JP2015501148A - 芳香族カチオン性ペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2011年10月17日出願の米国特許仮出願第61/548,114号への優先権を主張し、その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本技術は、一般に、電子輸送および電気伝導に使用するための芳香族カチオン性ペプチド組成物および方法に関する。
一態様において、本技術は、芳香族カチオン性ペプチド、またはその医薬的に許容可能な塩、例えば酢酸塩もしくはトリフルオロ酢酸塩を提供する。一部の実施形態において、該ペプチドは、
1.少なくとも1の正味正電荷;
2.最小で3のアミノ酸;
3.最大で約20のアミノ酸;
4.正味正電荷の最小数(pm)とアミノ酸残基の総数(r)との間の、3pmがr+1以下の最大数となる関係;
5.芳香族基の最小数(a)と正味正電荷の総数(pt)との間の、aが1でありptも1になり得る場合を除き、2aがpt+1以下の最大数となる関係、
を含む。
のうちの1種以上を含む。
(i)水素;
(ii)直鎖状または分枝状C1−C6アルキル;
(iii)
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は、それぞれ独立して、
(i)水素;
(ii)直鎖状または分枝状C1−C6アルキル;
(iii)C1−C6アルコキシ;
(iv)アミノ;
(v)C1−C4アルキルアミノ;
(vi)C1−C4ジアルキルアミノ;
(vii)ニトロ;
(viii)ヒドロキシル;
(ix)ハロゲン(ここで「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを包含する)、
から選択され、
nは、1〜5の整数である)
により定義される。
(i)水素;
(ii)直鎖状または分枝状C1−C6アルキル;
(iii)
(i)水素;
(ii)直鎖状または分枝状C1−C6アルキル;
(iii)C1−C6アルコキシ;
(iv)アミノ;
(v)C1−C4アルキルアミノ;
(vi)C1−C4ジアルキルアミノ;
(vii)ニトロ;
(viii)ヒドロキシル;
(ix)ハロゲン(ここで「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを包含する)、
から選択され;
R5、R6、R7、R8、およびR9は、それぞれ独立して、
(i)水素;
(ii)直鎖状または分枝状C1−C6アルキル;
(iii)C1−C6アルコキシ;
(iv)アミノ;
(v)C1−C4アルキルアミノ;
(vi)C1−C4ジアルキルアミノ;
(vii)ニトロ;
(viii)ヒドロキシル;
(ix)ハロゲン(ここで「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを包含する)、
から選択され;
nは、1〜5の整数である)
により定義される。
芳香族−カチオン性−芳香族−カチオン性(式III)
カチオン性−芳香族−カチオン性−芳香族(式IV)
芳香族−芳香族−カチオン性−カチオン性(式V)
カチオン性−カチオン性−芳香族−芳香族(式VI)
(式中、芳香族は、Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)、およびシクロヘキシルアラニン(Cha)からなる群より選択される残基であり;カチオン性は、Arg(R)、Lys(K)、ノルロイシン(Nle)、および2−アミノ−ヘプタン酸(Ahe)からなる群より選択される残基である)。
本技術は、芳香族カチオン性ペプチドの使用に関する。一部の実施形態において、該ペプチドは、導電率に関する態様において有用である。
1.少なくとも1の正味正電荷;
2.最小で3のアミノ酸;
3.最大で約20のアミノ酸;
4.正味正電荷の最小数(pm)とアミノ酸残基の総数(r)との間の、3pmがr+1以下の最大数となる関係;
5.芳香族基の最小数(a)と正味正電荷の総数(pt)との間の、aが1でありptも1になり得る場合を除き、2aがpt+1以下の最大数となる関係、
を有する。
少なくとも1の正味正電荷;
最小で3のアミノ酸;
最大で約20のアミノ酸;
正味正電荷の最小数(pm)とアミノ酸残基の総数(r)との間の、3pmがr+1以下の最大数となる関係;
芳香族基の最小数(a)と正味正電荷の総数(pt)との間の、aが1でありptも1になり得る場合を除き、2aがpt+1以下の最大数となる関係、
を有する、芳香族カチオン性ペプチドの有効量を摘出臓器に投与することを含む。
少なくとも1の正味正電荷;
最小で3のアミノ酸;
最大で約20のアミノ酸;
正味正電荷の最小数(pm)とアミノ酸残基の総数(r)との間の、3pmがr+1以下の最大数となる関係;
芳香族基の最小数(a)と正味正電荷の総数(pt)との間の、aが1でありptも1になり得る場合を除き、3aがpt+1以下の最大数となる関係、
を有する、芳香族カチオン性ペプチドの有効量を哺乳動物に投与することを含む。
が挙げられる。
(a)非極性アミノ酸:Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G)Cys(C);
(b)酸性アミノ酸:Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q);
(c)塩基性アミノ酸:His(H)Arg(R)Lys(K);
(d)疎水性アミノ酸:Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V);および
(e)芳香族アミノ酸:Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H)。
ペプチドは、当該技術分野で周知の方法のいずれにより合成されてもよい。蛋白質を化学合成するための適切な方法としては、例えばSolid Phase Peptide Synthesis,Second Edition,Pierce Chemical Company(1984)およびMethods Enzymol.,289,Academic Press,Inc,New York(1997)において、StuartおよびYoungにより記載されたものが挙げられる。
カルジオリピンは、ミトコンドリア内膜の重要成分であり、該脂質組成物全体の約20%を構成する。哺乳動物細胞において、カルジオリピンは、ほぼ独占的にミトコンドリア内膜中に見出され、ミトコンドリア代謝に関与する酵素の最適な機能に不可欠である。
本明細書に記載の芳香族カチオン性ペプチドは、疾患の予防または処置に有用である。具体的に本開示では、本明細書に記載の芳香族カチオン性ペプチドを投与することによる、疾患のリスクがある(あるいは罹患し易い)対象を処置する予防的および治療的方法の両方を提供する。したがって本発明の方法は、必要とする対象に芳香族カチオン性ペプチドの有効量を投与することにより、対象における疾患の予防および/または処置を提供する。
細胞、臓器、または組織をペプチドと接触させるための当業者に公知の任意方法を、適用することができる。適切な方法としては、インビトロ、エクスビボ、またはインビボの方法が挙げられる。インビボ法として、典型的には哺乳類、適切にはヒトへの、先に記載された芳香族カチオン性ペプチドの投与が挙げられる。治療のためにインビボで使用される場合、芳香族カチオン性ペプチドは、有効量(即ち、所望の治療効果を有する量)で対象に投与される。用量および投薬レジメンは、対象の傷害の程度、使用される特定の芳香族カチオン性ペプチドの特性、例えば治療指数、対象、および対象の病歴に依存する。
ミトコンドリアATP合成は、ミトコンドリア内膜(IMM)の電子伝達系(ETC)を介した電子流動により誘導される。伝達系を通る電子流動は、一連の酸化/還元工程として説明することができる。電子は、電子供与体(NADHまたはQH2)から一連の電子受容体(複合体I〜IV)を通り、最終的に末端の電子受容体である酸素分子に至る。シトクロムc(cyt c)は、IMMに緩く会合しており、複合体IIIとIVの間で電子を移動させる。
実施例に示すように、試料中の本明細書に開示の芳香族カチオン性ペプチド、例えばアミノ酸配列Tyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)またはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)を含むペプチドの濃度を変動させることで、cyt cの電気的性質およびフォトルミネッセンス性が変化する。具体的にはcyt cに対して芳香族カチオン性ペプチド濃度を増加させることで、導電率およびフォトルミネッセンスの効率を増加させる。芳香族カチオン性ペプチド濃度の適切な範囲としては、限定するものではないが0〜500mM;0〜100mM;0〜500μm;0〜250μm;および0〜100μmが挙げられる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
図8は、本明細書に開示のペプチドのいずれか、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)またはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)が単独で、またはカルジオリピンと共にドープされたcyt cの層110の導電率(抵抗)の変動を測定することにより、検査基板130のpHおよび/または温度の変化を検出する例示的センサー100を示す。一部の実施形態において、cyt c層は、カルジオリピンがドープされている。基板130の温度および/またはpHが変化すると、芳香族カチオン性ペプチド、カルジオリピン、またはペプチドとカルジオリピンとが、ドープされたcyt c層110内に、またはそこから拡散し、その一方でドープされたcyt c層110の導電率を変化させる。計量器120は、アノード122およびカソード124を通してcyt c層110に電位(電圧)を印加することにより、導電率の変動を測定する。導電率が上昇すると、アノード122とカソード124の間を流れる電流が増加する。導電率が低下すると、アノード122とカソード124の間を流れる電流が減少する。別のセンサーが、より感度の高い抵抗測定のための追加的電気端子(即ち、アノードおよびカソード)を含んでいてもよい。例えば別のセンサーが、抵抗のケルビン検知測定のための4つの電気端子を含んでいてもよい。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
さらに、カルジオリピンがドープされた、カルジオリピン/ペプチドがドープされた、またはペプチドがドープされたcyt cのセンサーを、マイクロフルイディクスおよびオプトフルイディックデバイスにおいて用いて、例えばハイブリッド生物学的/化学的/電子的プロセッサにおいて使用するために圧力、温度、pH、印加電界などの変動を電流および/または電圧に変換することができる。それらは、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2009/0201497号、同第2010/0060875号、および同第2011/0039730号に記載されるようなマイクロフルイディクスおよびオプトフルイディックデバイスにおいて用いることもできる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
芳香族カチオン性ペプチドとカルジオリピン、または芳香族カチオン性ペプチド、またはカルジオリピンがドープされたcyt cは、図10に示すように電気的または光学スイッチ、例えばスイッチ210として、またはそれらの内部で使用することもできる。スイッチ201は、導管221およびチャネル210を介してcyt cまたはドープされたcyt c110と流体連通している、カルジオリピン、芳香族カチオン性ペプチド200とカルジオリピン、または芳香族カチオン性ペプチド200、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)またはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)を受けるリザーバ220を含む。操作の際、導管221を開けて、カルジオリピン、またはペプチド200、またはペプチドとカルジオリピンを方向212でチャネル210に流す。チャネル210とcyt c130の間の境界を横断する温度および/またはpH勾配を生成することにより、スイッチ201を作動させる。勾配の方向に応じて、カルジオリピン、またはペプチド200、またはペプチドとカルジオリピンとが、cyt c130内へ、またはそこから拡散して、導電率およびフォトルミネッセンス性を先に記載された通り変化させる。ペプチドまたはカルジオリピン濃度の増減による導電率の変化を利用して、アノード222とカソード224の間の電流を調節することができる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
cyt cおよび/または本明細書に開示のカルジオリピン、芳香族カチオン性ペプチド、もしくはカルジオリピンと芳香族カチオン性ペプチド、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)がドープされたcyt cに基づくトランジスタは、デジタル計算において使用される情報を保存するスタティックまたはダイナミックランダムアクセスメモリー(RAM)などのメモリーを実行するために用いることもできる。より良く理解される通り、6個のトランジスタを一緒に連結して、周期的な再生を必要とせずに1ビットの情報を保存するスタティックRAM(SRAM)セルを形成することができる。cyt cおよび/またはカルジオリピン、もしくは芳香族カチオン性ペプチド、もしくはカルジオリピンと芳香族カチオン性ペプチドがドープされたcyt cに基づくトランジスタは、デジタル計算のためのダイナミックランダムアクセスメモリー(DRAM)などの他のタイプのメモリーを実行するのに用いることもできる。より良く理解される通り、RAMを用いて、先に記載されたような適用例でデジタル計算を実行することができる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
cyt c、および/あるいはは本明細書に開示のカルジオリピン、または芳香族カチオン性ペプチド、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくは D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)、またはカルジオリピンとペプチドがドープされたcyt cを用いて、コンピュータチップ上のより安価なデジタルでディスプレイおよび高速スイッチング光源を提供し得る有機発光トランジスタ(OLET)を作製することができる。OLETに基づく光源は、ダイオードよりもかなり迅速に切り替わり、平面設計であるためコンピュータチップ上により容易に集積することができ、銅製ワイヤーよりも急速にチップを隔てたデータ変換を与える。効率をより高める鍵は、互いの最上部に薄層を積層させた三層構造である。電流が、最上層と最下層を通り水平に流れ(一方は電子を、他方は正孔を担い)、中心層に流れるキャリアが再結合して、光子を放出する。チャネル内の接合領域の位置は、ゲートおよびドレインの電圧に依存するため、発光領域は調整することができる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
cyt c、および/あるいはカルジオリピン、または本明細書に開示の芳香族カチオン性ペプチド、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)、またはカルジオリピンとペプチドがドープされたcyt cを、有機発光ダイオード(OLED)およびエレクトロルミネッセンスディスプレイにおいて用いることができる。OLEDは、様々な消費者向け製品、例えば腕時計、電話、ラップトップコンピューター、ポケットベル、携帯電話、デジタルビデオカメラ,DVDプレーヤ、および計算機において有用である。OLEDを含むディスプレイは、従来の液晶ディスプレイ(LCD)を超える数多くの利点を有する。OLEDに基づくディスプレイは、バックライトを必要としないため、深黒レベルを表示することができ、広角であっても比較的高いコントラスト比を実現することができる。それらは、電力消費の大きなバックライトを必要とするLCDよりも、薄く効率的で明るくなることもできる。これらの特色を組み合わせた結果、OLEDは、LCDディスプレイよりも軽量で、小さな空間を取り込む。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
cyt c活性層中の芳香族カチオン性ペプチド、カルジオリピン、またはペプチドとカルジオリピンの濃度レベルは、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,897,429号に記載され図18および19の太陽光電池内に示すように、空間および/または時間の関数として変動させて、異なるエネルギーギャップの2つの半導体材料の界面であるヘテロ接合を提供してもよい。芳香族カチオン性ペプチド濃度の適切な範囲としては、限定するものではないが、0〜500mM;0〜100mM;0〜500μM;0〜250μM;および0〜100μMが挙げられる。カルジオリピン濃度の適切な範囲としては、限定するものではないが、0〜500mM;0〜100mM;0〜500μM;0〜250μM;および0〜100μMが挙げられる。例えばヘテロ接合を利用して、OLEDおよび他のデバイス内での発光を増強するために複数の量子井戸構造を作製することができる。有機ヘテロ接合は、p型およびn型の薄い結晶フィルムの活性層で構築された有機ヘテロ接合トランジスタで高導電率であることが発見された後、ますます注目を集めてきた。無機ヘテロ接合内に形成する空乏層とは異なり、電子および正孔蓄積層は、有機ヘテロ接合界面の両側に観察され得る。導電率の高いヘテロ接合フィルムは、電荷注入バッファー層として、そしてタンデムダイオードのための連結ユニットとして用いることができる。アンバイポーラトランジスタおよび発光トランジスタ(先に記載された)は、有機ヘテロ接合フィルムを活性層として用いて実現することができる。
cyt c、および/あるいはカルジオリピンがドープされた、または芳香族カチオン性ペプチド、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)がドープされた、またはカルジオリピンと芳香族カチオン性ペプチドがドープされたcyt cは、バッテリーの内部抵抗を減少させるのに用いることもでき、それにより放電の間にバッテリーをほぼ一定の電圧に維持することができる。当該技術分野で理解される通り、バッテリーは、化学エネルギーを電気エネルギーに直接変換するデバイスである。それは、複数のボルタ電池を含み、その一方でその電池のそれぞれが、アニオンおよびカチオンを含む導電性電解質によって直列で接続された2つの半電池を含む。一方の半電池は電解質と、アニオン(負に帯電したイオン)が移動する電極、即ちアノードまたは負電極とを含み、他方の半電池は電解質と、カチオン(正に帯電したイオン)が移動する電極、即ちカソードまたは正電極とを含む。バッテリーを作動させるレドックス反応において、カチオンはカソードで還元され(電子が付加され)、アニオンはアノードで酸化される(電子が除去される)。電極は互いに接触しておらず、電解質により電気的に接続している。一部の電池は、異なる電解質を含む2つの半電池を使用する。半電池の間のセパレータにより、イオンを流しながら電解質の混合を防ぐことができる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
cyt cの単一分子は、充電および/または放電時間が1種以上の芳香族カチオン性ペプチド、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)、カルジオリピン、またはカルジオリピンとペプチドにより調節され得る分子バッテリーとして用いることもできる。本明細書に記載の通り、cyt cは、帯電した酸素および窒素原子の膜の反対側に炭素および硫黄を有する膜蛋白質である。湿性環境が好適である、帯電した酸素および窒素でコーティングされた領域は、膜の反対の面に突き出している。この配列は、酸素から水への反応を利用して分子ポンプを作動させる、cyt cにより実施される動作に好適である。酸素が消費されると、水素イオンを膜の一方の側から他方の側に押し出すことにより、エネルギーが蓄積される。その後、エネルギーを利用してATPを構築するか、または水素イオンを膜から再度漏出させることによりモータを作動させることができる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
有機太陽光電池(OPV)は、顕著な低価格設定および審美性に加え、低照度条件で優れた効率を保証する。OPV材料は、可撓性で、形状に合わせることもできる。OPVは、潜在的に様々な材料を包み込むこと、またはそれに塗装することができる。現行のOPVの効率は、5%〜6.25%である。これらの効率は、電力発生の従来の形態に取って代わるのに十分とはなり得ないが、OPVは、著しい効率を必要としない用途に適し、特に高コストの半導体ソーラー電池を与える。例えばOPV電池を用いて、連続トリクル充電設定で、事務所、家庭またはカンファレンス室の設定と同様に低い照度条件下で、携帯電話を動作させることができる。
電子分野の当業者に十分に理解される通り、前述のデバイスのいずれも、堆積、成長、または他の方法で材料の薄層を提供して適切な構造を形成させることにより、作製することができる。例えばトランジスタ、ダイオード、および太陽光電池のためのヘテロ接合は、互いに隣接する、または層をなした、異なるバンドギャップエネルギーを有する材料の層を堆積させることにより形成することができる。層状の薄膜構造を形成することに加えて、異なるバンドギャップを有する有機材料を混合して、材料の不均一混合物を堆積させることにより、図19(a)および19(b)に示すように、様々な空間配列でヘテロ接合を形成することができる。そのような不均一混合物としては、限定するものではないが、cyt cと、芳香族カチオン性ペプチドと、様々なレベルのカルジオリピン、または芳香族カチオン性ペプチド、例えば限定するものではないがTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)がドープされたcyt cと、の混合物を挙げることができる。例示的な芳香族カチオン性ペプチドレベルとしては、限定するものではないが、0〜500mM;0〜100mM;0〜500μM;0〜250μM;および0〜100μMを挙げることができる。これらの薄膜を用いて、例えば電極の導電率を上昇させ、そして/または熱消散を減少させることにより、従来の電子デバイスの性能を構造させることもできる。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
太陽光電池および他の適用のための、cyt c、芳香族カチオン性ペプチド、あるいはカルジオリピンがドープされた、または芳香族カチオン性ペプチド、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)がドープされた、またはカルジオリピンおよびペプチドがドープされたcyt cをはじめとする有機フィルムは、スピンコーティング、気相堆積、ならびに全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,734,038号;同第7,662,427号;および同第7,799,377号に記載された方法により付着させてもよい。スピンコーティング技術を利用して、より大きな表面積を高速でコーティングすることができるが、一層のための溶媒を用いて、任意の既存のポリマー層を分解することができる。スピンコーティングされた材料は、別個のパターン化ステップでパターン化しなければならない。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
先に記載された通り、カルジオリピン、または例示的芳香族カチオン性ペプチド、例えばTyr−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−01)、2’,6’−Dmt−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−02)、Phe−D−Arg−Phe−Lys−NH2(SS−20)もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)は、単独で、またはカルジオリピンと一緒に用いて、導電率を上昇させることができる。その結果、例示的芳香族カチオン性ペプチドおよびカルジオリピンを用いて、(廃)熱エネルギーの生成による損失を低下させながら電流を伝導させることができる。この効果は、バッテリー電力デバイス、例えば消費者向け電子製品、および大型電化製品、例えば送電適用物の動作寿命を延長させるために活用することができる。廃熱の生成を減少させることで、冷却の必要性も低下し、効率を更に上昇させて、導電性材料、例えば本発明のカルジオリピン、または芳香族カチオン性ペプチド、またはカルジオリピンおよびペプチドがドープされたcyt cにより電力を伝えられた電子デバイスの寿命を延長する。一部の実施形態において、芳香族カチオン性ペプチドは、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)(ここで(atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(SS−36)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)(ここでAldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2(SPI−231)、およびDmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2(ここで(dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)(SS−17)を含む。
本明細書に開示の芳香族カチオン性ペプチドを用いて、cyt cバイオセンサー内の電子流動を増加させること、および感度レベルを上昇させることができる。実施例により示される通り、本明細書に開示のペプチド、例えばD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドは、cyt cの還元を促進し(図1)、cyt cを通して電子流動を増加させる(図2)。
本明細書に開示の芳香族カチオン性ペプチドは、環境汚染のバイオレメディエーションに有用である。特に該ペプチドは、バクテリアシトクロムcにより環境汚染物質までの電子の移動を媒介し、それにより物質の価電子を変化させて、相対的毒性を低減する、バイオレメディエーション反応の速度および/または効率を上昇させるのに有用である。本明細書に開示の方法において、芳香族カチオン性ペプチドは、バクテリアシトクロムcと相互作用し、電子輸送を促進する。一態様において、芳香族カチオン性ペプチドは、バクテリアシトクロムcの還元を促進する。別の態様において、該ペプチドは、バクテリアシトクロムcを介して電子の拡散を増進する。別の態様において、該ペプチドは、バクテリアシトクロムc内の電子の能力を増強する。別の態様において、該ペプチドは、電子拡散に好都合となる、バクテリアシトクロムのヘム群の周りの新規なπ−π相互作用を導入する。最終的に芳香族カチオン性ペプチドとバクテリアシトクロムcとの相互作用は、環境汚染物質の異化的還元を促進および/または増進する。
本明細書に開示の芳香族カチオン性ペプチド、シトクロムc、および/またはカルジオリピンがドープされた、もしくはペプチドがドープされた、もしくはカルジオリピン/ペプチドがドープされたcyt cは、ナノワイヤー適用において有用である。典型的にはナノワイヤーは、ナノメータ(10−9メーター)の規模の孔径を有するナノ構造である。あるいはナノワイヤーは、数十ナノメーター未満に限定された厚さまたは口径と、非制限的長さとを有する構造として定義することができる。これらの寸法では、量子力学的効果が機能するようになる。金属(例えば、Ni、Pt、Au)、半導体(例えば、Si、InP、GaNなど)、および絶縁体(例えば、SiO2、TiO2)をはじめとし、多くの異なるタイプのナノワイヤーが存在する。分子ナノワイヤーは、有機(例えば、DNA、本明細書に開示の芳香族カチオン性ペプチド、シトクロムc、および/またはカルジオリピンもしくはペプチドもしくはペプチド/カルジオリピンがドープされたcyt cなど)または無機(例えば、Mo6S9−xIx)のいずれかの反復分子単位で構成される。本明細書に開示のナノワイヤーは、例えば構成要素を極めて小さい回路内に結び付けるのに、有用である。ナノテクノロジーを用いれば、該構成要素が、化学的化合物から作製される。
ナノワイヤーを合成するために、トップダウンアプローチおよびボトムアップアプローチの2つの基本的アプローチが存在する。トップダウンアプローチでは、材料の大きな断片が、リソグラフィーおよび電気泳動などの異なる手段により、小さな断片に切り詰められる。一方ボトムアップアプローチでは、ナノワイヤーが、構成するアドアトムと組み合わせることにより合成される。その合成技術のほとんどは、ボトムアップアプローチに基づく。
シトクロムcの還元:芳香族カチオン性ペプチドの量を増加させながら、酸化cyt cの溶液に添加した。還元されたcyt cの形成を、500nmの吸収によりモニタリングした。cyt c還元の割合を、非線形解析(Prizmのソフトウエア)により決定した。
固相ペプチド合成を利用し、全てのアミノ酸誘導体は市販される。ペプチド組織化の完了後に、ペプチドを通常の手法で樹脂から切断する。粗ペプチドを分取逆相クロマトグラフィーにより精製する。ペプチドの構造同一性を、FAB質量分析法により確認し、その純度を、3つの異なるシステムの分析的逆相HPLCおよび薄層クロマトグラフィーにより評価する。98%を超える純度に達するであろう。典型的には、樹脂5gを用いた合成実験で、純粋なペプチド約2.0〜2.3gが得られる。
吸収分光法(UltroSpec 3300 Pro;220〜1100nm)を用いて、SS−31がcyt c還元をモジュレートするかについて決定した(図1)。グルタチオンによるcyt cの還元を、550nmの目立ったシフトと共に、Qバンド(450〜650nm)での複数のシフトに関連づけられる。SS−31の添加により、550nmに顕著なスペクトル重みのシフトを生じた(図1A)。時間依存的な分光光度法から、SS−31がcyt c還元の割合を増加させたことが示される(図1B)。これらのデータから、SS−31がcyt cの電子構造を変化させて、Fe3+ヘムからFe2+ヘムへの還元を増進したことが示唆される。
サイクリックボルタンメトリー(CV)を実施して、SS−31がcyt cの電子流動および/または還元/酸化電位を変化させるかについて決定した(図2、上図)。CVを、Au作用電極、Ag/AgCl参照電極、およびPt補助電極を利用して実施した。SS−31は、cyt cの還元および酸化の両工程で電流を増加させた(図2、上図)。SS−31は、還元/酸化電位を変化させないが(図2、上図)、むしろcyt cを通した電子流動を増加させており、SS−31が複合体IIIからIVの間で抵抗を減少させることが示唆される。図2(下図)では、ボルタンメトリーの測定全てを、BASi C3 Cell Standに連結させたBASi−50W Voltammetric Analyzerを用いて実施した。Ag/AgCl電極を参照として使用し、ガラス状炭素および白金電極を標準測定用に使用した。各測定の前に、溶液を窒素で完全に脱気して、電極ファウリングを回避した。サイクリックボルタモグラムを、図2(下図)に示す通り、Trisホウ酸塩−EDTA(TBE)緩衝液、緩衝液+cyt c、および緩衝液+cyt c+2種の異なるSS−31用量について得た。電流(電子拡散速度)は、SS−31用量がcyt cに関して二倍になると(cyt c:SS−31=1:2)ほぼ200%増加する。結果から、SS−31がcyt cにおける電子拡散を促進し、該ペプチドがより感度の高いバイオディテクターを設計するのに有用となることが示される。
フォトルミネッセンス(PL)を実施して、cyt cのヘムの伝導帯の電子構造、つまり電子輸送を有するエネルギー状態に対するSS−31の影響を検討した(図3)。Nd:YDO4レーザ(532.8nm)を用いて、cyt c中の電子を励起した(図2A)。cyt c状態での強いPL放出を、650nmで明確に識別することができる(図2B)。PL強度は、SS−31の添加に伴って用量依存的に上昇し、cyt cにおける伝導帯の利用可能な電子状態の増加が示唆される(図2B)。これにより、SS−31がcyt cの伝導帯の電子能力を増加させること、そして同時にSS−31を介してcyt cを通した電流が増加することが示唆される。
円偏光二色性測定(Olis分光偏光計、DSM20)を実施して、ソレットバンド(415nmでの負のピーク)を、cyt c中のπ−π*ヘム環境に関するプローブとしてモニタリングした(図4)。SS−31は、このピークの440nmへの「レッド」シフトを促進し、変性を伴わずに新規なヘム−チロシンπ−π*遷移を導入したことが示唆される(図4)。これらの結果から、SS−31が電子トンネル効果のための追加のTyrをヘムに提供すること、または内因性Tyr残基とヘムとの距離を短縮させることにより、ヘムの周囲環境を改良するに違いないことが示唆される。ヘム周囲でのπ−π*相互作用の増加が、電子トンネル効果を増進し、それにより電子拡散に好適となろう。
単離されたラット腎臓ミトコンドリアの酸素消費を、オキシグラフを用いて決定した(図5)。呼吸速度を、状態2(400μM ADPのみ)、状態3(400μM ADPおよび500μM 基質)および状態4(基質のみ)で、異なる濃度のSS−31の存在下で測定した。実験は全て、n=4〜7の三重測定で実施した。結果から、SS−31がミトコンドリアを脱共役させずに、酸素への電子輸送を促進したことが示される(図5)。
400mM ADPの添加後1分目に、単離されたミトコンドリアから採取された呼吸緩衝液中のATPを測定することにより、ミトコンドリアATP合成の割合を決定した(図6)。ATPは、HPLCによりアッセイした。実験は全て、n=3の三重測定で実施した。単離されたミトコンドリアにSS−31を添加すると、ATP合成の割合が用量依存的に増加した(図6)。これらの結果から、SS−31による電子移動の増進がATP合成に結び付くことが示される。
ミトコンドリア呼吸へのSS−31の作用におけるcyt cの役割を実証するために、ミトコンドリアO2消費に及ぼすSS−31の影響を、一度凍結されたラット腎臓ミトコンドリアから作製されたcyt c除去ミトプラストにおいて決定した(図7)。呼吸の速度は、100μM SS−31を含む、または含まない50μM コハク酸塩の存在下で測定した。実験は、n=3の三重測定で実施した。これらのデータから、1)SS−31がIMMと強固に結合したcyt cを介して機能すること;2)SS−31が機能的cyt cの低下から守り得ること、が示唆される。
SS−31およびSS−20は、還元剤としてのグルタチオン(GSH)により導入されたcyt c還元の反応速度を促進することができる(図13)。cyt cの還元を、550nmの吸収の増加によりモニタリングした。GSHの添加により、550nmでの吸収が時間依存的に増加した(図13)。同様の結果が、還元剤としてN−アセチルシステイン(NAC)を用いることで得られた(不図示)。100μM濃度のSS−31単独の添加は、cyt cを還元せず、SS−31がNACにより誘導されたcyt c還元の速度を用量依存的に上昇させており、SS−31が電子を供与せず電子移動を迅速化し得ることが示唆される。
SS−20およびSS−31の両方は、単離されたラット腎臓ミトコンドリア中のO2消費により測定される通り、電子フラックスを促進し得る(図14)。SS−20またはSS−31を、100μM濃度で、0.5mMコハク酸塩(複合体II基質)および400μM ADPを含む呼吸緩衝液中の単離されたミトコンドリアに添加した。低濃度の複合体I基質(グルタミン酸塩/マレイン酸塩)を用いた場合に、O2消費における同様の増加が観察された(不図示)。電子フラックスの増加は、低濃度のコハク酸塩でエネルギー供給された単離されたミトコンドリアにおけるATP生成の割合の有意な上昇と相関した(図15)。これらのデータから、SS−20およびSS−31にIMMを標的化させることで、特に還元基質供給の条件下では、電子伝達系における電子フラックスが促進し、ATP合成が改善し得ることが示唆される。
シトクロムcを単離および精製する方法は、当該技術分野で公知である。1つの例示的で非限定的な方法を示す。シトクロムcは、複数の正に帯電した基を有し、それをおよそ10のpIに与える。つまりシトクロムcは通常、膜上のリン脂質の負電荷へのイオン引力により、ミトコンドリア膜に結合する。組織およびミトコンドリアは、最初、硫酸アルミニウム溶液中、低pHでブレンダー内でのホモジネーションにより破壊される。正に帯電したアルミニウムイオンは、負に帯電したリン脂質に結合することにより膜からシトクロムcを脱離させて、溶液中に蛋白質を放出することができる。pHが8.0に上昇することにより、過剰な硫酸アルミニウムが除去され、アルミニウムが水酸化アルミニウムの形態で沈殿する。
本明細書に記載のバイオレメディエーション組成物および方法を、以下の実施例により更に例示する。この実施例は、例示のみを目的として示されており、限定を意図するものではない。化学薬品および他の成分は、典型として示されている。本明細書に記載の方法および組成物の範囲内で前述の開示を考慮して改良を誘導してもよい。
Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)およびDmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(SS−37)のカチオンペプチドは、中性pHで正味正電荷を含む。それらは、静電相互作用に基づくアニオン性リン脂質カルジオリピンに関連すると予測される。小ペプチドと脂質膜の相互作用を、蛍光分光法を利用して試験することができた(Surewicz and Epand,1984)。本来備わるTrp残基の蛍光は、リン脂質ベシクルに結合させると量子収率の増加を示し、これはより疎水的環境においてTrp残基の取込みを示す最大発光のブルーシフトも伴った。極性感受性蛍光プローブをペプチドに取り込ませ、蛍光分光法を利用して、SS−19、SS−37およびSS−36がCLと相互作用するかについて決定した。結果を、図21に示す。
蛍光クエンチングを利用して、ペプチドDmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2(SS−19)とcyt Cとの相互作用を実証した。SS−19の最大蛍光発光スペクトルを、Hitachi F−4500蛍光分光光度計を用いて320nmの励起に従って420nmでモニタリングした。結果を、図22に示す。
蛍光分光法を利用して、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2ペプチド(SS−19)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2ペプチド(SS−37)およびDmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2ペプチド(SS−36)がCLの存在下でシトクロムcと相互作用することを実証した。結果を図23に示す。
円偏光二色性(CD)を実施して、cyt Cのヘム環境をCLのアシル鎖から防御することに対するペプチドの影響を検証した。ヘム蛋白質では、ソレットCDスペクトルは、ヘムポケットコンホメーションと厳密に相関する。特に負の416〜420nmコットン効果は、本来のcyt CにおけるFe(III)−Met80配位の診断と見なされる(Santucci and Ascoli,1997)。コットン効果の消失から、軸性配位からヘム鉄へのMet80の交換を含むヘムポケット領域の変化が明らかとなる。CDスペクトルは、AVIV CD Spectrometer Model 410を用いて得られた。結果を図24に示す。
シトクロムcは、ミトコンドリア中の呼吸複合体IIIとIVの間の電子キャリアである。シトクロムcは、シトクロムcリダクターゼから電子を受け取った後還元され(F2+)、その後、シトクロムcオキシダーゼによりF3+に酸化される。CLに会合したシトクロムcは、レドックス電位を輸し、本来のシトクロムcよりも有意に負値であり、シトクロムcの還元は、CLの存在下で有意に阻害される(Basova et al.,2007)。
SS−20およびSS−31の両方は、単離されたラット腎臓ミトコンドリア中でのO2消費により測定された通り、電子フラックスを促進し得る。SS−20またはSS−31を10μMまたは100μM濃度で、グルタミン酸塩/マレイン酸塩(複合体I基質)、0.5mMコハク酸塩(複合体II基質)または3μM TMPD/1mM アスコルビン酸塩(cyt Cの直接還元体)を含有する呼吸緩衝液中の単離されたミトコンドリアに添加した。400μM ADPを添加して、状態3の呼吸を開始させた。結果を図26に示す。
電子伝達系における電子フラックスの増加は、ATP合成の増加、または電子漏出およびフリーラジカル生成の増加のいずれかを引き起こし得る。単離されたミトコンドリアのケルATP合成は、HPLCによりアッセイした。SS−31は、ATP合成を用量依存的に増加させ、電子フラックスにおける増加が酸化的リン酸化に結び付くことが示唆される(図27)。
ミトコンドリア性カルジオリピンに強く結合したcyt Cのモデルを使用して、ミトコンドリアにおけるSS−31とシトクロムc−CL複合体との相互作用を検討した。ジギトニンによる外膜の除去の後、ミトプラストを120mM KClで洗浄して全ての遊離したシトクロムc、および電気的に会合されたシトクロムcを除去して、CLに強く結合したシトクロムcのみを残留させた。D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2(SS−31)は、ミトプラスト内の複合体II呼吸を、内部ミトコンドリア膜に強く結合したシトクロムcにより用量依存的手法で増進する(図28)。これらのデータは、SS−31がシトクロムc−CL複合体と直接相互作用し、複合体IIIから複合体IVへの電子伝達を促進することが示唆される。
シトクロムcにおけるヘムの6つの配位は、H2O2と触媒金属部位との直接の相互作用を防ぎ、溶液中の本来のシトクロムcは、弱いペルオキシダーゼである。CLとの相互作用の際、シトクロムcは、Fe−Met80配位の崩壊を伴う構造変化を受ける。これによりFe3+がH2O2に暴露され、ペルオキシダーゼが劇的に増加する(Vladimirov et al.,2006;Sinibaldi et al.,2008)。シトクロムcペルオキシダーゼの作用機序は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などの他のペルオキシダーゼと類似している。つまりAmplex Red−HRP反応を使用して、シトクロムcペルオキシダーゼ活性を検討することが可能である。ペルオキシダーゼの存在下で、Amplex Red(AR)はH2O2と反応して、赤色蛍光酸化生成物レゾルフィン(Ex/Em=571/585)を形成する。
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本発明は、本願に記載した特定の実施形態に関して限定されず、本発明の個別の態様の1つの説明となることを意図している。当業者に明白なように、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明の多くの変更および変形を行うことができる。本明細書に列挙される内容に加えて、本発明の範囲内の機能的に同等の方法および機器は、前述の説明から当業者には明白である。変更および変形は添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。本発明は、特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲に関してのみ限定される。本発明が特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物系に限定されるものではなく、もちろん変動する可能性があることは理解されよう。また、本明細書で使用される用語論は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定するためのものではないことも理解されよう。
Claims (60)
- シトクロムcを含有する試料中のシトクロムc還元を増大させる方法であって、前記試料を有効量のD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする、方法。
- シトクロムcを含有する試料中のシトクロムcを通る電子の拡散を増加させる方法であって、前記試料を有効量のD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする、方法。
- シトクロムcを含有する試料中のシトクロムcの周囲にπ−π相互作用を導入する方法であって、前記試料を有効量のD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする、方法。
- あるレベルのカルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、カルジオリピンおよびペプチドがドープされたcyt cと、カルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンの前記レベルの変化により誘導される前記cyt cの特性変化を測定する計量器とを含むことを特徴とする、センサー。
- カルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンの前記レベルが、前記cyt cの温度および前記cyt cのpHの少なくとも一方の変動に応答して変化する、請求項4に記載のセンサー。
- 前記特性が、導電率であり、前記計量器が、前記cyt cと電気的に連通するアノードおよびカソードを含む、請求項4に記載のセンサー。
- 前記特性が、フォトルミネセンスであり、前記計量器が、前記cyt cにより発光された光の強度および前記cyt cにより発光された光の波長のうちの少なくとも一方の変化を測定する光検出器を含む、請求項4に記載のセンサー。
- カルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンのレベルの変化により誘導される、前記レベルのカルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンがドープされたcyt cの特性の変化を測定する工程を含むことを特徴とする、検知方法。
- カルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンの前記レベルが、前記cyt cの温度および前記cyt cのpHの少なくとも一方の変動に応答して変化する、請求項8に記載のセンサー。
- 前記特性が、導電率、フォトルミネセンス強度、およびフォトルミネセンス波長のうちの少なくとも1つである、請求項8に記載の方法。
- cyt c;前記cyt cと連通するカルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンの供給源;ならびに、前記cyt cと連通するカルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンの量を制御するアクチュエータ、を含むスイッチ。
- 前記アクチュエータが、前記cyt cの温度および前記cyt cのpHの少なくとも一方を制御する、請求項11に記載のスイッチ。
- cyt cと連通するカルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンのレベルを変化させる工程を含むことを特徴とする、切り替え方法。
- カルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンのレベルを変化させる工程が、前記cyt cの温度および前記cyt cのpHの少なくとも一方を変動させる工程を含む、請求項13に記載の方法。
- 有効量のカルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンがドープされたcyt c;および前記cyt cからの発光を刺激する光源を含むことを特徴とする、発光素子。
- 有効量のカルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンがドープされたcyt cを刺激する工程を含むことを特徴とする、発光方法。
- 前記試料が、センサー、導体、スイッチ、または発光素子の成分を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- カルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンがドープされたcyt cを含むことを特徴とする、バイオセンサー。
- カルジオリピンがドープされた、またはペプチドがドープされた、またはカルジオリピンおよびペプチドがドープされたcyt cが、電極への電子流動におけるメディエータを含む、請求項18に記載のバイオセンサー。
- カルジオリピンがドープされた、またはペプチドがドープされた、またはカルジオリピンおよびペプチドがドープされたcyt cが、前記電極に直接固定されている、請求項18に記載のバイオセンサー。
- カルジオリピン、もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、および/またはcyt cが、前記バイオセンサー内の表面に固定されている、請求項18に記載のバイオセンサー。
- カルジオリピン、もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、および/またはcyt cが、前記バイオセンサー内で自由に拡散可能である、請求項18に記載のバイオセンサー。
- 試料中の基質を検出する方法であって、
a)前記試料を、
i)前記基質に特異的なレドックス活性酵素、
ii)カルジオリピン、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、または、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチドおよびカルジオリピンがドープされたcyt c、ならびに、
iii)電極、
を含むバイオセンサーと接触させる工程と、
b)前記バイオセンサー内の電子流動を検出する工程と
を含むことを特徴とする、方法。 - ペプチドがドープされた、カルジオリピンがドープされた、またはペプチドとカルジオリピンとがドープされたcyt cが、電極への電子流動におけるメディエータを含む、請求項23に記載の方法。
- ペプチドがドープされた、カルジオリピンがドープされた、またはペプチドとカルジオリピンとがドープされたcyt cが、前記電極に直接固定されている、請求項23に記載の方法。
- カルジオリピン、もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、および/またはcyt cが、前記バイオセンサー内の表面に固定されている、請求項23に記載の方法。
- カルジオリピン、もしくはD−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2ペプチド、および/またはcyt cが、前記バイオセンサー内で自由に拡散可能である、請求項23に記載の方法。
- 1種以上の芳香族カチオン性ペプチドを発現する組換えバクテリアを含む、環境汚染物質のバイオレメディエーションにおいて使用するための組成物。
- 前記組換えバクテリアが、前記1種以上の芳香族カチオン性ペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項28に記載の組成物。
- 前記核酸配列が、誘導性プロモータの制御下で発現される、請求項29に記載の組成物。
- 前記核酸配列が、構成性プロモータの制御下で発現される、請求項29に記載の組成物。
- 前記核酸配列が、プラスミドDNAを含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記核酸配列が、ゲノムインサートを含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記組換えバクテリアが、表7に列挙されたバクテリア種に由来する、請求項28に記載の組成物。
- 環境汚染物質を含有する材料を、1種以上の芳香族カチオン性ペプチドを発現する組換えバクテリアを含むバイオレメディエーション組成物と接触させる工程を含むことを特徴とする、環境汚染物質のバイオエレメディエーションの方法。
- 前記環境汚染物質が、金属を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記金属が、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Pd、Ag、Cd、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Cn、Al、Ga、In、Sn、Ti、Pb、またはBiを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記環境汚染物質が、非金属を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記非金属が、硫酸塩を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記環境汚染物質が、過塩素酸塩を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記過塩素酸塩が、NH4ClO4、CsClO4、LiClO4、Mg(ClO4)2、HClO4、KClO4、RbClO4、AgClO4、またはNaClO4を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記環境汚染物質が、硝酸塩を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記硝酸塩が、HNO3、LiNO3、NaNO3、KNO3、RbNO3、CsNO3、Be(NO3)2、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2、Sr(NO3)2、Ba(NO3)2、Sc(NO3)3、Cr(NO3)3、Mn(NO3)2、Fe(NO3)3、Co(NO3)2、Ni(NO3)2、Cu(NO3)2、Zn(NO3)2、Pd(NO3)2、Cd(NO3)2、Hg(NO3)2、Pb(NO3)2、またはAl(NO3)3を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記環境汚染物質が、放射線核種を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記放射線核種が、アクチニドを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記放射線核種が、ウランを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記環境汚染物質が、メチル−tert−ブチルエーテル(MTBE)、塩化ビニル、またはジクロロエチレンを含む、請求項35に記載の方法。
- バイオレメディエーションが、インサイチュで実施される、請求項35に記載の方法。
- バイオレメディエーションが、エクスサイチュで実施される、請求項35に記載の方法。
- 前記バクテリアが、前記1種以上の芳香族カチオン性ペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記核酸配列が、誘導性プロモータの制御下で発現される、請求項50に記載の方法。
- 前記核酸配列が、構成性プロモータの制御下で発現される、請求項50に記載の方法。
- 前記核酸配列が、プラスミドDNAを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記核酸配列が、ゲノムインサートを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記組換えバクテリアが、表7に列挙されたバクテリア種に由来する、請求項35に記載の方法。
- 前記芳香族カチオン性ペプチドが、D−Arg−Dmt−Lys−Phe−NH2を含む、請求項35〜55のいずれか1項に記載の方法。
- Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2((atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(Aldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(Aldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2、Dmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2((dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、またはその医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される1種以上の芳香族カチオン性ペプチドを含むことを特徴とする、組成物。
- 医薬的に許容可能な担体を含む、請求項57に記載の組成物。
- シトクロムcペルオキシダーゼ活性を阻害することを必要としている対象において、シトクロムcペルオキシダーゼ活性を阻害する方法であって、治療有効量の芳香族カチオン性ペプチドまたはその医薬的に許容可能な塩を投与する工程を含むことを特徴とする、方法。
- 前記芳香族カチオン性ペプチドが、Dmt−D−Arg−Phe−(atn)Dap−NH2((atn)Dapは、β−アントラニロイル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、Dmt−D−Arg−Ald−Lys−NH2(Aldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、Dmt−D−Arg−Phe−Lys−Ald−NH2(Aldは、β−(6’−ジメチルアミノ−2’−ナフトイル)アラニンである)、D−Arg−Tyr−Lys−Phe−NH2、Dmt−D−Arg−Phe−(dns)Dap−NH2((dns)Dapは、β−ダンシル−L−α,β−ジアミノプロピオン酸である)、またはその医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項59に記載の方法。
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