JP6393505B2 - 生乾き臭抑制剤の探索方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生乾き臭抑制剤の探索方法に関する。
衣類、タオル、寝具等の繊維製品から生じる「生乾き臭」（又は部屋干し臭とも呼ばれる）とは、これら繊維製品を洗濯後に乾燥させたとき、特に、梅雨時における乾燥、又は閉め切った室内での乾燥等、洗濯後の繊維製品をその乾燥が不十分な状態で長時間放置したときに発生しやすい不快なニオイである。近年、共働き家庭の増加や家屋の高気密化等、ライフスタイルの変化から、繊維製品の生乾き臭は発生しやすい環境になってきていると考えられる。
生乾き臭は、中鎖アルデヒド、中鎖アルコール、ケトンなどの「黴様のニオイ」、短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸などの「酸っぱいニオイ」、窒素化合物などの「生臭いニオイ」及び硫黄化合物の臭いから構成される複合臭であり、特に中鎖脂肪酸の寄与度が大きいことが報告されている（非特許文献１）。特許文献１〜２には、生乾き臭に対する寄与度の大きい物質として、５−メチル−４−ヘキセン酸、５−メチル−２−ヘキセン酸及び４−メチル−３−ヘキセン酸が記載されている。さらに特許文献３には、４−メチル−３−ヘキセン酸が、雑巾様の臭いを有し、生乾き臭の主たる原因物質であることが記載されている。
従来の香料物質や消臭物質の開発においては、匂いの評価は専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約２％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
したがって、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、特定の悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもないことから、好ましい消臭手段である。特許文献４〜５には、嗅覚受容体の活性を指標として、嗅覚受容体アンタゴニズムによりヘキサン酸やスカトール等の悪臭を抑制する物質を探索することできることが記載されている。特許文献６にも、嗅覚受容体の活性を指標として汗臭を抑制する物質を探索することが記載されている。特許文献７には、イソ吉草酸やその等価体の存在下で嗅覚受容体をコードするポリペプチドの活性を測定することで、当該ポリペプチドの機能を調節する薬剤を同定する方法が記載されている。特許文献８には、嗅覚受容体をコードするポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定することにより、嗅覚の感覚に関連する化合物について化学物質のライブラリーをスクリーニングする方法が記載されている。
埴原，園田，「部屋干し臭を抑制する洗剤について」，香料，平成16年９月，No.223，p.109-116
本発明は、嗅覚受容体の応答を指標として生乾き臭抑制剤を効率良く探索する方法を提供する。
本発明者は、生乾き臭の主な原因物質である４−メチル−３−ヘキセン酸に応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功した。また本発明者は、当該嗅覚受容体又はそれと同様の機能を有するポリペプチドの応答を指標とすることにより、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによって生乾き臭を抑制する物質の評価及び選択が可能であることを見出した。
したがって本発明は、生乾き臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；
４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法を提供する。
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；
４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法を提供する。
本発明によれば、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより生乾き臭を選択的に消臭することができる生乾き臭抑制剤を、効率よく探索することができる。
本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段（例えば、封じ込め）、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、などが挙げられる。
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチドとは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，５：２６３−２７８）。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
図１に示すとおり、本発明者は、多くの嗅覚受容体の中から、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１を、生乾き臭の主な原因物質である４−メチル−３−ヘキセン酸に対して特異的に応答する嗅覚受容体として同定した。さらに図２に示すとおり、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１はいずれも、４−メチル−３−ヘキセン酸に対して濃度依存的に応答する。したがって、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１若しくはＯＲ５１Ｌ１、又はこれらと同様の機能を有するポリペプチドの応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより、中枢における生乾き臭の認識に変化を生じさせ、結果として、生乾き臭を選択的に抑制することができる。
したがって、本発明は、生乾き臭抑制剤の探索方法を提供する。当該方法は、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。同定された試験物質は、生乾き臭抑制剤として選択される。当該本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる方法であり得る。
本発明の別の実施形態は、４−メチル−３−ヘキセン酸臭抑制剤の探索方法である。当該方法は、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。同定された試験物質は、４−メチル−３−ヘキセン酸臭抑制剤として選択される。
上記本発明の方法においては、生乾き臭原因物質である４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有する嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質と４−メチル−３−ヘキセン酸とが添加される。
本発明の方法に使用される試験物質は、生乾き臭抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的若しくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
本発明の方法に使用される嗅覚受容体ポリペプチドは、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である。
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、及びＯＲ５１Ｌ１は、いずれもヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体である。ＯＲ５１Ｂ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１５７７３８６２２として登録されている。ＯＲ５１Ｂ２は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ５１Ｅ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２０５２７７３７７として登録されている。ＯＲ５１Ｅ１は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ５１Ｌ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５２３１７１４３として登録されている。ＯＲ５１Ｌ１は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ５１Ｂ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
ＯＲ５１Ｅ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
ＯＲ５１Ｌ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
本発明の方法では、上述した嗅覚受容体ポリペプチドから選択される少なくとも１種を使用すればよいが、いずれか２種以上を組み合わせて使用してもよい。好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種が使用され、より好ましくは少なくとも２種が使用される。さらに好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが組み合わせて使用され、なお好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１が組み合わせて使用される。
本発明の方法において、上記嗅覚受容体ポリペプチドは、４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、当該嗅覚受容体ポリペプチドは、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の、当該嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する当該組換え細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する人工脂質二重膜、などの形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体ポリペプチドの範囲に含まれる。
好ましい態様においては、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、嗅細胞等の上記嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する細胞、又は当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
好適には、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに、ＲＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を細胞に導入する。好ましくは、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに細胞に導入する。ＲＴＰ１Ｓの例としては、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されており、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
本発明の方法によれば、上記嗅覚受容体ポリペプチドへの試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸の添加に続いて、４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が測定される。測定は嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、細胞内ｃＡＭＰ量測定等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。したがって、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ等が挙げられる。上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する他の方法としては、カルシウムイメージング法が挙げられる。
次いで、測定された上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に基づいて、４−メチル−３−ヘキセン酸への応答に対して試験物質が及ぼす作用を評価し、当該応答を抑制する試験物質を同定する。試験物質による作用の評価は、試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答を、対照群における４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答と比較することによって行うことができる。対照群としては、異なる濃度の試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、試験物質を添加しなかった該嗅覚受容体ポリペプチド、対照物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、試験物質を添加する前の該嗅覚受容体ポリペプチドなどを挙げることができる。
例えば、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に対して試験物質が及ぼす作用は、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間、試験物質添加群と非添加群との間、試験物質添加群と対照物質添加群との間、又は試験物質添加前後で、４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を比較することによって評価することができる。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加により該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が抑制される場合、当該試験物質を、該嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答を抑制する物質として同定することができる。
例えば、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照群と比較して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていれば、当該試験物質を、４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することができる。あるいは、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照群と比較して統計学的に有意に抑制されていれば、当該試験物質を、４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することができる。
上記の手順で同定された試験物質は、生乾き臭の主な原因物質である４−メチル−３−ヘキセン酸に対する嗅覚受容体の応答を抑制することによって、個体による生乾き臭の認識を抑制することができる物質である。したがって、上記手順で同定された試験物質は、生乾き臭抑制剤として選択することができる。本発明の方法によって生乾き臭抑制剤として選択された物質は、４−メチル−３−ヘキセン酸に対する嗅覚受容体の応答抑制に基づく嗅覚マスキングによって、生乾き臭を抑制することができる。
したがって、一実施形態において、本発明の方法によって選択された物質は、生乾き臭抑制剤の有効成分であり得る。あるいは、本発明の方法によって選択された物質は、生乾き臭を抑制するための化合物又は組成物に、生乾き臭を抑制するための有効成分として含有され得る。またあるいは、本発明の方法によって選択された物質は、生乾き臭の抑制剤の製造のため、又は生乾き臭を抑制するための化合物若しくは組成物の製造のために使用することができる。
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞生乾き臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；
４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；
４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
＜２＞４−メチル−３−ヘキセン酸臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；
４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；
４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
＜３＞上記＜１＞又は＜２＞記載の方法であって、好ましくは、上記ＯＲ５１Ｂ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、上記ＯＲ５１Ｅ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ上記ＯＲ５１Ｌ１が配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、方法。
＜４＞上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の方法であって、
上記ＯＲ５１Ｂ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ５１Ｅ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
かつ
上記ＯＲ５１Ｌ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドである、
方法。
上記ＯＲ５１Ｂ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ５１Ｅ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
かつ
上記ＯＲ５１Ｌ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドである、
方法。
＜５＞上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の方法であって、上記ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、
好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも２種であり、
さらに好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドの組み合わせであり、
なお好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１の組み合わせである、
方法。
好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも２種であり、
さらに好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｌ１又はそれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドの組み合わせであり、
なお好ましくは、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１の組み合わせである、
方法。
＜６＞上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、対照群における４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答を測定することをさらに含み、かつ該対照群が、以下：
上記試験物質を添加しなかった上記嗅覚受容体ポリペプチド；
対照物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチド；又は
上記試験物質添加前の上記嗅覚受容体ポリペプチド
である、方法。
好ましくは、対照群における４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答を測定することをさらに含み、かつ該対照群が、以下：
上記試験物質を添加しなかった上記嗅覚受容体ポリペプチド；
対照物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチド；又は
上記試験物質添加前の上記嗅覚受容体ポリペプチド
である、方法。
＜７＞上記＜６＞記載の方法であって、好ましくは、
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答が、上記対照群における４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答と比べて統計学的に有意に抑制されていた場合に、該試験物質を４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答が、上記対照群における４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答と比べて統計学的に有意に抑制されていた場合に、該試験物質を４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
＜８＞上記＜６＞記載の方法であって、好ましくは、
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答が、上記対照群における４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答に対して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていた場合に、該試験物質を４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答が、上記対照群における４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答に対して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていた場合に、該試験物質を４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
＜９＞上記＜１＞、＜３＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答を抑制する試験物質を、生乾き臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。
＜１０＞上記＜２＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答を抑制する試験物質を、４−メチル−３−ヘキセン酸臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。
＜１１＞上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、
方法。
好ましくは、上記ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、
方法。
＜１２＞上記＜１１＞記載の方法であって、上記組換え細胞が、
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞であり、
より好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞である、
方法。
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞であり、
より好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞である、
方法。
＜１３＞上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドとして、上記＜１１＞又は＜１２＞記載の組換え細胞又はその培養物が使用される、
方法。
好ましくは、上記ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドとして、上記＜１１＞又は＜１２＞記載の組換え細胞又はその培養物が使用される、
方法。
＜１４＞上記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡ若しくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによる測定である、方法。
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡ若しくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによる測定である、方法。
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１ ４−メチル−３−ヘキセン酸に応答する嗅覚受容体の同定
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組み込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作製したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組み込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作製したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
２）ｐＭＥ１８Ｓ−ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ＲＴＰ１Ｓ（配列番号８）をコードするＲＴＰ１Ｓ遺伝子（配列番号７）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
ＲＴＰ１Ｓ（配列番号８）をコードするＲＴＰ１Ｓ遺伝子（配列番号７）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体４１７種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μＬずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
ヒト嗅覚受容体４１７種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μＬずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製した匂い物質（４−メチル−３−ヘキセン酸３ｍＭ）を含む溶液を７５μＬ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で２．５時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。匂い物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、匂い物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製した匂い物質（４−メチル−３−ヘキセン酸３ｍＭ）を含む溶液を７５μＬ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で２．５時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。匂い物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、匂い物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
５）結果
４１７種類の嗅覚受容体について４−メチル−３−ヘキセン酸３ｍＭに対する応答を測定した結果、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１が応答を示した（図１）。ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１の４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答は、濃度依存的であった（図２）。ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１は、これまで４−メチル−３−ヘキセン酸に応答することが見出されていない、新規の４−メチル−３−ヘキセン酸受容体である。
４１７種類の嗅覚受容体について４−メチル−３−ヘキセン酸３ｍＭに対する応答を測定した結果、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１が応答を示した（図１）。ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１の４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答は、濃度依存的であった（図２）。ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｌ１は、これまで４−メチル−３−ヘキセン酸に応答することが見出されていない、新規の４−メチル−３−ヘキセン酸受容体である。
Claims (6)
- 生乾き臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｌ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチド、配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチド、及び、配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４−メチル−３−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び４−メチル−３−ヘキセン酸を添加すること；
４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。 - 前記ＯＲ５１Ｂ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記ＯＲ５１Ｅ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ前記ＯＲ５１Ｌ１が配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載の方法。
- 前記嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、請求項１又は２記載の方法。
- 前記試験物質を添加しなかった前記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答を測定することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 前記試験物質を添加した前記嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答が、該試験物質を添加しなかった該嗅覚受容体ポリペプチドの４−メチル−３−ヘキセン酸に対する応答に対して６０％以下に抑制されていたときに、該試験物質を、４−メチル−３−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することをさらに含む、請求項４記載の方法。
- 前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡ若しくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによる測定である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
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