JP6533723B2 - 抗酸化剤 - Google Patents
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Description
(1)C末端にシステインを有するペプチドを有効成分とする抗酸化剤、
(2)さらに芳香族アミノ酸を有する請求項1記載の抗酸化剤、
(3)前記ペプチドのアミノ酸の数が2以上8以下である
(1)又は(2)に記載の抗酸化剤、
である。
本発明は、ペプチドにおいて、特定のアミノ酸が特定の位置に有することを特徴としており、これにより、抗酸化能に優れたペプチドとなる。
本発明で得られる抗酸化剤はC末端にシステインを有するペプチドである。
本発明で得られるペプチドは、C末端にシステインを有するペプチドであれば特に限定されず、アミノ酸等から合成されたものでも、タンパク質等を分解したものでもよい。
本発明で得られるペプチドのアミノ酸の数は、抗酸化効果が得られやすいことから、2以上30以下がよく、さらに2以上10以下がよく、さらに2以上8以下がよく、特に3以上5以下がよい。
また、本発明で得られるペプチドのアミノ酸の数は抗酸化効果が得られやすいことから、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、チロキシン等の芳香族アミノ酸を有するとよく、なかでもフェニルアラニン、トリプトファン、チロシンを有するとよい。
抗酸化能(Total Antioxidant Status:TAS)は、TASキット(ランドックス ラボラトリー社/Randox Laboratories Ltd.)を各ペプチド水溶液に用いて測定し、各ペプチド水溶液1mmoLあたりのTrolox(6−hydroxy−2,5,7,8−tetramethylchroman−2−carboxylic acid)当量(mmoL TE/L)として算出した。
本発明のペプチドの抗酸化能は、45(mmoL TE/L)以上がよくさらに50(mmoL TE/L)以上がよく、特に60(mmoL TE/L)以上がよい。なお上限は高い程好ましいため、特に限定はしない。
酸化触媒酵素ペルオキシダーゼ(メトミオグロビン)と過酸化水素によって、ABTS試薬[2,2‐アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)](ベーリンガー・マンハイム社/Boehringer Mannheim)がラジカル化されABTS・+が生成する。このラジカルABTS・+は、安定的で青緑色をしており、600nmの吸光度で測定することが出来る。検体中に抗酸化物質が含まれると、この青緑色のABTS・+の生成を阻害する。抗酸化物質の濃度に比例してこの青緑色の物質の生成が阻害される。
全ての合成ペプチドは、ゲンスクリプト社(GenScript Inc.)から入手した。
[実施例1]
<抗酸化剤の合成>
ゲンスクリプト社(GenScript Inc.)のカスタムペプチド合成によりトリペプチドLWC(N末端がロイシン、N末端から2番目のアミノ酸がトリプトファン、C末端がシステインのトリペプチド、以下ペプチドの記載方法はアミノ酸1文字略号を用い、N末端からC末端側に順に記載する)を作成し、抗酸化剤を得た。
実施例1で得られた抗酸化剤を、TASキット(ランドックス ラボラトリー社/Randox Laboratories Ltd.)を使用し、TASキット取扱説明書(Ver 61RA1224)に準じて抗酸化能を評価した。
具体的には、以下の表の試薬を用いて、以下の方法で抗酸化能を評価した。
28μLの純水をマイクロチューブに分注し、1.4mLのChromogen(試薬番号2)を混合後、37℃で1分間加温しブランクサンプルとする。
ブランクサンプルから714μL分注し、石英セルで吸光度600nmを測定し、この時の値をA1ブランクとする。
残りのブランクサンプルに140μLのSubstrate(試薬番号3)を混合し、37℃で3分間加温後、石英セルに移し、吸光度600nmを測定し、この時の値をA2ブランクとする。
A2ブランク−A1ブランク = ΔAブランクとする。
28μLのスタンダード(試薬番号4)をマイクロチューブに分注し、1.4mLのChromogen(試薬番号2)を混合後、37℃で1分間加温しスタンダードサンプルとする。
スタンダードサンプルから714μL分注し、石英セルで吸光度600nmを測定し、この時の値をA1スタンダードとする。
残りのスタンダードサンプルに140μLのSubstrate(試薬番号3)を混合し、37℃で3分間加温後、石英セルに移し、吸光度600nmを測定し、この時の値をA2スタンダードとする。
A2スタンダード−A1スタンダード= ΔAスタンダードとする。
Factor=スタンダード濃度/(ΔAブランク−ΔAスタンダード)
=2.18/(0.5509−0.1872)
=5.99
実施例1で得られた抗酸化剤2.0mgを、純水を用いて50μg/mLに調整し、ペプチド水溶液とした。
28μLのペプチド水溶液をマイクロチューブに分注し、1.4mLのChromogen(試薬番号2)を混合後、37℃で1分間加温しペプチドサンプルとする。
ペプチドサンプルから714μL分注し、石英セルで吸光度600nmを測定し、この時の値をA1ペプチドサンプルとする。
残りのペプチドサンプルに140μLの(試薬番号3)を混合し、37℃で3分間加温後、石英セルに移し、吸光度600nmを測定し、この時の値をA2ペプチドサンプルとする。
A2ペプチドサンプル−A1ペプチドサンプル=ΔAペプチドサンプルとする。
抗酸化能(mmoL TE/L) = Factor×(ΔAブランク−ΔAペプチドサンプル)/28×C
=5.99×(0.5509−0.4744)/0.333
=137.7
ただし、Cはペプチド水溶液濃度(moL/L)とする。
分光光度計はUV―2450(島津製作所)を用い、青緑色のABTS・+を波長600nmの吸光度で測定した。
なお、抗酸化能の測定値が0.1〜2.5(mmoL TE/L)から外れた場合は、純水で希釈又は濃縮し、測定値が0.1〜2.5(mmoL TE/L)となるようにした。
抗酸化剤の、アミノ酸配列の違いによる抗酸化能を調べた。
具体的には、実施例1において、合成するペプチドの配列をランダムに変更し、表1に示すアミノ酸配列に変更した以外は、実施例1と同様の方法で実施例2乃至9、比較例1乃至50のペプチドを合成した。
さらに、各実施例及び比較例で得られたペプチドを、実施例1の抗酸化能の測定方法と同様に、TASキット(ランドックス ラボラトリー社/Randox Laboratories Ltd.)を使用し、TASキット取扱説明書(Ver 61RA1224)に準じて抗酸化能を評価した。
具体的には、以下の表の試薬を用いて、以下の方法で抗酸化能を評価した。
また芳香族アミノ酸を有するペプチドは抗酸化能が高いことが理解される(実施例1、4、6乃至8)。
本発明で得られたTrolox当量を基に、コンピュータによるQSARモデル化技術を使用して、トリペプチドの抗酸化性を予測するモデル式の構築を行い、以下の式を得た。
Log [Activity] = 1.020C1+1.174C2+1.771C3−0.567H2+0.566 I1
+ 0.621 I3−0.163 Δ(ELUMO−EHOMO)2−0.150 Δ(ELUMO−EHOMO)3−0.596
(相関係数 r = 0.837)
ただし、Δ(ELUMO−EHOMO)n はN末端からn番目のアミノ酸のLUMOとHOMOのエネルギー差を表し、Cn、 Hn、 In はN末端からn番目のアミノ酸がそれぞれシステイン、ヒスチジン、芳香族性の時に1、それ以外の時に0の値をとる擬変数である。
また、上記のQSAR式の構築には、分析ソフトとしてQREG,version 2.05(Asao,M.ら、Japan Chemistry Program Exchange:Ibaraki,Japan)を使用した。
Claims (1)
- アミノ酸配列がLWC、LVC、SEC、WDC、VDC、RYC、FYC、LPCの1種または2種以上のC末端にシステインを有するペプチドを有効成分とする
抗酸化剤。
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JP2015180204A JP6533723B2 (ja) | 2015-09-11 | 2015-09-11 | 抗酸化剤 |
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