JPWO2019131789A1 - 加齢臭抑制素材のスクリーニング方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、加齢臭抑制素材のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、加齢臭原因物質に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、試験物質の中から加齢臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び加齢臭原因物質を添加すること；前記加齢臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定することを含む。また本発明は、トランス−２−ノネナール臭抑制素材及びトランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法に関する。

Description

本発明は、加齢臭抑制素材をスクリーニングする方法に関する。また本発明は、トランス−２−ノネナール臭抑制素材をスクリーニングする方法、さらにはトランス−２−オクテナール臭抑制素材をスクリーニングする方法に関する。
生活の中で不快に感じる身の回りの臭気・悪臭に対して、生活環境向上のため、より有効に消臭することが強く望まれており、その中でも近年体臭に関する意識が高まっている。
体臭は、口臭、足臭、腋臭、頭皮臭等の「体の各部分の匂い」と「体幹より発せられる匂いを総合した匂い」に大別される。「体幹より発せられる匂いを総合した匂い」は、年齢と共に移り変わっていくことが知られており、中高年以降に認められる加齢臭は嫌われる傾向が非常に強くなっている。この加齢臭の原因物質としてノネナール及びオクテナールなどの不飽和アルデヒドが原因であることが報告されている（特許文献１）。ノネナール及びオクテナールなどの不飽和アルデヒドは、飲料のオフフレーバーとしても知られている（例えば、非特許文献１）。
特開平１１−２８６４２３号公報
「ビールのオフフレーバーに関する近年の知見」岸本徹、におい・かおり環境学会誌（J. Japan Association on Odor Environment）44巻1号(2013)
既知の加齢臭原因物質に応答する嗅覚受容体を探索し、その嗅覚受容体を用いることで加齢臭抑制素材の候補物質をスクリーニングできる可能性がある。しかし、加齢臭原因物質に応答する嗅覚受容体はこれまでに知られていなかった。
このような状況の下、加齢臭原因物質に応答する嗅覚受容体を探索し、加齢臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法を提供することが望まれている。また、加齢臭や飲料のオフフレーバーの原因物質である不飽和アルデヒドに応答する嗅覚受容体を探索し、不飽和アルデヒド臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法を提供することが望まれている。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行ったところ、加齢臭の原因物質であり、不飽和アルデヒドの一種であるトランス−２−ノネナール及びトランス−２−オクテナールのそれぞれに応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功した。本発明者はさらに検討を進め、これらの嗅覚受容体を用いることで、嗅覚受容体アンタゴニストのマスキング効果による加齢臭抑制素材、さらにはトランス−２−ノネナール臭抑制素材及びトランス−２−オクテナール臭抑制素材の評価及び選択が可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、以下に示す加齢臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法を提供するものである。また本発明は、以下に示すトランス−２−ノネナール臭抑制素材をスクリーニングする方法、さらにはトランス−２−オクテナール臭抑制素材をスクリーニングする方法を提供するものである。
［１］加齢臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び加齢臭原因物質を添加すること；
前記加齢臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
［２］前記加齢臭原因物質がトランス−２−ノネナール及びトランス−２−オクテナールからなる群より選択される１種以上である［１］記載の方法。
［３］前記嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上、または嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で、前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、［１］または［２］のいずれかに記載の方法。
［４］前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、リポーターアッセイにより測定する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］トランス−２−ノネナール臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−ノネナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びトランス−２−ノネナールを添加すること；
前記トランス−２−ノネナールに対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
［６］前記嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上、または嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で、前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、［５］に記載の方法。
［７］前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、リポーターアッセイにより測定する、［５］または［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］トランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びトランス−２−オクテナールを添加すること；
前記トランス−２−オクテナールに対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
［９］前記嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上、または嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で、前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、［８］に記載の方法。
［１０］前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、リポーターアッセイにより測定する、［８］または［９］のいずれか１項に記載の方法。
本発明の方法を用いることにより、試験物質の中から加齢臭原因物質と嗅覚受容体ポリペプチドとの結合を阻害することができる加齢臭抑制素材の候補物質をスクリーニングすることができる。また、本発明の方法を用いることにより、トランス−２−ノネナール臭抑制素材及びトランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法は、加齢臭抑制素材、トランス−２−ノネナール臭抑制素材及びトランス−２−オクテナール臭抑制素材の開発に貢献できるものと期待される。
また、新しい香料素材を開発するために多数の候補物質の匂いを人間の嗅覚のみで評価することは、嗅覚疲労や個人差の問題があり、適切に候補物質を選択することに困難を伴う場合があるが、本発明の方法によれば、このような問題を解消または軽減することができる。
トランス−２−ノネナールに対する各種嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定結果を示す図である。 トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ１Ｄ２の応答の測定結果を示す図である。 トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｃ１の応答の測定結果を示す図である。 トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｊ２の応答の測定結果を示す図である。 トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ４Ｅ２の応答の測定結果を示す図である。 トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ５Ｐ３の応答の測定結果を示す図である。 トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ５２Ｎ２の応答の測定結果を示す図である。 トランス−２−オクテナールに対する各種嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定結果を示す図である。 シス−３−ヘキセノールの添加による、トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｃ１における応答抑制効果の結果を示す図である。 ジメチルテトラヒドロベンズアルデヒドの添加による、トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｃ１の応答抑制効果の結果を示す図である。
以下、本発明のスクリーニング方法について具体的に説明する。
１．加齢臭抑制素材のスクリーニング方法
本発明にかかる加齢臭抑制素材のスクリーニング方法は、加齢臭原因物質に対して応答性を示す嗅覚受容体ポリペプチドを用いて、試験物質の中から加齢臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び加齢臭原因物質を添加すること；
前記加齢臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含むことを特徴としている。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の加齢臭抑制素材のスクリーニング方法は、
（ｉ）（ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドと加齢臭原因物質を接触させ、加齢臭原因物質に対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程と、
（ｉｉ）加齢臭原因物質に試験物質を混合して、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答を低減させた試験物質を、加齢臭抑制素材の候補物質として選択する工程と
を含む。
本発明にかかる加齢臭抑制素材のスクリーニング方法は、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及びこれらのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドに対する試験物質の応答性を指標として、試験物質の中から加齢臭抑制素材の候補物質を選択するものである。
一種の嗅覚受容体は類似構造を有する複数種の香気化合物に応答することが知られていることから、既知の加齢臭原因物質に対して応答性を示す嗅覚受容体ポリペプチドを特定し、その嗅覚受容体ポリペプチドに対する試験物質の応答性を評価することによって、試験物質の中から既知の加齢臭原因物質が嗅覚受容体ポリペプチドと結合することを妨げることができる候補物質を選択することができる。なお、本明細書において、「試験物質」とは、特に限定するものではないが、加齢臭抑制効果の調査対象をいい、化合物、組成物または混合物をいうものとする。また、本明細書において「加齢臭抑制素材」とは、特に限定するものではないが、加齢臭を抑制することができる化合物、組成物または混合物をいうものとする。以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について説明する。
＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）では、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及びこれらのいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドと加齢臭原因物質を接触させ、加齢臭原因物質に対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する。
嗅覚受容体ポリペプチドとしては、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及びこれらのいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドが用いられる。
ＯＲ２Ｃ１はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿０１２３６８として登録されており、配列番号１で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなるポリペプチドである。
ＯＲ２Ｊ２はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿０３０９０５として登録されており、配列番号３で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）からなるポリペプチドである。
ＯＲ４Ｅ２はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００１９１２として登録されており、配列番号５で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）からなるポリペプチドである。
ＯＲ５Ｐ３はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿１５３４４５として登録されており、配列番号７で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドである。
これらのポリペプチドは、トランス−２−ノネナール及びトランス−２−オクテナールに選択的に強く応答することから、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３を用いたスクリーニング方法は、加齢臭抑制素材の開発に貢献できるものと期待される。
嗅覚受容体としてこれらのポリペプチドが有するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２、４、６または８）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドを用いてもよい。なお、本明細書においてアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩより公に入手できる）によって算出される。
嗅覚受容体ポリペプチドは、一種で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明において、加齢臭原因物質としては、トランス−２−ノネナール及びトランス−２−オクテナールからなる群より選ばれる１種以上を好ましく用いることができる。
本発明において嗅覚受容体ポリペプチドと加齢臭原因物質を接触させ、加齢臭原因物質に対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は特に制限されない。例えば、嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上で加齢臭原因物質と接触させ、嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよいし、嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で加齢臭原因物質と接触させ、嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよい。嗅覚受容体ポリペプチドと加齢臭原因物質を接触させる時間は、加齢臭原因物質の濃度にも依存するため一概には言えないが、通常、２〜４時間である。加齢臭原因物質に試験物質を混合して嗅覚受容体ポリペプチドと接触させる場合も同様である。
嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞は、嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
本発明の好ましい態様では、嗅覚受容体ポリペプチドと共に、ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込んでもよい。ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込むことにより、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進することができる。
ウシロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０１４８９０として登録されている。ウシロドプシンは、配列番号２１で示される塩基配列の第１番目から第１０４７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２２）からなるポリペプチドである。
また、ウシロドプシンに代えて、配列番号２２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進することができるポリペプチドを用いてもよい。
なお、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進できるものであれば、ウシロドプシンに限らず、他のポリペプチドのアミノ酸残基を用いてもよい。
嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は特に制限されなく、当分野で用いられている任意の方法を用いることができる。例えば、香気化合物が嗅覚受容体ポリペプチドへ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換し、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、ｃＡＭＰ量を測定することで嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が用いられる。中でも、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することが好ましい。
本発明の一実施態様によれば、嗅覚受容体ポリペプチドの応答は、加齢臭原因物質存在下における測定結果を、加齢臭原因物質の非存在下における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値を指標として評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する場合、ＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値が好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは１０以上となる濃度の加齢臭原因物質を使用して評価することができる。
＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）では、加齢臭原因物質に試験物質を混合して、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する。
嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は、加齢臭原因物質と試験物質を混合して嗅覚受容体ポリペプチドに接触させることを除いて、工程（ｉ）で示した方法と同様の方法を用いることができる。例えば、嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上で嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよいし、嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよい。工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定結果を適切に比較するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定条件は、試験物質の有無を除いて、同じであることが好ましい。
＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答が低減した試験物質を、加齢臭抑制素材の候補物質として選択する。
本発明では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して応答の低減が見られた場合、工程（ｉｉ）で用いた試験物質を、加齢臭抑制素材の候補物質として評価することができる。
上記のようにして、試験物質の中から加齢臭抑制素材の候補物質をスクリーニングすることができる。本発明によれば、人間の嗅覚によって行う官能評価による嗅覚疲労や個人差などによる問題を生じることなく、多数の試験物質の中から加齢臭抑制素材の候補物質を選択することができる。
選択された物質は、加齢臭抑制素材の候補物質として用いることができる。選択された物質を基に必要に応じて改変等を行い、最適な匂いのする新規な化合物を開発することもできる。さらには、選択された物質を他の香料素材とブレンドして加齢臭を抑制することができ、かつ最適な匂いのする香料素材を開発することも可能である。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、加齢臭抑制素材の新しい香料素材の開発に貢献することができる。
２．トランス−２−ノネナール臭抑制素材のスクリーニング方法
本発明にかかるトランス−２−ノネナール臭抑制素材のスクリーニング方法は、トランス−２−ノネナールに対して応答性を示す嗅覚受容体ポリペプチドを用いて、試験物質の中からトランス−２−ノネナール臭抑制素材臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−ノネナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びトランス−２−ノネナールを添加すること；
前記トランス−２−ノネナールに対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含むことを特徴としている。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のトランス−２−ノネナール臭抑制素材のスクリーニング方法は、
（ｉ）（ａ）ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−ノネナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−ノネナールを接触させ、トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程と、
（ｉｉ）トランス−２−ノネナールに試験物質を混合して、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答を低減させた試験物質を、トランス−２−ノネナールの候補物質として選択する工程と
を含む。
本発明にかかるトランス−２−ノネナール臭抑制素材のスクリーニング方法は、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２、及びこれらのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドに対する試験物質の応答性を指標として、試験物質の中からトランス−２−ノネナール臭抑制素材の候補物質を選択するものである。
本発明にかかるトランス−２−ノネナール臭抑制素材のスクリーニング方法において「試験物質」とは、特に限定するものではないが、トランス−２−ノネナール臭抑制効果の調査対象をいい、化合物、組成物または混合物をいうものとする。また、「トランス−２−ノネナール臭抑制素材」とは、特に限定するものではないが、トランス−２−ノネナール臭を抑制することができる化合物、組成物または混合物をいうものとする。また、「トランス−２−ノネナール臭」とは、トランス−２−ノネナールを原因物質とする臭いを意味し、例えば、加齢臭、オフフレーバーなどを含む。以下、各工程について説明する。
＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）では、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２、及びこれらのいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−ノネナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−ノネナールを接触させ、トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する。
嗅覚受容体ポリペプチドとしては、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２、及びこれらのいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−ノネナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドが用いられる。
ＯＲ２Ｃ１はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿０１２３６８として登録されており、配列番号１で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなるポリペプチドである。
ＯＲ２Ｊ２はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿０３０９０５として登録されており、配列番号３で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）からなるポリペプチドである。
ＯＲ４Ｅ２はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００１９１２として登録されており、配列番号５で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）からなるポリペプチドである。
ＯＲ５Ｐ３はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿１５３４４５として登録されており、配列番号７で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドである。
ОＲ１Ｄ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００２５４８として登録されており、配列番号９で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）からなるポリペプチドである。
ＯＲ５２Ｎ２はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００５１７４として登録されており、配列番号１１で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）からなるポリペプチドである。
これらのポリペプチドは、トランス−２−ノネナールに選択的に強く応答することから、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２を用いたスクリーニング方法は、トランス−２−ノネナール臭抑制素材の開発に貢献できるものと期待される。
嗅覚受容体としてこれらのポリペプチドが有するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２、４、６、８、１０または１２）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−ノネナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドを用いてもよい。
嗅覚受容体ポリペプチドは、一種で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明において嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−ノネナールを接触させ、トランス−２−ノネナールに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は特に制限されない。例えば、嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上でトランス−２−ノネナールと接触させ、嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよいし、嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上でトランス−２−ノネナールと接触させ、嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよい。嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−ノネナールを接触させる時間は、トランス−２−ノネナールの濃度にも依存するため一概には言えないが、通常、２〜４時間である。トランス−２−ノネナールに試験物質を混合して嗅覚受容体ポリペプチドと接触させる場合も同様である。
嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞は、嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
本発明の好ましい態様では、嗅覚受容体ポリペプチドと共に、ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込んでもよい。ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込むことにより、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進することができる。
ウシロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０１４８９０として登録されている。ウシロドプシンは、配列番号２１で示される塩基配列の第１番目から第１０４７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２２）からなるポリペプチドである。
また、ウシロドプシンに代えて、配列番号２２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進することができるポリペプチドを用いてもよい。
なお、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進できるものであれば、ウシロドプシンに限らず、他のポリペプチドのアミノ酸残基を用いてもよい。
嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は特に制限されなく、当分野で用いられている任意の方法を用いることができる。例えば、香気化合物が嗅覚受容体ポリペプチドへ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換し、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、ｃＡＭＰ量を測定することで嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が用いられる。中でも、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することが好ましい。
本発明の一実施態様によれば、嗅覚受容体ポリペプチドの応答は、トランス−２−ノネナール存在下における測定結果を、トランス−２−ノネナールの非存在下における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値を指標として評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する場合、ＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値が好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは１０以上となる濃度のトランス−２−ノネナールを使用して評価することができる。
＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）では、トランス−２−ノネナールに試験物質を混合して、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する。
嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は、トランス−２−ノネナールと試験物質を混合して嗅覚受容体ポリペプチドに接触させることを除いて、工程（ｉ）で示した方法と同様の方法を用いることができる。例えば、嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上で嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよいし、嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよい。工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定結果を適切に比較するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定条件は、試験物質の有無を除いて、同じであることが好ましい。
＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答が低減した試験物質を、トランス−２−ノネナール臭抑制素材の候補物質として選択する。
本発明では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して応答の低減が見られた場合、工程（ｉｉ）で用いた試験物質を、トランス−２−ノネナール臭抑制素材の候補物質として評価することができる。
上記のようにして、試験物質の中からトランス−２−ノネナール臭抑制素材の候補物質をスクリーニングすることができる。本発明によれば、人間の嗅覚によって行う官能評価による嗅覚疲労や個人差などによる問題を生じることなく、多数の試験物質の中からトランス−２−ノネナール臭抑制素材の候補物質を選択することができる。
選択された物質は、トランス−２−ノネナール臭抑制素材の候補物質として用いることができる。選択された物質を基に必要に応じて改変等を行い、最適な匂いのする新規な化合物を開発することもできる。さらには、選択された物質を他の香料素材とブレンドしてトランス−２−ノネナール臭を抑制することができ、かつ最適な匂いのする香料素材を開発することも可能である。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、トランス−２−ノネナール臭抑制素材の新しい香料素材の開発に貢献することができる。
３．トランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法
本発明にかかるトランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法は、トランス−２−オクテナールに対して応答性を示す嗅覚受容体ポリペプチドを用いて、試験物質の中からトランス−２−オクテナール臭抑制素材臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びトランス−２−オクテナールを添加すること；
前記トランス−２−オクテナールに対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含むことを特徴としている。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のトランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法は、
（ｉ）（ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−オクテナールを接触させ、トランス−２−オクテナールに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程と、
（ｉｉ）トランス−２−オクテナールに試験物質を混合して、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答を低減させた試験物質を、トランス−２−オクテナールの候補物質として選択する工程と
を含む。
本発明にかかるトランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法は、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７、及びこれらのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドに対する試験物質の応答性を指標として、試験物質の中からトランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質を選択するものである。
本発明にかかるトランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法において「試験物質」とは、特に限定するものではないが、トランス−２−オクテナール臭抑制効果の調査対象をいい、化合物、組成物または混合物をいうものとする。また、「トランス−２−オクテナール臭抑制素材」とは、特に限定するものではないが、トランス−２−オクテナール臭を抑制することができる化合物、組成物または混合物をいうものとする。また、「トランス−２−オクテナール臭」とは、トランス−２−オクテナールを原因物質とする臭いを意味し、例えば、加齢臭、オフフレーバーなどを含む。以下、各工程について説明する。
＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）では、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７、及びこれらのいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−オクテナールを接触させ、トランス−２−オクテナールに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する。
嗅覚受容体ポリペプチドとしては、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７、及びこれらのいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドが用いられる。
ＯＲ２Ｃ１はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿０１２３６８として登録されており、配列番号１で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなるポリペプチドである。
ＯＲ２Ｊ２はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿０３０９０５として登録されており、配列番号３で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）からなるポリペプチドである。
ＯＲ４Ｅ２はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００１９１２として登録されており、配列番号５で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）からなるポリペプチドである。
ＯＲ５Ｐ３はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿１５３４４５として登録されており、配列番号７で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドである。
ОＲ２Ｊ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００５２１６として登録されており、配列番号１３で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１４）からなるポリペプチドである。
ＯＲ７Ｇ１はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００５１９２として登録されており、配列番号１５で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１６）からなるポリペプチドである。
ＯＲ９Ｉ１はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００５２１１として登録されており、配列番号１７で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１８）からなるポリペプチドである。
ＯＲ５１Ａ７はＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００４７４９として登録されており、配列番号１９で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２０）からなるポリペプチドである。
これらのポリペプチドは、トランス−２−オクテナールに選択的に強く応答することから、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７を用いたスクリーニング方法は、トランス−２−オクテナール臭抑制素材の開発に貢献できるものと期待される。
嗅覚受容体としてこれらのポリペプチドが有するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８または２０）と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドを用いてもよい。
嗅覚受容体ポリペプチドは、一種で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明において嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−オクテナールを接触させ、トランス−２−オクテナールに対する嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は特に制限されない。例えば、嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上でトランス−２−オクテナールと接触させ、嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよいし、嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上でトランス−２−オクテナールと接触させ、嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよい。嗅覚受容体ポリペプチドとトランス−２−オクテナールを接触させる時間は、トランス−２−オクテナールの濃度にも依存するため一概には言えないが、通常、２〜４時間である。トランス−２−オクテナールに試験物質を混合して嗅覚受容体ポリペプチドと接触させる場合も同様である。
嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞は、嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
本発明の好ましい態様では、嗅覚受容体ポリペプチドと共に、ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込んでもよい。ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込むことにより、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進することができる。
ウシロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０１４８９０として登録されている。ウシロドプシンは、配列番号２１で示される塩基配列の第１番目から第１０４７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２２）からなるポリペプチドである。
また、ウシロドプシンに代えて、配列番号２２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進することができるポリペプチドを用いてもよい。
なお、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進できるものであれば、ウシロドプシンに限らず、他のポリペプチドのアミノ酸残基を用いてもよい。
嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は特に制限されなく、当分野で用いられている任意の方法を用いることができる。例えば、香気化合物が嗅覚受容体ポリペプチドへ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換し、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、ｃＡＭＰ量を測定することで嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が用いられる。中でも、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することが好ましい。
本発明の一実施態様によれば、嗅覚受容体ポリペプチドの応答は、トランス−２−オクテナール存在下における測定結果を、トランス−２−オクテナールの非存在下における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値を指標として評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する場合、ＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値が好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは１０以上となる濃度のトランス−２−オクテナールを使用して評価することができる。
＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）では、トランス−２−オクテナールに試験物質を混合して、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する。
嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する方法は、トランス−２−オクテナールと試験物質を混合して嗅覚受容体ポリペプチドに接触させることを除いて、工程（ｉ）で示した方法と同様の方法を用いることができる。例えば、嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上で嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよいし、嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定してもよい。工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定結果を適切に比較するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定条件は、試験物質の有無を除いて、同じであることが好ましい。
＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答が低減した試験物質を、トランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質として選択する。
本発明では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して応答の低減が見られた場合、工程（ｉｉ）で用いた試験物質を、トランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質として評価することができる。
上記のようにして、試験物質の中からトランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質をスクリーニングすることができる。本発明によれば、人間の嗅覚によって行う官能評価による嗅覚疲労や個人差などによる問題を生じることなく、多数の試験物質の中からトランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質を選択することができる。
選択された物質は、トランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質として用いることができる。選択された物質を基に必要に応じて改変等を行い、最適な匂いのする新規な化合物を開発することもできる。さらには、選択された物質を他の香料素材とブレンドしてトランス−２−オクテナール臭を抑制することができ、かつ最適な匂いのする香料素材を開発することも可能である。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、トランス−２−オクテナール臭抑制素材の新しい香料素材の開発に貢献することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。
［実施例１］
トランス−２−ノネナールに応答する嗅覚受容体ポリペプチドの探索
（１）嗅覚受容体遺伝子クローニング
ヒト嗅覚受容体遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ：Ｆｅｍａｌｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）よりＰＣＲ法にてクローニングすることで得た。ｐＭＥ１８ＳベクターにウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込み、さらにその下流に、得られたヒト嗅覚受容体遺伝子を組み込むことで、ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクターを得た。
（２）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での嗅覚受容体遺伝子の発現
ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクター０．０５μｇ、ＲＴＰ１Ｓベクター０．０１μｇ、ｃＡＭＰ応答配列プロモーターを含むホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．２９（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．０１μｇ、およびチミジンキナーゼプロモーターを含むウミシイタケルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．７４（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．００５μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（ｇｉｂｃｏ社）１０μＬに溶解して遺伝子溶液（１穴分）とした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４時間後にコンフルエントに達する細胞数で９６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００の使用法に従ってリポフェクション法によって遺伝子溶液を各穴に添加して、細胞に遺伝子導入を行い、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で２４時間培養した。
（３）ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ
培養液を除去した後に、検体となる香気物質を測定する濃度になる様にＣＤ２９３（ｇｉｂｃｏ社）培地（２０μＭＬ−グルタミン添加）で調製したものを５０μＬずつ添加し、３時間の刺激を行った後に、Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の使用方法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。嗅覚受容体ポリペプチドの応答強度は、香気物質の刺激によって生じたルシフェラーゼ活性を、香気物質を含まない試験系で生じたルシフェラーゼ活性で割ることで求められるＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値で表現した。
（４）トランス−２−ノネナールに応答する嗅覚受容体ポリペプチドの同定
ヒト嗅覚受容体４０２種を発現させた細胞で、トランス−２−ノネナール６０μＭに対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図１に示す。トランス−２−ノネナールに対してＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３およびＯＲ５２Ｎ２が、ＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値２以上の応答を示した。
また、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３およびＯＲ５２Ｎ２の、様々な濃度のトランス−２−ノネナールに対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図２〜７にそれぞれ示す。ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３およびＯＲ５２Ｎ２はトランス−２−ノネナールに対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３およびＯＲ５２Ｎ２はトランス−２−ノネナールに対して、特異的に応答することが示された。
［実施例２］
トランス−２−オクテナールに応答する嗅覚受容体ポリペプチドの探索
実施例１と同様にして、ヒト嗅覚受容体４０２種を発現させた細胞で、トランス−２−オクテナール５０μＭに対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図８に示す。トランス−２−オクテナールに対してＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１およびＯＲ５１Ａ７が、ＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値２以上の応答を示した。
［実施例３］
加齢臭抑制素材に対するＯＲ２Ｃ１の応答抑制効果の評価
日本化粧品技術者会誌、３４（４）、３７９−３８６、（２０００）において加齢臭をマスキングおよび変調する加齢臭抑制素材として知られているシス−３−ヘキセノールおよびジメチルテトラヒドロベンズアルデヒド（ＩＦＦ社商品名：トリプラール）について、トランス−２−ノネナールに対して強い応答を示したＯＲ２Ｃ１の応答を抑制する効果を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。ルシフェラーゼレポータージーンアッセイにおいて、検体にトランス−２−ノネナールと加齢臭抑制素材を混合して用い、加齢臭抑制素材を混合しなかった試験でのＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値を１００とした際の、加齢臭抑制素材を混合した試験でのＦｏｌｄＩｎｃｒｅａｓｅ値の割合を求めた。結果を図９及び１０にそれぞれ示す。シス−３−ヘキセノールおよびジメチルテトラヒドロベンズアルデヒドは、ＯＲ２Ｃ１のトランス−２−ノネナールに対する応答を、濃度依存的に低減させる効果を示した。
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、多数の試験物質の中から加齢臭抑制素材、トランス−２−ノネナール臭抑制素材及びトランス−２−オクテナール臭抑制素材の候補物質をそれぞれ選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、加齢臭抑制素材、さらにはトランス−２−ノネナール臭抑制素材及びトランス−２−オクテナール臭抑制素材の開発に貢献できるものと期待される。

Claims (10)

  1. 加齢臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
    （ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ加齢臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び加齢臭原因物質を添加すること；
    前記加齢臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
    測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
    を含む方法。
  2. 前記加齢臭原因物質がトランス−２−ノネナール及びトランス−２−オクテナールからなる群より選択される１種以上である請求項１に記載の方法。
  3. 前記嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上、または嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で、前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、リポーターアッセイにより測定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. トランス−２−ノネナール臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
    （ａ）ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５２Ｎ２、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−ノネナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びトランス−２−ノネナールを添加すること；
    前記トランス−２−ノネナールに対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
    測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
    を含む方法。
  6. 前記嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上、または嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で、前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、リポーターアッセイにより測定する、請求項５または６のいずれか１項に記載の方法。
  8. トランス−２−オクテナール臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
    （ａ）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ５１Ａ７、及び（ｂ）前記（ａ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつトランス−２−オクテナールに対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及びトランス−２−オクテナールを添加すること；
    前記トランス−２−オクテナールに対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
    測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
    を含む方法。
  9. 前記嗅覚受容体ポリペプチドを発現している生体から単離された細胞上、または嗅覚受容体ポリペプチドを遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で、前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、リポーターアッセイにより測定する、請求項８または９のいずれか１項に記載の方法。

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