JP2015514134A - 芳香族カチオン性ペプチド及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本願は、芳香族カチオン性ペプチドに関する組成物及び方法を開示する。詳細には、前記組成物及び方法は、シトクロムｃと組み合わせる芳香族カチオン性ペプチドに関する。いくつかの実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（Ｐ−２３１）、ＤＡｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ２、及びＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（Ｐ−２３１０）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、シトクロムｃ還元の増加、シトクロムｃを通じた電子拡散の強化、シトクロムｃの電子容量の拡大、及び／又はシトクロムｃ周囲での新規なｎ−ｎ相互作用の誘導、に関する。【選択図】 なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年４月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／６２３，３４８号の利益及び優先権を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本願は、芳香族カチオン性ペプチドに関する組成物及び方法を開示する。詳細には、前記組成物及び方法は、シトクロムｃと組み合わせる芳香族カチオン性ペプチドに関する。
本明細書に開示する芳香族カチオン性ペプチドは、ミトコンドリア性機能不全に対する治療応用に有用である。前記ペプチドを必要とする哺乳動物に投与すると、前記ペプチドは、ミトコンドリアへと局在化され、この細胞小器官の健全性及び機能を改善する。シトクロムｃは、ミトコンドリアの内膜と弱く結合していることがわかっている、小型のヘムタンパク質であり、電子伝達系の構成要素である。シトクロムｃは、ヒドロキシル化及び芳香族酸化などの複数の反応を触媒することができ、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）、２−ケト−４−チオメチル酪酸、及び４−アミノアンチピリンなどの様々な電子供与体の酸化によるペルオキシダーゼ活性を示す。
１態様では、本発明の技術は、芳香族カチオン性ペプチド、又はその製薬上許容できる塩を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、及びＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）のうちの１つ以上を含む。
いくつかの態様では、本開示は、シトクロムｃ、及び芳香族カチオン性ペプチドに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、シトクロムｃ還元の増加、シトクロムｃを通じた電子拡散の強化、シトクロムｃの電子容量（electron capacity）の拡大（enhance）、及び／又はシトクロムｃ周囲での新規なπ−π相互作用の誘導、に関する。いくつかの実施形態では、シトクロムｃを含有する試料が、有効量の芳香族カチオン性ペプチド又はその塩と接触させられる。いくつかの実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、及びＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）のうちの１つ以上である。
いくつかの実施形態では、シトクロムｃは、精製形態、単離形態、及び／又は濃縮形態の試料中に存在する。いくつかの実施形態では、シトクロムｃは、天然型態の試料中に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、シトクロムｃは、１つ以上のミトコンドリア中に存在する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは、単離されている。他の実施形態では、ミトコンドリアは、細胞中、又は細胞標品中に存在する。
いくつかの態様では、本開示は、ミトコンドリア呼吸に関する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、ミトコンドリアのＯ2消費を増加させることに関し、試料中でのＡＴＰ合成を増加させること、及び／又は、シトクロムｃ欠乏マイトプラストでの呼吸を強化することに関する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア、及び／又はシトクロム欠乏マイトプラストを含有する試料は、有効量の芳香族カチオン性ペプチド、又はその製薬上許容できる塩と接触させられる。いくつかの実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、及びＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは、精製形態、単離形態、及び／又は濃縮形態の試料中に存在する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは、天然型態の試料中に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ミトコンドリアは、細胞中、又は細胞標品中に存在する。
いくつかの実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2、及びＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）のうちの１つ以上を含む。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、以下のうちの１つ以上を含む。
Figure 2015514134
Figure 2015514134
（式中、Ｃｈａは、シクロヘキシルアラニンであり、Ｎｌｅは、ノルロイシンであり、Ａｈｅは、２−アミノ−ヘプタン酸である。）
１実施形態では、前記ペプチドは、式Ｉ：
Figure 2015514134
 によって定義され、式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、
（ｉ）水素；
（ｉｉ）直鎖状又は分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ6アルキル；
（ｉｉｉ）
Figure 2015514134
 （ｉｖ）
Figure 2015514134
 （ｖ）
Figure 2015514134
 から選択され、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12はそれぞれ独立して、
（ｉ）水素；
（ｉｉ）直鎖状又は分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ6アルキル；
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；
（ｉｖ）アミノ；
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ；
（ｖｉｉ）ニトロ；
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル；
（ｉｘ）ハロゲン（ここで、「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモ及びヨードを包含する）から選択され；
ｎは、１〜５の整数である。
ある特定の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12は、全て水素であり；ｎは、４である。他の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、及びＲ11は、全て水素であり；Ｒ8及びＲ12は、メチルであり；Ｒ10は、ヒドロキシルであり；ｎは、４である。
１実施形態では、前記ペプチドは、式ＩＩ：
Figure 2015514134
 によって定義され、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、
（ｉ）水素；
（ｉｉ）直鎖状又は分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ6アルキル；
（ｉｉｉ）
Figure 2015514134
 （ｉｖ）
Figure 2015514134
 （ｖ）
Figure 2015514134
 から選択され、
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、
（ｉ）水素；
（ｉｉ）直鎖状又は分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ6アルキル；
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；
（ｉｖ）アミノ；
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ；
（ｖｉｉ）ニトロ；
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル；
（ｉｘ）ハロゲン（ここで、「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモ及びヨードを包含する）から選択され；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は、それぞれ独立して、
（ｉ）水素；
（ｉｉ）直鎖状又は分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ6アルキル；
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；
（ｉｖ）アミノ；
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ；
（ｖｉｉ）ニトロ；
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル；
（ｉｘ）ハロゲン（ここで、「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモ及びヨードを包含する）から選択され；
ｎは、１〜５の整数である。
ある特定の実施形態では、Ｒ1及びＲ2が水素であり；Ｒ3及びＲ4は、メチルであり；Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、及びＲ9は、全て水素であり；ｎは、４である。
１実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、芳香族アミノ酸とカチオン性アミノ酸とが交互になったコア構造モチーフを有する。例えば、前記ペプチドは、以下に述べる式ＩＩＩ〜ＶＩのうちのいずれかによって定義されるテトラペプチドであってよい。
Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ−Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ（式ＩＩＩ）
Ｃａｔｉｏｎｉｃ−Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ−Ａｒｏｍａｔｉｃ（式ＩＶ）
Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ（式Ｖ）
Ｃａｔｉｏｎｉｃ−Ｃａｔｉｏｎｉｃ−Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ａｒｏｍａｔｉｃ（式ＶＩ）
（式中、Ａｒｏｍａｔｉｃは、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、及びシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）からなる群から選択される残基であり、Ｃａｔｉｏｎｉｃは、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、及び２−アミノ−ヘプタン酸（Ａｈｅ）からなる群から選択される残基である。）
本発明の特定の側面、態様、実施形態、変更例、及び特徴が、本発明の実質的な理解をもたらすために、様々な程度の詳細さをもって、以下に説明されることが理解される。
本発明の実践においては、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学及び組換えＤＮＡにおける、多くの従来の手法が使用される。これらの手法は周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ及びＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８７）；並びにＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４及び１５５、Ｗｕ ＆ Ｇｒｏｓｓｍａｎ、及びＷｕ，Ｅｄｓ．のそれぞれにおいて説明されている。
本明細書で使用される特定の用語の定義を以下に提供する。特に断らないかぎり、本明細書で用いる技術的及び科学的な全ての用語は、概して、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。例えば、「細胞（a cell）」への言及には、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
本明細書で使用する場合、被験体に対する薬剤、薬物、又はペプチドの「投与」には、被験体に化合物を導入又は送達して、その化合物に意図された機能を果たさせる、任意の経路が含まれる。投与は、任意の好適な経路によって行われてよく、例えば、経口的に、鼻腔内的に、非経口的に（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下に）、又は局所的に行われてよい。投与には、自己投与及び他者による投与が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」には、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに、天然に存在するアミノ酸と同様の機能を果たす、アミノ酸類似体及びアミノ酸ミメティックが含まれる。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸、並びに後天的に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンなど）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造（即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。このような類似体は、Ｒ基が修飾されていたり（例えば、ノルロイシン）、ペプチド主鎖が修飾されていたりするが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持している。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するものの、天然に存在するアミノ酸と同様の機能を果たす化合物を指す。本明細書では、アミノ酸を、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている、一般的に知られた３文字の記号、又は１文字の記号のどちらかによって示す場合がある。
本明細書で使用する場合、用語「有効量」とは、所望の治療及び／又は予防効果を達成するために十分な量を指す。治療又は予防用途の場合には、被験体に投与される組成物の量は、病気の種類及び重篤度、並びに個体の特性（全般的な健康状態、年齢、性別、体重、及び薬物に対する耐性など）に依存するであろう。また、有効量は、病気の程度、重篤度及び種類にも依存するであろう。当業者であれば、上記の因子、及び他の因子に応じて、適切な投与量を決定することができるであろう。また、これらの組成物は、１種類以上の治療用化合物と組み合わせて投与することもできる。
「単離した」又は「精製した」ポリペプチド又はペプチドは、薬剤が由来する元の細胞若しくは組織からの、細胞物質若しくは他の汚染性ポリペプチド類を実質的に含まないか、又は、化学的に合成した場合には、化学的な前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。例えば、単離した芳香族カチオン性ペプチドは、薬剤の診断又は治療用途と干渉しかねない物質を含まないであろう。このような干渉物質には、酵素類、ホルモン類、並びに他のタンパク質性及び非タンパク質性溶質が含まれ得る。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は互換可能に使用され、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸、又は修飾されたペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸（即ち、ペプチドイソスター）を含む、ポリマーを意味する。ポリペプチドは、一般的にペプチド、グリコペプチド、又はオリゴマーと呼ばれる短鎖のもの、及び一般的にタンパク質と呼ばれる長鎖のもの、の両方を指す。ポリペプチドには、遺伝子にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸が包含され得る。ポリペプチドには、天然のプロセス（翻訳後プロセシングなど）、又は当該技術分野で周知の化学的な修飾手法のどちらかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「処置すること」又は「処置」又は「緩和」とは、治療処置及び予防（prophylactic, preventative）手段の両方を指し、ここでの目標は、標的の病態又は障害を予防する、又は進行を遅らせる（低減する）ことである。また、記載したような医学的状態への処置又は予防の様々な態様は、「実質的」なものであることを意味するように意図されており、総合的な処置又は予防だけでなく、（生物学的又は医学的に関連する幾分かの結果が達成される）非総合的な処置又は予防をも含むことが、理解される。
本明細書で使用する場合、障害若しくは状態の「予防」、又は障害若しくは状態を「予防すること」とは、統計的な試料において、処置された試料での、障害若しくは状態の発生を、処置されていないコントロール試料と比較して、減少させる、又は、発病を遅らせる、又は、障害若しくは状態の１つ以上の症状の重篤度を、処置されていないコントロール試料と比較して、低減させる化合物を指す。
予防又は処置の方法
本発明の技術は、特定の芳香族カチオン性ペプチドの投与による病気への処置又は予防に関する。
前記芳香族カチオン性ペプチドは、水溶性であり、かつ極性が高い。これらの性質にもかかわらず、前記ペプチドは、容易に細胞膜を貫通する。典型的には、前記芳香族カチオン性ペプチドは、ペプチド結合により共有結合した、最低２つ若しくは３つのアミノ酸、又は最低４つのアミノ酸を含む。前記芳香族カチオン性ペプチドに存在するアミノ酸の最大数は、ペプチド結合により共有結合した、約２０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の最大数は、約１２個、約９個、又は約６個である。
前記芳香族カチオン性ペプチドのアミノ酸は、任意のアミノ酸であってよい。本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのカルボキシル基を含有する、任意の有機分子を指すように使用される。典型的には、少なくとも１つのアミノ基が、カルボキシル基に対してα位にある。アミノ酸は、天然に存在するものであってよい。天然に存在するアミノ酸としては、例えば、哺乳類のタンパク質で標準的に見られる、２０種類の最も一般的な左旋性（Ｌ）アミノ酸（即ち、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ））が挙げられる。他の天然に存在するアミノ酸としては、例えば、タンパク質合成とは関連していない、代謝プロセスにおいて合成されるアミノ酸が挙げられる。例えば、哺乳類の代謝においては、尿素の産生の際に、アミノ酸であるオルニチン及びシトルリンが、合成される。天然に存在するアミノ酸の他の例としては、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が挙げられる。
前記ペプチドは、任意選択で、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含有する。最適には、前記ペプチドは、天然に存在するアミノ酸を有さない。天然に存在しないアミノ酸は、左旋性（Ｌ−）、右旋性（Ｄ−）、又はそれらの混合物であってよい。天然に存在しないアミノ酸は、生体内の標準的な代謝プロセスにおいては通常合成されず、タンパク質中に天然には存在しないアミノ酸である。加えて、好適なことに、天然に存在しないアミノ酸は、一般的なプロテアーゼ類によって認識されない。天然に存在しないアミノ酸は、前記ペプチド内の任意の位置に存在してよい。例えば、天然に存在しないアミノ酸は、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端との間の任意の位置にあってよい。
非天然のアミノ酸は、例えば、天然のアミノ酸には見られないアルキル基、アリール基、又はアルキルアリール基を含んでよい。非天然のアルキルアミノ酸の例の一部としては、α−アミノ酪酸、β−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸、及びε−アミノカプロン酸が挙げられる。非天然のアリールアミノ酸の一部の例としては、オルト、メタ、及びパラ−アミノ安息香酸が挙げられる。非天然のアルキルアリールアミノ酸の例の一部としては、オルト、メタ、及びパラ−アミノフェニル酢酸、及びγ−フェニル−β−アミノ酪酸が挙げられる。天然に存在しないアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸の誘導体が挙げられる。天然に存在するアミノ酸の誘導体としては、例えば、天然に存在するアミノ酸に対する、１つ以上の化学基の付加が含まれてもよい。
例えば、１つ以上の化学基が、フェニルアラニン若しくはチロシン残基の芳香環の２’、３’、４’、５’、若しくは６’位、又はトリプトファン残基のベンゾ環の４’、５’、６’、若しくは７’位のうちの１つ以上に付加されてもよい。前記基は、芳香環に付加できる任意の化学基である。このような基の例の一部としては、分岐鎖状又は非分岐鎖状のＣ1〜Ｃ4アルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はｔ−ブチルなど）、Ｃ1〜Ｃ4アルキルオキシ（即ち、アルコキシ）、アミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ及びＣ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ（例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ）、ニトロ、ヒドロキシル、ハロゲン（即ち、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）が挙げられる。天然に存在するアミノ酸の、天然に存在しない誘導体の一部の具体例としては、ノルバリン（Ｎｖａ）、及びノルロイシン（Ｎｌｅ）が挙げられる。
ペプチドにおけるアミノ酸の修飾の他の例は、該ペプチドのアスパラギン酸、又はグルタミン酸残基のカルボキシル基の誘導体化である。誘導体化の一例としては、アンモニアによる、又は第一級又は第二級アミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン又はジエチルアミンなど）によるアミド化がある。誘導体化の他の例としては、例えば、メチルアルコール又はエチルアルコールによるエステル化が挙げられる。このような修飾としては、他に、リジン、アルギニン、又はヒスチジン残基のアミノ基の誘導体化が挙げられる。例えば、このようなアミノ基は、アシル化することができる。好適なアシル基の一部として、例えば、上述したＣ1〜Ｃ4アルキル基（アセチル基又はプロピオニル基など）のいずれかを含む、ベンゾイル基又はアルカノイル基が挙げられる。
天然に存在しないアミノ酸は、一般的なプロテアーゼ類に対して好ましくは抵抗性であり、より好ましくは、非感受性である。プロテアーゼ類に対して抵抗性又は非感受性である天然に存在しないアミノ酸の例としては、上述した天然に存在するＬ−アミノ酸のいずれかの右旋（Ｄ−）型、並びに、天然に存在しないＬ−かつ／又はＤ−アミノ酸が挙げられる。Ｄ−アミノ酸類は、通常、タンパク質中に存在しないが、細胞の通常のリボソームによるタンパク質合成機構以外の手段によって合成された、特定のペプチド抗生物質に見出される。本明細書で使用する場合、Ｄ−アミノ酸は、天然に存在しないアミノ酸とみなされる。
プロテアーゼ感受性を最小にするためには、前記ペプチドは、一般的なプロテアーゼ類に認識される、５未満、好ましくは４未満、より好ましくは３未満、最も好ましくは２未満の連続したＬ−アミノ酸を、それらのアミノ酸が天然に存在するか、天然に存在しないかに関わらず、有するべきである。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、Ｄ−アミノ酸のみを有し、Ｌ−アミノ酸を有していない。前記ペプチドがプロテアーゼ感受性のアミノ酸配列を包含している場合、好ましくは、それらのアミノ酸のうちの少なくとも１つが、天然に存在しないＤ−アミノ酸であることによって、プロテアーゼ抵抗性がもたらされる。プロテアーゼ感受性配列の例としては、エンドペプチダーゼ及びトリプシンなどの一般的なプロテアーゼ類によって容易に切断される、２つ以上の連続した塩基性アミノ酸が挙げられる。塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。
前記芳香族カチオン性ペプチドは、前記ペプチド中のアミノ酸残基の総数と比較して、生理的ｐＨにおける正味の正電荷の最小数を有するべきである。以下において、生理的ｐＨにおける正味の正電荷の最小数は、（ｐm）として言及される。以下において、前記ペプチド中のアミノ酸残基の総数は、（ｒ）として言及される。以下で述べられる正味の正電荷の最小数は、全て生理的ｐＨにおけるものである。本明細書で使用する場合、用語「生理的ｐＨ」とは、哺乳類の体における組織及び器官の細胞での通常のｐＨを指す。例えば、ヒトの生理的ｐＨは、通常およそ７．４であるが、哺乳類における一般的な生理的ｐＨは、約７．０〜約７．８の間の任意のｐＨであり得る。
本明細書で使用する場合、「正味の電荷」とは、ペプチド内に存在するアミノ酸によって保持される、正電荷の数と負電荷の数との収支を指す。本明細書では、正味の電荷は、生理的ｐＨにおいて測定したものと理解される。生理的ｐＨにおいて正に帯電する、天然に存在するアミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、及びＬ−ヒスチジンが挙げられる。生理的ｐＨにおいて負に帯電する、天然に存在するアミノ酸としては、Ｌ−アスパラギン酸、及びＬ−グルタミン酸が挙げられる。
典型的には、ペプチドは、正に帯電するＮ末端のアミノ基と、負に帯電するＣ末端のカルボキシル基とを有する。生理的ｐＨにおいて、これらの電荷は互いに打ち消し合う。正味の電荷を計算する例として、ペプチドのＴｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｒｇは、１つの負に帯電するアミノ酸（即ち、Ｇｌｕ）と、４つの正に帯電するアミノ酸（即ち、２つのＡｒｇ残基、１つのＬｙｓ、及び１つのＨｉｓ）を有する。それ故、上記ペプチドは、３の正味の正電荷を有する。
１実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、生理的ｐＨにおける正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間に、３ｐmが、ｒ＋１以下の最大の数となるという関係を有する。この実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間の関係は、次のようになる。
Figure 2015514134
他の実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間に、２ｐmが、ｒ＋１以下の最大の数となるという関係を有する。この実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間の関係は、次のようになる。
Figure 2015514134
１実施形態では、正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）とが等しくなる。他の実施形態では、前記ペプチドは、３つ又は４つアミノ酸残基、及び最低１の正味の正電荷、好適には、最低２の正味の正電荷、より好ましくは、最低３の正味の正電荷を有する。
また、前記芳香族カチオン性ペプチドは、正味の正電荷の総数（ｐt）と比較して、芳香族基の最少数を有することが重要である。以下において、芳香族基の最少数は、（ａ）として言及される。芳香族基を有する、天然に存在するアミノ酸には、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニンなどのアミノ酸が含まれる。例えば、ヘキサペプチドのＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐは、２の正味の正電荷（リジン残基及びアルギニン残基が寄与している）及び３の芳香族基（チロシン残基、フェニルアラニン残基及びトリプトファン残基が寄与している）を有している。
また、前記芳香族カチオン性ペプチドは、芳香族基の最少数（ａ）と生理的ｐＨにおける正味の正電荷の総数（ｐt）との間に、３ａが、ｐt＋１以下の最大の数となる（ｐtが１のとき、ａも１となり得るということを除く）という関係を有するべきである。この実施形態では、芳香族基の最少数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との間の関係は、次のようになる。
Figure 2015514134
他の実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、芳香族基の最少数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との間に、２ａが、ｐt＋１以下の最大の数となるという関係を有する。この実施形態では、芳香族アミノ酸残基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との間の関係は、次のようになる。
Figure 2015514134
他の実施形態では、芳香族基の最小数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）とが等しくなる。１実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドは、
（ａ）少なくとも１つの正味の正電荷と；
（ｂ）最低３つのアミノ酸と；
（ｃ）最大約２０個のアミノ酸と；
（ｄ）正味の正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間に、３ｐmが、ｒ＋１以下の最大の数となるという関係と；
（ｅ）芳香族基の最少数（ａ）と正味の正電荷の総数（ｐt）との間に、３ａが、ｐt＋１以下の最大の数となる（ａが１のとき、ｐtも１となり得るということを除く）という関係と、を有してもよい。
カルボキシル基（特に、Ｃ末端のアミノ酸の末端カルボキシル基）は、例えば、アンモニアによって、好適にアミド化され、Ｃ末端アミドを形成する。あるいは、Ｃ末端のアミノ酸の末端カルボキシル基は、任意の第一級又は第二級アミンによってアミド化されてもよい。第一級又は第二級アミンは、例えば、アルキル（特に、分岐鎖状又は非分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ4アルキル）、又はアリールアミンであってよい。したがって、前記ペプチドのＣ末端におけるアミノ酸は、アミド基、Ｎ−メチルアミド基、Ｎ−エチルアミド基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミド基、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミド基、Ｎ−フェニルアミド基、又はＮ−フェニル−Ｎ−エチルアミド基へと変換されてもよい。また、前記芳香族カチオン性ペプチドのＣ末端に存在しない、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、及びグルタミン酸残基の遊離カルボキシラート基が、それらがペプチドのどこに存在するかに関わらず、アミド化されてもよい。これらの内部位置におけるアミド化は、上述したアンモニア又は第一級若しくは第二級アミンのいずれかによるものであってよい。
芳香族カチオン性ペプチドとしては、次の例示的なペプチド類が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2015514134
Figure 2015514134
（式中、Ｃｈａは、シクロヘキシルアラニンであり、Ｎｌｅは、ノルロイシンであり、Ａｈｅは、２−アミノ−ヘプタン酸である。）
１実施形態では、前記ペプチドは、ミューオピオイド受容体アゴニスト活性を有する（即ち、これらのペプチドは、ミューオピオイド受容体を活性化する）。ミューオピオイド活性は、クローニングしたミューオピオイド受容体に結合する放射性リガンド、又はモルモットの回腸を使用した生物検定によって検査することができる（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，３５：８９５〜９０１，２０００；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ，３０７：９４７〜９５４，２００３）。典型的には、ミューオピオイド受容体の活性化により、鎮痛効果が誘発される。特定の例においては、ミューオピオイド受容体アゴニスト活性を有する芳香族カチオン性ペプチドが好ましい。例えば、急性の病気又は状態などの短期間の処置の際、ミューオピオイド受容体を活性化する芳香族カチオン性ペプチドを使用することが有益である。大抵、このような急性の病気及び状態は、中程度の又は激しい痛みと関連する。これらの例においては、前記芳香族カチオン性ペプチドの鎮痛効果は、ヒト患者又は他の哺乳動物への処置レジメンにおいて有益となり得る。しかしながら、ミューオピオイド受容体を活性化しない芳香族カチオン性ペプチドが、臨床上の必要性に応じて、鎮痛剤と共に、又は鎮痛剤なしで使用されてもよい。典型的には、ミューオピオイド受容体アゴニスト活性を有するペプチドは、Ｎ末端（即ち、最初のアミノ酸位）において、チロシン残基又はチロシン誘導体を有するペプチドである。
あるいは、他の例においては、ミューオピオイド受容体アゴニスト活性を有さない芳香族カチオン性ペプチドが好ましい。例えば、慢性的な病状又は状態などの長期間の処置の際、ミューオピオイド受容体を活性化する芳香族カチオン性ペプチドを使用することは禁忌となり得る。これらの例では、芳香族カチオン性ペプチドによる有害な又は中毒的な影響の可能性から、ヒト患者又は他の哺乳動物への処置レジメンでの、ミューオピオイド受容体を活性化する芳香族カチオン性ペプチドの使用は排除され得る。可能性がある有害な影響としては、鎮静、便秘、呼吸抑制などを挙げることができる。このような例においては、ミューオピオイド受容体を活性化しない芳香族カチオン性ペプチドが、適切な処置となり得る。一般的に、ミューオピオイド受容体アゴニスト活性を有さないペプチドは、Ｎ末端（即ち、アミノ酸位１）において、チロシン残基又はチロシンの誘導体を有さない。Ｎ末端のアミノ酸は、天然に存在する、又は天然に存在しない、チロシン以外の任意のアミノ酸であってよい。１実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸は、フェニルアラニン又はその誘導体である。フェニルアラニンの誘導体の例としては、２’−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｐ）、２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（２’，６’−Ｄｍｐ）、Ｎ，２’，６’−トリメチルフェニルアラニン（Ｔｍｐ）、及び２’−ヒドロキシ−６’−メチルフェニルアラニン（Ｈｍｐ）が挙げられる。
本明細書で言及するペプチド及びその誘導体は、機能的変異体を更に有する場合がある。ある変異体が既に述べたペプチドと同一の機能を有する場合には、機能的変異体であるペプチドとみなされる。この類似体は、例えば、１つ以上のアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換されている、ペプチドの置換変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、前記ペプチドの置換変異体は、保存的なアミノ酸置換を含む。アミノ酸は、それぞれの物理化学的特性に従い、次のように分類することができる。
（ａ）非極性アミノ酸：Ａｌａ（Ａ）Ｓｅｒ（Ｓ）Ｔｈｒ（Ｔ）Ｐｒｏ（Ｐ）Ｇｌｙ（Ｇ）Ｃｙｓ（Ｃ）；
（ｂ）酸性アミノ酸：Ａｓｎ（Ｎ）Ａｓｐ（Ｄ）Ｇｌｕ（Ｅ）Ｇｌｎ（Ｑ）；
（ｃ）塩基性アミノ酸：Ｈｉｓ（Ｈ）Ａｒｇ（Ｒ）Ｌｙｓ（Ｋ）；
（ｄ）疎水性アミノ酸：Ｍｅｔ（Ｍ）Ｌｅｕ（Ｌ）Ｉｌｅ（Ｉ）Ｖａｌ（Ｖ）；及び
（ｅ）芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ（Ｆ）Ｔｙｒ（Ｙ）Ｔｒｐ（Ｗ）Ｈｉｓ（Ｈ）。
あるペプチド内のアミノ酸が、同一の分類に属する他のアミノ酸によって置換されるときは、保存的置換と呼ばれ、元のペプチドの物理化学的特性が保存され得る。対照的に、あるペプチド内のアミノ酸が、異なる分類に属する他のアミノ酸によって置換されるときは、一般的に、元のペプチドの特性がより変化しやすい。
前記ペプチドは、当該技術分野で周知の任意の方法によって合成されてよい。前記タンパク質を化学的に合成する好適な方法としては、例えば、ＳｔｕａｒｔとＹｏｕｎｇによって、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）、及びＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）に記載されているものなどが挙げられる。
芳香族カチオン性ペプチドの予防及び治療用途
本明細書に記載の芳香族カチオン性ペプチドは、病気への予防又は処置を行うために有用である。具体的には、本開示では、本明細書に記載の芳香族カチオン性ペプチドを投与することによって、病気の危険がある（又は病気を発症しやすい）被験体への処置を行う、予防方法又は治療方法の両方が提供される。したがって、本発明の方法は、有効量の芳香族カチオン性ペプチドを、それを必要とする被験体に対して投与することによる、被験体における病気への予防及び／又は処置のために提供される。
１実施形態では、上述したペプチドは、ミトコンドリア膜透過性遷移（ＭＰＴ）に関連する任意の病気又は状態への処置において有用である。ＭＰＴは哺乳類に共通する複数の病気及び状態に関連しているため、ＭＰＴが起こっているミトコンドリアの数を減少させること、及びＭＰＴを予防することは重要である。このような病気及び状態としては、組織又は器官の虚血及び／又は再潅流、低酸素症、神経変性疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。ＭＰＴへの処置又は予防を必要とする哺乳動物は、これらの病気又は状態を患っている哺乳動物である。
哺乳類の組織又は器官における虚血は、酸素の欠乏（低酸素症）及び／又はグルコース（例えば、基質）の欠乏によって引き起こされる、多面的な病態である。組織又は器官の細胞において、酸素及び／又はグルコースが欠乏することにより、エネルギー生成能力の減少、又は完全な消失が引き起こされ、結果として、細胞膜を渡って移動する活性イオンの機能の消失が起こる。また、酸素及び／又はグルコースの欠乏は、ミトコンドリア膜における透過性遷移などの、他の細胞膜での病理学的変化をも引き起こす。加えて、通常はミトコンドリア内に区分けされているアポトーシス性タンパク質などの他の分子が、細胞質へと漏れ出し、アポトーシス性の細胞死を引き起こし得る。重大な虚血により、壊死性の細胞死が引き起こされる場合もある。ある特定の組織又は器官での虚血又は低酸素症は、その組織又は器官に対する血液供給の消失又は重度の減少によって引き起こされる場合がある。この血液供給の消失又は重度の減少は、例えば、血栓塞栓性脳卒中、冠動脈アテローム性動脈硬化症、又は末梢血管疾患に起因する場合がある。虚血又は低酸素症によって影響を受ける組織は、典型的には、心筋、骨格筋又は平滑筋などの筋肉である。虚血又は低酸素症によって影響を受ける器官は、虚血又は低酸素症が起きる任意の器官であり得る。虚血又は低酸素症によって影響を受ける器官の例としては、脳、心臓、腎臓及び前立腺が挙げられる。例えば、心筋の虚血又は低酸素症は、一般的に、アテローム性又は血栓性閉塞によって引き起こされ、心臓の動脈及び毛細血管の血液供給によって心臓組織へと送達される酸素の減少、又は消失を引き起こす。このような心臓の虚血又は低酸素症は、痛みと影響を受けた心筋の壊死を引き起こし得るとともに、最終的には心不全を引き起こす場合がある。骨格筋又は平滑筋における虚血又は低酸素症は、同様の原因により起こる場合がある。例えば、腸の平滑筋、又は四肢の骨格筋における虚血又は低酸素症も、アテローム性又は血栓性閉塞によって引き起こされる場合がある。
再潅流とは、血液の流れが減少するか又は閉塞されていた任意の器官及び組織へ、血流が回復することである。例えば、血流は、虚血又は低酸素症によって影響を受ける任意の器官及び組織へ回復させることができる。血流の回復（再潅流）は、当業者に既知の任意の方法によって行うことができる。例えば、虚血心臓組織の再潅流は、血管形成、冠動脈バイパス移植、又は血栓溶解薬の使用によって起こすことができる。
また、本明細書に記載の方法を、ＭＰＴに関連する神経変性疾患への処置又は予防において使用することもできる。ＭＰＴに関連する神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病としても知られている）などが挙げられる。本明細書に開示する方法を使用して、これらの及び他のＭＰＴに関連する神経変性疾患の発病を遅らせたり、又は進行を遅らせることもできる。本明細書に開示する方法は、ＭＰＴに関連する神経変性疾患の初期段階を患っているヒトへの処置、及びこれらの病気を発症しやすいヒトに、特に有用である。
また、上述した芳香族カチオン性ペプチドは、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、熱傷及び二次的な合併症、心不全、糖尿病の合併症（糖尿病性網膜症など）、眼性疾患（脈絡膜血管新生、網膜変性、酸素誘導網膜症など）への予防又は処置においても有用である。
また、上述した芳香族カチオン性ペプチドは、酸化損傷の減少を、それを必要とする哺乳動物において行う上でも有用である。酸化損傷の減少を必要とする哺乳動物は、酸化損傷に関連する病気、状態又は処置により苦痛を受けている哺乳動物である。典型的には、酸化損傷は、活性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は活性窒素種（ＲＮＳ）などのフリーラジカルによって引き起こされる。ＲＯＳ及びＲＮＳの例としては、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ2 -）、一酸化窒素（ＮＯ・）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）及び過酸化亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ-）が挙げられる。１実施形態では、酸化損傷の減少を必要とする哺乳動物は、酸化損傷に関連する処置を受けている哺乳動物であり得る。例えば、哺乳動物は、再潅流を受けているか、虚血、又は低酸素症を起こしていてよい。
他の実施形態では、前記芳香族カチオン性ペプチドを使用して、病気又は状態に対する酸化損傷に関連する脂質過酸化、及び／又は炎症プロセスを予防することもできる。脂質過酸化とは、脂質の酸化修飾を指す。脂質は、細胞膜に存在してもよい。典型的には、この膜脂質の修飾により、細胞の膜機能の変化及び／又は損傷がもたらされる。加えて、脂質過酸化は、細胞の外因性脂質又はリポタンパク質においても生じ得る。例えば、低密度リポタンパク質は、脂質過酸化されやすい。脂質過酸化に関連する状態の１例としては、アテローム性動脈硬化症がある。アテローム性動脈硬化症は、例えば、心臓発作及び冠動脈疾患に関係するため、アテローム性動脈硬化症に関連する酸化損傷を減少させることは重要である。
炎症プロセスには、免疫システムの活性化が含まれる。典型的には、免疫システムは、抗原物質によって活性化される。抗原物質は、免疫システムによって認識される任意の物質であってよく、自己由来の粒子と外部由来の粒子とを含む。自己由来の粒子に対する炎症プロセスにより起こる病気又は状態の例としては、関節炎及び多発性硬化症が挙げられる。外部由来の粒子の例としては、ウイルス及び細菌が挙げられる。ウイルスは、炎症プロセスを活性化する任意のウイルスであってよく、酸化損傷に関連するものであってもよい。ウイルスの例としては、Ａ型、Ｂ型、又はＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、及びウシ下痢症ウイルスが挙げられる。例えば、肝炎ウイルスは、炎症プロセス及びフリーラジカルの形成を誘発することによって、肝臓に損傷を与え得る。前記細菌は、任意の細菌であってよく、グラム陰性菌又はグラム陽性菌を含んでよい。グラム陰性菌は、細菌の細胞壁にリポ多糖を含有する。グラム陰性菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓが挙げられる。グラム陽性菌の例としては、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ及びｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉが挙げられる。細菌によって引き起こされる酸化ストレスに関連する炎症プロセスの１例としては、敗血症がある。典型的には、敗血症は、グラム陰性菌が血流に侵入したときに起こる。
炎症プロセス及び酸化ストレスに関連する他の状態としては、毒性薬剤によって引き起こされる肝臓損傷がある。毒性薬剤は、肝臓に損傷を与える任意の薬剤であってよい。例えば、毒性薬剤は、肝臓細胞のアポトーシス及び／又は壊死を引き起こし得る。このような薬剤の例としては、アルコール、病気又は状態への処置に用いられる処方薬及び非処方薬などの医薬品が挙げられる。
また、本明細書に開示する方法は、任意の神経変性疾患又は状態に関連する酸化損傷の減少のために使用することもできる。神経変性疾患は、中枢神経系及び末梢神経系の、任意の細胞、組織又は器官に影響を与え得る。このような細胞、組織及び器官の例としては、脳、脊髄、ニューロン、神経節、シュワン細胞、星状細胞、乏突起神経膠細胞及び小神経膠細胞などが挙げられる。神経変性による状態は、脳卒中、又は外傷性脳損傷若しくは脊髄損傷などの急性の状態であってもよい。他の実施形態では、神経変性による疾患又は状態は、慢性的な神経変性による状態であってもよい。慢性的な神経変性による状態においては、フリーラジカルが、例えば、タンパク質に損傷を与え得る。このようなタンパク質の１例は、アミロイドベータタンパク質である。フリーラジカルによる損傷に関連する慢性的な神経変性疾患の例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病としても知られている）などが挙げられる。
芳香族カチオン性ペプチドに基づく治療薬の生物学的効果の判定。様々な実施形態において、好適なインビトロの、又はインビボのアッセイを行い、特定の芳香族カチオン性ペプチドに基づく治療薬の効果と、該治療薬の投与が処置用途に望ましいかどうかについて判定する。様々な実施形態において、代表的な動物モデルを用いてインビトロのアッセイを行い、所与の芳香族カチオン性ペプチドに基づく治療薬が、病気又は医学的状態への予防又は処置に所望の効果を与えたかどうかを判定できる。治療で使用する化合物については、ヒト被験体で試験を行うに先立って、好適な動物モデル系（ラット、マウス、ニワトリ、ブタ、ウシ、サル、ウサギなどがあげられるが、これらに限定されない）において試験を行うことができる。同様に、インビボの試験のために、ヒト被験体に投与するに先立って、当該技術分野で既知の動物モデル系のいずれかを使用することもできる。
予防法。１態様では、本発明は、状態の開始又は進行を予防する芳香族カチオン性ペプチドを被験体に投与することによって、被験体において、病気を予防する方法を提供する。予防用途においては、芳香族カチオン性ペプチドの医薬組成物又は薬剤を、病気又は状態を発症しやすい、さもなければその危険がある被験体に対し、（病気の生化学的、組織学的、及び／又は行動上の症状、合併症、並びに病気の進行の途中で表れる中間の病理学的表現型などを含めた）病気の危険を失くし、若しくは減少させ、重篤度を下げ、又は発病を遅らせるのに十分な量にて、投与する。予防用の芳香族カチオン性物の投与は、特徴的に異常な症状の発現に先立って、病気又は障害を予防するように、又はその進行を遅延させるように、行うことができる。適切な化合物は、上述したスクリーニングアッセイに基づいて、決定することができる。
治療法。本技術の他の態様は、治療目的で被験体の病気を処置する方法を含む。治療用途においては、組成物又は薬剤を、このような病気の疑いがある、又は既に患っている被験体に対し、（合併症、並びに病気の進行中の、中間の病理学的表現型などを含めた）病気の症状を治療する、又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量にて、投与する。したがって、本発明は、病気又は医学的状態によって苦しんでいる個体への処置を行う方法を提供する。
投与の態様及び効果的な投与量
細胞、器官及び組織をペプチドと接触させることについては、当業者に既知の任意の方法が用いられてよい。いくつかの実施形態では、方法には、インビトロ、エクスビボ、又はインビボの方法が含まれる。インビボの方法では、典型的には、上述したもののような芳香族カチオン性ペプチドの、哺乳動物（好適にはヒト）への投与が含まれる。治療のためにインビボで使用するとき、前記芳香族カチオン性ペプチドは、被験体に、有効量（即ち、所望の治療効果を有する量）にて投与される。投与量及び投与レジメンは、被験体の障害の程度、使用する具体的な芳香族カチオン性ペプチドの特性（例えば、その治療指数）、被験体、被験体の既往歴などに依存するであろう。
有効量は、医師及び臨床医に馴染みのある方法による、前臨床試験及び臨床試験の際に決定されてもよい。前記方法において有用なペプチドの有効量を、医薬化合物の投与に関する、多くの周知の方法のうちの任意のものによって、該ペプチドを必要とする哺乳動物へ投与してよい。前記ペプチドは、全身に投与してもよいし、局所的に投与してもよい。
前記ペプチドは、製薬上許容できる塩として処方されてもよい。用語「製薬上許容できる塩」とは、哺乳動物などの患者／患畜への投与が許容できる、塩基、又は酸から調製された塩（例えば、所与の投与レジメンに対して、哺乳動物に対して許容できる安全性を有する塩）を意味する。しかしながら、患者／患畜への投与が意図されていない中間化合物の塩などのように、製薬上許容できる塩であることは必要条件ではないことが理解される。製薬上許容できる塩は、製薬上許容できる無機塩基又は有機塩基に由来するものであってもよいし、製薬上許容できる無機酸又は有機酸に由来するものであってもよい。加えて、ペプチドが、アミン、ピリジン、又はイミダゾールなどの塩基性部分と、カルボン酸又はテトラゾールなどの酸性部分との両方を含有するときは、双性イオンが形成され得、本明細書で使用する場合、用語「塩」には、双性イオンが含まれる。製薬上許容できる無機塩基に由来する塩としては、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩及び亜鉛塩などが挙げられる。製薬上許容できる有機塩基由来の塩としては、第一級、第二級及び第三級アミン類、例えば、置換アミン類、環状アミン類、天然に存在するアミン類（アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペラジン（piperadine）、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなど）などの塩が挙げられる。製薬上許容できる無機酸に由来する塩としては、ホウ酸、炭酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素酸、塩酸、フッ化水素酸又はヨウ化水素酸）、硝酸、リン酸、スルファミン酸、及び硫酸の塩が挙げられる。製薬上許容できる有機酸由来の塩としては、脂肪族ヒドロキシル酸（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸、酒石酸など）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸など）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチジン酸、馬尿酸、トリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシル酸（例えば、ｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸、３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、コハク酸）、グルクロン酸（glucoronic acid）、マンデル酸、ムチン酸、ニコチン酸、オロチン酸、パモ酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、カンホスルホン酸、エジシル酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、キシナホ酸（xinafoic acid）などの塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記塩は、酢酸塩である。追加的に、又は代替的に、いくつかの実施形態では、前記塩は、トリフルオロ酢酸塩である。
本明細書に記載の芳香族カチオン性ペプチドは、本明細書に記載の病気又は医学的状態への処置又は予防の必要な被験体への投与のために、単一で、又は組み合わせて、医薬組成物に組み込まれてもよい。このような組成物は、典型的には、有効薬剤、及び製薬上許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、用語「製薬上許容できる担体」には、製薬上の投与に適合する、食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、並びに、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。また、補助的な有効化合物を、前記組成物に組み込んでもよい。
典型的には、医薬組成物は、意図した投与の経路に適合するように処方される。投与の経路の例としては、非経口的投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、腹腔内投与、又は皮下投与）、経口投与、吸入投与、経皮投与（局所投与）、眼内投与、イオントフォレシス、及び経粘膜投与が挙げられる。非経口的、皮内、又は皮下用途に使用される溶液又は懸濁液としては、次のような成分：注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液又はリン酸緩衝液などの緩衝液、及び塩化ナトリウム又はブドウ糖などの張性の調整剤など、を含み得る。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの、酸又は塩基によって調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨ての注射器、又は複数回分の投与量のバイアル瓶に封入することもできる。患者／患畜又は処置を行う医師にとって便利なように、投与製剤は、処置のコース（例えば、７日間の処置）用の全ての必要な器具（例えば、薬物のバイアル瓶、希釈剤のバイアル瓶、注射器、及び針）を包含するキットとして、提供することもできる。
注射用途に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）若しくは懸濁液、又は、注射用滅菌溶液若しくは懸濁液を即座に調製するための滅菌粉末を挙げることができる。静脈内投与に対して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、非経口的投与のための組成物は、無菌でなければならず、容易に注射可能な範囲の流動性を有するべきである。非経口的投与のための組成物は、製造及び保存の条件下では安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。
前記芳香族カチオン性ペプチド組成物は、担体を含んでもよく、該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、懸濁液の場合においては、必要な粒径を維持することにより、及び、界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサール（thiomerasol）など）によって達成することができる。グルタチオン及び他の酸化防止剤が、酸化を防止するために含まれてもよい。多くの場合、前記組成物中には、例えば、糖類、ポリアルコール類（マンニトール、ソルビトールなど）、又は塩化ナトリウムなどの等張剤が含まれることが好ましいであろう。例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を前記組成物に含めることによって、注射用組成物の吸収を持続させることができる。
注射用滅菌溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分のうちの１つ、又はその組み合わせを含む適切な溶媒中に、必要な量の有効化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することにより、調製することができる。一般的には、懸濁液は、滅菌ビヒクル内へ有効化合物を組み込むことにより調製され、塩基性の分散媒と、上に列挙したもののうち、必要な他の成分とを含有する。注射用滅菌溶液の調製用の滅菌粉末の場合では、典型的な調製方法としては、真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられる。真空乾燥及び凍結乾燥では、任意の、所望の追加成分を加えた有効成分の粉末を、その濾過滅菌済溶液から、得ることができる。
一般的に、経口組成物は、不活性希釈剤、又は食用の担体を含む。経口治療での投与目的のために、有効化合物を賦形剤と組み合わせ、錠剤、トローチ、又はカプセル（例えば、ゼラチンカプセルなど）の形態で使用してもよい。また、経口組成物は、流動性の担体を使用して、口内洗剤として使用するために調製されてもよい。前記組成物の一部として、製薬上適合性の結合剤、及び／又はアジュバント物質が含まれてもよい。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどには、類似する性質の以下の成分又は化合物：微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などのグライダント（glidant）；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの香味料、を含有させることができる。
吸入による投与のために、前記化合物は、好適な噴射剤（例えば、二酸化炭素などの気体）を入れた加圧容器若しくは散布器、又はネブライザからのエアロゾルスプレーの形態で送達することもできる。このような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されているものが挙げられる。
また、本明細書に記載の治療用化合物の全身投与は、経粘膜的、又は経皮的な方法であってもよい。経粘膜投与又は経皮投与のために、製剤においては、透過すべき隔膜に対して適切な浸透剤が使用される。このような浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られており、経粘膜投与用途では、例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸の誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーを使用することによって達成することができる。経皮投与用途では、有効化合物は、当該技術分野で一般的に知られている軟膏、膏薬、ゲル又はクリームへと配合することができる。１実施形態では、経皮投与は、イオントフォレシスによって行われてもよい。
治療用ペプチドは、担体系の中に配合することもできる。担体は、コロイド系であってもよい。コロイド系は、リポソーム（リン脂質二重層によるビヒクル）であってもよい。１実施形態では、前記治療用ペプチドは、ペプチドの完全性を維持したまま、リポソーム内にカプセル化される。当業者には理解されるように、リポソームを調製する様々な方法が存在する。（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．，３３：３３７〜４６２（１９８８）、Ａｎｓｅｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照されたい）。リポソーム製剤は、クリアランスを遅延させ、細胞による取り込みを増加させることができる（Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３４（７〜８）：９１５〜９２３（２０００）を参照されたい）。また、有効薬剤は、製薬上許容できる成分から調製される粒子内に充填することもでき、該製薬上許容できる成分としては、可溶性の、非可溶性の、透過性の、非透過性の、生分解性の、又は胃保持性（gastroretentive）のポリマー又はリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。このような粒子としては、ナノ粒子、生分解性ナノ粒子、マイクロ粒子、生分解性マイクロ粒子、ナノスフェア、生分解性ナノスフェア、マイクロスフェア、生分解性マイクロスフェア、カプセル、エマルション、リポソーム、ミセル、及びウィルスベクター系などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、担体は、例えば、生分解性、生体適合性ポリマーマトリックスなどのポリマーであってもよい。１実施形態では、前記治療用ペプチドは、タンパク質の完全性を維持したまま、ポリマーマトリックス内に埋め込むことができる。このポリマーは、ポリペプチド、タンパク質、又は多糖などの天然のものであってもよいし、ポリα−ヒドロキシ酸などの合成されたものであってもよい。例としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、及びそれらの組み合わせにより製造された担体が挙げられる。１実施形態では、前記ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又は乳酸／グリコール酸コポリマー（ＰＧＬＡ）である。ポリマーマトリックスは、マイクロスフェア、及びナノスフェアなどの様々な形態及びサイズで調製又は単離できる。ポリマー製剤により、治療効果の持続期間を延ばすことができる（Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３４（７〜８）：９１５〜９２３（２０００）を参照されたい）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のためのポリマー製剤は、臨床試験において使用されている。（Ｋｏｚａｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｉｃｈ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：５４８〜５５２（１９９８）を参照されたい）。
ポリマー製のマイクロスフェア持続放出製剤の例は、国際公開第９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，６７４，５３４号及び第５，７１６，６４４号（共にＺａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第９６／４００７３（Ｚａｌｅ ｅｔ ａｌ．）、及び国際公開第００／３８６５１（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号及び第５，７１６，６４４号及び国際公開第９６／４００７３号には、塩による凝集に対して安定なエリスロポエチンの粒子を含有する、ポリマーマトリックスが記載されている。
いくつかの実施形態では、前記治療用化合物は、体内からすぐに排出されてしまうことから前記治療用化合物を保護する担体を用いて調製される（インプラント及びマイクロカプセル化送達システムなどを含む放出制御製剤など）。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸（polylacetic acid）などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤は、既知の手法を使用して調製することができる。また、材料を、例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃなどから、購入することもできる。また、リポソーム懸濁液（細胞特異的な抗原に対するモノクローナル抗体を有する、特定の細胞に標的化されたリポソームを含む）を、製薬上許容できる担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者にとって既知の方法に従って調製することができる。
また、前記治療用化合物は、細胞内送達を強化するために処方することもできる。例えば、リポソーム送達系は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｃｈｏｎｎ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，「Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：６９８〜７０８（１９９５）、Ｗｅｉｎｅｒ，「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４（３）：２０１〜９（１９９４）、及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３（１２）：５２７〜３７（１９９５）を参照されたい）。Ｍｉｚｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，１００：６３〜６９（１９９６）は、インビボ及びインビトロの両方で、細胞に対して、タンパク質を送達するための膜融合性リポソームの使用について記載している。
この治療用薬剤の投与量、毒性、及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死である投与量）、及びＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的効果のある投与量）を決定するための細胞培養又は実験動物での標準的な製薬上の手法によって、決定することができる。毒性効果と治療効果との間の投与量の比率が、治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比率として表現することができる。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することは可能ではあるが、感染していない細胞への損傷の可能性を最小化することによって副作用を減少させるために、そのような化合物が患部組織部位を標的とするような送達システムを設計するように、配慮すべきである。
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを、ヒトにおける使用での投与量の範囲の策定に使用してもよい。好ましくは、このような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか、又は毒性がない、ＥＤ５０を含む、循環濃度範囲内にある。投与量は、用いる投与法、及び利用する投与の経路に応じて、この範囲内で変化させてよい。前記方法において使用される任意の化合物に対して、治療上効果的な投与量を、初めは細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されたＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、策定することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定するために使用できる。血漿における濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
典型的には、治療又は予防効果を達成するために十分な前記芳香族カチオン性ペプチドの有効量は、１日に体重１キログラム当たり約０．０００００１ｍｇ〜１日に体重１キログラム当たり約１０，０００ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態では、投与量の範囲は、１日に体重１キログラム当たり約０．０００１ｍｇ〜１日に体重１キログラム当たり約１００ｍｇである。例えば、投与量は、１日毎、２日毎、若しくは３日毎に、１ｍｇ／ｋｇ体重、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であってよく、又は、１週毎、２週毎、若しくは３週毎に１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってよい。１実施形態では、ペプチドの一回の投与量は、体重１ｋｇ当たり０．１〜１０，０００マイクログラムの範囲である。１実施形態では、担体中の芳香族カチオン性ペプチド濃度は、送達される１ミリリットル当たり０．２〜２０００マイクログラムの範囲である。ある例示的な処置レジメンでは、１日当たり１回又は１週当たり１回の投与が伴う。治療用途においては、病気の進行が遅くなるか、停止するまでに、及び、好ましくは被験体が、病気の症状の部分的又は完全な改善を示すまでに、比較的短い間隔で、比較的多い投与量が必要とされることがある。その後は、患者／患畜には予防的なレジメンが適用される。
いくつかの実施形態では、芳香族カチオン性ペプチドの治療上の有効量は、標的組織において、１０-11〜１０-6モル（例えば、およそ１０-7モル）のペプチド濃度として定義することができる。この濃度を、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの全身投与量によって送達してもよいし、体表面積における投与当量によって送達してもよい。投与スケジュールは、標的組織において、治療濃度を維持するために最適化されてよく、最も好ましくは１日毎又は１週毎に１回の投与であるが、連続的な投与（例えば、非経口的な注入又は経皮適用など）も含まれる。
当業者であれば、特定の因子が、被験体に効果的な処置を行うのに必要な投与量及び時期に影響し得ることを理解するであろう。特定の因子としては、病気又は障害の重篤度、治療歴、被験体の全般的な健康状態及び／又は年齢、並びに他の病気の有無などがあるが、これらに限定されない。更に、治療上有効量の本明細書に記載の治療用組成物を用いた被験体への処置には、一回の処置、又は連続的な複数の処置が含まれてよい。
本発明の方法に従って処置が行われる哺乳動物は、例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びウマなどの家畜、イヌ及びネコなどのペット動物、例えば、ラット、マウス及びウサギなどの実験動物を含む、任意の哺乳動物であってよい。好適な実施形態では、哺乳動物はヒトである。
ペプチド合成
芳香族カチオン性ペプチドは、次の一般的な方法に従って、合成することができる。固相ペプチド合成法が使用され、全てのアミノ酸誘導体は、市販されているものである。ペプチド構築の終了後、ペプチドを、通常の方法により樹脂から切断する。粗ペプチドは、分取逆相クロマトグラフィーによって精製される。ペプチドの構造同一性は、ＦＡＢ法による質量分析によって確認され、ペプチドの純度は、３つの異なる系における分析的な逆相ＨＰＬＣ、及び薄層クロマトグラフィーによって分析される。＞９８％の純度が、達成される。典型的には、５ｇの樹脂を使用した合成の実行により、約２．０〜２．３ｇの純粋なペプチドが得られる。
本発明を、次の実施例によって例示するが、これらの実施例は、いかようにも、限定的なものとして解釈されてはならない。これらの方法は、本明細書に開示するペプチド類のいずれを使用して行われてもよいこと、及び以下に記載する例示的なペプチドを限定するものではないことが、理解される。
シトクロムｃ及びミトコンドリアを単離する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ １１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９７０，Ｐａｇｅｓ ２２７１〜２２８０、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ，２７２２０ Ｔｕｒｎｂｅｒｒｙ Ｌａｎｅ，Ｓｕｉｔｅ ２００ Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ ９１３５５を参照されたい）。
実施例１．ペプチド実施例１ Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）の使用方法
Ａ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃ還元を促進する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2がｃｙｔ ｃ還元を変化させるかどうかを判定するために、吸光分光法（ＵｌｔｒｏＳｐｅｃ ３３００ Ｐｒｏ；２２０〜１１００ｎｍ）が使用される。グルタチオンによるｃｙｔ ｃの還元は、５５０ｎｍにおいて著しいシフトを伴う、Ｑ帯（４５０〜６５０ｎｍ）における複数のシフトに関連する。Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の添加により、５５０ｎｍにおいて、顕著なスペクトル上のウェイトシフトが生じるものと予想される。時間依存の分光法により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃ還元の速度を増加させることが示される。これらのデータから、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃの電子構造を変化させ、Ｆｅ3+のＦｅ2+ヘムへの還元を強化することが実証される。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃ還元を増加させるために有用である。
Ｂ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃを通じた電子拡散を強化する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、電子流、及び／又はｃｙｔ ｃの還元電位／酸化電位を変化させるかどうかを判定するために、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）が行われる。ＣＶは、Ａｕ製の作用電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ製の参照電極、及びＰｔ製の補助電極を使用して行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ｃｙｔ ｃの還元プロセスと酸化プロセスの両方に対して、電流を増加させるものと予想される。Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、還元電位／酸化電位を変化させないが、ｃｙｔ ｃを通じた電子流を増加させ、これにより、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、錯体ＩＩＩ〜ＩＶ間の抵抗性を減少させることが示されることが予想される。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃを通じた電子拡散を強化するために有用である。
Ｃ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃの電子容量を拡大する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の、ｃｙｔ ｃのヘムの伝導帯（電子輸送に関与するエネルギー状態）の電子構造への影響を調べるため、フォトルミネセンス（ＰＬ）が行われる。Ｎｄ：ＹＤＯ４レーザ（５３２．８ｎｍ）を使用して、ｃｙｔ ｃの電子を励起する。ｃｙｔ ｃ状態において、６５０ｎｍでの強いＰＬ発光が、明確に示されることが予想される。ＰＬ強度は、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の添加により、投与量依存で増加することが予想され、これは、ｃｙｔ ｃの伝導帯において利用可能な電子状態が増加したことを意味する。この結果により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃの伝導帯の電子容量を増加させることが示され、これは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2媒介性のｃｙｔ ｃを通じた電流の増加と一致する。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃの電子容量を拡大するために有用である。
Ｄ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃヘム周囲で、新規なπ−π相互作用を誘導する。
ｃｙｔ ｃにおけるπ−π*ヘム環境に対する探針として、ソーレー帯（４１５ｎｍでの負のピーク）をモニタリングするために、円偏光二色性測定（Ｏｌｉｓ分光偏光計、ＤＳＭ２０）が行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、このピークの４４０ｎｍへの「レッド」シフトを促進することが予想され、これにより、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃ内において、変性なしに、新規なヘム−チロシンπ−π*遷移を誘導することが示される。この結果により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ヘムへの電子トンネル効果のために更なるＴｙｒを提供すること、又は内在性Ｔｙｒ残基とヘムとの間の距離を短くすることのどちらかによって、ヘム付近の環境を改変することが示される。ヘム周囲でのπ−π*相互作用の増加は、電子拡散のために好ましいと考えられる、電子トンネル効果を強化するであろう。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃ周囲でπ−π相互作用を誘導するために有用である。
Ｅ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ミトコンドリアのＯ2消費を増加させる。
単離したラット腎ミトコンドリアの酸素消費を、Ｏｘｙｇｒａｐｈを使用して測定する。呼吸速度は、異なる濃度のＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の存在下で、状態２（４００μＭのＡＤＰのみ）、状態３（４００μＭのＡＤＰと５００μＭの基質）及び状態４（基質のみ）において、測定される。実験は全て、ｎ＝４〜７にて、３度行われる。結果から、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ミトコンドリアを脱共役することなく酸素への電子伝達を促進することが示されることが予想される。
Ｆ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、単離したミトコンドリアにおいてＡＴＰ合成を増加させる。
ミトコンドリアのＡＴＰ合成の速度は、４００ｍＭのＡＤＰの添加の１分後に単離したミトコンドリアから回収した呼吸緩衝液中のＡＴＰを測定することによって決定される。ＡＴＰは、ＨＰＬＣによって分析される。実験は全て、ｎ＝３にて、３度行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を単離したミトコンドリアに添加することにより、ＡＴＰ合成の速度が投与量依存で増加することが予想される。この結果は、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による電子伝達の強化が、ＡＴＰ合成と関連していることを示すものであろう。
Ｇ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃ欠乏マイトプラストでの呼吸を強化する。
ミトコンドリア呼吸での、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の作用におけるｃｙｔ ｃの働きを実証するために、Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の、ミトコンドリアのＯ2消費への影響が、一度冷凍したラット腎ミトコンドリアから作製したｃｙｔ ｃ欠乏マイトプラストにおいて測定される。１００μＭのＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含む、又は含まない５００μＭのスクシナートの存在下で、呼吸速度を測定する。実験は、ｎ＝３にて、３度行われる。データからは、１）Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ＩＭＭに緊密に結合したｃｙｔ ｃを介して働くこと、２）Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、機能性ｃｙｔ ｃの減少を回復できることが示されることが予想される。
実施例２．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の使用方法
Ａ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃ還元を促進する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2がｃｙｔ ｃ還元を変化させるかどうかを判定するために、吸光分光法（ＵｌｔｒｏＳｐｅｃ ３３００ Ｐｒｏ；２２０〜１１００ｎｍ）が使用される。グルタチオンによるｃｙｔ ｃの還元は、５５０ｎｍにおいて著しいシフトを伴う、Ｑ帯（４５０〜６５０ｎｍ）における複数のシフトに関連する。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の添加により、５５０ｎｍにおいて、顕著なスペクトル上のウェイトシフトが生じるものと予想される。時間依存の分光法により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃ還元の速度を増加させることが示される。これらのデータから、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃの電子構造を変化させ、Ｆｅ３＋のＦｅ２＋ヘムへの還元を強化することが実証される。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃ還元を増加させるために有用である。
Ｂ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃを通じた電子拡散を強化する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、電子流、及び／又はｃｙｔ ｃの還元電位／酸化電位を変化させるかどうかを判定するために、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）が行われる。ＣＶは、Ａｕ製の作用電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ製の参照電極、及びＰｔ製の補助電極を使用して行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ｃｙｔ ｃの還元プロセスと酸化プロセスの両方に対して、電流を増加させるものと予想される。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、還元電位／酸化電位を変化させないが、ｃｙｔ ｃを通じた電子流を増加させ、これにより、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、錯体ＩＩＩ〜ＩＶ間の抵抗性を減少させることが示されることが予想される。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃを通じた電子拡散を強化するために有用である。
Ｃ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃの電子容量を拡大する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の、ｃｙｔ ｃのヘムの伝導帯（電子輸送に関与するエネルギー状態）の電子構造への影響を調べるため、フォトルミネセンス（ＰＬ）が行われる。Ｎｄ：ＹＤＯ４レーザ（５３２．８ｎｍ）を使用して、ｃｙｔ ｃの電子を励起する。ｃｙｔ ｃ状態において、６５０ｎｍでの強いＰＬ発光が、明確に示されることが予想される。ＰＬ強度は、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の添加により、投与量依存で増加することが予想され、これは、ｃｙｔ ｃの伝導帯において利用可能な電子状態が増加したことを意味する。この結果により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃの伝導帯の電子容量を増加させることが示され、これは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2媒介性のｃｙｔ ｃを通じた電流の増加と一致する。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃの電子容量を拡大するために有用である。
Ｄ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃヘム周囲で、新規なπ−π相互作用を誘導する。
ｃｙｔ ｃにおけるπ−π*ヘム環境に対する探針として、ソーレー帯（４１５ｎｍでの負のピーク）をモニタリングするために、円偏光二色性測定（Ｏｌｉｓ分光偏光計、ＤＳＭ２０）が行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、このピークの４４０ｎｍへの「レッド」シフトを促進することが予想され、これにより、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃ内において、変性なしに、新規なヘム−チロシンπ−π*遷移を誘導することが示される。この結果により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ヘムへの電子トンネル効果のために更なるＴｙｒを提供すること、又は内在性Ｔｙｒ残基とヘムとの間の距離を短くすることのどちらかによって、ヘム付近の環境を改変することが示される。ヘム周囲でのπ−π*相互作用の増加は、電子拡散のために好ましいと考えられる、電子トンネル効果を強化するであろう。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃ周囲でπ−π相互作用を誘導するために有用である。
Ｅ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ミトコンドリアのＯ2消費を増加させる。
単離したラット腎ミトコンドリアの酸素消費を、Ｏｘｙｇｒａｐｈを使用して測定する。呼吸速度は、異なる濃度のＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の存在下で、状態２（４００μＭのＡＤＰのみ）、状態３（４００μＭのＡＤＰと５００μＭの基質）及び状態４（基質のみ）において、測定される。実験は全て、ｎ＝４〜７にて、３度行われる。結果から、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ミトコンドリアを脱共役することなく酸素への電子伝達を促進することが示されることが予想される。
Ｆ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、単離したミトコンドリアにおいてＡＴＰ合成を増加させる。
ミトコンドリアのＡＴＰ合成の速度は、４００ｍＭのＡＤＰの添加の１分後に単離したミトコンドリアから回収した呼吸緩衝液中のＡＴＰを測定することによって決定される。ＡＴＰは、ＨＰＬＣによって分析される。実験は全て、ｎ＝３にて、３度行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を単離したミトコンドリアに添加することにより、ＡＴＰ合成の速度が投与量依存で増加することが予想される。この結果は、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による電子伝達の強化が、ＡＴＰ合成と関連していることを示すものであろう。
Ｇ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃ欠乏マイトプラストでの呼吸を強化する。
ミトコンドリア呼吸での、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の作用におけるｃｙｔ ｃの働きを実証するために、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の、ミトコンドリアのＯ2消費への影響が、一度冷凍したラット腎ミトコンドリアから作製したｃｙｔ ｃ欠乏マイトプラストにおいて測定される。１００μＭのＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含む、又は含まない５００μＭのスクシナートの存在下で、呼吸速度を測定する。実験は、ｎ＝３にて、３度行われる。このデータからは、１）Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ＩＭＭに緊密に結合したｃｙｔ ｃを介して働くこと、２）Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、機能性ｃｙｔ ｃの減少を回復できることが示されることが予想される。
実施例３．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2.（Ｐ−２３１−Ｄ）の使用方法
Ａ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃ還元を促進する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2がｃｙｔ ｃ還元を変化させるかどうかを判定するために、吸光分光法（ＵｌｔｒｏＳｐｅｃ ３３００ Ｐｒｏ；２２０〜１１００ｎｍ）が使用される。グルタチオンによるｃｙｔ ｃの還元は、５５０ｎｍにおいて著しいシフトを伴う、Ｑ帯（４５０〜６５０ｎｍ）における複数のシフトに関連する。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の添加により、５５０ｎｍにおいて、顕著なスペクトル上のウェイトシフトが生じるものと予想される。時間依存の分光法により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃ還元の速度を増加させることが示される。これらのデータから、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃの電子構造を変化させ、Ｆｅ３＋のＦｅ２＋ヘムへの還元を強化することが実証される。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃ還元を増加させるために有用である。
Ｂ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃを通じた電子拡散を強化する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、電子流、及び／又はｃｙｔ ｃの還元電位／酸化電位を変化させるかどうかを判定するために、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）が行われる。ＣＶは、Ａｕ製の作用電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ製の参照電極、及びＰｔ製の補助電極を使用して行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ｃｙｔ ｃの還元プロセスと酸化プロセスの両方に対して、電流を増加させるものと予想される。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、還元電位／酸化電位を変化させないが、ｃｙｔ ｃを通じた電子流を増加させ、これにより、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、錯体ＩＩＩ〜ＩＶ間の抵抗性を減少させることが示されることが予想される。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃを通じた電子拡散を強化するために有用である。
Ｃ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃの電子容量を拡大する。
Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の、ｃｙｔ ｃのヘムの伝導帯（電子輸送に関与するエネルギー状態）の電子構造への影響を調べるため、フォトルミネセンス（ＰＬ）が行われる。Ｎｄ：ＹＤＯ４レーザ（５３２．８ｎｍ）を使用して、ｃｙｔ ｃの電子を励起する。ｃｙｔ ｃ状態において、６５０ｎｍでの強いＰＬ発光が、明確に示されることが予想される。ＰＬ強度は、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の添加により、投与量依存で増加することが予想され、これは、ｃｙｔ ｃの伝導帯において利用可能な電子状態が増加したことを意味する。この結果により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃの伝導帯の電子容量を増加させることが示され、これは、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2媒介性のｃｙｔ ｃを通じた電流の増加と一致する。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃの電子容量を拡大するために有用である。
Ｄ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃヘム周囲で、新規なπ−π相互作用を誘導する。
ｃｙｔ ｃにおけるπ−π*ヘム環境に対する探針として、ソーレー帯（４１５ｎｍでの負のピーク）をモニタリングするために、円偏光二色性測定（Ｏｌｉｓ分光偏光計、ＤＳＭ２０）が行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、このピークの４４０ｎｍへの「レッド」シフトを促進することが予想され、これにより、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ｃｙｔ ｃ内において、変性なしに、新規なヘム−チロシンπ−π*遷移を誘導することが示される。この結果により、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ヘムへの電子トンネル効果のために更なるＴｙｒを提供すること、又は内在性Ｔｙｒ残基とヘムとの間の距離を短くすることのどちらかによって、ヘム付近の環境を改変することが示される。ヘム周囲でのπ−π*相互作用の増加は、電子拡散のために好ましいと考えられる、電子トンネル効果を強化するであろう。それ故、本明細書に開示するペプチドは、シトクロムｃ周囲でπ−π相互作用を誘導するために有用である。
Ｅ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ミトコンドリアのＯ2消費を増加させる。
単離したラット腎ミトコンドリアの酸素消費を、Ｏｘｙｇｒａｐｈを使用して測定する。呼吸速度は、異なる濃度のＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の存在下で、状態２（４００μＭのＡＤＰのみ）、状態３（４００μＭのＡＤＰと５００μＭの基質）及び状態４（基質のみ）において、測定される。実験は全て、ｎ＝４〜７にて、３度行われる。結果から、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ミトコンドリアを脱共役することなく酸素への電子伝達を促進することが示されることが予想される。
Ｆ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、単離したミトコンドリアにおいてＡＴＰ合成を増加させる。
ミトコンドリアのＡＴＰ合成の速度は、４００ｍＭのＡＤＰの添加の１分後に単離したミトコンドリアから回収した呼吸緩衝液中のＡＴＰを測定することによって決定される。ＡＴＰは、ＨＰＬＣによって分析される。実験は全て、ｎ＝３にて、３度行われる。Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を単離したミトコンドリアに添加することにより、ＡＴＰ合成の速度が投与量依存で増加することが予想される。この結果は、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による電子伝達の強化が、ＡＴＰ合成と関連していることを示すものであろう。
Ｇ．ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、シトクロムｃ欠乏マイトプラストでの呼吸を強化する。
ミトコンドリア呼吸での、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の作用におけるｃｙｔ ｃの働きを実証するために、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の、ミトコンドリアのＯ2消費への影響が、一度冷凍したラット腎ミトコンドリアから作製したｃｙｔ ｃ欠乏マイトプラストにおいて測定される。１００μＭのＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含む、又は含まない５００μＭのスクシナートの存在下で、呼吸速度を測定する。実験は、ｎ＝３にて、３度行われる。このデータからは、１）Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ＩＭＭに緊密に結合したｃｙｔ ｃを介して働くこと、２）Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、機能性ｃｙｔ ｃの減少を回復できることが示されることが予想される。

Claims (7)

  1. ペプチド配列Ｄ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）を含む、芳香族カチオン性ペプチド。
  2. ペプチド配列Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）を含む、芳香族カチオン性ペプチド。
  3. ペプチド配列Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を含む、芳香族カチオン性ペプチド。
  4. シトクロムｃを含有する試料中において、シトクロムｃ還元を増加させる方法であって、該試料を有効量の芳香族カチオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）、又はＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2のうちの１つ以上と接触させることを含む、方法。
  5. シトクロムｃを含有する試料中において、シトクロムｃを通じた電子拡散を強化する方法であって、該試料を有効量の芳香族カチオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）、又はＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2のうちの１つ以上と接触させることを含む、方法。
  6. シトクロムｃを含有する試料中において、シトクロムｃの電子容量を拡大する方法であって、該試料を有効量の芳香族カチオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）、又はＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2のうちの１つ以上と接触させることを含む、方法。
  7. シトクロムｃを含有する試料中において、シトクロムｃ周囲のπ−π相互作用を誘導する方法であって、該試料を有効量の芳香族カチオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１）、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（Ｐ−２３１Ｄ）、又はＤ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｄｍｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＨ2のうちの１つ以上と接触させることを含む、方法。
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