JP2017052742A

JP2017052742A - 抗酸化剤

Info

Publication number: JP2017052742A
Application number: JP2015180204A
Authority: JP
Inventors: 真也宇野; Shinya Uno; 児玉　大介; Daisuke Kodama; 大介児玉
Original assignee: QP Corp
Current assignee: QP Corp
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2017-03-16
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: JP6533723B2

Abstract

【課題】
本発明は、抗酸化能に優れたペプチドを提供する。
【解決手段】
Ｃ末端にシステインを有するペプチドを有効成分とする抗酸化剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗酸化能に優れたペプチドに関する。

不飽和脂肪酸の酸化により生じる過酸化物やフリーラジカルは、生体においては、その強い酸化力によって細胞内のタンパク質や遺伝子DNＡを傷つけるとともに、細胞膜を構成する脂質を攻撃して、毒性の強いハイドロパーオキサイド等の過酸化脂質を作り、細胞損傷や組織障害を引き起こすといわれている。こうした活性酸素やフリーラジカルによる生体への有害な作用の蓄積が、老化を促進したり、ガンや動脈硬化、心臓病をはじめとする、いわゆる生活習慣病の原因の一つとして関係があることが明らかとなってきた。そのため、食品成分による酸化ストレスの防止や抑制の観点から、食品の抗酸化性と食品成分との関係に関する研究や抗酸化能を持つ成分の検索が盛んに行われており、食事由来の抗酸化活性成分の摂取が健康維持に重要と考えられるようになっている。

また、抗酸化能を持つ食品成分に関しては、例えば卵や大豆等由来（特許文献１）のペプチドが抗酸化能を持つ成分が含まれることが知られている。

しかしながら、どのようなアミノ酸配列のペプチドが高い抗酸化性を有するかは不明であった。

特開２０１１−２４６４２５号公報

そこで、本発明の目的は、特定のアミノ酸配列を有する抗酸化能に優れたペプチドを提供するものである。

本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｃ末端にシステインを有するペプチドを作ることで、抗酸化能に優れたペプチドを得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）Ｃ末端にシステインを有するペプチドを有効成分とする抗酸化剤、
（２）さらに芳香族アミノ酸を有する請求項１記載の抗酸化剤、
（３）前記ペプチドのアミノ酸の数が２以上８以下である
（１）又は（２）に記載の抗酸化剤、
である。

本発明によれば、抗酸化能に優れたペプチドを作ることができることから、抗酸化性を持つ食品成分の検索方法が改善することが期待される。

以下、本発明を詳細に説明する。

＜本発明の特徴＞
本発明は、ペプチドにおいて、特定のアミノ酸が特定の位置に有することを特徴としており、これにより、抗酸化能に優れたペプチドとなる。

＜抗酸化剤＞
本発明で得られる抗酸化剤はＣ末端にシステインを有するペプチドである。

＜ペプチド＞
本発明で得られるペプチドは、Ｃ末端にシステインを有するペプチドであれば特に限定されず、アミノ酸等から合成されたものでも、タンパク質等を分解したものでもよい。
本発明で得られるペプチドのアミノ酸の数は、抗酸化効果が得られやすいことから、２以上３０以下がよく、さらに２以上１０以下がよく、さらに２以上８以下がよく、特に３以上５以下がよい。
また、本発明で得られるペプチドのアミノ酸の数は抗酸化効果が得られやすいことから、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、チロキシン等の芳香族アミノ酸を有するとよく、なかでもフェニルアラニン、トリプトファン、チロシンを有するとよい。

＜抗酸化能の測定方法＞
抗酸化能（ＴｏｔａｌＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＳｔａｔｕｓ：ＴＡＳ）は、ＴＡＳキット（ランドックスラボラトリー社／ＲａｎｄｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ．）を各ペプチド水溶液に用いて測定し、各ペプチド水溶液１ｍｍｏＬあたりのＴｒｏｌｏｘ(６−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，５，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）当量(ｍｍｏＬＴＥ／Ｌ)として算出した。

＜抗酸化能＞
本発明のペプチドの抗酸化能は、４５(ｍｍｏＬＴＥ／Ｌ)以上がよくさらに５０(ｍｍｏＬＴＥ／Ｌ)以上がよく、特に６０(ｍｍｏＬＴＥ／Ｌ)以上がよい。なお上限は高い程好ましいため、特に限定はしない。

＜ＴＡＳキットの測定原理＞
酸化触媒酵素ペルオキシダーゼ（メトミオグロビン）と過酸化水素によって、ＡＢＴＳ試薬［２，２‐アジノビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホン酸）］（ベーリンガー・マンハイム社／ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）がラジカル化されＡＢＴＳ^・＋が生成する。このラジカルＡＢＴＳ^・＋は、安定的で青緑色をしており、６００ｎｍの吸光度で測定することが出来る。検体中に抗酸化物質が含まれると、この青緑色のＡＢＴＳ^・＋の生成を阻害する。抗酸化物質の濃度に比例してこの青緑色の物質の生成が阻害される。

＜材料＞
全ての合成ペプチドは、ゲンスクリプト社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＩｎｃ．）から入手した。
［実施例１］
＜抗酸化剤の合成＞
ゲンスクリプト社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＩｎｃ．）のカスタムペプチド合成によりトリペプチドＬＷＣ（Ｎ末端がロイシン、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がトリプトファン、Ｃ末端がシステインのトリペプチド、以下ペプチドの記載方法はアミノ酸１文字略号を用い、Ｎ末端からＣ末端側に順に記載する）を作成し、抗酸化剤を得た。

＜抗酸化能の評価＞
実施例１で得られた抗酸化剤を、ＴＡＳキット（ランドックスラボラトリー社／ＲａｎｄｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ．）を使用し、ＴＡＳキット取扱説明書（Ｖｅｒ６１ＲＡ１２２４）に準じて抗酸化能を評価した。
具体的には、以下の表の試薬を用いて、以下の方法で抗酸化能を評価した。

＜試薬＞

＜１．ブランクの測定＞
２８μＬの純水をマイクロチューブに分注し、１．４ｍＬのＣｈｒｏｍｏｇｅｎ（試薬番号２）を混合後、３７℃で１分間加温しブランクサンプルとする。
ブランクサンプルから７１４μＬ分注し、石英セルで吸光度６００ｎｍを測定し、この時の値をＡ_{1ブランク}とする。
残りのブランクサンプルに１４０μＬのＳｕｂｓｔｒａｔｅ（試薬番号３）を混合し、３７℃で３分間加温後、石英セルに移し、吸光度６００ｎｍを測定し、この時の値をＡ_{2ブランク}とする。
Ａ_{2ブランク}−Ａ_{1ブランク}= ΔＡ_ブランクとする。

＜２．スタンダードの測定＞
２８μＬのスタンダード（試薬番号４）をマイクロチューブに分注し、１．４ｍＬのＣｈｒｏｍｏｇｅｎ（試薬番号２）を混合後、３７℃で１分間加温しスタンダードサンプルとする。
スタンダードサンプルから７１４μＬ分注し、石英セルで吸光度６００ｎｍを測定し、この時の値をＡ_{1スタンダード}とする。
残りのスタンダードサンプルに１４０μＬのＳｕｂｓｔｒａｔｅ（試薬番号３）を混合し、３７℃で３分間加温後、石英セルに移し、吸光度６００ｎｍを測定し、この時の値をＡ_{2スタンダード}とする。
Ａ_{2スタンダード}−Ａ_{1スタンダード}= ΔＡ_{スタンダード}とする。

＜３．ファクターの算出＞
Ｆａｃｔｏｒ＝スタンダード濃度／(ΔＡ_ブランク−ΔＡ_{スタンダード})
＝２．１８／(０．５５０９−０．１８７２)
＝５．９９

＜４．ペプチド水溶液の調整＞
実施例１で得られた抗酸化剤２．０ｍｇを、純水を用いて５０μｇ／ｍＬに調整し、ペプチド水溶液とした。

＜５．ペプチドサンプルの分析＞
２８μＬのペプチド水溶液をマイクロチューブに分注し、１．４ｍＬのＣｈｒｏｍｏｇｅｎ（試薬番号２）を混合後、３７℃で１分間加温しペプチドサンプルとする。
ペプチドサンプルから７１４μＬ分注し、石英セルで吸光度６００ｎｍを測定し、この時の値をＡ_{1ペプチドサンプル}とする。
残りのペプチドサンプルに１４０μＬの（試薬番号３）を混合し、３７℃で３分間加温後、石英セルに移し、吸光度６００ｎｍを測定し、この時の値をＡ_{2ペプチドサンプル}とする。
Ａ_{2ペプチドサンプル}−Ａ_{1ペプチドサンプル}=ΔＡ_{ペプチドサンプル}とする。
抗酸化能(ｍｍｏＬＴＥ／Ｌ) = Ｆａｃｔｏｒ×(ΔＡ_ブランク−ΔＡ_{ペプチドサンプル})／２８×Ｃ
＝５．９９×（０．５５０９−０．４７４４）／０．３３３
＝１３７．７
ただし、Ｃはペプチド水溶液濃度(ｍｏＬ/Ｌ)とする。
分光光度計はＵＶ―２４５０（島津製作所）を用い、青緑色のＡＢＴＳ^・＋を波長６００ｎｍの吸光度で測定した。
なお、抗酸化能の測定値が０．１〜２．５(ｍｍｏＬＴＥ／Ｌ)から外れた場合は、純水で希釈又は濃縮し、測定値が０．１〜２．５(ｍｍｏＬＴＥ／Ｌ)となるようにした。

［試験例］
抗酸化剤の、アミノ酸配列の違いによる抗酸化能を調べた。
具体的には、実施例１において、合成するペプチドの配列をランダムに変更し、表１に示すアミノ酸配列に変更した以外は、実施例１と同様の方法で実施例２乃至９、比較例１乃至５０のペプチドを合成した。
さらに、各実施例及び比較例で得られたペプチドを、実施例１の抗酸化能の測定方法と同様に、ＴＡＳキット（ランドックスラボラトリー社／ＲａｎｄｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ．）を使用し、ＴＡＳキット取扱説明書（Ｖｅｒ６１ＲＡ１２２４）に準じて抗酸化能を評価した。
具体的には、以下の表の試薬を用いて、以下の方法で抗酸化能を評価した。

表１より、Ｃ末端にシステインを有するペプチドが、抗酸化能が高いことが理解される（実施例１乃至９）。
また芳香族アミノ酸を有するペプチドは抗酸化能が高いことが理解される（実施例１、４、６乃至８）。

さらに、表１の抗酸化能の実測値からコンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して、ペプチドの抗酸化性を統計的に予測するモデル式の構築を行った。

＜ＱＳＡＲ式の構築＞
本発明で得られたＴｒｏｌｏｘ当量を基に、コンピュータによるＱＳＡＲモデル化技術を使用して、トリペプチドの抗酸化性を予測するモデル式の構築を行い、以下の式を得た。
Ｌog [Ａctivity] = 1.020C₁＋1.174C₂＋1.771C₃−0.567H₂＋0.566 I₁
+ 0.621 I₃−0.163 Δ(E_LUMO−E_HOMO)₂−0.150 Δ(E_LUMO−E_HOMO)₃−0.596
(相関係数 r = 0.837)
ただし、Δ(E_LUMO−E_HOMO)_n はN末端からn番目のアミノ酸のLUMOとHOMOのエネルギー差を表し、C_n、 H_n、 I_n はN末端からn番目のアミノ酸がそれぞれシステイン、ヒスチジン、芳香族性の時に１、それ以外の時に０の値をとる擬変数である。
また、上記のＱＳＡＲ式の構築には、分析ソフトとしてＱＲＥＧ，ｖｅｒｓｉｏｎ２．０５（Ａｓａｏ，Ｍ．ら、ＪａｐａｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙＰｒｏｇｒａｍＥｘｃｈａｎｇｅ：Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）を使用した。

前記モデル式の結果より、統計的にも、Ｃ末端にシステインを有するペプチドが、抗酸化能が高いこと、芳香族アミノ酸を有するペプチドは抗酸化能が高いことが理解された。

Claims

Ｃ末端にシステインを有するペプチドを有効成分とする抗酸化剤。
さらに芳香族アミノ酸を有する
請求項１記載の抗酸化剤。
前記ペプチドのアミノ酸の数が２以上８以下である
請求項１又は２に記載の抗酸化剤。