグリンの抗微生物活性は生理的条件下で、すなわち生理的食塩水および血清の存在下で有効である。３）プロテグリンは高等生物の細胞に対して毒性でない。４）プロテグリンは免疫原性のない形態で調製することができ、したがって、それらを投与し得る生物種の数が広がる。５）プロテグリンは幾つかのプロテアーゼに抵抗性を示す形態で調製することができ、リソソーム中でさえ抗微生物活性を示すことが示唆される。６）プロテグリンはオートクレーブ滅菌の際の分解に抵抗する形態で調製することができ、したがって、医薬品の成分としてのその調製が簡便になる。以下の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明を制限するものではない。実施例１ PG-1 、PG-2およびPG-3の単離新鮮なブタ血液を、抗凝血物質としてpH7.4の通常の生理食塩水に 5%EDTA を加えたものを入れた(33ml/リットル血液)15リットルの容器に集めた。血球を室温で90分間沈降させ、白血球の豊富な上清を取り出し、200×gで5.7 分間遠心分離した。ペレットを集めて、0.84%塩化アンモニウムに懸濁させることにより赤血球を溶解し、その結果得られた白血球(70-75% PMN、5-10% 好酸球、15-25%リンパ球および単球)を通常の生理食塩水で洗浄し、氷冷した 10%酢酸に10⁸/mlの濃度で再懸濁し、ホモジナイズして、４℃で一晩撹拌した。該調製物を４℃において、25,000×gで３時間遠心分離して、上清を凍結乾燥して重さを量った。 BCA分析によって520mgのタンパク質を含むことが分かっている950mg(乾燥重量 )の凍結乾燥した抽出物を、100mlの 10%酢酸中で４℃において一晩撹拌した後、 25,000×gで２時間遠心分離した。上清を取り出し、これをYM-5フィルターを入れた50ml の撹拌した超遠心セル(Amicon，Danvers，MA)に加圧しながら通した。限外ろ過物(BCAによれば24.5mgのタンパク質)を真空遠心(SpeedVac Concentrato r，Savant Instruments，Hicksville，NY)により3ml に濃縮し、2.5×117cm Bio Gel P10カラム(Bio-Rad，Hercules，CA)にかけて、４℃で５%酢酸により溶出した。 6.6ml を含む画分が得られた。該画分を280nmにおける吸収によりアッセイし、溶出パターンを図１に示した。各画分のアリコート(66μl)を真空遠心により乾燥し、6.6μlの0.01%酢酸に再懸濁した。この濃縮物の５μlのサンプルについて、Lehrer，R.I．et al.，J. I mmunol ．Meth. （1991）137:167-173に記載された放射状拡散およびゲル重層技術を用いて、大腸菌(E.coli)ML-35、リステリア菌(L.monocytogenes)EGD株およびカンジダ・アルビカンス(C.albicans)820株に対する抗微生物活性の試験を行った。簡単に述べると、すべての生物体に用いられる下層の寒天は、最終的なpHが 6.5で、9mMリン酸ナトリウム/1mMクエン酸ナトリウム緩衝液、1%w/vアガロースおよび0.30μg/mlトリプティカーゼ大豆ブロス粉末(BBL Cockeysville，MD)を含むものであった。放射状拡散アッセイにおける活性（ユニット）は以下のように測定された。すなわち、10ユニットは、サンプルウエルの周りの直径1mmの透明な区域に相当する。さまざまな画分について得られた活性を図２に示す。活性は多くの画分に見いだされた。活性を有する画分について、酸-尿素PAGE(AU-PAGE)およびSDS PAGEによってさらに試験を行った。これらの分析の結果によって、適当な分子量を有する活性な抗微生物ペプチドが存在し、画分76-78に濃縮されていることが示された。次いで、Biogel P10カラムから得られた画分76-78を集めて、1×25cm Vydac 2 18 TP1010カラムを用いて、勾配（緩衝液Aは0.1% TFA、緩衝液Bは0.1%のTFAのアセトニトリル溶液である）により、アセトニトリルの濃度の増加が毎分1%となるようにしてクロマトグラフィーを行った。280nmおよび225nmにおける吸光度に基づいて評価された結果を図３に示す。図において、ここに記された三つのペプチドに対応するピークに表示をつけた。図にはまた、集められた画分および個々の PG種から構成される出発混合物を含むクーマシーブルーで染色された酸-尿素PAG Eゲルの結果を示す差し込み図も挿入されている。これらは、差し込み図の上にM 、１、２および３と表示してある。この結果、三つの異なるタンパク質の存在が明瞭に示された。単離されたタンパク質について、三つの別々の方法を用いたアミノ酸分析、エドマン分解、キモトリプシン消化、および高速原子衝撃質量分析を行った。“プロテグリン”と名付けられたペプチドは以下に示すようなアミノ酸配列を有しており、C-末端がアミド化されている。単離されたペプチドのアミド化された状態は、遊離のカルボキシル型およびカルボキシアミド化された型の両方のPG-3を合成することにより証明された。これらの合成ペプチドを、AU-PAGEおよび逆相HPLCを用いて単離されたPG-3と比較した。どちらの場合にも、天然の生成物は、合成されたアミド化型と共に移動した。また、単離されたプロテグリンにおけるジスルフィド結合の位置についても、モデルとしてPG-2を用いて研究した。連続的な酵素による消化（キモトリプシンに続いてサーモリシン）を用い、得られたフラグメントをLC-ESI-MSによって直接分析することにより測定を行った。これらの分析の結果、二つの分子内ジスルフィド結合はC₆-C₁₅およびC₈-C₁₃であることが示された。これらの位置にジスルフィドが存在するため、プロテグリン分子は、全体の構造がタキプレシンと同様の逆平行βシートとして存在する傾向がある。上記の抗微生物タンパク質は、最初の抽出物中においては、対応する粗抽出物中のウサギデフェンシン、ここにおいてデフェンシンはウサギ顆粒球中の全タンパク質の15%以上を構成しているが、これに比べてはるかに低い濃度で存在している。精製のさまざまな段階においてAU-PAGE分析法を行うと、粗抽出物中にはペプチドはわずかに検出されるのみであるのに対して、対応するウサギ顆粒球の粗抽出物は明らかにデフェンシンの存在を示す。本発明のペプチドは限外ろ過の過程の後に初めて明瞭に認められる。上に構造を記載したプロテグリンが、PG-3の4-13位のデカペプチド部位において、ウサギデフェンシンNP-3aの残基1-10に対応するデカペプチド部位に相同する配列を示すので、プロテグリン、および特にPG-3も、デフェンシンNP-3aが持つ、副腎細胞によるACTH媒介ステロイド合成に競合的に拮抗することができる性質を有していると思われる。この性質は、“コルチコスタシス”と呼ばれ、プロテグリンをin vivoで用いたときの抗感染薬としての有効性に影響していると思われる。実施例２抗微生物活性実施例１に記載されたアガロースゲル中での放射状拡散アッセイを、精製されたプロテグリンの活性を試験するためにも用いた。図4a、4bおよび4cに、三つの試験生物体に対する結果を上に記したような数量（ユニット）で示す。対照としてウサギデフェンシン(NP-1)およびヒトデフェンシン(HNP-1)を用いた。図4aは、PG-1およびPG-3は、大腸菌(E.coli)ML-35Pに対してHNP-1よりも効果的であり、NP-1と比べてわずかに効果が少ないだけであることを示している。PG-1およびPG-3は、図4bに示すように、リステリア菌（LiSteria monocyt ogenes)EGD株に対しても効果があった。図4cには、PG-1およびPG-3はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)に対しても効果があることが示されている。一般的に、これらのペプチドは、重さを基準にするとウサギデフェンシンNP-1とほぼ同等の効果を有し、HNP-1よりも効果が大きい。すべての場合において、PG-2 もまた試験した三つの生物体に対して効果があったが、他の二つのペプチドに比べると活性は低かった。上記の生物体の成長を阻害する活性に加えて、本発明のPG-1は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(図4d参照)および肺炎桿菌(K.pneumoneae)270(図4e) の成長を阻害することが直接示されている。対照として用いたHNP-1は黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対してはより小さい効果しか示さず、肺炎桿菌(K.pneumonea e)に対してはほとんど完全に効果がなかった。本発明のプロテグリンを他のさまざまな生物体に対しても試験した結果、広い範囲に渡って活性を示した。下記の実施例９に記載するようなSTDに関連する微生物の成長またはこれらの微生物による感染の阻害に対する有効性に加えて、プロテグリンは上で試験されたものに加えて以下の微生物に対して強い活性を示す：緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、ネズミチフス菌(Salmonella tyPhimurium)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus )、ヒストプラスマ・カプスレイタム(Histoplasma capsulatum)、鳥結核菌(Myob acterium avium-intracellulare)、およびヒト結核菌(Mycobacterium tuberculo sis)。プロテグリンはビブリオ・ブルニフィカス(Vibrio vulnificus)に対しては普通の活性しか示さず、コレラ菌(Vibrio cholerae)およびボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)に対しては不活性であった。実施例３特定の条件下での活性の保持本発明の化合物の抗微生物活性を、100μM NaClの条件下および90%ウシ胎児血清の存在下で、上記のように試験した。図5aおよび5bによれば、PG-1およびPG-3 は、100mM NaClの存在下においても、カンジダ・アルビカンス(C.albic ans)および大腸菌(E.coli)に対してそれぞれ活性を保持することが示される。NP -1もHNP-1もその性質を失っている。図5cによれば、NP-1およびNHP-2は90%ウシ胎児血清中でカンジダ・アルビカンス(C.albicans)を不活性化する能力を失うが、PG-3による不活性化は保持されることを示している。したがって、本発明のプロテグリンは、目のケア用製品への使用に適した等張溶液及びホウ酸塩溶液を含む有用な生理的条件において、その抗微生物活性を保持する。さらに、合成PG-1の大腸菌(E.coli)ML-35(血清感受性)に対する活性について、pH7.4の10mMのリン酸ナトリウム緩衝液および1:100希釈のトリプティカーゼ大豆ブロスのみを含む下層ゲル中で、大腸菌(E.coli)のこの株に対して溶菌濃度未満である2.5%の正常ヒト血清を存在させてまたは存在させずに、試験を行った。血清の存在下では、最小殺菌濃度はおよそ1.0μg/mlから約0.1μg/mlに減少した。このタイプの効果は、カテプシンGの線形フラグメントについてもデフェンシンHNP-1についても観察されなかった。同様に、標的生物体としてカンジダ・アルビカンス(C.albicans)を用いる場合には、下層は10mMリン酸ナトリウムを加えて、10%の正常ヒト血清を加えてまたは加えずに調製した。最小殺真菌濃度は、血清が存在しないときの約1.3μg/ml から血清が存在するときの0.14μg/mlに減少した。この濃度の血清そのものはカンジダ・アルビカンス(C.albicans)に効果を及ぼさない。このように、プロテグリンの活性は、血清の存在により阻害されないばかりかこれにより増強される。標的生物体としてリステリア菌(L.monocytogenes)を用いても同様の結果が得られた。プロテグリンPG-1 およびPG-3 をpH2.0で0.5μg/mlのペプシンと共に４時間インキュベートした後、中和した。カンジダ・アルビカンス(C.albicans)、大腸菌 (E.coli)およびリステリア菌(L.monocytogenes)に対する残存抗微生物活性を評価して、該活性が完全に保持されていることを見いだした。同様の実験により、これらの化合物は、ヒト白血球エラスターゼまたはヒト白血球カテプシンGによっては、たとえタンパク質分解活性に好適なpH7.0-8.0において高濃度のこれらの酵素にさらされた場合でも、分解されないことが示された。さらに、合成PG- 3アミドおよび合成PG-3酸を高圧滅菌して大腸菌(E.coli)、リステリア菌(L.mono cyogenese)およびカンジダ・アルビカンス(C.albicans)に対する抗微生物活性を試験したところ、すべての場合において完全な抗微生物活性が保持された。これらの化合物のプロテアーゼによる分解および高圧滅菌に対する安定性はジスルフィド結合により増強されている可能性がある。実施例４エンドトキシンに結合する能力本発明のプロテグリンについて、グラム陰性菌である大腸菌(E.coli)0.5SB5株のリポ多糖(LPS)に結合する能力を試験した。アッセイは、エンドトキシンに対するリムルス変形細胞ライゼート(LAL)試験で、被験化合物の存在下および不存在下で行われた。試験は、Sigma Chemical Company，St．Louis，MOにより出版され、1992年12月に改訂されたシグマ技術便覧(Sigma Technical Bulletin）No ．210に記載された方法を用いて行った。 LAL試験は、カブトガニ(Limulus polyphemus)の循環変形細胞のライゼートから調製された市販の試薬E-Toxate^TM中で、LPSがゲル化に効果を与える能力に基づくものである。前記技術便覧に記載されているように、微量のLPSにさらされると、該ライゼートは不透明度および粘度を増し、エンドトキシンの濃度に依存してゲル化する。前記技術便覧には、このメカニズムは哺乳類の血液の凝固と類似しているように思われ、カルシウムイオンの存在下でのLPSによるトリプシン様前凝固酵素の活性化の段階と、それに続くタンパク質分解による“コアグロゲン”の酵素的修飾が凝固可能なタンパク質を製造するを含むものと推測されることが記載されている。これらの段階は、分子の生物学的に活性な、または“発熱原性の”部分と関連していると信じられている。解毒されたLPS（またはエンドトキシン）はLAL試験で陰性であることがこれまでに示されている。被験化合物は最終的な体積0.2ml中に0.25μg-10μg含まれるようなさまざまな濃度で用い、試験混合物にはLPSを最終濃度が0.05エンドトキシンユニット/mlとなるように、また、E-Toxate^TMを同じ濃度となるように加えた。被験化合物をLP Sと共に15分間インキュベートした後、最終的な体積が0.2mlとなるようにE-Toxate^TMを加えた。次いでこの試験管を37℃で30分間インキュベートし、ゲルの形成を調べた。単離された天然プロテグリン(nPG)および合成的に製造したプロテグリン(sPG) の両方について試験を行った。sPGはC-末端にカルボキシル基を有するものまたはアミド化されたC-末端を有するものを製造した。nPGはC-末端がアミド化されている。また、六つの異なるウサギデフェンシン(NP)および四つの天然ヒトテフェンシン(HNP)についても試験を行った。結果を表１に示す。結果から分かるように、合成のものも天然のものも、またアミド化された型もアミド化されていない型も、すべてのプロテグリンが2.5μg/0.2mlという低濃度で実質的なゲルの形成を防ぐのに十分な程度にLPSに結合することができる。nPG -1およびnPG-2はさらにもう少し低い濃度でも効果があった。プロテグリンはNP またはHNP被験化合物に比べて実質的に効果が大きかった。これらの対照の中で最も効果の高かったのはNP-3aで、このペプチドの一次配列はプロテグリンのそれと最もよく似ているものであった。続けて行った実験で、LPSの濃度を0.05-0.25エンドトキシンユニット(E.U.)の範囲で変化させ、合成PG-3アミドを被験化合物として用いた。結果を表２に示す。これらの結果によれば、ゲル化の阻害はLPSの濃度を増加することにより克服できるので、LPSとの相互作用は、ゲル化酵素のカスケードの妨害よりもゲル化の欠除の原因となっていることが示される。実施例５線形化型の活性 nPG-1およびnPG-3を、ジスルフィド結合をスルフヒドリル基に変換させるような還元剤を用いて線形型に変換し、次いでヨードアセトアミドによりアルキル化して安定化した。環状および線形化されたPG-1およびPG-3の両方について、標準的なLALアッセイにおいてゲル化を阻害する能力を、実施例４に記載された方法で評価し、その結果を表３に示した。これらの結果によれば、プロテグリンの線形化型および環状型は等しくゲル化を阻害し、エンドトキシンに結合することができることが示される。線形化型の抗微生物活性についても、天然プロテグリンと比較した。試験された線形化型と環状型の両方のプロテグリンは、これらのペプチドの抗微生物剤としての有効性は標的生物体の性質と試験条件に依存するものの、ここでも抗微生物活性を示した。天然PG-1とその線形化型(cam-PG-1)およびPG-3とその線形化型 (cam-PG-3)の抗微生物活性を、実施例１に記載した方法でLehrer，R.I．et al., J ．Immunol．Meth. （1991）137:167-173の記載に従って試験した。結果を図6a- 6fに示す。図6aおよび6bは、pH6.5の10mMリン酸-クエン酸緩衝液中(図6a)またはこの緩衝液に 100mM NaCl を加えたものの中(図6b)のいずれかにおける、20μg/ml-125μ g/mlの濃度範囲での、大腸菌(E.coli)ML-35Pに対するこれらのペプチドの抗微生物活性を示す。どちらのプロテグリンも、この生物体に対して強い抗微生物活性を示した。線形型は緩衝液のみが存在する場合に環状型よりも少し能力が高かった。一方、環状型は等張条件下で線形型よりも能力が高かった。図6cおよび6dはリステリア菌(L.monocytogenes)に対する抗微生物効果を示す。図6cでは上記の緩衝液のみを用いたが、プロテグリンの環状型および線形化型はどちらも強い抗微生物活性を示し、試験された濃度の範囲(20μg/ml-125μg/m l)ではどちらもほぼ等しい効果を示した。図6dは、同じ濃度範囲についての、この緩衝液に 100mM NaCl を加えたものの存在下におけるリステリア菌(L.monocytogenes)に対する効果を示す。環状型は濃度依存性が少し大きくなったが、強い抗微生物活性を保持していた。線形化により活性は明らかに低下したが、それでも高濃度においては抗菌効果を示した。酵母カンジダ・アルビカンス(C.albicans)について試験を行い、結果を図6eおよび6fに示した。図6eは、10mM リン酸緩衝液のみの存在下で試験を行った場合に、これらのプロテグリンのすべての型が上記の濃度範囲において用量に依存した抗微生物性を示すが、線形化されたペプチドはごくわずかに効果が低いことを示している。図6fは、緩衝液に 100mM NaCl を加えたものの存在下で行った同じアッセイの結果を示す。環状型はほぼ同じレベルの抗微生物効果を保持していたが、線形化型の活性は著しく減少し、プロテグリンの濃度が100μg/ml以下では実質的に抗微生物効果はみられなかった。しかし、130/μg/mlというより高い濃度では中程度の抗微生物効果が観察された。以上のように、標的となる生物体および用いる条件に応じて、プロテグリンの環状型および線形化型はどちらも抗微生物活性を有する。実施例６眼の治療に適した条件下での抗微生物活性コンタクトレンズ溶液は、典型的にはホウ酸塩で緩衝された生理食塩水を加えて調合され、EDTAが添加されている場合と添加されていない場合がある。合成PG -3アミドおよび合成PG酸の型のプロテグリンについて、実施例１に記載されたアッセイ法に従って、すべての下層のゲルにpH7.4の25mMホウ酸緩衝液、1%(v/v)トリプティカーゼ大豆ブロス(0.3μg/ml TSB粉末)および1%アガロースが加えてある状態で試験を行った。添加物としては、100mM NaCl、1mM EDTAまたはこれらを組み合わせたものを加えた。他の被験化合物として、デフェンシンNP-1およびリゾチームをコントロールとして用いた。用量応答曲線を測定した。表４に、さまざまな被験化合物について概算された最小殺菌濃度をμg/mlで表したものを示す。表に示されるように、プロテグリンは、25mMホウ酸緩衝生理食塩水中においては、25mMリン酸緩衝液中に比べていくらか活性が低下するものの、抗微生物活性は生理食塩水を加えることにより増加し、1mM EDTAによりわずかに増加した。標的生物体としてカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を用いて同様の試験を行い、最小殺真菌濃度を概算した結果を表５に示した。表６には標的としてリステリア菌(L.monocytogenes)を用いて行った同様の実験の結果を示す。以上の結果は、これらの化合物は、眼ケア用製品に好適な条件と典型的に関連した条件下でその抗微生物効果を発揮できることを示している。実施例７ｃＤＮＡクローンおよび新規プロテグリンをコードするｃＤＮＡの回収ｃＤＮＡの産生およびＰＣＲ増幅若い Duroc種赤ブタの骨髄細胞からチオシアン酸グアニジンで全ＲＮＡを抽出した。第１ストランドｃＤＮＡを合成するため、総反応容積 20μl中、オリゴ(d T)プライマー 20 pmolおよびマロニーマウス白血病ウイルス（M-MLV）逆転写酵素（Clontech Laboratory,Palo Alto,CA）200 U とともに、全ＲＮＡ 1μg を使用した。２つのＰＣＲプライマーを調製した。センスプライマー（5'-GTCGGAATT CATGGAGACCCAGAG(AまたはG)GCCAG-3'）は PG-2 および PR-39ｃＤＮＡの5'領域に対応し、EcoRI 制限部位を含んでいた。アンチセンスプライマー（5'-GTCGTCT AGA(CまたはG)GTTTCACAAGAATTTATTT-3'）は PG-2 および PR-39ｃＤＮＡのポリＡテールの直前の3'末端に相補的であり、XbaI 制限部位を含んでいた。50μl 容積中、鋳型として上記のブタｃＤＮＡ 1/10 容積、プライマー 25 pmolおよび AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer-Cetus）2.5 単位を使用してＰＣＲを実施した。１サイクルにつき、変性（94℃）およびアニーリング（60℃）ステップ１分ならびに伸長ステップ（72℃）２分として、反応を30サイクル実施した。ｃＤＮＡクローニングおよび配列決定増幅したｃＤＮＡを調製用アガロース電気泳動によって分画し、臭化エチジウムで染色した。主画分を切り出し、 EcoRI および XbaI エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs,Beverly,MA）で消化し、M13mp18 バクテリオファージベクター中にサブクローン化し、E.coli X L1-Blue MRF'コンピテント細胞（Stratagene,La Jolla,CA）へ形質転換した。キット（U.S.Biochemical Corp.,Cleveland,OH）を使用して、ＤＮＡ配列決定を実施した。PC-GENE（Intelligenetics,Palo Alto,CA）によって、ヌクレオチドおよびタンパク質配列を分析した。ノーザンブロット全ＲＮＡ 10μgを 50％ホルムアミド中で変性し、0.6 2 Mホルムアルデヒド中 1％アガロースを通して電気泳動し、GeneScreen Plus膜（DuPont,Boston,MA）上に毛管転移によってブロットした。膜を80℃で２時間乾熱し、急速ハイブリダイゼーション緩衝液（Amersham,Arlington Height,IL）中で³²Ｐ−標識プローブとハイブリダイズした。各種のプロテグリンをコードする各種のクローンの配列決定の結果を図７に要約する。プロテグリン PG-1，PG-3，および PG-4 のｃＤＮＡ配列は、Storici P.ら、Biochem Biophys Res Comm（1993）196:1363-1368によって PG-2 についてすでに示されているのと同様に、691 塩基を含んでいる。これらのｃＤＮＡは、すべてのプロテグリンについて同一と見られる 110アミノ酸をコードする上流配列を示している。その他の差異は、事実上極めてわずかであるが、それらを図７に示す。分析によると、式(1)のアミノ酸配列を有するプロテグリン PG-4 の存在が示された。式(1)中、Ａ₁₀は小型アミノ酸であり、そしてＡ₁₁は疎水性アミノ酸であり、これらの残基が塩基性である従来知られているプロテグリンと異なっている。PG-4のアミノ酸配列はしたがって RGGRLCYCRGWICFCVGRG であり、ここでＮ末端の第１，２または３アミノ酸は欠失していてもよい。 PG-2および別のカテリン結合ペプチド、PR39（Agerbeth B.ら、Eur J Biochem (1991)202:849-854；Storici P.ら、Biochem Biophys Res Com(1993)186:1058-1 065）の5'末端に対応する上流プライマー、ならびにポリＡ領域の直前の領域に適合する下流プライマーを使用して、逆転写されたブタ骨細胞ＲＮＡを増幅することによって、その他のクローンを得た。生成した約 0.7 kb のＰＣＲ産物を M 13mp18中にサブクローン化し、精製および配列決定のために組換えプラークを選択した。この手法によって、PG-1，PG-3および PG-4 の前駆体のための配列を回収した。これらのペプチドの全部が、（図７において PG-4 について示す）式(1 )の化合物のＡ₁の上流にアミノ酸配列をさらに含有する前駆体をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。実施例８ PG-1 ，PG-3および PG-5 をコードするゲノムＤＮＡの回収 QIAGEN血液ＤＮＡキット（QIAGEN,Chatsworth,CA）によってブタ白血球細胞から高分子量のゲノムＤＮＡを精製した。プロテグリン（PG）遺伝子を増幅するため、鋳型としてゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲを実施した。センスプライマー（5'-GTCGGAATTCATGGAGACCCAGAG(AまたはG)GCCAG-3'）は実施例７の PG ｃＤＮＡの5'領域に対応し、EcoRI 制限部位を備えていた。アンチセンスプライマー（5'-GTCGTCTAGA(CまたはG)GTTTCACAAGAATTTATTT-3'）は PG ｃＤＮＡのポリ(Ａ)テールの直前の3'末端に相補的であり、XbaI 制限部位を備えていた。精製ブタゲノムＤＮＡ 200 ng、各プライマー 25 pmol、10 mM ｄＮＴＰ 1μl，10ＸＰＣＲ緩衝液（200 mM Tris-ＨＣｌ，100mM(ＮＨ₄)₂、2 0 mM ＭｇＳＯ₄，1％ Triton X-100，0.1％ BSA）５μl、およびクローン化 Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene,La Jolla,CA）2.5 単位を含有する総容積 50 μl中で反応を実施した。１サイクルにつき、94℃で変性１分、55℃でプライマーのアニーリング１分、72℃でプライマーの伸長２分、および72℃で最終の伸長ステップを10分とする反応を30サイクル実施した。増幅したＰＣＲ産物を EcoRIおよび XbaI で消化し、アガロースゲルから切り出し、精製し、そしてあらかじめ EcoRIおよび XbaI で消化し精製した pBluesc ript KS+ベクター（Stratagene,La Jolla,CA）中に連結した。Sequenase バージョン 2.0キット（United States Biochemical,Cleveland,OH）、pBluescript 汎用プライマーならびに PG ゲノムおよびｃＤＮＡ配列に基づく特定のオリゴマープライマーを使用して、ジデオキシ法によってＤＮＡの両鎖を配列決定した。PC -Gene プログラム(Intelligenetics,Palo Alto,CA）を使用して、ＤＮＡ配列のコンピューター分析を実施した。プロテグリンｃＤＮＡ配列の 403-429ヌクレオチドに相補的なプロテグリン特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって、約1.85 kbのＰＣＲ産物がプロテグリン関連と確認された。次に、このＰＣＲ産物を pB luescriptベクター中にサブクローン化し、組換えプラスミドをＤＮＡ精製および配列決定した。３つの異なるプロテグリンに関する遺伝子配列は PG-1，PG-3 および PG-5 と同定された。このヌクレオチド配列およびこれから帰結するアミノ酸配列を図８に示す。プロテグリンｃＤＮＡおよび遺伝子の比較によって、プロテグリン遺伝子のコード領域が３つのイントロンでさえぎられた４つのエキソンからなっていることが明らかになった（図８および図９）。最初のエキソンは、5'非コード領域、ならびに29残基シグナルペプチドおよび最初の37カテリン残基を含む、プロテグリンプレプロペプチドの最初の66アミノ酸のコドンを含んでいた。エキソンIIおよびIII は比較的小さく、それぞれわずかに108 および72 bp であり、ともに次の 60カテリン残基を含んでいた。最後の２つのカテリン残基はエキソンIV上にあり、プロテグリン配列が続いていた。エキソン−イントロンスプライス部位の配列を表７に示し、共通規則に適合させる。すべてのイントロンは T/Cに富む 8-12 塩基ストレッチが先導する AG ダブレット上で終了し、一方すべてのイントロンが GT で開始し、主として A/G A/G G配列が続く。高度に保存されたカテリン領域がエキソンI−IVにおよび、エキソンIVは成熟プロテグリンペプチドの完全配列を含み、これにアミド化共通配列、3'非翻訳領域、および推定上のポリアデニル化部位が続いている。３つのイントロンは 152 から596 bp のサイズの範囲である。このプロテグリン遺伝子が他のカテリン様遺伝子の典型であるならば、カテリン結合ペプチドの第３イントロンは、エキソンIV中にコードされた可変抗微生物ペプチドから、高度に保存されたカテリン領域の最後の２つの残基以外の全部を分離することがわかるであろう。こうした考え方はプレプロ領域を含むカテリンを特定する最初の３つのエキソンと別種のエキソンIVの組合せを含む、組換え機構に好都合である。こうして天然に生起するプロテグリンのファミリーには少なくとも５種が含まれる。図10はこれまでブタ白血球中に発見された５つのプロテグリンのアミノ酸配列の比較を示す。1−3，5−9，13および15−16位置に完全な相同性がある。 EMBL/GenBankに対するプロテグリン遺伝子の相同性の探索によって、有意に相同な遺伝子は何ら同定されなかった。より特定すると、プロテグリンの遺伝子構造およびヌクレオチド配列は、デフェンシン（骨髄デフェンシン遺伝子では３つのエキソンが含まれ、また腸デフェンシン遺伝子では２つのエキソンが含まれる）とは非常に異なっていた。予想されたように、この探索によって、ウシ、ブタおよびウサギ白血球のカテリン結合ペプチドに対応するｃＤＮＡの大きなファミリーが得られた。プロテグリン関連遺伝子をさらに評価するため、EMBL-3 SP6/T7 中の約2.3×1 0⁵クローンのブタゲノムライブラリーを³²Ｐ−標識プロテグリンｃＤＮＡでスクリーニングし、ハイブリダイズした45クローンを同定した。 EMBL-3 SP6/T7 ファージ中のブタ肝臓ゲノムライブラリーをClontech（PaloAl to,CA）より購入した。宿主として E.coli K803株を使用し、ファージプラークからのＤＮＡをナイロン膜（DuPont,Boston,MA）上に移した。このフィルターを³² Ｐ−標識ブタ 691 PG-3 ｃＤＮＡでハイブリダイズした。フィルターを数回、最後に60℃で 0.1x SSCおよび 0.1％ SDS中で洗浄し、-70℃で増強したスクリーンを有するＸ線フィルムに露出した。陽性クローンをさらに２ラウンドの低密度でのプラーク精製に供した。ハイブリダイズしたクローンから精製したＤＮＡを各種の制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs,Beverly,MA）で消化し、0.8％アガロースゲル上で分画し、GeneScreen Plus 膜（DuPont,Boston,MA）上に移した。ハイブリダイゼーションプローブは³²Ｐで標識し、ブタ PG-3 ｃＤＮＡ、ならびにPG- 1，2および3 ｃＤＮＡの nt 403−429に相補的な5'−標識プロテグリン特異的オリゴヌクレオチドを含ませた。ｃＤＮＡプローブについては、ライブラリースクリーニングと同様のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を採用した。オリゴヌクレオチドプローブについては、42℃で 0.1x SSCおよび0.1％ SDS中で洗浄した。陽性クローンがら精製したＤＮＡについて、プロテグリンｃＤＮＡおよびプロテグリンｃＤＮＡ配列の nt 403−429に相補的なプロテグリン特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、サザンブロット分析を実施した。すべてのクローンが完全ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしたが、プロテグリン特異的プローブとはこれらの約半数のみがハイブリダイズした。ブタ白血球から誘導された別のカテリン結合抗微生物ペプチドである、ブタポルフェニンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの非プロテグリンクローンとハイブリダイズした。これらの結果は、ａ）カテリンに相同な保存されたプロテグリンは成熟抗微生物ペプチドと同一の遺伝子内に存在し、転写後の現象によって添加されたものではないこと、およびｂ）ブタ中ではプロテグリンはカテリン関連遺伝子の約半分の割合であること、の確証となった。 PG-5のアミノ酸配列に相当する合成ペプチドを調製し、E.coli、L.monocytoge nes およびC.albicansに対する抗微生物活性について試験した。この結果を合成によって調製したPG-1 で得られた結果と比較した。この結果を図11a−11cに示す。この結果の図による説明で示されるように、PG-5は、試験した３つの生物すべてに対して、PG-1に匹敵する抗微生物活性を有している。実施例９エナンチオPG-1の調製標準的な固相技術を使用して、PG-1のアミノ酸配列を有するが全アミノ酸が D体であるプロテグリンを調製した。この形態のプロテグリンをプロテアーゼの非存在下または存在下で、その他は実施例１に示したアガロースゲル中の放射性拡散アッセイについて記載されたようにして、E.coli、L.monocytogenes、C.alb icansおよびその他の微生物に対して試験した。結果を図12a-12gに示す。図12a は、天然 PG-1 およびエナンチオPG-1の両方がプロテアーゼの非存在下で E.coli の増殖を阻害するのに同等に有効であることを示している。図１2b はトリプシンおよびキモトリプシンのいずれもエナンチオPG-1の抗菌効果を阻害しないことを示している。図12cは、図12dに示されるように、これらのプロテアーゼが存在しない場合に PG-1 はエナンチオPG-1に匹敵する活性であるのに、これらのプロテアーゼの存在下では、天然 PG-1 のL.monocytogenesの増殖を阻害する能力が逆作用を受けることを示している。実施例10 STD 病原体に対するプロテグリンの活性 STD 病原体に対する、デフェンシン HNP-1に比較したプロテグリン PG-1 の活性を表８に要約する。これらの結果において、“活性”はペプチドが 10μg/ml 未満で有効であったことを意味し、“中程度活性”は 10−25μg/ml で活性であったことを示し、そして“わずかに活性”は 25−50μg/ml で活性であったことを意味する。50−200μg/mlで効果が得られなかった場合は、その化合物を不活性とみなした。クラミジア・トラコマティス（Chlamvdia trachomatis） STD に関係する他の細菌とは異なって、クラミジアは代謝活性および２分裂のためには細胞内生息が必要である。そのライフサイクルは以下の通りである。基本小体（EB）と称される、挙動について多少胞子に類似する代謝的に不活性な粒子である、細胞外形態がある。EBは宿主細胞に付着し、取り込まれてしばしば“ 封入体”と呼ばれる内部空胞性空間を形成する。細菌はもろい網状体（RB）に再組織され、これは非感染性であるが代謝的には活性であり、48−72時間でEB状態に再形成される。このEBはその後細胞から放出される。クラミジアはEB段階において防護のため、ペプチドグリカン層ではなくて、システインに富むタンパク質中での多重ジスルフィド結合を含んでいる。 Clarke,L.M．によって Clinical Microbiology Procedures Handbook II(1992 ),Isenberg,H.T.Ed.Am.Soc.Microbiol.Washington,D.C.;pp.8.0.1−8.24.3.9. に記載された臨床検体のための“ゴールドスタンダード”クラミジア培養シスデムを使用して、クラミジアに対する抗微生物活性について、本発明のプロテグリンを試験した。簡単に述べると、宿主として、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むシクロヘキシミド EMEM 中の McCoy細胞（マウス細胞系）を使用する。クラミジアの接種の前に、細胞層を乱さないように維持培地を吸引して、細胞層を標準バイアル中のカバーグラス上に保持する。その後各バイアルに接種材料 100−300 μL を接種し、20℃で１時間、3500ｘ gで遠心分離する。その後、液体を吸引し、EMEM１ml を添加する。バイアルにふたをして、37℃で48時間インキュベートする。48時間後、培地を再び吸引し、カバーグラスを PBSで２回洗浄し、EtOH 3 00μL で10分固定する。EtOHを吸引し、バイアルを乾燥させる。その後、染色のために、PBS１滴とクラミジアの主要な外部膜タンパク質に対する Syva Microtr ak モノクローナル抗体を添加する。37℃で30分インキュベートした後、細胞を蒸留水で洗浄し、明るいアップルグリーンに染色された細胞質空胞として容易に認識される封入体について試験する。これらは標準細菌培地上の遊離の生体細菌の集団の当量を表す。以下において実施するアッセイで、Kuo,C.C.ら、Nongynococcal Urethritis a nd Related Infections (1977),Taylor-Robinson,D.ら、Ed.Am.Soc.Microbiol.Wa shington,D.C.,pp.322−326 に記載された、C.trachomatis serovar L2(L2/434B u)を使用した。L929マウス繊維芽細胞における音波処理培地からシードを調製し、遠心分離によって一部精製した。宿主タンパク質はシードアリコートにそのまま存在するので、各シードバッチを2×10^-9まで連続10倍希釈する調製時に力価測定する。9.2×10⁶IFU/mlを含有するシードを37℃で急速に解凍し、ショ糖／リン酸塩／グリシンで10^-2に希釈し、室温で予備インキュベートした後、約 2 00 IFUを生成させ、バックグラウンド真核タンパク質を希釈する。最初のアッセイにおいて、試験するペプチドを 0.01％氷酢酸中のストックとして調製した。希釈したクラミジアシード 100μL を 1.5 ml エッペンドルフ管中に分注し、各管毎に抗生物ペプチド 200μL を添加した。このペプチドストック（および対照）のアリコートをシードとともに室温で１時間、２時間および４時間インキュベートした。各インキュベート期間の約10分前に、標準接種および培養の準備として、McCoy バイアルから維持用培地を吸引した。その後、ペプチドの存在および不在下で培養を実施した。いくつかの場合、予備インキュベーションに加えて培養培地にペプチドを最終濃度になるように添加した。試験を顕微鏡によって評価した。１添加についてプロテグリン 50μgを使用した結果は劇的だった。ペプチドを添加しなかった対照培養において、222−460封入体が計数された。クラミジアシードを細胞に添加する前に、または前および後の両方でプロテグリンを添加したすべてのプロトコルにおいて、封入体は見つからなかった。タキプレシン(tachy plesin）20μg の添加についても同様の結果が得られた。デフェンシン NP-1 および HNP-1 は防護効果に劣っていた。要約すると、試験したプロテグリンはクラミジアに対する抗微生物性を示す。次の実験シリーズでは、２時間の予備インキュベーションにして、各種濃度（１μg，12.5μg，25μg および 50μg）のプロテグリンを使用した。12.5μgの低濃度で封入体の数が０まで低下した。濃度 1μg においても、封入体の数は約 110から約 30 へ劇的に減少した。次の実験群においては、血清の存在の影響を試験した。クラミジアシードを 1 0％ FBSの存在および不在下で、そしてまたプロテグリン 25μgの存在または不在下で２時間予備インキュベートした。プロテグリンは血清が存在してもしなくてもどちらも高度に効果があったが、一方対照として使用したデフェンシン HNP -2は血清不在下では適度な効果があったが、血清存在下ではかろうじて効果があるのみだった。クラミジアの培養開始後に、すなわち遠心分離および最終培地の混合後で48時間の培養期間の開始１時間後に、プロテグリン 25μgを添加した以外は、この実験を繰り返した。HNP-2 は全く効果がなかったが、プロテグリンは封入体の数を未処理の対照の約57％に減少させた。最後に、プロテグリン（25μg）をクラミジアシードに添加して、その後すぐにこの混合物を培養した。予備インキュベーションおよび感染後の１時間のギャップをともなわない、このケースでは、プロテグリンは血清があってもなくても最少限の効果があった。クラミジアの感染に抗するのに有効な局所用剤については、血清の存在下で作用しなければならないので、血清の影響は特に重要である。その外、プロテグリンの有効性を評価するのに使用することができる、クラミジア感染についてのいくつかのマウスを基礎とするモデルがある。これらには、 Patton,D.L．ら、Chlamydial Infection（1990）Bowie,W.R.ら、Eds.Cambridge University Press NY pp.223-231；Swenson,C.E.ら、J.Infect.Dis.(1983)pp.11 01-1107、および Barron,A.L.ら、J.Infect.Dis.(1981)143:63-66の記載が含まれる。淋菌（Neisseria gonorrhoeae）より詳細に、プロデグリンの淋菌を抑制する能力を、Miyasakiら、Antimicrob Agent Chemother （1993）37:2710-2715の方法を改変して試験した。非線毛性透明変異株 FA19 および F62をグルコースおよび鉄補充物を含有する GCB寒天プレート上で 37℃、3.8％ v/vＣＯ₂下で一晩増殖させた。これらの菌株をこのアッセイへの適合性に関して選択した。一晩増殖させたものを寒天プレートから取り出して、補充物および炭酸水素ナトリウムを含有する GCBブロスに懸濁させて、中間対数期まで 37℃で振盪して生育させる。培養物を GCBブロス中 1:100に希釈して、約 10⁶CFU/mlとし、連続希釈物を GCB寒天にまいた。ペプチドを 0.01％ v/v酢酸に溶解して１mg/mlストック溶液を製造し、連続希釈する。各希釈物 10μlを希釈細菌 90μlを含有する無菌ポリスチレン管に添加して、試験管を 37℃で45分振盪する。内容物を 1:10 に連続希釈して、GCB寒天プレートにまき、ＣＯ₂インキュベーターでインキュベートする。24時間後に CF Uを計数し、殺細菌活性の対数を計算する。このアッセイにおいて、天然 PG-1 、合成 PG-1 、合成 PG-3 アミドおよびアミド化無しの合成 PG-3 はすべて CFU/ml が５対数以上の減少を示した。天然 P G-2 （16アミノ酸を含有）は2.6倍の減少を示した。その他、このアッセイにおいて、エナンチオPG-1、１ジスルフィド PG-1（Ｃ₆ −Ｃ₁₅）、および１スルフィドPG-1（Ｃ₈−Ｃ₁₃）はCFU/ml が５倍の対数減少を示した。トレポネーマ・パラディウム（Treponema pallidum）梅毒の発症因子であるこの生物に対する殺細菌活性についても試験した。ペプチドを未処理の正常ウサギ血清 90μl中 1.758μg から 56.25μg までの一連の濃度で評価した。血清は、補体源の提供と同時に、インキュベーション中にスピロヘータを生存させるための栄養源として作用させた。約 5×10⁷/μlの生物を含有する T.pallidum の懸濁液 10μl を各試験管に添加し、適当なペプチドとの混合物を34℃で 95％Ｎ₂および 5％ＣＯ₂下でインキュベートした。０時、インキュベーションの直前、４時間目および16時間目に、無作為に選択した25生物の運動性の有無について試験した。スピロヘータの 50％を不動化するのに必要な濃度を示すために、50％の不動化終了点（IE₅₀）を計算した。PG-1の存在下では、０および４時間目の IE₅₀はそれぞれ 2.717μg および＜1.758μg であった。タキプレシンの IE₅₀は０および４時間目について 5.231μg および 2.539μg であった。これは、不動化能力をほとんど示さなかった HNPおよび NP 調製物に対照的である。単純ヘルペスウイルス 2％ウシ胎児血清を加えた最少必須培地（MEM）中で生育させた VERO 細胞中で調製したウイルスストックを使用して、すべて 3μM アシクロビア感受性のHSV 1 MacIntyre株、臨床 HSV 1単離物の 10 集団、HSV-2G、および臨床 HSV 2単離物の 10 集団に対する各種のペプチドの効果を試験した。２つの繊維芽細胞系、ヒト W138 およびウマ CCL57 を標的として使用し、直接のウイルスの中和および遅延させたペプチドの添加によって、試験を実施した。ウイルスを直接中和する場合は、ウイルスを組織培養単層に添加する前に、ペプチドとともに90分予備インキュベートした。遅延ペプチドを添加する場合は、ウイルスを添加して50分間標的細胞に吸着させて、その後単層を洗浄してペプチドを90分添加した。最後に単層を洗浄してペプチドを除去し、ペプチドを含まない MEMを細胞に添加して、未処理の感染単層が 4+ の細胞変性効果（CPE）を示すまで（約６０時間）培養した。両方の場合において抗ウイルス活性が見られたが、遅延ペプチドを添加した方が活性がよりはっきりしていた。W138および CCL57細胞を用いてウイルスを直接中和する実験において、PG-1は 50μg/mlおよび 25μg/mlの濃度で HSV-2Gに起因する CPEを完全に阻害したが、この濃度では HSV-1に対しては何ら防御せずに、4+ CPEの結果となった。遅延ペプチドを添加する場合には、PG-1は 35μg/mlおよび 50μg/mlの濃度で HSV-2G による CPEを完全に阻害し、両濃度において臨床 HSV-2集団に対しても十分防御した。従って、PG-1は、細胞培養物中にウイルスが侵入してから６０分も遅れてこのペプチドを添加した場合でも、HSV-2 の実験用および臨床株による感染から、ヒトおよび動物細胞を防御した。トリコモナス・バギナリス(Trichomonas vaginallis) Gorrell，T.E．ら，Carlsberg Res Comm（1984）49:259-268に記載されるようにトリコモナス・バギナリスＣ１株(ATCC 30001)を増殖させた。RPMI＋1%熱不活性化ウシ胎児血清中で行った実験では、50μg/mlのPG-1に接触させて数分以内に、T.バギナリス（それまで激しく運動していた）が動かなくなった。その後すぐに、この生物はトリパンブルー侵入性となり、さらに15〜30分で溶菌された。予期されたように、このような生物はその通常の増殖培地（Diamond's 培地）に導入したとき増殖できなかった。25μg/mlのPG-3に接触させた生物はその運動性を保持していた。 T.バギナリスの２種類の高メトロニダゾール耐性臨床分離株、ＭＲおよびＴＶ株を用いた初期の研究から、両株ともC₈-C₁₃およびC₆- C₁₅ユニジスルフィドおよびエナンチオPG-1を含めたPG-1に対して100 および50μg/mlの濃度で感受性であることがわかった。実施例11 抗レトロウイルス活性 Mlles，S.A．ら，Blood（1991）78:3200-3208 に記載される方法を用いて、ＨＩＶ株に対する抗ウイルス活性に関して合成および天然PG-1と天然PG-2の両方を試験した。簡単に述べると、米国赤十字社から得られた正常なドナー・ロイコパックから、Ficoll-hypaque密度勾配を用いて単核細胞画分を回収した。20% ウシ胎児血清、1%ペニシリン／ストレプトマイシンとファンギゾン、および0.5% PHA を含有するRPMI 1640 中に１×10⁶個／mlで単核細胞を懸濁し、5% CO₂中37℃で2 4時間インキュベートした。細胞を遠心し、洗浄した後、増殖培地で24時間増殖させた。上記のように調製したヒト末梢血単核細胞に、実験室外に適応させたクローン化HIV_JR-CSFおよびHIV_JR-FLをエレクトロポレーションで導入した。力価を測定し、一般には細胞１個あたり約4,000感染単位の感染多重度（ＭＯＩ）を使用する（これは上清中の25〜40ピコグラム/ml のHIV p24 抗原に相当する）。アッセイにおいては、上記のように調製したＨＩＶストックを正確なＭＯＩに希釈し、ＰＢＭを24ウェルプレートに２×10⁶個／mlの濃度で加えた。全量１μl を各ウェルに加える。試験すべきペプチドを増殖培地に加えて所望の最終濃度を得る。次いで適当な数のＭＯＩを加える。ウイルスの増殖をアッセイするため、200 μl の上清を３日目と７日目に取り出し、ｐ２４抗原の濃度を市販のアッセイ(Coulter Immunology，Hialeah，Florida)を用いて測定する。対照として、細胞のみ、細胞プラス５μg/mlのペプチド、ペプチドの不在下でウイルスを含む細胞、および10^-5M〜10^-8M のＡＺＴの存在下でウイルスを含む細胞を含有する各２通りのウェルを使用する。このアッセイを用いて、天然PG-1および合成PG-1はどちらも１〜５μg/mlの濃度でＨＩＶ感染を完全に阻止することが実証された。ＩＣ₉₀は５μg/ml未満であった。次にペプチドの添加時期を変えてみた。ウイルス添加の２時間前、ウイルス添加時、または感染の２時間後に予備処理した細胞はこのペプチドの抗ウイルス活性を示した。しかし、PG-1を感染の24時間後に添加したときには、抗ウイルス活性が全く見られなかった。さらに、PG-2も同様の活性を示すが、約１／５の活性レベルである。ヒト・デフェンシンやウサギ・デフェンシンのような代替抗生物質はこのアッセイでは強力な活性を欠いていた。実験室外に適応させた分離株であるHIV_JR-CSFおよびHIV_JR-FL の両方において結果は類似していた（Koyanagi，Y.S.ら，Science(1987)23 6:819-822）。プロテグリンは他のレトロウイルスに対しても同様の活性を示す。実施例12 修飾プロテグリン：カイト形およびブレット形の製造全てのＸがアラニンであるPG-1のカイト形およびブレット形を、慣用のFmoc化学を用いて合成した。粗製の合成ペプチドを還元するにあたり、6 M グアニジン HCl，0.5 Mトリス緩衝液および2 mM EDTA を含有する溶液（pH8.05）中に10mg/m lの濃度で溶解した合成ペプチドに、同重量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、窒素下に52℃で２時間インキュベートした。この混合物を0.45μフィルターに通し、1/20(v/v)氷酢酸で酸性となし、C-18カラムを使って慣用の RP-HPLC 精製にかけた。還元し、HPLC精製した合成ブレットおよびカイトPG-1をスピードバック(speed vac)で真空遠心して部分濃縮し、鎖間シスチンジスルフィドの形成を最小限にくい止めるため、低濃度(0.1 mg ペプチド/ml)で0.1 M トリス(pH7.7)中で周囲空気中室温にて24時間かけて折り返し(folding)を行った。次に、この混合物を濃縮し、HOACで酸性化して最終濃度５％とし、RP-HPLC 精製にかけた。最終生成物のブレットおよびカイトPG-1の純度はAU-PAGE 、分析用HPLCおよび FAB-マススペクトルにより証明された。AU-PAGE はそれぞれの場合に最終生成物の単一バンドを示した。MH⁺質量の実測値は両方の場合に2093であった。実施例13 カイト形およびブレット形の抗微生物活性基層の寒天に最終ｐＨ 7.4の 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液を含ませた以外は Lehrer,R.I.ら、J ．Immunol Meth（1991）137:167-173に記載されているのと同様に、実施例 1に記載された放射性拡散アッセイを使用して、実施例12で調製したカイト形およびブレット形 PG-1 剤の抗微生物活性を試験した。実施例 1に記載したように、基層寒天に、0.3 mg/ml トリプチカーゼソイ(tripticase soy) ブロスパウダーおよび 1％アガロースを追加使用した。場合によっては、寒天に、100 mMＮａＣｌまたは RPMI＋2.5％正常ヒト血清（NHS）を添加した。最初の測定群において、ブレット形およびカイト形の PG-1 を、L.monocytoge nes、E.faecium（VR）または S.aureus に対する抗微生物活性について、これらの３つの群の条件下で試験した。図13はこの結果を示している。図示のように、ブレット形およびカイト形は標準アッセイ条件を使用したとき、これらの３つの細菌に対してほぼ同程度の効果があった。しかし、寒天に 100 mM ＮａＣｌを添加した場合、これらの条件下で、カイト形は、S.aureus を除いて、３つの株全部に対してわずかに増強された抗微生物活性を示すブレット形よりもわずかに低い活性を示した。同様に、RPMI＋ 2.5％ NHS を添加したとき、ブレット形はやはりカイト形よりも効果があった。E.faecium に対するカイト形の活性はこれらの条件下では顕著に低かった。図14に示されるように、これらの PG-1 の形態を E.coli 、K.pneumoniaeおよび P.aeruginosa に対しても試験した。標準条件下で３つの微生物すべてがカイト形およびブレット形の両方によって阻害された。この抗微生物活性は 100 mM ＮａＣｌおよび RPMI＋NHS でも維持された。実施例14 スネーク形 PG-1 の合成 Synpep Inc.,Dublin,CA による標準方法を使用して、すべてのＸがアラニンであるスネーク形の PG-1 を形成させた。 FAB- 質量分析における MH+値は予想されたように 2031.3 であつた。このスネーク形を RP-HPLCによって均質になるまで精製した。実施例15 スネーク形 PG-1 の抗微生物活性実施例13においてブレット形およびカイト形 PG-1 について示したものと同一の６種の生物について同一の条件を使用して、スネーク形 PG-1 を試験した。結果を図15および16に示す。この場合、対照として、天然 2シスチン形の PG-1（天然）を使用した。標準条件下で、スネーク形は L.monocytogenes、E.faecium 、および S.aureus については多少優れた活性を示すが、 100 mM ＮａＣｌまたは RPMI＋NHS のいずれかの存在下では天然型よりも著しく効果が低い。図16に示すように、試験生物が E.coli、K.pneumoniaeおよびP.aeruginosaの場合、同一のパターンが見られる。実施例16 プロテグリンの最少阻害濃度以下の生物に対する各種のプロテグリンの最少阻害濃度（MIC）を測定した：メチシリン耐性 Staphylococcus aureus（MRSA）、Pseudomonas aeruginosa（Ps a）、バンコマイシン耐性 Enterococcus fecium（VREF）、Candida albicans（C andid）および Escherichia coli（E.Co）。結果を表９に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コクリャコブ，ブラディミール，エヌ. アメリカ合衆国 90036 カリフォルニア州ロサンジェルス，カーソンアベニュー 435 エス．，アパートメント３ディー (72)発明者ハーウィグ，シルビア，エス．，エル. アメリカ合衆国 91364 カリフォルニア州ウッドランドヒルズ，ウッドランドクレストドライブ 21911

Claims

【特許請求の範囲】１．任意に−ＳＨ安定化された線形またはシスチン架橋形のいずれかである式（１）： A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-C₆-A₇-C₈-A₉-A₁₀-A₁₁-A₁₂-C₁₃-A₁₄-C₁₅-A₁₆-(A₁₇-A₁₈) (1) 〔式中、A₁は塩基性アミノ酸であり、 A₂およびA₃はそれぞれが独立に小型のアミノ酸であり、 A₅、A₇およびA₁₄はそれぞれが独立に疎水性アミノ酸であり、 A₄は塩基性または小型のアミノ酸であり、 A₉、A₁₂およびA₁₆はそれぞれが独立に塩基性、疎水性、中性／極性または小型のアミノ酸であり、 A₁₀およびA₁₁はそれぞれが独立に塩基性、中性／極性、疎水性もしくは小型のアミノ酸であるか、またはプロリンであり、 A₁₇は存在しないか、または存在する場合は、塩基性、中性／極性、疎水性もしくは小型のアミノ酸であり、 A₁₈は存在しないか、または存在する場合は、塩基性、疎水性、中性／極性もしくは小型のアミノ酸である〕で表される、精製および単離されたまたは組換え的に生産された、＋３以上の電荷を有する化合物またはそのＮ末端アシル化および／またはＣ末端アミド化もしくはエステル化型、または４個のシステインのうちの少なくとも１個が独立に疎水性アミノ酸または小型のアミノ酸で置換されている式（１）の修飾型またはそのＮ末端アシル化および／またはＣ末端アミド化もしくはエステル化型。２．２個のシスチン橋を含有する、請求項１に記載の化合物。３．C₆-C₁₅またはC₈-C₁₃であるシスチン橋を１個含有する、請求項１に記載の化合物。４．線形である、請求項１に記載の化合物。５．Ｃ末端カルボキシルがCOOHまたはその塩、COOR、CONH₂、CONHR および CONR₂ よりなる群から選択される式で表され、ここで各R は独立にヒドロカルビル(1-6C)であり、および／またはＮ末端のアミノ基が式 NH₂またはNHCOR で表され、ここでR はヒドロカルビル(1-6C)であり、および／またはA₁およびA₉のそれぞれが独立にR 、K およびHar よりなる群から選択され、および／またはA₂およびA₃のそれぞれが独立にG 、A 、S およびT よりなる群から選択され、および／またはA₄がR またはG であり、および／またはA₅、A₁₄およびA₁₆のそれぞれが独立にI 、V 、NLe 、L およびF よりなる群から選択され、および／またはA₇およびA₁₂のそれぞれが独立にI 、V 、L 、W 、Y およびF よりなる群から選択され、および／またはA₁₀がR 、G またはP であり、および／またはA₁₁がR またはW である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。６．線形またはシスチン架橋形の次の化合物：およびそれらのアミド化型よりなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。７．すべてのアミノ酸がＤ立体配置である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。８．請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物のアミノ酸配列を有する抗微生物ペプチドを産生するための組換え発現系であって、発現を行わせるための調節配列に機能的に連結された、前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現系。９．請求項８に記載の発現系を含有するように改変された組換え宿主細胞。 10．抗微生物もしくは抗ウイルスペプチドまたはその中間体ペプチドを産生する方法であって、請求項９に記載の改変された宿主細胞を、前記ペプチドが産生される条件下で培養し、この培養物から前記ペプチドを回収することを含んでなる方法。 11．前記ペプチドのシスチン結合を行うこと、かつ／または前記ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端を修飾することをさらに含む、請求項10に記載の方法。 12．請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を、少なくとも１種の製剤上許容される賦形剤と共に含有する、抗微生物または抗ウイルス用の医薬組成物。 13．請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を、少なくとも１種の環境的に許容される希釈剤と共に含有する、微生物またはウイルス感染に対する抵抗性を植物に付与するための植物または植物環境に適用される組成物。 14．ウイルスまたは微生物の増殖を阻止する方法であって、ウイルスまたは微生物の増殖を支持する組成物を、前記増殖を阻止するのに有効な量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含んでなる方法。 15．グラム陰性細菌の内毒素を不活性化する方法であって、前記内毒素を、該内毒素を不活性化するのに有効な量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含んでなる方法。 16．請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物と特異的に反応する抗体。