CN104114181B - 芳香族阳离子肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了芳香族阳离子肽组合物及其使用方法。该方法包括肽在电子传递、心磷脂过氧化的抑制、细胞凋亡抑制和电导中的用途。

Description

芳香族阳离子肽及其用途
与相关申请的交叉参考
本专利申请要求于2011年10月17日提交的美国临时专利申请号61/548,114的优先权，所述美国临时专利申请的内容在此全文以引用方式并入。
技术领域
本技术总体涉及芳香族阳离子肽组合物和在电子传递和电导中的使用方法。
发明内容
在一个方面，本技术提供了芳香族阳离子肽或其药学可接受的盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐。在一些实施例中，该肽包含
1.至少一个净正电荷；
2.最少三个氨基酸；
3.最多约二十个氨基酸；
4.净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；和
5.芳香族基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1时，pt也可以是1之外。
在一些实施例中，该肽包含氨基酸序列Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)。在一些实施例中，该肽包含下述中的一种或多种：
D-Arg-Dmt-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Trp-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Met-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe(NMe)-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2；
H-D-Arg(NαMe)-Dmt(NMe)-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Dmt-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Lys-Met-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Dmt-Lys-Met-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Sar-Gly-Cys-NH2；
H-D-Arg-Ψ[CH2-NH]Dmt-Lys-Phe-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Phe-NH2；
H-D-Arg-Dmt-LysΨ[CH2-NH]Phe-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Ψ[CH2-NH]Phe-NH2；
Lys-D-Arg-Tyr-NH2；
Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2；
2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2；
Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2；
Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2；
D-Arg-2′6′Dmt-Lys-Phe-NH2；
H-Phe-D-Arg-Phe-Lys-Cys-NH2；
Lys-D-Arg-Tyr-NH2；
D-Tyr-Trp-Lys-NH2；
Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2；
Tyr-His-D-Gly-Met；
Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2；
Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg；
D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg；
Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2；
Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His；
Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2；
Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2；
Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys；
Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2；
Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys；
Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH2；
D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2；
Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe；
Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe；
Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2；
Phe-Tyr-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr；
Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys；
Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2；,
Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly；
D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2；
Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-P he-Lys-Phe；
His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-T yr-His-Ser-NH2；
Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-H is-Trp-His-D-Lys-Asp；
Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-V al-Ile-D-His-Arg-Tyr-Lys-NH2；
Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；
Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；
Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸
Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸；
D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2；和
D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2。
在一些实施例中，“Dmt”指2′,6′-二甲基酪氨酸(2′6′-Dmt)或3′,5′-二甲基酪氨酸(3′5′Dmt)。
在一个实施例中，该肽由式I限定：
其中R1和R2独立地选自
(i)氢；
(ii)线性或分支C1-C6烷基；
(iii)其中m＝1-3；
(iv)
(v)
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地选自
(i)氢；
(ii)线性或分支C1-C6烷基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烷基氨基；
(vi)C1-C4二烷基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”包含氯、氟、溴和碘；和
n为1-5的整数。
在特定实施例中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12均为氢；并且n为4。在另一个实施例中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R11均为氢；R8和R12为甲基；R10为羟基；并且n为4。
在一个实施例中，该肽由式II限定：
其中R1和R2各自独立地选自
(i)氢；
(ii)线性或分支C1-C6烷基；
(iii)其中m＝1-3；
(iv)
(v)
R3和R4各自独立地选自
(i)氢；
(ii)线性或分支C1-C6烷基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烷基氨基；
(vi)C1-C4二烷基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”包含氯、氟、溴和碘；和
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自
(i)氢；
(ii)线性或分支C1-C6烷基；
(iii)C1-C6烷氧基；
(iv)氨基；
(v)C1-C4烷基氨基；
(vi)C1-C4二烷基氨基；
(vii)硝基；
(viii)羟基；
(ix)卤素，其中“卤素”包含氯、氟、溴和碘；和
n为1-5的整数。
在一个实施例中，该肽由下式限定：
还表示为Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一个实施例中，该肽由下式限定：
还表示为Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-19)。
在特定实施例中，R1和R2为氢；R3和R4为甲基；R5、R6、R7、R8和R9均为氢；并且n为4。
在一个实施例中，芳香族阳离子肽具有交替的芳香族和阳离子氨基酸的核心结构基序。例如，该肽可以是由下文所示式III-VI中的任一个限定的四肽：
芳香族-阳离子-芳香族-阳离子(式III)
阳离子-芳香族-阳离子-芳香族(式IV)
芳香族-芳香族-阳离子-阳离子(式V)
阳离子-阳离子-芳香族-芳香族(式VI)
其中，芳香族是选自下述的残基：Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)和环己基丙氨酸(Cha)；并且阳离子是选自下述的残基：Arg(R)、Lys(K)、正亮氨酸(Nle)和2-氨基-庚酸(Ahe)。
在一些实施例中，本文描述的芳香族阳离子肽包含所有左旋(L)氨基酸。
在一些方面，本公开内容提供了涉及细胞色素c的方法。在一些实施例中，该方法涉及增加含有细胞色素c的样品中的细胞色素c还原，包括使样品与有效量的芳香族阳离子肽或其盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐接触。另外或可替代地，在一些实施例中，该方法涉及增强含有细胞色素c的样品中通过细胞色素c的电子扩散，包括使样品与有效量的芳香族阳离子肽接触。另外或可替代地，在一些实施例中，该方法涉及增强含有细胞色素c的样品中的细胞色素c中的电子容量，包括使样品与有效量的芳香族阳离子肽接触。另外或可替代地，在一些实施例中，该方法涉及诱导含有细胞色素c的样品中的围绕细胞色素c的新型π-π相互作用，包括使样品与有效量的芳香族阳离子肽接触。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，该方法包括使样品与芳香族阳离子肽(例如D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2)和心磷脂接触。在一些实施例中，该方法包括使样品与心磷脂接触。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些实施例中，掺杂芳香族阳离子肽、或掺杂芳香族阳离子肽和心磷脂、或掺杂心磷脂的含有细胞色素c的样品包含传感器的部件，例如光电池或发光传感器；导体；开关例如晶体管；发光元件例如发光二极管；电荷储存或蓄积装置，例如光伏装置；二极管；集成电路；固态装置；或任何其他有机电子装置。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些实施例中，细胞色素c以纯化、分离和/或浓缩形式存在于样品中。在一些实施例中，细胞色素c以天然形式存在于样品中。例如，在一些实施例中，细胞色素c存在于一个或多个线粒体中。在一些实施例中，线粒体是分离的。在其他实施例中，线粒体存在于细胞或细胞制剂中。在一些实施例中，细胞色素c掺杂芳香族阳离子肽或其盐，例如乙酸盐或三氟乙酸盐。在一些实施例中，细胞色素c掺杂芳香族阳离子肽或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)和心磷脂。在一些实施例中，细胞色素c掺杂心磷脂。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，本公开内容提供了涉及线粒体呼吸的方法。在一些实施例中，该方法涉及增加线粒体O2消耗，增加样品中的ATP合成和/或增强细胞色素c耗尽丝状体(mitoplast)中的呼吸。在一些实施例中，使含有线粒体和/或细胞色素耗尽的丝状体的样品与有效量的芳香族阳离子肽或其盐接触。在一些实施例中，使含有线粒体和/或细胞色素耗尽的丝状体的样品与有效量的芳香族阳离子肽或其盐和心磷脂接触。在一些实施例中，使含有线粒体和/或细胞色素耗尽的丝状体的样品与有效量的心磷脂接触。在一些实施例中，线粒体以纯化、分离和/或浓缩形式存在于样品中。在一些实施例中，线粒体以天然形式存在于样品中。例如，在一些实施例中，线粒体存在于细胞或细胞制剂中。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，提供了传感器。在一些实施例中，传感器包括掺杂一定水平的本文公开的芳香族阳离子肽或其盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐的细胞色素c(“cyt c)。在一些实施例中，传感器包括掺杂一定水平的本文公开的芳香族阳离子肽或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)和心磷脂的细胞色素c。在一些实施例中，传感器包括掺杂一定水平的心磷脂的细胞色素c。在一些实施例中，传感器包括仪表，以测量由芳香族阳离子肽、肽和心磷脂或心磷脂水平的改变诱导的细胞色素c特性的改变。在一些实施例中，肽或心磷脂或两者的水平响应细胞色素c的温度和细胞色素c的pH中的至少一种的变化而改变。在一些实施例中，特性是电导率，并且仪表包括与细胞色素c电连通的阳极和阴极。在一些实施例中，特性是光致发光，并且仪表包括光检测器，以测量下述中的至少一种的改变：由掺杂一定水平的本发明芳香族阳离子肽或芳香族阳离子肽和心磷脂或心磷脂的细胞色素c发出的光强度，和由掺杂肽的细胞色素c或掺杂肽和心磷脂的细胞色素c或掺杂心磷脂的细胞色素c发出的光波长。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，提供了感测方法。在一些实施例中，该方法包括测量掺杂一定水平的芳香族阳离子肽或其盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐的细胞色素c的特性的改变。在一些实施例中，该方法包括测量掺杂一定水平的芳香族阳离子肽或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)和心磷脂的细胞色素c的特性的改变。在一些实施例中，该方法包括测量掺杂心磷脂的细胞色素c的特性的改变。在一些实施例中，测量的改变由芳香族阳离子肽、心磷脂或肽和心磷脂水平的改变诱导。在一些实施例中，肽、心磷脂或肽和心磷脂的水平响应细胞色素c的温度和细胞色素c的pH中的至少一种的变化而改变。在一些实施例中，特性是电导率、光致发光强度和光致发光波长中的至少一种。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，提供了开关。在一些实施例中，开关包含细胞色素c和芳香族阳离子肽的源。在一些实施例中，开关包含细胞色素c以及芳香族阳离子肽和心磷脂的源。在一些实施例中，开关包含细胞色素c和心磷脂的源。在一些实施例中，肽、心磷脂和肽或心磷脂与细胞色素c连通。在一些实施例中，提供了致动器，以控制与细胞色素c连通的肽、肽和心磷脂或心磷脂的量。在一些实施例中，致动器控制细胞色素c的温度和细胞色素c的pH中的至少一种。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，提供了转换方法。在一些实施例中，该方法包括改变与细胞色素c连通的芳香族阳离子肽或其盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐的水平。在一些实施例中，该方法包括改变与细胞色素c连通的芳香族阳离子肽或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)和心磷脂的水平。在一些实施例中，该方法包括改变与细胞色素c连通的心磷脂的水平。在一些实施例中，改变肽、心磷脂或肽和心磷脂的水平包括改变细胞色素c的温度和细胞色素c的pH中的至少一种。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，提供了发光元件。在一些实施例中，发光元件包含掺杂有效量的芳香族阳离子肽例如D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2和/或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)的细胞色素c和刺激来自细胞色素c的光发射的源。在一些实施例中，发光元件包含掺杂有效量的芳香族阳离子肽例如D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2和/或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)和心磷脂的细胞色素c和刺激来自细胞色素c的光发射的源。在一些实施例中，发光元件包含掺杂有效量的心磷脂的细胞色素c和刺激来自细胞色素c的光发射的源。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，提供了发光方法。在一些实施例中，该方法包括刺激掺杂有效量的芳香族阳离子肽或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)例如D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2和/或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2的细胞色素c。在一些实施例中，该方法包括刺激掺杂有效量的芳香族阳离子肽或其盐(例如乙酸盐或三氟乙酸盐)例如D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2和/或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2和心磷脂的细胞色素c。在一些实施例中，该方法包括刺激掺杂有效量的心磷脂的细胞色素c。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，本公开内容提供了用于细胞色素c生物传感器的方法和组合物。在一些实施例中，细胞色素c生物传感器包括本文公开的芳香族阳离子肽或其盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐中的一种或多种。在一些实施例中，细胞色素c生物传感器包括本文公开的芳香族阳离子肽或其盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐和心磷脂中的一种或多种。在一些实施例中，细胞色素c生物传感器包括心磷脂。在一些实施例中，掺杂肽、掺杂心磷脂或掺杂肽/心磷脂的细胞色素c充当生物传感器内的氧化还原活性酶和电极之间的介质。在一些实施例中，掺杂肽的细胞色素c直接固定在生物传感器的电极上。在一些实施例中，掺杂肽/心磷脂的细胞色素c直接固定在生物传感器的电极上。在一些实施例中，掺杂心磷脂的细胞色素c直接固定在生物传感器的电极上。在一些实施例中，肽、心磷脂或肽和心磷脂与生物传感器内的细胞色素c连接。在一些实施例中，肽、心磷脂或肽和心磷脂不与细胞色素c连接。在一些实施例中，心磷脂、肽或细胞色素c中的一种或多种固定在生物传感器内的表面上。在一些实施例中，心磷脂、肽或细胞色素c中的一种或多种在生物传感器内可自由扩散。在一些实施例中，生物传感器包括肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，生物传感器包括芳香族阳离子肽Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在一些方面，本公开内容提供了用于环境污染物的生物修复的组合物。在一些实施例中，组合物包含表达一种或多种芳香族阳离子肽或其盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐的重组细菌。在一些实施例中，重组细菌包含编码一种或多种芳香族阳离子肽的核酸。在一些实施例中，核酸在诱导型启动子的控制下表达。在一些实施例中，核酸在组成型启动子的控制下表达。在一些实施例中，核酸包含质粒DNA。在一些实施例中，核酸包含基因组插入片段。在一些实施例中，重组细菌源自表7中列出的细菌物种。
在一些方面，本公开内容提供了用于环境污染物的生物修复的方法。在一些实施例中，该方法包括使含有环境污染物的材料与生物修复组合物接触，所述生物修复组合物包含表达一种或多种芳香族阳离子肽的重组细菌。在一些实施例中，本文公开的方法包括用于异化金属还原的方法。在一些实施例中，金属包含Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Pd、Ag、Cd、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Cn、Al、Ga、In、Sn、Ti、Pb或Bi。在一些实施例中，本文公开的方法包括用于非金属的异化还原的方法。在一些实施例中，非金属包含硫酸盐。在一些实施例中，本文公开的方法包括用于高氯酸盐的异化还原的方法。在一些实施例中，高氯酸盐包含NH4ClO4、CsClO4、LiClO4、Mg(ClO4)2、HClO4、KClO4、RbClO4、AgClO4或NaClO4。在一些实施例中，本文公开的方法包括用于异化硝酸盐还原的方法。在一些实施例中，硝酸盐包含HNO3、LiNO3、NaNO3、KNO3、RbNO3、CsNO3、Be(NO3)2、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2、Sr(NO3)2、Ba(NO3)2、Sc(NO3)3、Cr(NO3)3、Mn(NO3)2、Fe(NO3)3、Co(NO3)2、Ni(NO3)2、Cu(NO3)2、Zn(NO3)2、Pd(NO3)2、Cd(NO3)2、Hg(NO3)2、Pb(NO3)2或Al(NO3)3。在一些实施例中，本文公开的方法包括用于放射性核素的异化还原的方法。在一些实施例中，放射性核素包含锕系元素。在一些实施例中，放射性核素包含铀。在一些实施例中，本文公开的方法包括用于甲基-叔丁基醚(MTBE)、氯乙烯或二氯乙烯的异化还原的方法。
在一些实施例中，本文描述的生物修复方法原位进行。在一些实施例中，本文描述的生物修复方法非原位进行。
在一些实施例中，本文描述的生物修复方法包括使污染物与重组细菌接触，所述重组细菌包含编码一种或多种芳香族阳离子肽的核酸。在一些实施例中，核酸在诱导型启动子的控制下表达。在一些实施例中，核酸在组成型启动子的控制下表达。在一些实施例中，核酸包含质粒DNA。在一些实施例中，核酸包含基因组插入片段。在一些实施例中，重组细菌源自表7中列出的细菌物种。
在本文公开的生物修复方法和组合物的一些实施例中，芳香族阳离子肽包含D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2。
附图说明
图1是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加细胞色素c还原率的图表。
图2(上图)是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增强通过细胞色素c的电子扩散的图表。图2(下图)是显示在100mV/下具有渐增SS31剂量(20mM Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液pH7的溶液中的细胞色素c的循环伏安图的图。
图3是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加细胞色素c中的电子容量的图表。
图4是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)诱导围绕细胞色素c血红素的新型π-π相互作用的图表。
图5是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加分离的线粒体中的O2消耗的图表。
图6是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加分离的线粒体中的ATP合成的图表。
图7是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增强细胞色素c耗尽的丝状体中的呼吸的图表。
图8是掺杂肽的细胞色素c传感器的图解。
图9是可替代的掺杂肽的细胞色素c传感器的图解。
图10是掺杂肽的细胞色素c开关的图解。
图11是生物传感器中的电子流的图解，在所述生物传感器中掺杂肽的细胞色素c充当流向电极的电子流中的介质。
图12是生物传感器中的电子流的图解，在所述生物传感器中掺杂肽的细胞色素c固定在电极上。
图13是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)和Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)促进细胞色素c还原的图表。
图14是显示如通过分离的大鼠肾线粒体中的O2消耗测量的，肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)和Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)促进电子流量的图表。
图15是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)和Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)增加分离的线粒体中的ATP生产率的图表。
图16是有机发光晶体管的方框图。
图17是有机发光二极管的方框图。
图18是分散的异质连接有机光伏电池的方框图。
图19(a)示出使用高度折叠的异质连接有机光伏电池的电子空穴对生成。图19(b)示出用控制生长的异质连接有机光伏电池作出的电子空穴对生成。
图20示出在有机电子装置的制造过程中用于沉积有机材料薄膜的技术，所述有机电子装置包括但不限于有机发光晶体管、有机发光二极管和有机光伏电池。
图21是显示肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap--NH2(SS-19)、Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)和Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)与CL的相互作用的图表。
图22是显示肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap--NH2(SS-19)与细胞色素c的相互作用的图表。
图23是显示肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)、Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)和Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)与细胞色素c和CL的相互作用的图表。
图24是显示肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)、D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)、Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)和D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)保护细胞色素c的血红素环境不受CL的酰基链影响的图表。
图25是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)、D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)防止由CL引起的细胞色素c还原的抑制的图表。
图26是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)和Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)增强分离的线粒体中的O2消耗的图表。
图27是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加分离的线粒体中的ATP合成的图表。
图28是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增强细胞色素c耗尽的丝状体中的呼吸的图表。
图29是显示肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)、Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)、Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)、Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)和D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)防止细胞色素c/CL复合物中的过氧化物酶活性的图表。
具体实施方式
应当理解本发明的某些方面、模式、实施例、变化和特点在下文以不同的详细水平描述，以便提供本发明的基本理解。如本说明书中使用的某些术语的定义在下文提供。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
在实践本公开内容中，使用细胞生物学、分子生物学、蛋白质生物化学、免疫学和细菌学的许多常规技术。这些技术是本领域众所周知的，并且在任何数目的可用出版物中提供，包括Current Protocols in Molecular Biology,第I-III卷，Ausubel，编辑(1997)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。
如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数所指对象，除非内容另有明确说明。例如，提及“细胞”包括两种或更多种细胞的组合等等。
如本文使用的，试剂、药物或肽对受试者的“施用”包括将化合物引入或递送至受试者以执行其预期功能的任何途径。施用可通过任何合适途径执行，包括经口、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)或局部。施用包括自施用和通过另一者的施用。
如本文使用的，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及以后修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指这样的化合物，其具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即与氢、羧基、氨基和R基结合的α-碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指这样的化学化合物，其具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及。
如本文使用的，术语“有效量”指足以实现所需治疗和/或预防效应的数量。在治疗或预防应用的背景下，施用于受试者的组合物量将取决于疾病的类型和严重性，以及个体的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受。它还将取决于疾病的程度、严重性和类型。取决于这些及其他因素，技术人员将能够测定适当剂量。组合物还可与一种或多种另外的治疗性化合物组合施用。在一些实施例中，术语“有效量”指足以实现所需电子或电导效应例如以促进或增强电子转移的数量。
如本文使用的，“外源核酸”指这样的核酸(例如DNA、RNA)，其并非天然存在于宿主细胞内，而是从外部源引入。如本文使用的，外源核酸指未整合到宿主细胞的基因组内而是保持分离的核酸，例如细菌质粒核酸。如本文使用的，“细菌质粒”指细菌起源的环状DNA，其充当目的序列的载体和用于在细菌宿主细胞中表达序列的工具。
“分离的”或“纯化的”多肽或肽基本上不含来自试剂源自其的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染多肽，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学品。例如，分离的芳香族阳离子肽或分离的细胞色素c蛋白质将不含这样的材料，其将干扰试剂的诊断或治疗用途，或干扰肽的电导或电子特性。此类干扰材料可包括酶、激素及其他蛋白质性和非蛋白质性溶质。
如本文使用的，“诱导型启动子”指这样的启动子，其受某些条件例如温度或特定分子的存在影响，且仅在满足这些条件时，促进可操作地连接的目的核酸序列的表达。
如本文使用的，“组成型启动子”指这样的启动子，其在所有或大多数环境条件下促进可操作地连接的目的核酸序列的表达。
如本文使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以意指包含通过肽键或经修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物，即肽等排物。多肽指通常被称为肽、糖肽或寡聚物的短链，和一般被称为蛋白质的更长链两者。多肽可含有20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通过天然过程例如翻译后加工、或通过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰的氨基酸序列。
如本文使用的，“重组细菌”指已改造为携带和/或表达一种或多种外源核酸(例如DNA)序列的细菌。
如本文使用的，术语“处理”或“治疗”或“减轻”指治疗性处理和预防或防止措施两者，其中目的是预防或减慢(减轻)靶向病理学病症或障碍。还应当理解如所述的医学病症的多种治疗或预防模式意指“基本的”，其包括完全治疗或预防以及少于完全治疗或预防，并且其中达到一些生物学或医学相关结果。
如本文使用的，障碍或病症的“预防”或“防止”指这样的化合物，相对于未经处理的对照样品，其降低经处理的样品中的障碍或病症的出现，或者相对于未经处理的对照样品，延迟障碍或病症的一种或多种症状的发作或降低障碍或病症的一种或多种症状的严重性。
芳香族阳离子肽
本技术涉及芳香族阳离子肽的用途。在一些实施例中，该肽可用于涉及电导的方面。
芳香族阳离子肽是水溶性和高度极性的。尽管有这些特性，该肽仍可容易地穿透细胞膜。芳香族阳离子肽通常包括由肽键共价连接的最少三个氨基酸或最少四个氨基酸。芳香族阳离子肽中存在的氨基酸的最大数目是由肽键共价连接的约二十个氨基酸。适当地，氨基酸的最大数目是约十二、约九或约六。
芳香族阳离子肽的氨基酸可以是任意氨基酸。如本文使用的，术语“氨基酸”用于指含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。通常，至少一个氨基在相对于羧基的α位置处。氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括例如在哺乳动物蛋白质中通常发现的二十种最常见的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。其他天然存在的氨基酸包括例如在与蛋白质合成不相关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，氨基酸鸟氨酸和瓜氨酸在尿素生产过程中的哺乳动物代谢中合成。天然存在的氨基酸的另一个例子包括羟脯氨酸(Hyp)。
该肽任选含有一种或多种非天然存在的氨基酸。最佳地，该肽不具有天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸可以是左旋的(L-)、右旋的(D-)或其混合物。非天然存在的氨基酸是这样的氨基酸，其通常在活生物体中的正常代谢过程中未合成，并且在蛋白质中未天然存在。另外，天然存在的氨基酸适当地也不由常见蛋白酶识别。天然存在的氨基酸可存在于肽中的任何位置处。例如，非天然存在的氨基酸可在N末端、C末端或N末端和C末端之间的任何位置处。
非天然氨基酸可例如包含在天然氨基酸中未发现的烷基、芳基或烷基芳基。非天然烷基氨基酸的一些例子包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸。非天然芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯甲酸。非天然烷基芳基氨基酸的一些例子包括邻、间和对氨基苯乙酸和γ-苯基-β-氨基丁酸。非天然存在的氨基酸包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可例如包括一个或多个化学基团对天然存在的氨基酸的添加。
例如，一个或多个化学基团可加入苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳环的2′、3′、4′、5′或6′位置或者色氨酸残基的苯并环的4′、5′、6′或7′位置中的一个或多个。基团可以是可加入芳环的任何化学基团。此类基团的一些例子包括分支或未分支的C1-C4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基、C1-C4烷基氧基(即烷氧基)、氨基、C1-C4烷基氨基和C1-C4二烷基氨基(例如甲基氨基、二甲氨基)、硝基、羟基、卤素(即氟、氯、溴或碘)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些具体例子包括正缬氨酸(Nva)和正亮氨酸(Nle)。
肽中的氨基酸修饰的另一个例子是肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基的衍生化。一个衍生化例子是由氨或者由伯胺或仲胺酰胺化，所述伯胺或仲胺例如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺。另一个衍生化例子包括由例如甲醇或乙醇酯化。另一种此类修饰包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基的衍生化。例如，此类氨基可以是酰化的。一些合适的酰基包括例如苯甲酰基或包含上文提及的C1-C4烷基中的任一个的烷酰基例如乙酰基或丙酰基。
非天然存在的氨基酸适当地对常见蛋白酶是抗性或不敏感的。对蛋白酶是抗性或不敏感的非天然存在的氨基酸的例子包括右旋(D-)形式的上述天然存在的L-氨基酸中的任一个，以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。D-氨基酸通常不存在于蛋白质中，尽管它们在某些肽抗生素中发现，所述肽抗生素由细胞的正常核糖体蛋白合成机制以外的方法合成。如本文使用的，D-氨基酸视为非天然存在的氨基酸。
为了使蛋白酶敏感性降到最低，该肽应具有由常见蛋白酶识别的小于五个、小于四个、小于三个或小于两个连接L-氨基酸，与氨基酸是天然存在的还是非天然存在的无关。在一个实施例中，该肽仅具有D-氨基酸，且不具有L-氨基酸。如果该肽含有蛋白酶敏感的氨基酸序列，则氨基酸中的至少一个优选是非天然存在的D-氨基酸，由此赋予蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的例子包括由常见蛋白酶例如内肽酶和胰蛋白酶容易切割的两个或更多个连接的碱性氨基酸。碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
与肽中的氨基酸残基总数目相比较，芳香族阳离子肽应在生理pH下具有最小数目的净正电荷。在生理pH下的净正电荷的最小数目在下文将被称为(pm)。肽中的氨基酸残基总数目在下文将被称为(r)。下文讨论的净正电荷的最小数目均在生理pH下。如本文使用的术语“生理pH”指在哺乳动物机体的组织和器官的细胞中的正常pH。例如，人的生理pH通常为大约7.4，但哺乳动物中的正常生理pH可以是约7.0-约7.8的任何pH。
如本文使用的“净电荷”指由肽中存在的氨基酸携带的正电荷数目和负电荷数目的平衡。在本说明书中，应当理解净电荷在生理pH下测量。在生理pH下带正电的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。在生理pH下带负电的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有带正电的N末端氨基和带负电的C末端羧基。电荷在生理pH下彼此抵消。作为计算净电荷的例子，肽Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-D-Arg具有一个带负电的氨基酸(即Glu)和四个带正电的氨基酸(即两个Arg残基、一个Lys和一个His)。因此，上述肽具有净正电荷三。
在一个实施例中，芳香族阳离子肽具有的在生理pH下的净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基总数目(r)之间的关系如下：
表1.氨基酸数目和净正电荷(3pm≤p+1)
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一个实施例中，芳香族阳离子肽具有的在净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系为：其中2pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基总数目(r)之间的关系如下：
表2.氨基酸数目和净正电荷(2pm≤p+1)
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10
在一个实施例中，净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数目(r)相等。在另一个实施例中，该肽具有三个或四个氨基酸残基和最少一个净正电荷、适当地最少二个净正电荷和更优选地最少三个净正电荷。
还重要的是，芳香族阳离子肽具有与净正电荷的总数目(pt)相比较最小数目的芳香族基团。芳香族基团的最小数目在下文将被称为(a)。具有芳香族基团的天然存在的氨基酸包括氨基酸组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。例如，六肽Lys-Gln-Tyr-D-Arg-Phe-Trp具有净正电荷二(由赖氨酸残基和精氨酸残基贡献)以及三个芳香族基团(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基贡献)。
芳香族阳离子肽还应具有的在芳香族基团的最小数目(a)和在生理pH下的净正电荷的总数目(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除了当pt是1时，a也可以是1之外。在该实施例中，芳香族基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(pt)之间的关系如下：
表3.芳香族基团和净正电荷(3a≤pt+1或a＝pt＝1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(a) 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一个实施例中，芳香族阳离子肽具有的在芳香族基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数。在该实施例中，芳香族氨基酸残基的最小数目(a)和净正电荷的总数目(pt)之间的关系如下：
表4.芳香族基团和净正电荷(2a≤pt+1或a＝pt＝1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(a) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10
在另一个实施例中，芳香族基团的数目(a)和净正电荷的总数目(pt)相等。
羧基且尤其是C末端氨基酸的末端羧基适当地由例如氨酰胺化，以形成C末端酰胺。作为另外一种选择，C末端氨基酸的末端羧基可由任一伯胺或仲胺酰胺化。所述伯胺或仲胺可以例如是烷基，尤其是分支的或无分支的C1-C4烷基或者芳基胺。相应地，在肽的C末端处的氨基酸可转化为酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N,N-二甲基酰胺基、N,N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或N-苯基-N-乙基酰胺基。未存在于芳香族阳离子肽的C末端处的天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸残基的游离羧酸酯基团也可被酰胺化，不论它们是否存在于肽内。在这些内部位置处的酰胺化可以是由氨或者上述伯胺或仲胺中的任一个。
在一个实施例中，芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷和至少一个芳香族氨基酸的三肽。在特定实施例中，芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。
在一个实施例中，芳香族阳离子肽具有
1.至少一个净正电荷；
2.最少三个氨基酸；
3.最多约二十个氨基酸；
4.净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；和
5.芳香族基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1时，pt也可以是1之外。
在另一个实施例中，本发明提供了用于降低经历线粒体通透性转换(MPT)的线粒体数目或防止哺乳动物的移除器官中的线粒体通透性转换的方法。该方法包括给移除器官施用有效量的具有下述特性的芳香族阳离子肽：
至少一个净正电荷；
最少三个氨基酸；
最多约二十个氨基酸；
净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；和
芳香族基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1时，pt也可以是1之外。
在另外一个实施例中，本发明提供了用于降低经历线粒体通透性转换(MPT)的线粒体数目或防止有此需要的哺乳动物中的线粒体通透性转换的方法。该方法包括给哺乳动物施用有效量的具有下述特性的芳香族阳离子肽：
至少一个净正电荷；
最少三个氨基酸；
最多约二十个氨基酸；
净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；和
芳香族基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1时，pt也可以是1之外。
芳香族阳离子肽包括但不限于下述示出肽：
H-Phe-D-Arg Phe-Lys-Cys-NH2
D-Arg-Dmt-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Trp-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Met-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe(NMe)-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2；
H-D-Arg(NαMe)-Dmt(NMe)-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Dmt-Lys-Trp-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Lys-Met-NH2；
D-Arg-Dmt-Lys-Dmt-Lys-Met-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Sar-Gly-Cys-NH2；
H-D-Arg-Ψ[CH2-NH]Dmt-Lys-Phe-NH2；
H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Phe-NH2；
H-D-Arg-Dmt-LysΨ[CH2-NH]Phe-NH2；和
H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Ψ[CH2-NH]Phe-NH2，
Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2
2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2
Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2
Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2
D-Arg-2′6′Dmt-Lys-Phe-NH2
H-Phe-D-Arg-Phe-Lys-Cys-NH2
Lys-D-Arg-Tyr-NH2，
D-Tyr-Trp-Lys-NH2，
Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2，
Tyr-His-D-Gly-Met,
Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2，
Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg，
D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg，
Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2，
Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His，
Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2，
Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2，
Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys，
Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2，
Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys，
Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH2，
D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2，
Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe，
Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe，
Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2，
Phe-Tyr-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr，
Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys，
Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2，
Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly，
D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2，
Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-P he-Lys-Phe，
His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-T yr-His-Ser-NH2，
Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-H is-Trp-His-D-Lys-Asp和
Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-V al-Ile-D-His-Arg-Tyr-Lys-NH2；
Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；
Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸；
Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；
Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸和D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2；和
D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2。
在一些实施例中，可用于本发明的方法中的肽是具有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物的肽。在一些实施例中，酪氨酸的衍生物包括2′-甲基酪氨酸(Mmt)；2′,6′-二甲基酪氨酸(2′6′Dmt)；3′,5′-二甲基酪氨酸(3′5′Dmt)；N,2′,6′-三甲基酪氨酸(Tmt)；和2′-羟基-6′-甲基酪氨酸(Hmt)。
在一个实施例中，该肽具有式Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(在本文中被称为SS-01)。SS-01具有由氨基酸酪氨酸、精氨酸和赖氨酸贡献的净正电荷三，并且具有由氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸贡献的两个芳香族基团。SS-01的酪氨酸可以是经修饰的酪氨酸衍生物例如2′,6′-二甲基酪氨酸，以产生具有式2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(在本文中被称为SS-02)的化合物。
在合适的实施例中，在N末端处的氨基酸残基是精氨酸。此类肽的例子是D-Arg-2′6′Dmt-Lys-Phe-NH2(在本文中被称为SS-31)。
在另一个实施例中，在N末端处的氨基酸是苯丙氨酸或其衍生物。在一些实施例中，苯丙氨酸的衍生物包括2′-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2′,6′-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N,2′,6′-三甲基苯丙氨酸(Tmp)和2′-羟基-6′-甲基苯丙氨酸(Hmp)。此类肽的例子是Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(在本文中被称为SS-20)。在一个实施例中，SS-02的氨基酸序列重排，使得Dmt不在N末端处。此类芳香族阳离子肽的例子具有式D-Arg-2′6′Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)。
在另外一个实施例中，芳香族阳离子肽具有式Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2(在本文中被称为SS-30)。作为另外一种选择，N末端苯丙氨酸可以是苯丙氨酸的衍生物，例如2′,6′-二甲基苯丙氨酸(2′6′Dmp)。含有在氨基酸位置一处的2′,6′-二甲基苯丙氨酸的SS-01具有式2′,6′-Dmp-D-Arg-Dmt-Lys-NH2。
在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
本文提及的肽及其衍生物还可包括功能类似物。如果类似物具有与所述肽相同的功能，则肽视为功能类似物。类似物例如可以是肽的置换变体，其中一个或多个氨基酸由另一个氨基酸置换。适当的肽置换变体包括保守氨基酸置换。氨基酸可根据其物理化学特征如下分组：
(a)非极性氨基酸：Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G)Cys(C)；
(b)酸性氨基酸：Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q)；
(c)碱性氨基酸：His(H)Arg(R)Lys(K)；
(d)疏水氨基酸：Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V)；和
(e)芳香族氨基酸：Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H)。
肽中的氨基酸由相同组的另一种氨基酸的置换被称为保守置换，并且可保存原始肽的物理化学特征。相比之下，肽中的氨基酸由不同组的另一种氨基酸的置换一般更可能改变原始肽的特征。可用于本发明实践的类似物的非限制性例子包括但不限于表5中所示的芳香族阳离子肽。
表5.肽类似物的例子
Cha＝环己基
在某些情况下，使用还具有阿片样物质受体激动剂活性的肽可以是有利的。可用于本发明实践中的类似物的例子包括但不限于表6中所示的芳香族阳离子肽。
表6.具有阿片样物质受体激动剂活性的肽
Dab＝二氨基丁酸
Dap＝二氨基丙酸
Dmt＝二甲基酪氨酸
Mmt＝2′-甲基酪氨酸
Tmt＝N,2′,6′-三甲基酪氨酸
Hmt＝2′-羟基,6′-甲基酪氨酸
dnsDap＝β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸
atnDap＝β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸
Bio＝生物素
具有阿片样物质受体激动剂活性的另外的肽包括Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸和Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸。
具有μ阿片样物质受体激动剂活性的肽通常为在N末端(即第一氨基酸位置)处具有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物的肽。适合的酪氨酸衍生物包括2′-甲基酪氨酸(Mmt)；2′,6′-二甲基酪氨酸(2′6′-Dmt)；3′,5′-二甲基酪氨酸(3′5′Dmt)；N,2′,6′-三甲基酪氨酸(Tmt)；和2′-羟基-6′-甲基酪氨酸(Hmt)。
不具有μ阿片样受体激动剂活性的肽通常在N末端(即氨基酸位置1)处不具有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物。在N末端处的氨基酸可以是酪氨酸以外的任何天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在一个实施例中，在N末端处的氨基酸是苯丙氨酸或其衍生物。苯丙氨酸的示例性衍生物包括2′-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2′,6′-二甲基苯丙氨酸(2′,6′-Dmp)、N,2′,6′-三甲基苯丙氨酸(Tmp)和2′-羟基-6′-甲基苯丙氨酸(Hmp)。
表5和6中所示的肽的氨基酸可以为L-或D-构型。
在一些实施例中，芳香族阳离子肽包括至少一个精氨酸和/或至少一个赖氨酸残基。在一些实施例中，精氨酸和/或赖氨酸残基充当电子受体且参与质子偶联的电子传递。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含导致例如在SS-31中存在的“电荷-环-电荷-环”构型的序列。另外或可替代地，在一些实施例中，芳香族阳离子肽包括含硫醇残基例如半胱氨酸和甲硫氨酸。在一些实施例中，包括含硫醇残基的肽直接贡献电子且还原细胞色素c。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包括在肽的N末端和/或C末端处的半胱氨酸(vysteine)。
在一些实施例中，提供了肽多聚体。例如，在一些实施例中，提供了二聚体。例如SS-20二聚体：Phe-D-Arg-Phe-Lys-Phe-D-Arg-Phe-Lys。在一些实施例中，二聚体是SS-31二聚体：D-Arg-2′6′Dmt-Lys-Phe-D-Arg-2′6′Dmt-Lys-Phe-NH2。在一些实施例中，多聚体是三聚体、四聚体和/或五聚体。在一些实施例中，多聚体包括不同单体肽的组合(例如与SS-31肽连接的SS-20肽)。在一些实施例中，这些更长的类似物可用作治疗分子和/或可用于本文公开的传感器、开关和导体中。
在一些实施例中，本文描述的芳香族阳离子肽包含所有左旋(L)氨基酸。
肽合成
可通过本领域众所周知的方法的任一种来合成肽。用于化学方式合成蛋白质的合适方法包括例如由Stuart和Young在Solid Phase Peptide Synthesis,第二版，PierceChemical Company(1984)和在Methods Enzymol.,289,Academic Press,Inc,New York(1997)中描述的方法。
使肽针对酶促降解稳定化的一种方法是用D-氨基酸替换在经受切割的肽键处的L-氨基酸。制备除了已经存在的D-Arg残基之外还含有一个或多个D-氨基酸残基的芳香族阳离子肽类似物。防止酶促降解的另一种方法是使在肽的一个或多个氨基酸残基处的α氨基的N-甲基化。这将防止肽键被任一肽酶裂解。例子包括：H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe-NH2；H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe(NMe)-NH2；H-D-Arg-Dmt-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2；和H-D-Arg(NαMe)-Dmt(NMe)-Lys(NαMe)-Phe(NMe)-NH2。Nα-甲基化的类似物具有较低的氢键合能力并且可预期具有改善的肠道通透性。
使肽酰胺键(-CO-NH-)针对酶促降解稳定化的可替选方法是其由还原的酰胺键(Ψ[CH2-NH])的替换。这可通过在固相肽合成中在Boc-氨基酸-乙醛和生长肽链的N末端氨基酸残基的氨基之间的还原性烷基化反应来实现。预测还原的肽键由于氢键合能力下降而引起改善的细胞通透性。例子包括：H-D-Arg-Ψ[CH2-NH]Dmt-Lys-Phe-NH2、H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Phe-NH2、H-D-Arg-Dmt-LysΨ[CH2-NH]Phe-NH2、H-D-Arg-Dmt-Ψ[CH2-NH]Lys-Ψ[CH2-NH]Phe-NH2等。
脂质
心磷脂是线粒体内膜的重要组分，在其中它构成约20％的总脂质组成。在哺乳动物细胞中，心磷脂几乎专一地在线粒体内膜中发现，在其中它是涉及线粒体代谢的酶的最佳功能所需的。
心磷脂是包含两个磷脂酰甘油的双磷脂酰甘油脂质种类，所述两个磷脂酰甘油由甘油主链连接以形成二聚体结构。它具有四个烷基且潜在携带两个负电荷。因为在心磷脂中存在四条不同的烷基链，所以该分子种类的复杂性的潜力是巨大的。然而，在大多数动物组织中，心磷脂含有18-碳脂肪烷基链，在其各自上具有2个不饱和键。已提出(18:2)4酰基链配置是心磷脂对哺乳动物线粒体中的内膜蛋白质的高亲和力的重要结构需求。然而，用分离的酶制剂的研究指示它的重要性可取决于检查的蛋白质而改变。
分子中的两个磷酸盐各自可捕获一个质子。尽管它具有对称结构，但一个磷酸盐的电离在与电离两个不同的酸度水平下发生，其中pK1＝3和pK2>7.5。因此，在正常生理条件(大约7.0的pH)下，分子可仅携带一个负电荷。在磷酸盐上的羟基(-OH和-O-)形成稳定的分子内氢键，形成二环共振结构。该结构捕获一个质子，其有助于氧化磷酸化。
在由复合物IV催化的氧化磷酸化过程期间，大数量的质子从膜一侧转移到另一侧，引起大pH改变。已提出心磷脂充当线粒体膜内的质子肼，从而严格局限化质子池且使线粒体膜间隙中的pH降到最低。该功能被认为是由于独特的心磷脂结构，其如上所述可捕获双环结构内的质子，同时携带负电荷。因此，心磷脂可充当电子缓冲池，以释放或吸收质子以便维持在线粒体膜附近的pH。
另外，心磷脂已显示在细胞凋亡中起作用。细胞凋亡级联中的早期事件涉及心磷脂。如下文更详细地讨论的，心磷脂特异性氧合酶产生心磷脂-氢过氧化物，其促使脂质经历构象改变。氧化的心磷脂随后从线粒体内膜易位到线粒体外膜，在其中它被认为形成细胞色素c通过其释放到细胞溶质内的孔。细胞色素c可与刺激钙释放的IP3受体结合，其还促进细胞色素c的释放。当细胞质钙浓度达到毒性水平时，细胞死亡。另外，线粒体外的细胞色素c与细胞凋亡活化因子相互作用，从而引起凋亡体复合物的形成和蛋白酶解半胱天冬酶级联的活化。
另一个后果是细胞色素c以高亲和力与线粒体内膜上的心磷脂相互作用且与心磷脂形成复合物，所述复合物在转运电子中是非生产性的，但充当心磷脂特异性氧合酶/过氧化物酶。事实上，心磷脂与细胞色素c的相互作用获得其正常氧化还原电位比完整细胞色素c的氧化还原电位更负约负(-)400mV的复合物。因此，细胞色素c/心磷脂复合物不能接受来自线粒体复合物III的电子，从而导致增强的其歧化获得H2O2的超氧化物产生。细胞色素c/心磷脂复合物也不能接受来自超氧化物的电子。另外，心磷脂与细胞色素c的高亲和相互作用导致细胞色素c活化成心磷脂特异性过氧化物酶，其具有针对多不饱和分子心磷脂的过氧化的选择性催化活性。细胞色素c/心磷脂复合物的过氧化物酶反应由作为氧化当量源的H2O2驱动。最终，该活性导致心磷脂氧化产物(主要是心磷脂-OOH)及其还原产物(心磷脂-OH)的蓄积。如上所述，已显示氧合的心磷脂种类在线粒体膜透化和促细胞凋亡因子(包括细胞色素c自身)释放到细胞溶质中起作用。参见例如Kagan等人，Advanced Drug DeliveryReviews,61(2009)1375-1385；Kagan等人，Mol.Nutr.Food Res.2009January；53(1):104-114，所述两个参考文献均以引用的方式并入本文。
关于细胞色素c，细胞色素c是球状蛋白质，其主要功能是充当在线粒体电子传递链中的从复合物III(细胞色素c还原酶)到复合物IV(细胞色素c氧化酶)的电子载体。血红素辅基在Cys14和Cys17处附着至细胞色素c，并且另外由两个配位轴向配体His18和Met80结合。与Met80的第6配位结合防止Fe与其他配体例如O2、H2O2、NO等的相互作用。
细胞色素c池分布在膜间隙中，而剩余部分经由静电作用和疏水作用与线粒体内膜(IMM)结合。细胞色素c是高阳离子蛋白质(在中性pH下的8+净电荷)，其可经由静电作用与IMM上的阴离子磷脂心磷脂松散结合。另外，如上所述，细胞色素c还可经由疏水相互作用与心磷脂紧密结合。细胞色素c与心磷脂的该紧密结合起因于心磷脂的酰基链离开脂质膜的延伸且延伸到细胞色素c内部中的疏水通道内(Tuominen等人，2001；Kalanxhi&Wallace,2007；Sinabaldi等人，2010)。这导致在细胞色素c血红素袋中的Fe-Met80键的破裂且导致血红素环境中的改变，如由索雷带(Soret band)区中的负科顿(Cotton)峰的丧失(Sinabaldi等人，2008)。它还导致血红素Fe对H2O2和NO的暴露。
天然细胞色素c具有由于其第6配位的弱过氧化物酶活性。然而，在与心磷脂的疏水结合后，细胞色素c经历破坏Fe-Met80配位且增加血红素Fe对H2O2的暴露的结构改变，并且细胞色素C从电子载体转换为过氧化物酶，其中心磷脂是主要底物(Vladimirov等人，2006；Basova等人，2007)。如上所述，心磷脂过氧化导致改变的线粒体膜结构，和来自IMM的细胞色素c释放，以起始半胱天冬酶介导的细胞死亡。
因此，在一些实施例中，如本文公开的芳香族阳离子肽(例如D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2；Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2；Dmt-D-Arg-Phe-(atn)DapNH2，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2；Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸；或其药学可接受的盐，例如乙酸盐或三氟乙酸盐)施用于有此需要的受试者。不希望受理论束缚，认为肽接触(例如靶向)细胞色素c、心磷脂或两者，阻碍心磷脂-细胞色素c相互作用，抑制心磷脂/细胞色素c复合物的氧合酶/过氧化物酶活性，抑制心磷脂-氢过氧化物形成，抑制心磷脂至外膜的易位和/或抑制来自IMM的细胞色素c释放。另外或可替代地，在一些实施例中，本文公开的芳香族阳离子肽包括下述特征或功能中的一种或多种：(1)是细胞可渗透的且靶向线粒体内膜；(2)经由静电相互作用与心磷脂选择性结合，所述静电相互作用促进肽与细胞色素c的相互作用；(3)与细胞色素c相互作用，所述细胞色素c是游离的且与心磷脂或松散结合或紧密结合；(4)保护细胞色素c的疏水血红素袋和/或抑制心磷脂破坏Fe-Met80键；(5)促进与血红素卟啉(porphorin)的π-π*相互作用；(6)抑制细胞色素c过氧化物酶活性；(7)促进细胞色素c还原的动力学；(8)防止由心磷脂引起的细胞色素c还原的抑制；(9)促进线粒体电子传递链和ATP合成中的电子流量。在一些实施例中，肽促进电子传递的能力与肽抑制细胞色素c/心磷脂复合物的过氧化物酶活性的能力不相关。因此，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低心磷脂和细胞色素c之间的相互作用。另外或可替代地，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低细胞色素c/心磷脂复合物的形成。另外或可替代地，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低细胞色素c/心磷脂复合物的氧合酶/过氧化物酶活性。另外或可替代地，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低细胞凋亡。
芳香族阳离子肽的预防和治疗用途
本文描述的芳香族阳离子肽可用于预防或治疗疾病。具体地，本公开内容提供了通过施用本文描述的芳香族阳离子肽来治疗处于疾病的危险中(或易受疾病影响)的受试者的预防和治疗方法。因此，本方法提供了通过将有效量的芳香族阳离子肽施用于有此需要的受试者来预防和/或治疗受试者中的疾病。
在一个方面，本公开内容提供了降低经历线粒体通透性转变(MPT)的线粒体数目或防止有此需要的哺乳动物的中的线粒体通透性转换的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的本文描述的一种或多种芳香族阳离子肽。在另一个方面，本公开内容提供了用于增加有此需要的哺乳动物中的ATP合成率的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的本文描述的一种或多种芳香族阳离子肽。在另外一个方面，本公开内容提供了用于降低有此需要的哺乳动物中的氧化损伤的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的本文描述的一种或多种芳香族阳离子肽。
氧化损伤。上文描述的肽可用于降低有此需要的哺乳动物中的氧化损伤。需要降低氧化损伤的哺乳动物是患有与氧化损伤相关的疾病、病症或治疗的哺乳动物。通常，通过例如活性氧种类(ROS)和/或活性氮种类(RNS)的自由基导致氧化损伤。ROS和RNS的例子包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、一氧化氮、氢、次氯酸(HOCl)和过氧亚硝酸盐阴离子。如果在施用有效量的上述芳香族阳离子肽后，哺乳动物、移除器官或细胞中的氧化损伤的量减少，则氧化损伤被视为“降低的”。通常，与未使用该肽治疗的对照受试者相比，如果氧化损伤减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％，则氧化损伤被视为降低的。
在一些实施例中，待治疗的哺乳动物可以是患有与氧化损伤相关的疾病或病症的哺乳动物。氧化损伤可出现在哺乳动物的任何细胞、组织或器官中。在人中，许多疾病涉及氧化性应激。例子包括动脉粥样硬化、帕金森氏病、心力衰竭、心肌梗塞、阿尔茨海默氏病、精神分裂症、双相型障碍、脆性X染色体综合征和慢性疲劳综合征。
在一个实施例中，哺乳动物可经历与氧化损伤相关的治疗。例如，该哺乳动物可以经历再灌注。再灌注指对其中血流减少或阻塞的任何器官或组织的血流恢复。在再灌注期间的血流恢复导致呼吸爆发和自由基形成。
在一个实施例中，由于缺氧或缺血，哺乳动物可具有减少或阻塞的血流。在缺氧或缺血过程中的血液供给的丧失或严重降低可以例如是由于血栓栓塞性中风、冠状动脉粥样硬化或周围性血管疾病。众多器官和组织遭受缺血或缺氧。此类器官的例子包括脑、心脏、肾、肠和前列腺。受累组织通常为肌肉，例如心肌、骨骼肌或平滑肌。例如，心肌缺血或缺氧通常由动脉粥样硬化性或血栓性阻塞引起，所述动脉粥样硬化性或血栓性阻塞导致由心脏动脉和毛细血管供血而输送到心脏组织的氧降低或丧失。此类心肌缺血或缺氧可引起受累心肌的疼痛和坏死，并且最终可导致心力衰竭。
该方法还可用于降低与任何神经变性疾病或病症相关的氧化损伤。神经变性疾病可影响中枢神经系统和周围神经系统的任何细胞、组织或器官。此类细胞、组织和器官的例子包括脑、脊髓、神经元、神经节、许旺细胞、星形细胞、少突胶质细胞和小神经胶质细胞。神经变性病症可以是急性病症例如中风或脑创伤或脊髓损伤。在另一个实施例中，神经变性疾病或病症可以是慢性神经变性病症。在慢性神经变性病症中，自由基例如可引起对蛋白质的损伤。此类蛋白质的例子为β淀粉样蛋白。与通过自由基的损伤相关的慢性神经变性疾病的例子包括帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩侧索硬化症(也称为葛雷克氏病)。
可被治疗的其他病症包括先兆子痫、糖尿病和与老化相关的症状和病症例如黄斑变性、皱纹。
线粒体通透性转变。上文描述的肽可用于治疗与线粒体通透性转变(MPT)相关的任何疾病或病症。此类疾病和病症包括但不限于组织或器官的缺血和/或再灌注、缺氧和大量神经变性疾病中的任一种。需要抑制或预防MPT的哺乳动物是患有这些疾病或病症的哺乳动物。
细胞凋亡。上文描述的肽可用于治疗与细胞凋亡相关的疾病或病症。示例性疾病或病症包括但不限于癌症例如结肠直肠癌、神经胶质瘤、肝癌、成神经细胞瘤、白血病和淋巴瘤和前列腺癌；自身免疫疾病例如重症肌无力(myastenia gravis)、系统性红斑狼疮、炎性疾病、支气管哮喘、炎性肠病、肺炎症；病毒感染例如腺病毒和杆状病毒和HIV-AIDS；神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、帕金森氏病、色素性视网膜炎和癫痫；血液病例如再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征、T CD4+淋巴细胞减少症和G6PD缺陷；例如由心肌梗塞、脑血管意外、缺血肾损伤和多囊肾引起的组织损伤。因此，在一些实施例中，如本文公开的芳香族阳离子肽(例如D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2；Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2；Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸和D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2；Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸，或其药学可接受的盐例如乙酸盐或三氟乙酸盐)施用于有此需要的受试者(例如哺乳动物例如人)。如上所述，认为肽接触(例如靶向)细胞色素c、心磷脂或两者，阻碍心磷脂-细胞色素c相互作用，抑制心磷脂-氢过氧化物形成，抑制心磷脂至外膜的易位、和/或抑制氧合酶/过氧化物酶活性。因此，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低心磷脂和细胞色素c之间的相互作用。另外或可替代地，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低细胞色素c/心磷脂复合物的形成。另外或可替代地，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低细胞色素c/心磷脂复合物的氧合酶/过氧化物酶活性。另外或可替代地，在一些实施例中，施用的肽抑制、延迟或降低细胞凋亡。
测定基于芳香族阳离子肽的治疗剂的生物效应。在多个实施例中，进行合适的体外测定或体内测定，来测定特定的基于芳香族阳离子肽的治疗剂的效应以及其施用是否适应于治疗。在多个实施例中，可对代表性动物模型进行体外测定，以测定给定的基于芳香族阳离子肽的治疗剂是否在预防或治疗疾病方面发挥所需效应。在人受试者中的测试之前，可在合适的动物模型系统中测试用于治疗的化合物，所述动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、猪、牛、猴、兔等等。类似地，对于体内测试，在施用于人受试者之前，可使用本领域已知的动物模型系统中的任一种。
预防方法。在一个方面，本发明提供了通过将预防病症起始或进展的芳香族阳离子肽施用于受试者来预防受试者中的疾病的方法。在预防应用中，将芳香族阳离子肽的药物组合物或药剂施用于易遭受疾病或病症或者另外处于疾病或病症的危险中的受试者，其量足以消除或降低疾病的危险、减轻疾病的严重性或延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在该疾病发展过程中呈现的中间病理表型。预防性芳香族阳离子肽的施用可在反常的症状特征体现之前发生，使得疾病或障碍得到预防或可替代地延迟其进展。可基于上文描述的筛选测定来测定适当的化合物。
治疗方法。该技术的另一个方面包括为了治疗目的治疗受试者中的疾病的方法。在治疗应用中，将组合物或药剂施用于疑似患有此类疾病或已患有此类疾病的受试者，其量足以治愈或至少部分地阻止该疾病的症状，包括其并发症和在该疾病发展过程中的中间病理表型。
施用模式和有效剂量
可采用本领域的技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与肽接触的任何方法。合适方法包括体外、离体或体内方法。体内方法通常包括将芳香族阳离子肽(例如上文描述的芳香族阳离子肽)施用于哺乳动物、适当地施用于人。当在体内用于治疗时，芳香族阳离子肽可以有效量(即具有所需疗效的量)施用于受试者。剂量和给药方案将取决于受试者中的损伤的程度、所使用的特定的芳香族阳离子肽的特征(例如其治疗指数)、受试者以及受试者的病史。
可在临床前试验和临床试验过程中通过医生和临床医生熟悉的方法来测定有效量。在所述方法中有用的肽的有效量可通过用于施用药物组合物的多种众所周知方法中的任一种施用于有此需要的哺乳动物。肽可全身或局部施用。
该肽可配制成药学可接受的盐。术语“药学可接受的盐”意指由对于施用于患者例如哺乳动物可接受的碱或酸制备成的盐(例如对于给定的给药方案，具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，应当理解，所述盐无需是药学可接受的盐，例如不预期施用于患者的中间化合物的盐。药学可接受的盐可源自药学可接受的无机碱或有机碱以及药学可接受的无机酸或有机酸。另外，当肽包含碱性部分(例如胺、吡啶或咪唑)和酸性部分(例如羧酸或四唑)两者时，可形成两性离子，且包括在如本文使用的术语“盐”中。源自药学可接受的无机碱的盐包括铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等等。源自药学可接受的有机碱的盐包括伯胺盐、仲胺盐和叔胺盐，包括取代胺盐、环胺盐、天然存在的胺盐等等，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N’-二苄乙烯二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、葡甲胺、吗啉、哌嗪、哌啶(piperadine)、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等等。源自药学可接受的无机酸的盐包括硼酸盐、碳酸盐、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)盐、硝酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐和硫酸盐。源自药学可接受的有机酸的盐包括脂肪族羟基酸(例如柠檬酸、葡糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)盐、脂肪族单羧酸(例如乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)盐、氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)盐、芳香族羧酸(例如苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)盐、芳香族羟基酸(例如邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-羧酸和3-羟基萘-2-羧酸)盐、抗坏血酸盐、二羧酸(例如富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)盐、葡糖醛酸盐、扁桃酸盐、粘酸盐、烟酸盐、乳清酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磺酸(例如苯磺酸、樟脑磺酸、乙二磺酸(edisylic)、乙磺酸、羟乙磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)盐、辛那酸盐(xinafoicacid)等等。在一些实施例中，该盐是乙酸盐。另外或可替代地，在其他实施例中，该盐是三氟乙酸盐。
本文描述的芳香族阳离子肽可掺入药物组合物内用于单独或组合施用于受试者，以治疗或预防本文描述的障碍。此类组合物通常包括活性剂和药学可接受的载体。如本文使用的，术语“药学可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充性活性化合物也可掺入组合物内。
通常将药物组合物配制成与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、经口、吸入、经皮(局部)、眼内、电离子透入和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括下述组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张度的试剂，例如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠来调节pH。肠胃外制剂可封装在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。为了患者或治疗医生的方便，剂量制剂可在试剂盒中提供，所述试剂盒含有治疗过程(例如治疗7天)所需的所有设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针)。
适合于注射用途的药物组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或者用于临时制备无菌注射液或分散体的分散体和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外施用的组合物必须是无菌的，且应流动至存在容易注射性的程度。它在制造和储存条件下应是稳定的，且必须针对微生物例如细菌和真菌的污染作用进行防腐。
芳香族阳离子肽组合物可包括载体，该载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可通过例如下述来保持适当的流动性：使用涂层例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需粒子大小，和使用表面活性剂。可通过多种抗菌剂和抗真菌剂来实现微生物作用的预防，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、thiomerasol等等。可包括谷胱甘肽及其他抗氧化剂以防止氧化。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来造成可注射组合物的延长吸收，所述延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝或明胶。
可通过将所需量的活性化合物掺入具有上文列举的成分之一或组合的适当溶剂中，根据需要随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其可获得活性成分加上来自其先前灭菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。为了经口治疗施用的目的，活性化合物可与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。还可使用流体载体制备口服组合物，以用作漱口剂。药学相容的粘合剂和/或辅助材料可被包括作为该组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等等可含有下述成分或具有相似性质的化合物中的任一种：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、羧甲淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味料。
关于通过吸入施用，化合物可以来自含有合适推进剂(例如气体，例如二氧化碳)的加压容器或分配器或者喷雾器的气溶胶喷雾形式进行递送。此类方法包括美国专利号6,468,798中描述的方法。
如本文描述的治疗性化合物的全身施用还可通过经粘膜或经皮方法来进行。对于经粘膜或经皮施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于配制中。此类渗透剂一般是本技术领域已知的，并且对于经粘膜施用，包括例如去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。可通过使用鼻腔喷雾来完成经粘膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制成本领域一般已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。在一个实施例中，经皮施用可通过电离子透入来进行。
治疗性蛋白质或肽可在载体系统中进行配制。该载体可以是胶态系统。该胶态系统可以是脂质体、磷脂双层媒介物。在一个实施例中，治疗性肽在脂质体中包封，同时维持肽完整性。如本领域技术人员理解的，存在多种制备脂质体的方法。(参见Lichtenberg等人，Methods Biochem.Anal.,33:337-462(1988)；Anselem等人，Liposome Technology,CRCPress(1993))。脂质体制剂可延迟清除并增加细胞摄取(参见Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。活性剂还可装载到由药学可接受的成分制备的颗粒内，所述药学可接受的成分包括但不限于可溶、不可溶、可渗透、不可渗透、生物可降解或胃滞留的聚合物或脂质体。此类颗粒包括但不限于纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、微粒、生物可降解的微粒、纳米球、生物可降解的纳米球、微球、生物可降解的微球、胶囊、乳剂、脂质体、胶粒以及病毒载体系统。
该载体还可以是聚合物，例如生物可降解、生物相容的聚合物基质。在一个实施例中，治疗性肽可嵌入到聚合物基质中，同时维持蛋白质完整性。聚合物可以是天然的，例如多肽、蛋白质或多糖；或合成的，例如聚α-羟酸。例子包括由例如下述物质制成的载体：胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、乙酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合。在一个实施例中，聚合物是聚乳酸(PLA)或乳酸/乙醇酸共聚物(PGLA)。聚合物基质可以多种形式和大小进行制备并分离，包括微球和纳米球。聚合物制剂可导致疗效的延长持续时间(参见Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。用于人生长激素(hGH)的聚合物制剂已用在临床试验中。(参见Kozarich和Rich,Chemical Biology,2:548-552(1998))。
聚合物微球持续释放制剂的例子在PCT公开WO99/15154(Tracy等人)、美国专利号5,674,534和5,716,644(两者均属于Zale等人)、PCT公开WO96/40073(Zale等人)和PCT公开WO00/38651(Shah等人)中进行描述。美国专利号5,674,534和5,716,644以及PCT公开WO96/40073描述了含有促红细胞生成素颗粒的聚合物基质，所述促红细胞生成素颗粒用盐针对聚集进行稳定化。
在一些实施例中，治疗性化合物与保护该治疗性化合物不受从机体快速消除的载体一起制备，所述载体例如控制释放制剂，包括埋植剂和装入微胶囊的递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。可使用已知技术来制备此类制剂。还可例如从Alza Corporation and NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得材料。脂质体悬浮液(包括靶向具有针对细胞特异性抗原的单克隆抗体的特定细胞的脂质体)也可用作药学可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法进行制备，例如如美国专利号4,522,811中描述的。
治疗性化合物还可配制为增强细胞内递送。例如，脂质体递送系统是本领域已知的，参见例如Chonn和Cullis,“Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems,”Current Opinion in Biotechnology6:698-708(1995)；Weiner,“Liposomes for ProteinDelivery:Selecting Manufacture and Development Processes,”Immunomethods,4(3):201-9(1994)；和Gregoriadis,“Engineering Liposomes for Drug Delivery:Progressand Problems,”Trends Biotechnol.,13(12):527-37(1995)。Mizguchi等人，CancerLett.,100:63-69(1996)描述了使用膜融合脂质体在体内和在体外将蛋白质递送至细胞。
可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定治疗剂的剂量、毒性和治疗效果，例如，用于测定LD50(对50％群体致命的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，并且它可表示为比率LD50/ED50。显示出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可使用显示出毒性副作用的化合物，但应当小心设计递送系统，该递送系统将此类化合物靶向受累组织部位，以便使对未感染细胞的潜在损伤降到最低，且由此降低副作用。
得自细胞培养测定和动物研究的数据可用于配制在人中使用的剂量范围中。此类化合物的剂量优选位于包括具有很少毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围中。取决于采用的剂型和利用的施用途径，剂量可在该范围内变化。对于该方法中使用的任何化合物，可最初由细胞培养测定来估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量来实现循环血浆浓度范围，其包括如在细胞培养中测定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物浓度)。此类制剂可用于更准确地测定人中的有用剂量。可例如通过高效液相色谱法测量血浆水平。
通常，足以实现治疗或预防效应的芳香族阳离子肽的有效量范围为约0.000001mg/千克体重/天至约10,000mg/千克体重/天。适当地，剂量范围为约0.0001mg/千克体重/天至约100mg/千克体重/天。例如，剂量可以是每天、每两天或每三天1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施例中，肽的单次剂量范围为0.1-10,000毫克/kg体重。在一个实施例中，在载体中的芳香族阳离子肽浓度范围为0.2-2000毫克/每递送的毫升。示例性治疗方案需要每天一次或每周一次的施用。在治疗应用中，在相对短的间隔中相对高的剂量有时是需要的，直到疾病的进展降低或终止，且优选直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善。其后，可对患者施用预防方案。
在一些实施例中，芳香族阳离子肽的治疗有效量可限定为在靶标组织处10-12-10-6摩尔、例如大约10-7摩尔的肽浓度。该浓度可通过0.01-100mg/kg的全身剂量或体表面积的等效剂量来递送。最佳化剂量的时间表，以维持在靶标组织处的治疗浓度，最优选通过每天或每周单次施用，但也包括连续施用(例如，肠胃外输注或经皮应用)。
在一些实施例中，芳香族阳离子肽的剂量以约0.001-约0.5mg/kg/h、适当地0.01-约0.1mg/kg/h提供。在一个实施例中，提供约0.1-约1.0mg/kg/h、适当地约0.1-约0.5mg/kg/h的剂量。在一个实施例中，提供约0.5-约10mg/kg/h、适当地约0.5-约2mg/kg/h的剂量。
本领域技术人员应当理解，某些因素可影响有效治疗受试者的剂量和时机，包括但不限于疾病或障碍的严重性、先前治疗、一般健康和/或受试者的年龄以及存在的其他疾病。此外，使用本文描述的治疗有效量的治疗组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。
依照本方法治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括例如农场动物，如绵羊、猪、牛和马；宠物动物，例如犬和猫；实验室动物，例如小鼠、大鼠和兔。在优选实施例中，哺乳动物是人。
电子转移中的芳香族阳离子肽
线粒体ATP合成由通过线粒体内膜(IMM)的电子传递链(ETC)的电子流驱动。通过链的电子流可描述为一系列氧化/还原过程。电子从电子供体(NADH或QH2)经过一系列电子受体(复合物I-IV)，最终到终末电子受体分子氧。与IMM松散结合的细胞色素c(cyt c)在复合物III和IV之间转移电子。
电子通过ETC的快速分流对于防止短路是重要的，所述短路将导致电子逃逸和自由基中间产物的生成。电子供体和电子受体之间的电子转移(ET)率随着它们之间的距离指数减少，并且超交换ET限制于长程ET可在多步电子跳跃过程中实现，其中在供体和受体之间的总体距离拆分成一系列更短和因此更快速的ET步骤。在ETC中，经过长距离的有效ET通过辅因子得到辅助，所述辅因子沿IMM策略性集中，包括FMN、FeS簇和血红素。芳香族氨基酸例如Phe、Tyr和Trp还可促进通过重叠π云对血红素的电子转移，并且这对于细胞色素c具体显示(参见实验实例)。具有合适氧化电位的氨基酸(Tyr、Trp、Cys、Met)可通过充当中间电子载体来充当步石。另外，当Tyr输送电子时，Tyr的羟基可丢失质子，并且附近碱性基团例如Lys的存在可导致甚至更有效的质子偶联的ET。
靶向线粒体的过氧化氢酶(mCAT)的过表达已显示在小鼠中改善老化(例如降低症状)和延长寿命。这些例子鉴定“可成药的(druggable)”化学化合物，其可降低线粒体氧化性应激且保护线粒体功能。因为线粒体是细胞内活性氧种类(ROS)的主要源，所以抗氧化剂必须递送至线粒体，以便限制对线粒体DNA、电子传递链(ETC)的蛋白质和线粒体脂质膜的氧化损伤。我们开发了选择性靶向且集中于线粒体内膜(IMM)的合成芳香族阳离子四肽家族。这些肽中的一些含有氧化还原活性氨基酸，其可经历单电子氧化且表现为线粒体靶向的抗氧化剂。本文公开的肽例如D-Arg-2′6′-Dmt-Tyr-Lys-Phe-NH2肽在细胞和动物研究中降低线粒体ROS，且保护线粒体功能。近期研究显示该肽可赋予与用线粒体过氧化氢酶过表达观察到的那种可比较的针对线粒体氧化性应激的保护。尽管自由基清除是最常用的降低氧化性应激的方法，但存在可使用的其他潜在机制，包括电子转移的促进，以降低电子泄漏和改善的线粒体还原电位。
充足的环境证据指示氧化性应激促成正常老化和几种重大疾病的许多后果，所述重大疾病包括心血管疾病、糖尿病、神经变性疾病和癌症。氧化性应激一般定义为促氧化剂和抗氧化剂的不平衡。然而，尽管大量科学证据支持增加的氧化组织损伤，但使用抗氧化剂的大规模临床研究仍未证实在这些疾病中的显著健康益处。原因之一可能是由于可用抗氧化剂无法到达促氧化剂产生的部位。
线粒体电子传递链(ETC)是ROS的主要细胞内生产者，并且线粒体自身对氧化性应激是最脆弱的。因此，保护线粒体功能将是防止由线粒体氧化性应激引起的细胞死亡的必要条件。过表达靶向线粒体的过氧化氢酶(mCAT)而不是过氧化物酶体(pCAT)的益处提供了下述概念验证：靶向线粒体的抗氧化剂将是克服老化的有害效应所必需的。然而，化学抗氧化剂充分递送至IMM仍然是挑战。
一种肽类似物D-Arg-2′6′-Dmt-Tyr-Lys-Phe-NH2具有固有的抗氧化剂能力，因为经修饰的酪氨酸残基是氧化还原活性的，并且可经历单电子氧化。我们已显示该肽可中和H2O2、羟基原子团和过氧亚硝酸盐，并且抑制脂质过氧化。该肽在缺血再灌注损伤、神经变性疾病和新陈代谢综合症的动物模型中已证实显著的功效。
靶向线粒体的肽的设计掺入且增强下述作用模式中的一种或多种：(i)清除过量的ROS，(ii)通过促进电子转移来降低ROS产生，或(iii)增加线粒体还原能力。肽分子的优点在于它能够掺入可充当氧化还原中心、促进电子转移或增加巯基的天然或非天然氨基酸，同时保留线粒体靶向所需的芳香族阳离子基序。
用于电子和光学感测的芳香族阳离子肽
如由例子示出的，改变样品中本文公开的芳香族阳离子肽的浓度改变细胞色素c的电子和光致发光特性，所述芳香族阳离子肽包括包含氨基酸序列Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)的肽。具体地，增加相对于细胞色素c的芳香族阳离子肽浓度引起细胞色素c的电导率和光致发光效率增加。合适的芳香族阳离子肽浓度范围包括但不限于0-500mM；0-100mM；0-500μm；0-250μm；和0-100μm。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
这些电导率和光致发光效率中的改变可用于传导、感测、转换和/或增强如下所述来自细胞色素c的光发射。例如，细胞色素c、脂质、芳香族阳离子肽和/或掺杂肽或脂质的细胞色素c可用于制备和/或增强传感器；压力/温度/pH至电流换能器；场效应晶体管，包括发光晶体管；发光装置，例如二极管和显示器；电池和太阳能电池。芳香族阳离子肽浓度水平(例如在细胞色素c中)还可在空间上改变，以产生具有不同带隙的区域；这些带隙变化可用于制备异质连接、量子井、分级带隙区域等，其可掺入上述传感器、晶体管、二极管和太阳能电池内，以增强其性能。
掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c传感器
图8显示示例传感器100，其通过测量掺杂单独或与心磷脂一起的本文公开的肽中的任一种(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))的细胞色素c层110的电导率(电阻)的改变，检测测试基底130的pH和/或温度的改变。在一些实施例中，细胞色素c层掺杂心磷脂。随着基底130的温度和/或pH改变，芳香族阳离子肽、心磷脂或肽和心磷脂扩散到掺杂的细胞色素c层110内或从中离开，这依次又引起掺杂的细胞色素c层110的电导率改变。通过经由阳极122和阴极124对细胞色素c层110施加电位(电压)，仪表120测量电导率的变化。当电导率上升时，在阳极122和阴极124之间的电流增加。当电导率下降时，在阳极122和阴极124之间的电流减少。可替代的传感器可包括另外的电终端(即阳极和阴极)用于更灵敏的电阻测量。例如，可替代的传感器可包括用于开尔文感测电阻测量的四个电终端。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
图9显示可替代的传感器101，其通过测量掺杂肽或掺杂肽/心磷脂或掺杂心磷脂的细胞色素c层110的光致发光的改变，检测测试基底130的pH和/或温度的改变。光源140例如激光或发光二极管(LED)在激发波长例如532.8nm处照射掺杂的细胞色素c层110。如图3A中所示，掺杂的细胞色素c层110在激发波长处的照射将电子从价带激发为激发态。(如本领域技术人员应当理解的，价带和激发态之间的间隙与激发波长成比例。)在短弛豫时间后，电子从激发态衰变为导带。当电子从导带松弛为价带时，掺杂的细胞色素c层110在发光波长例如650nm处发出光子，由价带和导带之间的间隙固定。
如图3B中所示，对于恒定激发强度(来自源140)由细胞色素c发出的光强度随着芳香族阳离子肽浓度非线性改变：芳香族阳离子肽浓度从0μM增加到50μM使在发光波长处的发出强度从约4200CPS增加到约4900CPS，而芳香族阳离子肽浓度从50μM加倍到100μM使在发光波长处的发出强度从约4900CPS增加到约7000CPS。因此，随着掺杂的细胞色素c层110中的芳香族阳离子肽或芳香族阳离子肽/心磷脂或心磷脂浓度由于测试基底130的pH和/或温度的改变而改变，在发光波长处的强度同样改变。用光检测器150检测这种强度改变获得测试基底130的pH和/或温度指示。
在一些情况下，肽、心磷脂或心磷脂和肽浓度的改变可引起发光发射的波长的改变，其代替或加上发光发射强度的改变。这些发射波长的改变可通过用设置在掺杂的层110和检测器150之间的滤光片152过滤发出的光进行检测。滤光片152传输在通带内的光，并且反射和/或吸收通带外的光。如果发射波长由于pH和/或温度诱导的肽、心磷脂或肽和心磷脂浓度的改变而超出通带，则检测器150未检测到任何光，这是可用于测定肽和/或心磷脂浓度的改变的效应。作为另外一种选择，肽诱导的和/或心磷脂诱导的发光波长的改变可通过例如用光谱分析仪(未示出)代替光检测器150分析未过滤发射谱进行测量。
本领域技术人员容易理解本文公开的心磷脂和芳香族阳离子肽(例如肽Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))中的一种或多种还可用于增强和/或调谐由光和/或电刺激的细胞色素c发出的光的波长。例如，如由图3B所示，以100μM的肽浓度掺杂细胞色素c几乎使在650nm处发出的光强度加倍。因此，图9的传感器101也可用作增强的发光元件。与半导体LED和显示器不同，基于掺杂的细胞色素c的增强的发光元件可以任意形状和在柔性基底上进行制备。另外，肽和心磷脂浓度可设置为提供所需的照明水平和/或波长。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
使用细胞色素c、掺杂心磷脂、掺杂芳香族阳离子肽、或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c制备的传感器可用于检测压力、温度、pH、外加场和/或影响电导率的其他特性的改变。例如，传感器100和101可用于检测压力的改变，所述改变影响细胞色素c中的心磷脂和芳香族阳离子肽中的一种或多种的浓度；因为压力改变引起芳香族阳离子肽扩散到细胞色素c内，所以电导率和/或发射强度增加，并且反之亦然。影响细胞色素c中的肽和/或心磷脂浓度的温度和pH的改变产生相似结果。改变细胞色素c中的肽和/或心磷脂浓度的外加场例如电磁场也引起测量的电导率、发射强度和发射波长改变。
掺杂心磷脂、心磷脂和芳香族阳离子肽或芳香族阳离子肽的细胞色素c传感器也可用于感测如本文公开的生物学和/或化学活性。例如，示例性传感器可用于鉴定其他分子和/或原子，所述其他分子和/或原子与芳香族阳离子肽、心磷脂和/或细胞色素c联接，并且改变掺杂的细胞色素c的电和发光特性。例如，在一些情况下，掺杂单一肽分子(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)的分子)、或肽和心磷脂的细胞色素c单分子，可能能够检测由心磷脂、肽或心磷脂和肽分子自身与细胞色素c分子结合或使自身从细胞色素c分子释放引起的压力、温度、pH、外加场等的微小变化。单分子传感器(和/或多分子传感器)可排列在规则(例如周期)或不规则阵列中，用于检测在应用中的上述性质中的任一种，所述应用包括但不限于酶促分析(例如葡萄糖和乳酸盐测定)、DNA分析(例如聚合酶链反应和高流通量测序)、和蛋白质组学。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
在微流体中掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
另外，掺杂心磷脂、掺杂心磷脂/肽或掺杂肽的细胞色素c传感器可用于微流体和光流体装置中，例如以将压力、温度、pH、外加场等的变化转换成电流和/或电压，用于混合(hybrid)生物学/化学/电子处理器中。它们还可用于微流体和/或光流体装置中，例如美国专利申请公开号2009/0201497、美国专利申请公开号2010/0060875和美国专利申请公开号2011/0039730中描述的装置，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
光流体指在微米至纳米规模上使用流体的光操作或反之亦然。通过利用微流体操作，流体的光学特性可得到精确和弹性控制，以实现可配置的光学部件，其否则难以或不能由固态技术实现。另外，在微/纳米规模上的流体的独特行为已产生使用光操作流体的可能性。基于掺杂一种或多种芳香族阳离子肽、心磷脂或一种或多种芳香族阳离子肽和心磷脂的细胞色素c的光流体装置的应用包括但不限于：适应性光学元件；使用微谐振器的检测；流体波导；荧光微流体光源；集成纳米光子和微流体；显微分光镜检查；微流体量子点条形码；用于非线性光学应用的微流体；光流体显微镜检查；用于可配置的光子和芯片上的分子检测器的光流体量子级联激光器；使用纳米颗粒混合物的光存储器；和用于集成光流体应用的试管微腔激光器。
包含掺杂一种或多种芳香族阳离子肽和心磷脂或一种或多种芳香族阳离子肽或心磷脂的细胞色素c的传感器可用于微流体处理器中，以将由于流体流动的改变导致的压力变化转换成电和/或光信号的变化，所述电和/或光信号的变化可使用如上所述的常规电检测器和光检测器容易地检测。掺杂心磷脂/肽或掺杂肽或掺杂心磷脂的细胞色素c换能器可用于控制微流体泵、处理器及其他装置，包括可调谐微透镜阵列。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
用于开关和晶体管的掺杂一种或多种芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
掺杂一种或多种芳香族阳离子肽和心磷脂或一种或多种芳香族阳离子肽和心磷脂的细胞色素c也可用作或用于电或光控开关，例如图10中所示的开关201。开关201包括经由导管221和通道210与细胞色素c或掺杂的细胞色素c110流体连通的储存器220，所述储存器220容纳心磷脂、芳香族阳离子肽200和心磷脂、或芳香族阳离子肽200，例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)。在操作中，打开导管221，以允许心磷脂或肽200或肽和心磷脂在方向212上流动到通道210内。开关201通过跨越通道210和细胞色素c130之间的边界产生温度和/或pH梯度得到致动。取决于梯度的方向，心磷脂或肽200或肽和心磷脂扩散到细胞色素c130内或从中离开，这引起如上所述的电导率和光致发光性质改变。由于肽或心磷脂浓度的波动导致的电导率的改变可用于调节阳极222和阴极224之间的电流。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
图10中所示的开关201充当有机场效应晶体管(OFET)：它调节响应“场”中的改变的电流，所述“场”中的改变对应于跨越通道210和细胞色素c130之间的边界的温度和/或pH梯度。每个晶体管包括细胞色素c通道层或者掺杂芳香族阳离子肽和心磷脂或芳香族阳离子肽或心磷脂的细胞色素c通道层、栅、源和漏。通道层设置在较低基底上方。源和漏设置在通道层上方，并且分别与通道层的两个相对侧接触。栅设置在通道层上方，并且放置在源和漏之间。上述有机电致发光装置与漏电连接，用于接纳经由通道层由源输出的电流且根据电流量级发射。
与常规晶体管相比较，本发明的晶体管例如掺杂肽/心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂的细胞色素c OFET可以是易于制造的。常规无机晶体管需要高温(例如500-1,000℃)，但OFET可在室温和200℃之间进行制备。OFET甚至可在易受热影响的塑料基底上形成。OFET可用于实现光、薄和柔性装置元件，允许其用于多种独特装置例如柔性显示器和传感器中。
OFET可用于实现数字信号处理所需的基础逻辑操作。例如，晶体管可用于产生(非线性)逻辑门，例如NOT和NOR门，其可联接在一起用于处理数字信号。掺杂肽/心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂的细胞色素c晶体管可用于应用中，包括但不限于射极跟随器(例如用于电压调节)、电源、计数器、模拟数字转换等，以及在通用计算和专门应用处理两者中例如计算机网络处理、无线通信(例如软件定义无线电)等中。关于晶体管的更多应用，参见全文以引用方式并入本文的P.Horowitz和W.Hill的“The Art of Electronics”。
通过将一种特性例如pH的小改变转变为另一种特性例如电导率的大改变，晶体管还可用于放大信号；如充分理解的，放大可用于多种应用，包括无线(无线电)传输、声重放和(模拟)信号处理。掺杂肽/心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂的细胞色素c晶体管还可用于制备运算放大器(op amp)，其用于倒相放大器、非倒相放大器、反馈环、振荡器等。关于有机晶体光的更多细节，参见美国专利号7,795,611；美国专利号7,768,001；美国专利号7,126,153；和美国专利号7,816,674，所述专利各自全文以引用方式并入本文。
用于随机存取存储器的掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素C
基于如本文公开的细胞色素c和/或掺杂心磷脂、芳香族阳离子肽、或心磷脂和芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))的细胞色素c的晶体管，也可用于实现存储器，例如静态或动态随机存取存储器(RAM)，所述存储器储存用于数字计算的信息。如充分理解的，六个晶体管可联接在一起以形成静态RAM(SRAM)单元，其储存一字节信息，而无需定期刷新。基于细胞色素c和/或掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽或心磷脂和肽的细胞色素c的晶体管，也可用于实现用于数字计算的其他类型的存储器，包括动态随机存取存储器(DRAM)。如充分理解的，RAM可用于实现用于例如上文描述的应用的数字计算。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c晶体管可在可编程或预编程的生物学阵列中形成，非常类似在集成电路中形成的常规晶体管。如果由于肽或心磷脂活性导致细胞色素c的电导率(电阻率)的改变足够高，则示例晶体管(开关)可由掺杂单一肽分子、单一心磷脂分子或单一肽分子和单一心磷脂分子的单一细胞色素c分子制成。可形成单分子细胞色素c晶体管阵列，以产生难以置信的小型致密填充的逻辑电路。
用于发光晶体管的掺杂本发明的芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
细胞色素c和/或掺杂心磷脂或如本文公开的芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))或心磷脂和一种或多种肽的细胞色素c也可用于制备有机发光晶体管(OLET)，其可导致更廉价的数字显示器和在计算机芯片上的快速转换的光源。基于OLET的光源比二极管快得多地转换，并且由于其平面设计，它能够更容易地整合到计算机芯片上，从而提供跨越芯片比铜线更快速的数据传输。关于更高效率的关键是三层结构，其中薄膜叠加在彼此之上。电流水平流动通过上和下层—一层携带电子并且另一层携带空穴—而漂移到中间层内的载体重组且发出光子。因为通道中的连接区的位置取决于栅和漏电压，可调谐发射区。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
示例OLET例如图6中所示的OLET可在涂布有铟锡氧化物层的透明(例如玻璃)基底上构建，所述铟锡氧化物层充当晶体管的栅，涂布有聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)层，这是一种常见介电材料。可包括电子传递材料(例如掺杂心磷脂、或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c)的膜、发射材料的膜、和空穴运输材料的多层有机结构沉积到PMMA上。最后，将金属接触点沉积到有机结构之上，以提供源和漏。OLET中的光作为沿发射层的条纹发出，而不是向上通过接触点如OLED中。发射层的形状可改变，以使得更易于将发出的光联接到光导纤维、波导及其他结构内。
在2003年由Hepp等人开发的有机发光晶体管(OLET)以单极p型模式操作，并且产生接近于金漏极电极(电子注入)的绿色电致发光。然而，由于单极操作模式，不能调节Hepp装置的发射区。平衡双极运输对于改善OLET的量子效率是高度期望的，并且对于单部件和异质结构晶体管两者均为重要的。
双极OLET可基于空穴传输材料和电子传输材料的异质结构，所述材料例如掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c。双极OLET的光强度可受漏-源电压和栅压两者控制。通过改变两个部件的比率，可调谐基于相同材料(例如掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c)的OLET的载体迁移性和电致发光特性。更高浓度的空穴传输材料可导致非发光双极FET，而更高浓度的掺杂心磷脂、或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c(或在细胞色素c中的肽或心磷脂浓度)可导致发光单极n通道FET。
基于两部件层状结构的OLET可通过序贯沉积空穴传输材料和电子传输材料来实现。形态分析指示在两个有机膜之间的连续界面，所述连续界面对于控制界面质量和所得到的OLET的光电特性是关键性的。通过在序贯沉积过程期间改变基底的倾斜角，重叠的p-n异质结构可局限在晶体管通道内部。发射区(即重叠区)远离空穴和电子源电极，从而避免在金属电极处的激子和光子猝灭。OLET也可在可替代的异质结构中实现，包括垂直组合的静电感应晶体管与OLED、类似于顶栅静电感应晶体管或三极管的顶栅型OLET、和具有横向排列的异质连接结构和二极管/FET混合物的OLET。有机发光晶体管的更多细节可在Meng等人的美国专利号7,791,068和Kido等人的美国专利号7,633,084中发现，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。
作为另外一种选择，或另外地，芳香族阳离子肽或心磷脂或肽/心磷脂浓度可用于调节由细胞色素c110发出的光强度和/或波长。合适的芳香族阳离子肽浓度范围包括但不限于0-500mM；0-100mM；0-500μm；0-250μm；和0-100μm。合适的心磷脂浓度范围包括但不限于0-500mM；0-100mM；0-500μm；0-250μm；和0-100μm。事实上，图3B中所示的发射强度的非线性改变指示掺杂肽的细胞色素c110非常适合于二元(数字)转换：当肽浓度低于预定阈值例如50μM时，发出的强度低于给定水平例如5000CPS。在芳香族阳离子肽超过阈值例如100μM时，发出的强度跳跃至例如约7000CPS。这种非线性行为可用于检测或响应细胞色素c110和/或与细胞色素c110热连通和/或流体连通的任何层或物质的pH或温度的相应改变。心磷脂或肽和心磷脂的组合预期提供可比较的行为。
用于发光二级管和电致发光显示器的掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
细胞色素c和/或掺杂心磷脂或如本文公开的芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))或心磷脂和一种或多种肽的细胞色素c也可用于有机发光二级管(OLED)和电致发光显示器中。OLED可用于多种消费者产品中，例如表、电话、笔记本电脑、寻呼机、手机、数码摄像机、DVD播放机和计算器。含有OLED的显示器具有超过常规液晶显示器(LCD)的众多优点。因为基于OLED的显示器不需要背光，所以它们可显示深黑色水平，并且即使在宽视角时也实现相对高的对照比。它们还可比LCD更薄、更有效和更明亮，所述LCD需要强、高耗电的背光。由于这些组合特点，OLED显示器在重量上更轻并且占据比LCD显示器更少的空间。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
如图17中所示，OLED通常包含插入两个电极—阳极和阴极—之间的发光元件。发光元件通常包含一叠薄有机层，包含空穴传输层、发射层和电子传输层。OLED还可含有另外的层，例如空穴注射层和电子注射层。用芳香族阳离子肽(以及可能的其他掺杂剂例如心磷脂)掺杂细胞色素c发射层可增强OLED的电致发光效率且控制颜色输出。掺杂心磷脂、或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c也可用作电子传输层。
在OLED中，掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))或心磷脂和一种或多种肽的细胞色素c层涂布(例如旋转涂布)或另外设置在两个电极之间，所述电极中的至少一个是透明的。例如，基于OLED的显示器可以是丝网印刷的，用喷墨打印机印刷的，或使用辊-气相沉积而沉积到任何合适的基底包括刚性和柔性基底两者上。通常的基底是至少部分在电磁波谱的可见区中能透射的。例如，对于电磁波谱的可见区中的光(400nm至700nm)，透明基底(和电极层)可具有至少30％、可替代地至少60％、可替代地至少80％的透射率百分比。基底的例子包括但不限于半导体材料例如硅、具有二氧化硅的表面层的硅和砷化镓；石英；熔融石英；氧化铝；陶瓷；玻璃；金属箔；聚烯烃例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚对苯二甲酸乙二酯；氟碳聚合物例如聚四氟乙烯和聚氟乙烯；聚酰胺例如尼龙；聚酰亚胺；聚酯例如聚(甲基丙烯酸甲酯)和聚(乙烯2,6-萘二甲酸酯)；环氧树脂；聚醚；聚碳酸酯；聚砜；和聚醚砜。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
通常，基底的至少一个表面涂布有第一电极，所述第一电极可以是透明材料例如铟锡氧化物(ITO)或任何其他合适材料。第一电极层可充当OLED中的阳极或阴极。阳极通常选自高功函数(>4eV)金属、合金、或金属氧化物例如氧化铟、氧化锡、氧化锌、铟锡氧化物(ITO)、铟锌氧化物、掺杂铝的氧化锌、镍和金。阴极可以是低功函数(<4eV)金属，例如Ca、Mg和Al；如上所述的高功函数(>4eV)金属、合金、或金属氧化物；或低功函数金属和具有高或低功函数的至少一种其他金属的合金例如Mg—Al、Ag—Mg、Al—Li、In—Mg和Al—Ca。在OLED的构造中沉积阳极和阴极层的方法例如蒸发、共蒸发、DC磁控溅射或RF溅射是本领域熟知的。
包括细胞色素c和/或掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽或心磷脂和芳香族阳离子肽的细胞色素c层的活性层涂布到透明电极上，以形成发光元件。发光元件包含空穴运输层和发射/电子运输层，其中空穴运输层和发射/电子运输层直接位于彼此之上，并且空穴运输层包含下文描述的固化的聚硅氧烷。发光元件的取向取决于阳极和阴极在OLED中的相对位置。空穴运输层位于阳极和发射/电子运输层之间，并且发射/电子运输层位于空穴运输层和阴极之间。空穴运输层的厚度可以是2-100nm，可替代地30-50nm。发射/电子运输层的厚度可以是20-100nm，可替代地30-70nm。
OLED显示器可由被动矩阵和主动矩阵寻址方案驱动，所述两种矩阵均为熟知的。例如，OLED显示板可包括主动矩阵像素阵列和几个薄膜晶体管(TFT)，所述薄膜晶体管各自可作为掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂-肽的细胞色素c晶体管(如上所述)实现。主动矩阵像素阵列设置在含有活性层的基底之间。主动矩阵像素阵列包括几个像素。每个像素由第一扫描线及其相邻第二扫描线以及第一数据线及其相邻第二数据线限定，所述扫描线和数据线两者均设置在较低基底上。设置在像素的非显示区内部的TFT与相应的扫描和数据线电连接。用扫描和数据线转换像素中的TFT引起相应像素打开(即发光)。
另外，活性层(例如细胞色素c和/或掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c)可以几乎任意的形状和大小排列，并且可模式化成任意形状。它们还可进一步掺杂，以生成在特定波长处的光。有机发光二极管和有机发光显示器的更多细节可在美国专利号7,358,663；美国专利号7,843,125；美国专利号7,550,917；美国专利号7,714,817；和美国专利号7,535,172中找到，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。
用于异质连接的掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
一个或多个细胞色素c活性层中的芳香族阳离子肽、心磷脂或肽和心磷脂的浓度水平还可根据空间和/或时间而改变，以提供其为不同能隙的两种半导体材料之间的界面的异质连接，如全文以引用的方式并入本文的美国专利号7,897,429中描述的，并在图18和19的光伏电池中示出。合适的芳香族阳离子肽浓度范围包括但不限于0-500mM；0-100mM；0-500μm；0-250μm；和0-100μm。合适的心磷脂浓度范围包括但不限于0-500mM；0-100mM；0-500μm；0-250μm；和0-100μm。例如，异质连接可用于产生多重量子井结构以用于OLED及其他装置中的增强发射。在发现用p型和n型薄结晶膜的活性层构建的有机异质连接晶体管中的高电导率之后，有机异质连接已获得越来越多的关注。与在无机异质连接中形成的耗尽层形成对比，电子和空穴蓄积层可在有机异质连接界面的两侧上观察到。具有高电导率的异质连接膜可用作电荷注射缓冲层和串联二极管的连接单元。双极晶体管和发光晶体管(上文描述的)可使用有机异质连接膜作为活性层来实现。
有机异质结构可用于OLED(上文描述的)、OFET(上文讨论的)和有机光伏(OPV)电池(下文讨论的)中，以改善装置性能。在典型的双层OLED结构中，有机异质连接降低起始电压且改善照明效率。有机异质连接也可用于改善OPV电池的功率转换效率超过单层电池双极OFET(上文讨论的)一个数量级，所述单层电池双极OFET需要电子和空穴两者均取决于施加的电压在装置通道中蓄积且运输，可通过引入有机异质结构包括掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c作为活性层来实现。有机异质结构在有机电子装置的连续开发中具有重要作用。
有机异质结构还可用作OFET中的缓冲层，以改善电极和有机层之间的接触。例如，细胞色素c和/或掺杂心磷脂或肽或心磷脂/肽的细胞色素c的薄层可插入电极和半导体层之间，导致更佳的载体注射和改善的迁移性。具有高电导率的有机异质连接(例如由于使用掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽或心磷脂/肽的细胞色素c)也可用作OFET中的缓冲层，以改善金属和有机半导体之间的接触，由此改善电子场效应迁移性。基于掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c的其他异质结构可用于改善OFET、OPV电池中的电接触，以及作为叠加OPV电池和OLED中的连接单元。
有机异质结构的引入具有显著改善的装置性能且允许许多应用中的新功能。例如，在有机异质连接两侧上的电子和空穴蓄积层的观察提出在异质连接界面处的相互作用可导致载体再分布和带弯曲。有机异质连接的该双极运输行为提出构造具有高量子效率的OLED FET的可能性。还讨论了有机异质结构包括由掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c形成的异质结构作为缓冲层的应用，改善有机层和金属电极之间的接触。有机半导体中的电荷运输受许多因素影响—本综述强调有意掺杂的n和p型有机半导体的使用，并且主要考虑由展示带运输行为的结晶有机膜组成的有机异质连接。
一般而言，OFET以蓄积模式操作。在空穴蓄积模式OFET中，例如当负电压相对于源电极(其是接地的)施加于栅时，在绝缘层附近的有机层中诱导正电荷(空穴)的形成。当施加的栅压超过阈值电压(VT)时，诱导的空穴形成导电通道，并且在相对于源电极施加于漏电极的电位偏压(VDS)条件下，允许电流从漏流动到源。OFET中的通道含有移动的自由空穴，并且阈值电压是诱导导电通道形成所需的最小栅压。因此，OFET以蓄积模式操作，或作为‘常关’装置操作。然而，在一些情况下，OFET可具有在零栅压下的开放通道，意指相对栅压是关闭装置所需的。这些装置因此被称为‘常开’或‘耗尽模式’晶体管。
用于常开CuPc/F16CuPc异质连接晶体管的导电通道中的电荷-载流子类型取决于底层半导体(绝缘体附近的有机层)。电荷蓄积可导致从本体到界面的在p型材料中向上的带弯曲和在n型材料中向下的带弯曲，其不同于常规无机p-n连接的情况。因为自由电子和空穴可共存于有机异质连接膜中，所以取决于栅压，有机异质连接膜可运输电子或空穴是可能的。事实上，在最佳化膜厚度和装置配置后，已观察到双极运输行为。
平面异质连接中的载体运输与异质连接界面平行，类似于OFET的情况且直接反映异质连接膜的电导率。具有双层结构的二极管的电导率可比单层装置的电导率高约一个数量级，并且还可通过改变用于形成异质连接的细胞色素c层中的芳香族阳离子肽浓度得到增强。合适的芳香族阳离子肽浓度范围包括但不限于0-500mM；0-100mM；0-500μm；0-250μm；和0-100μm。对于常开OFET，诱导的电子和空穴形成膜中的导电通道，从而导致高电导率。由于界面的更高粗糙度而减少的电导率可通过改变如上所述的肽掺杂浓度得到补偿。
在n和p型半导体中诱导的电子和空穴在异质连接界面处形成空间电荷区，所述空间电荷区可导致从p到n型半导体的内置电场。此类叠加在具有垂直结构的二极管的电子特性中揭示。垂直异质连接二极管在正电位偏压下产生小电流，并且在负偏压下产生大电流。与无机p-n二极管形成对比，有机异质连接二极管可显示反向整流特征。正偏压强化带弯曲且限制载体流，然而，在负偏压下，施加的电场相对内置场，导致位垒的降低。带弯曲因此在负偏压下减弱，并且通过连接的电流得到辅助。
在有机异质连接界面的两侧上的电荷载流子蓄积产生内置场，其可用于转换OFET中的阈值电压。在n通道有机异质连接晶体管中，例如，阈值电压与n型层中的陷阱密度关联。诱导的电子可填充陷阱；因此，在恒定n型层厚度的条件下，阈值电压随着增加的电子密度而减少。在中性条件下，在p型层中诱导的空穴数目等于n型层中的空穴数目，并且随着p型层厚度增加趋向饱和。因此，有机异质连接晶体管的阈值电压可通过增加p型层的厚度得到降低。电荷蓄积厚度可由在其下阈值电压不再随着增加的p型层厚度而改变的点进行估计。
构成异质连接的两个半导体的功函数之间的差异导致空间-电荷区中的多种电子状态。半导体异质连接也通过形成异质连接的两个半导体的电导率类型进行分类。如果两个半导体具有相同类型的电导率，则连接被称为同型异质连接；否则它被称为非同型异质连接。由于两个部件的费米能级中的差异，电子和空穴可在非同型异质连接的两侧上同时蓄积且耗尽。如果p型半导体的功函数大于n型半导体的功函数()，则电子和空穴的耗尽层存在于异质连接的任一侧上，并且空间-电荷区由不能活动的阴离子和阳离子组成。这类异质连接被称为耗尽异质连接，并且大多数无机异质连接属于这类异质连接，包括常规p-n异质连接。
用于电池的掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
细胞色素c和/或掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))或肽和心磷脂的细胞色素c，也可用于降低电池的内电阻，这使得在放电过程中电池能够维持在几乎恒定的电压下。如本领域理解的，电池是将化学能直接转换为电能的装置。它包括许多伏打电池，所述伏打电池各自依次又包括通过含有阴离子和阳离子的导电电解质串联连接的两个半电池。一个半电池包括电解质和阴离子(带负电的离子)迁移至其的电极，即阳极或负极；另一个半电池包括电解质和阳离子(带正电的离子)迁移至其的电极，即阴极或正极。在给电池供电的氧化还原反应中，阳离子在阴极处被还原(添加电子)，而阴离子在阳极处被氧化(去除电子)。电池不接触彼此，而是由电解质电连接。一些电池使用具有不同电解质的两个半电池。半电池之间的分离器允许离子流动，但防止电解质的混合。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
每个半电池具有电动势(或emf)，由其驱动电流从电池内部到外部的能力决定。电池的净电动势是其半电池的电动势之间的差异。因此，如果电极具有电动势，则半反应的还原电位之间的差异。掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c可用于将电流从具有可变或预置电导率的电池内部传输到外部，以增加(或减少)电动势和/或充电时间，这取决于应用。
跨越电池终端的电驱动力被称为端电压(差异)并且以伏特进行测量。其既不充电也不放电的电池的端电压被称为开路电压，并且等于电池的电动势。由于内电阻，其为放电的电池的端电压在量级中小于开路电压，并且其为充电的电池的端电压超过开路电压。理想的电池具有可忽略不计的内电阻，因此它将维持恒定端电压直至衰竭时，随后降至零。在实际电池中，内电阻在放电下增加，并且开路电压也在放电下减少。如果电压和电阻针对时间进行标绘，则所得到的图通常为曲线；曲线的形状根据采用的化学和内部排列而改变。细胞色素c和/或掺杂心磷脂或一种或多种芳香族阳离子肽或心磷脂和一种或多种肽的细胞色素c可用于降低电池的内电阻，以便提供更佳的性能。关于有机电池的更多细节，参见例如全文以引用的方式并入本文的美国专利号4,585,717。
掺杂单分子肽或心磷脂的细胞色素c电池
细胞色素c的单分子也可用作分子电池，其充电和/或放电时间可通过一种或多种芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))、心磷脂或心磷脂和一种或多种肽进行调节。如本文描述的，细胞色素c是在膜的相对侧上来自荷电氧和氮原子的具有碳和硫的膜蛋白质。更喜欢水样环境的涂布有荷电氧和氮的区域在膜的相对面上伸出。该排列对于由细胞色素c进行的工作是完美的，所述细胞色素c使用氧至水的反应以给分子泵供电。当氧消耗时，通过将氢离子从膜的一侧泵到另一侧来储存能量。以后，通过使氢离子跨越膜回渗，能量可用于构建ATP或给发动机供电。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
用于光伏(太阳能)电池的掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
有机光伏电池(OPV)提供定价和审美中的显著破坏的希望，以及低光条件中的印象深刻的效率。OPV材料也是柔性和形状配合的。OPV可潜在包裹在多种材料周围或甚至印刷在多种材料上。目前的OPV效率为5％-6.25％。尽管这些效率不能充分替换常规发电形式，但OPV适合于不需要显著效率的应用，尤其是考虑到半导体太阳能电池的高成本。例如，OPV电池可用于在低光条件如在办公室、家庭或会议室设置下的低光条件下，在连续点滴式充电设置下给手机供电。
由于在低得多的温度(20-200℃)下的更简单加工，OPV电池例如图18和19中所示的OPV电池也比无机电池更廉价且更易于构建。例如，使用与有机染料和液体电解质结合的二氧化钛的电化学太阳能电池已超过6％功率转换效率，并且由于其相对低的生产成本将要进入商业市场。OPV还可在室温下从溶液加工到柔性基底上，其中使用简单和因此更廉价的沉积方法如旋转涂布或刮刀涂布。可能的应用范围可从给智能塑料卡(信用卡、借记卡、电话卡或其他)供电的小型一次性使用的太阳能电池(其可例如显示剩余量)，至在大面积扫描仪或医学成像中的光检测器和在粗糙表面上的太阳能动力应用。
OPV电池(OPVC)是光伏电池，其使用有机电子学，例如细胞色素c和/或掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))或心磷脂和一种或多种肽的细胞色素c，用于光吸收和电荷运输。OPVC将可见光转换成直流电(DC)。一些光伏电池还可将红外线(IR)或紫外线(UV)放射转换成DC。活性层(例如掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c)的带隙决定OPVC的吸收带。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
当这些有机带隙材料吸收光子时，激发态被产生且局限于吸收光子的分子或分子区域。激发态可视为由静电相互作用结合在一起的电子空穴对。在光伏电池中，激子由有效场拆散成自由的电子空穴对。通过在两种异化材料之间产生异质连接来建立有效场。有效场通过引起电子从吸收剂的导带落到受体分子的导带来拆散激子。受体材料具有的导带边沿低于吸收剂材料的导带边沿是必需的。
单层OPVC可通过将一层有机电子材料(例如细胞色素c或掺杂心磷脂或一种或多种芳香族阳离子肽的细胞色素c)或心磷脂和一种或多种肽夹在两个金属导体之间进行制备，所述两个金属导体通常为一层具有高功函数的铟锡氧化物(ITO)和一层低功函数金属例如Al、Mg或Ca。两个导体之间的功函数差异建立有机层中的电场。当有机层吸收光时，电子将激发至导带且在价带中留下空穴，从而形成激子。由不同功函数产生的电位帮助分开激子对，从而将电子拉动到阴极并且将空穴拉动到阳极。起因于该过程的电流和电压可用于起作用。
在实践中，单层OPVC具有低量子效率(<1％)和低功率转换效率(<0.1％)。关于其的主要问题是起因于两个导电电极之间的差异的电场很少足以拆散光生成激子。通常，电子与空穴重组而不是到达电极。
有机异质连接可用于制备内置场以用于增强OPVC性能。异质连接通过将两个或更多个不同层掺入导电电极之间来实现。这些两层或更多层材料具有电子亲和力和电离能的差异，例如由于肽浓度、心磷脂浓度或肽和心磷脂浓度，其在两层之间的界面处诱导静电力。材料适当选择以使得差异足够大，因此这些局部电场很强，其可比单层光伏电池有效得多地拆散激子。具有更高电子亲和力(例如更高的肽掺杂浓度)和电离电位的层是电子受体，并且另一层是电子供体。该结构也被称为平面供体-受体异质连接。
电子供体和受体可混合在一起，以形成本体异质连接OPVC。如果掺和的供体和受体的长度规模类似于激子扩散距离，则在任一材料中生成的大多数激子可到达界面，在其中激子有效断裂。电子移动到受体结构域，随后通过装置携带且由一个电极收集，并且空穴在相反方向上拉动且在另一侧处收集。
与有机光伏电池相关的困难包括其与无机光伏装置相比较的低量子效率(～3％)；在很大程度上由于有机材料的大带隙。针对氧化和还原的不稳定性、重结晶和温度变动也可导致装置降解和随着时间过去减少的性能。这对于具有不同组成的装置在不同程度发生，并且是采取主动研究的领域。其他重要因素包括激子扩散距离；电荷分离和电荷收集；和电荷运输和迁移性，其受杂质的存在影响。关于有机光伏电池的更多细节，参见例如美国专利号6,657,378；美国专利号7,601,910；和美国专利号7,781,670，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。
掺杂示例性芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c的薄膜应用
如电子领域普通技术人员充分理解的，上述装置中的任一种可通过沉积、生长或另外提供薄层材料以形成适当结构进行制备。例如，晶体管、二极管和光伏电池的异质连接可通过使具有不同带隙能量的材料层彼此邻近或以分层方式沉积来形成。除形成分层薄膜结构之外，通过沉积材料的异质混合物，可混合具有不同带隙的有机材料，以形成具有多种空间排列的异质连接，如图19(a)和19(b)中所示。此类异质混合物可包括但不限于细胞色素c、芳香族阳离子肽和掺杂不同水平的心磷脂或芳香族阳离子肽的细胞色素c的混合物，所述芳香族阳离子肽包括但不限于例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)。示例性芳香族阳离子肽水平可包括但不限于0-500mM；0-100mM；0-500μM；0-250μM；和0-100μM。例如通过增加电导率和/或降低在电极处的热消散，这些薄膜还可用于增强常规电子装置的性能。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
如上所述，与平面异质连接相比较，分散的供体-受体有机材料的异质连接具有高量子效率，因为激子更可能发现在其扩散距离内的界面。膜形态还可对装置的量子效率具有强烈作用。粗糙表面和空隙的存在可增加串联电阻以及短路的机会。膜形态和量子效率可通过在用具有约厚度的金属阴极覆盖装置后，使其退火而得到改善。在有机膜之上的金属膜对有机膜施加压力，这帮助防止有机膜中的形态松弛。这获得更致密填充的膜，同时允许形成在有机薄膜本体内部的相分离的相互渗透的供体-受体界面。
异质连接的控制生长提供对供体-受体材料的位置的更佳控制，导致比平面和高度定向障碍的异质连接的大得多的功率效率(输出功率与输入功率的比率)。这是因为电荷分离在供体受体界面处发生：当电荷行进到电极时，它可变得被截留和/或在混乱的相互渗透的有机材料中重组，导致减少的装置效率。选择合适的加工参数以更佳控制结构和膜形态减轻不希望有的过早截留和/或重组。
沉积掺杂芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
用于光伏电池及其他应用的包括细胞色素c、芳香族阳离子肽、或掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽(例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31))或心磷脂和一种或多种肽的细胞色素c的有机膜可通过旋转涂布、气相沉积和美国专利号6,734,038；美国专利号7,662,427；和美国专利号7,799,377中所述的方法进行沉积，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。旋转涂布技术可用于以高速度涂布更大的表面积，但对于一层使用溶剂可降解任何已经存在的聚合物层。旋转涂布的材料必须在分离的模式化步骤中进行模式化。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
如图20(a)中所示的真空热蒸发(VTE)是涉及加热真空中的有机材料的沉积技术。基底放置远离源几厘米，使得蒸发的材料可直接沉积到基底上。VTE可用于沉积多层不同材料，而在不同层之间没有化学相互作用。
如图20(b)中所示的有机气相沉积(OVPD)获得比真空热蒸发更佳的对膜结构和形态的控制。OPVD涉及在惰性载气的存在下在基底上的有机材料的蒸发。所得到的膜的形态可通过改变气体流速和源温度进行改变。均匀膜可通过降低载气压得到生长，所述降低载气压增加气体的速度和平均自由程，其导致边界层厚度的减少。通过OVPD制备的电池不具有来自从室壁出来的絮片的污染有关的问题，因为壁是温的且不允许分子粘附膜且在其上产生膜。取决于生长参数(例如源温度、载气的底压和流量等)，沉积的膜在性质上可以是结晶或无定形的。使用OVPD构造的装置显示比使用VTE制备的装置更高的短路电流密度。在电池之上的供体-受体异质连接的额外层可阻断激子，同时允许电子的传导，导致改善的电池效率。
用于增加效率的掺杂示例性芳香族阳离子肽或心磷脂或两者的细胞色素c
如上所述，心磷脂或示例性芳香族阳离子肽例如Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-01)、2′,6′-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-02)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)或D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)可单独或与心磷脂结合使用，以增加电导率。因此，示例性芳香族阳离子肽和心磷脂可用于传导电流，具有通过(废)热能产生的更低损耗。该效应可用于延长电池供电装置例如消费电子产品的操作寿命，和大功率系统例如输电应用中。废热生产的降低也降低冷却需要，进一步增加效率且延长由传导材料供电的电子装置的寿命，所述传导材料例如掺杂心磷脂或芳香族阳离子肽或心磷脂和本发明的一种或多种肽的细胞色素c。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α，β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
用于细胞色素c生物传感器应用的芳香族阳离子肽
本文描述的芳香族阳离子肽可用于增强细胞色素c生物传感器中的电子流，且增加其灵敏度水平。如由例子示出的，本文公开的肽例如肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2促进细胞色素c的还原(图1)且增加通过细胞色素c的电子流(图2)。
细胞色素c从电化学观点来看是有希望的生物传感器候选物。然而，在血红素和裸电极之间的电子转移通常缓慢。作为另外一种选择，小介质可用于间接促进氧化还原活性中心和电极之间的电子转移。另外或可替代地，可使用直接电子转移方法，由此氧化还原活性酶直接固定在电极表面上。例如，在pH7下带正电且含有在血红素边缘周围的大量Lys残基的细胞色素c，例如通过自装配的羧基末端的烷硫醇而吸附在产生的带负电的表面上。在一些实施例中，在+150mV的恒定电位下，细胞色素c电极对在nM浓度范围中的超氧化物敏感。
在一些方面，本公开内容提供了用于增加细胞色素c生物传感器的灵敏度的方法和组合物。在一些实施例中，细胞色素c生物传感器包括本文公开的芳香族阳离子肽中的一种或多种。在一些实施例中，掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c充当生物传感器内的氧化还原活性酶和电极之间的介质。在一些实施例中，掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c直接固定在生物传感器的电极上。在一些实施例中，肽和心磷脂中的一种或多种与生物传感器内的细胞色素c连接。在一些实施例中，肽和心磷脂中的一种或多种不与细胞色素c连接。在一些实施例中，肽、心磷脂和/或细胞色素c中的一种或多种固定在生物传感器内的表面上。在其他实施例中，肽、心磷脂和/或细胞色素c中的一种或多种在生物传感器内可自由扩散。在一些实施例中，生物传感器包括肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2和/或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。在一些实施例中，芳香族阳离子肽包含：Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)，其中(atn)Dap是β-氨茴酰-L-α,β-二氨基丙酸；Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)，其中Ald是β-(6’-二甲氨基-2’-萘酰)丙氨酸；D-Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)；和Dmt-D-Arg-Phe-(dns)Dap-NH2，其中(dns)Dap是β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸(SS-17)。
图11显示在生物传感器内的电子流，在所述生物传感器中芳香族阳离子肽和细胞色素c充当从氧化还原活性酶到电极的电子流的介质。在一些实施例中，生物传感器包括心磷脂。在串联氧化还原反应中，电子从基底300转移到氧化还原活性酶310，从酶310转移到掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂肽/心磷脂的细胞色素c320，并且从掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂肽/心磷脂的细胞色素c320转移到电极330。
图12显示在生物传感器内的电子流，在所述生物传感器中芳香族阳离子肽和细胞色素c直接固定在电极上。在一些实施例中，生物传感器包括心磷脂。在串联氧化还原反应中，电子从基底340转移到氧化还原活性酶350，并且从酶350转移到掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c固定在其上的电极360。
在环境污染物的生物修复中的芳香族阳离子肽
本文公开的芳香族阳离子肽可用于环境污染物的生物修复。特别地，该肽可用于增加生物修复反应中的速率和/或效率，在所述生物修复反应中细菌细胞色素c介导电子到环境污染物的转移，由此改变物质的效价且降低其相对毒性。在本文公开的方法中，芳香族阳离子肽与细菌细胞色素c相互作用且促进电子传递。在一个方面，芳香族阳离子肽促进细菌细胞色素c的还原。在另一个方面，该肽增强通过细菌细胞色素c的电子扩散。在另一个方面，该肽增强细菌细胞色素c中的电子容量。在另一个方面，该肽诱导围绕细菌细胞色素的血红素基团的新型π-π相互作用，所述相互作用有利于电子扩散。最终，芳香族阳离子肽与细菌细胞色素c的相互作用促进和/或增强环境污染物的异化还原。
在一个方面，本公开内容提供了用于环境污染物的生物修复的方法和组合物。一般而言，该方法包括在有助于样品中存在的特定污染物的异化还原的条件下，使含有环境污染物的样品与生物修复组合物接触。一般而言，生物修复组合物包含表达本文公开的芳香族阳离子肽中的一种或多种的重组细菌。
在一些实施例中，本文描述的生物修复组合物包含重组细菌，所述重组细菌表达来自外源核酸的本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。在一些实施例中，核酸编码肽。在一些实施例中，编码肽的核酸携带在质粒DNA上，所述质粒DNA通过细菌转化由细菌吸收。可用于本文描述的方法中的细菌表达质粒的例子包括但不限于ColE1、pACYC184、pACYC177、pBR325、pBR322、pUC118、pUC119、RSF1010、R1162、R300B、RK2、pDSK509、pDSK519和pRK415。
在一些实施例中，生物修复组合物包含重组细菌，所述重组细菌表达来自稳定基因组插入片段的本文公开的芳香族阳离子肽。在一些实施例中，基因组插入片段包含编码肽的核酸序列。在一些实施例中，核酸序列由整合到细菌基因组内的细菌转座子携带。可用于本文描述的方法中的细菌转座子的例子包括但不限于Tn1、Tn2、Tn3、Tn21、γδ(Tn1000)、Tn501、Tn551、Tn801、Tn917、Tn1721Tn1722Tn2301。
在一些实施例中，编码芳香族阳离子肽的核酸序列处于细菌启动子的控制下。在一些实施例中，启动子包含诱导型启动子。可用于本文描述的方法中的诱导型启动子的例子包括但不限于热休克启动子、异丙基β-D-L-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导型启动子和四环素(Tet)诱导型启动子。
在一些实施例中，启动子包含组成型启动子。可用于本文描述的方法中的组成型启动子的例子包括但不限于spc核糖体蛋白操纵子启动子(Pspc)、β-内酰胺酶基因启动子(Pbla)、λ噬菌体的PL启动子、复制控制启动子PRNAI和PRNAII、以及rrnB核糖体RNA操纵子的P1和P2启动子。
在一些实施例中，重组细菌包含希瓦氏菌属(Shewenella)。在一些实施例中，细菌包含深渊希瓦氏菌(S.abyssi)、海藻希瓦氏菌(S.algae)、嗜冷希瓦氏菌(S.algidipiscicola)、亚马逊希瓦氏菌(S.amazonensis)、海水希瓦氏菌(S.aquimarina)、波罗的海希瓦氏菌(S.baltica)、希瓦氏菌属嗜压菌(S.benthica)、考氏希瓦氏菌(S.colwelliana)、脱色希瓦氏菌(S.decolorationis)、反硝化希瓦氏菌(S.denitrificans)、奥奈达湖希瓦氏菌(S.donghaensis)、真实希瓦菌(S.fidelis)、冷海希瓦氏菌(S.frigidimarina)、S.gaetbuli、冰海希瓦氏菌(S.gelidimarina)、S.glacialipiscicola、S.hafniensis、哈夫尼希瓦氏菌(S.halifaxensis)、羽田希瓦氏菌(S.hanedai)、S.irciniae、日本希瓦氏菌(S.japonica)、S.kaireitica、S.livingstonensis、S.loihica、海动物肠希瓦氏菌(S.marinintestina)、S.marisflavi、鱼希瓦菌(S.morhuae)、S.olleyana、奥奈达希瓦式菌(S.oneidensis)、S.pacifica、皮氏希瓦氏菌(S.pealeana)、耐压希瓦氏菌(S.piezotolerans)、S.pneumatophori、S.profunda、S.psychrophila、腐败希瓦菌(S.putrefaciens)、竹刀鱼希瓦氏菌(S.sairae)、S.schegeliana、S.sediminis、S.spongiae、S.surugensis、紫色希瓦氏菌(S.violacea)、S.waksmanii、或武氏希瓦氏菌(S.woodyi)。
在一些实施例中，重组细菌包含地杆菌属(Geobacter)。在一些实施例中，细菌包含G.ferrireducens、G.chapellei、G.humireducens、G.arculus、硫还原地杆菌(G.sullfurreducens)、G.hydrogenophilus、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、G.argillaceus、G.bemidjiensis、G.bremensis、G.grbiciae、G.pelophilus、G.pickeringii、G.thiogenes或G.uraniireducens。
在一些实施例中，重组细菌包含脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)。在一些实施例中，细菌包含棕榈油酸脱硫单胞菌(D.palmitatis)、D.chloroethenica、需乙酸脱硫单胞菌(D.acetexigens)、乙酸氧化脱硫单胞菌(D.acetoxidans)、脱硫单胞菌(D.michiganensis)或嗜硫脱硫单胞菌(D.thiophila)、脱硫单胞菌属物种(D.sp)。
在一些实施例中，重组细菌包含脱硫弧菌属(Desulfovibrio)。在一些实施例中，细菌包含非洲脱硫弧菌(Desulfovibrio africanus)、Desulfovibrio baculatus、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)、巨大脱硫弧菌(Desulfovibrio gigas)、嗜盐脱硫弧菌(Desulfovibrio halophilus)、趋磁脱硫弧菌(Desulfovibrio magneticus)、Desulfovibrio multispirans、惰性脱硫单胞菌(Desulfovibrio pigra)、Desulfovibriosalixigens、脱硫弧菌属物种(Desulfovibrio sp.)或普通脱硫弧菌(Desulfovibriovulgaris)。
在一些实施例中，重组细菌包含硫还原弯形菌属(Desulfuromusa)。在一些实施例中，细菌包含巴氏硫还原弯形菌(D.bakii)、科瑟硫还原弯形菌(D.kysingii)或琥珀酸氧化硫还原弯形菌(D.succinoxidans)。
在一些实施例中，重组细菌包含暗杆菌属(Pelobacter)。在一些实施例中，细菌包含乙炔居泥杆菌(P.propionisus)、P.acetylinicus、P.venetianus、P.arbinolicus、没食子酸居泥杆菌(P.acidigallici)、暗杆菌属物种(P.sp.)A3b3、玛斯里暗杆菌(P.masseliensis)或P.seleniigenes。
在一些实施例中，重组细菌包含海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Thermoterrobacterium ferrireducens、Deferribacter thermophilus、Geovibrioferrireducens、Desulfobacter propionicus、Geospirillium barnseii、Ferribacteriumlimneticum、Geothrix fermentens、土下芽孢杆菌(Bacillus infernus)、Thermas sp.SA-01、大肠杆菌(Escherichia coli)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)、反硝化微球菌(Micrococcus denitrificans)、脱氮副球菌(Paraoccus denitrificans)或假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)。
在一些实施例中，本文公开的方法涉及金属的异化还原。在一些实施例中，金属包含Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Pd、Ag、Cd、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Cn、Al、Ga、In、Sn、Ti、Pb或Bi。在一些实施例中，该方法导致不溶性氧化物的形成。在一些实施例中，该方法导致Cr(VI)还原为Cr(III)和不溶性沉淀物的形成。在一些实施例中，用于金属生物修复的方法包括使金属与包含表7中列出的细菌的生物修复组合物接触，所述细菌被改造为表达本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。
在一些实施例中，本文公开的方法涉及非金属的异化还原。在一些实施例中，非金属包含硫酸盐。在一些实施例中，该方法导致硫酸盐的还原和硫化氢的形成。在一些实施例中，硫酸盐生物修复方法包括使硫酸盐与包含表7中列出的细菌的生物修复组合物接触，所述细菌被改造为表达本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。
在一些实施例中，本文公开的方法涉及高氯酸盐的异化还原。在一些实施例中，高氯酸盐包含NH4ClO4、CsClO4、LiClO4、Mg(ClO4)2、HClO4、KClO4、RbClO4、AgClO4或NaClO4。在一些实施例中，该方法导致高氯酸盐还原为亚氯酸盐。在一些实施例中，高氯酸盐生物修复方法包括使高氯酸盐与包含大肠杆菌、奇异变形杆菌、荚膜红细菌或类球红细菌的生物修复组合物接触，所述细菌被改造为表达本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。在一些实施例中，高氯酸盐生物修复方法包括使高氯酸盐与包含表7中列出的细菌的生物修复组合物接触，所述细菌被改造为表达本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。
在一些实施例中，本文公开的方法涉及硝酸盐的异化还原。在一些实施例中，硝酸盐包含HNO3、LiNO3、NaNO3、KNO3、RbNO3、CsNO3、Be(NO3)2、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2、Sr(NO3)2、Ba(NO3)2、Sc(NO3)3、Cr(NO3)3、Mn(NO3)2、Fe(NO3)3、Co(NO3)2、Ni(NO3)2、Cu(NO3)2、Zn(NO3)2、Pd(NO3)2、Cd(NO3)2、Hg(NO3)2、Pb(NO3)2或Al(NO3)3。在一些实施例中，该方法导致硝酸盐还原为亚硝酸盐。在一些实施例中，硝酸盐生物修复方法包括使硝酸盐与包含脱氮硫杆菌、反硝化微球菌、脱氮副球菌或假单胞菌属物种或大肠杆菌的生物修复组合物接触，所述细菌被改造为表达本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。在一些实施例中，硝酸盐生物修复方法包括使硝酸盐与包含表7中列出的细菌的生物修复组合物接触，所述细菌被改造为表达本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。
在一些实施例中，本文公开的方法涉及放射性核素的异化还原。在一些实施例中，放射性核素包含锕系元素。在一些实施例中，放射性核素包含铀(U)。在一些实施例中，该方法导致U(VI)还原为U(IV)和不溶性沉淀物的形成。在一些实施例中，该方法涉及甲基-叔丁基醚(MTBE)、氯乙烯或二氯乙烯的异化还原。在一些实施例中，生物修复方法包括使这些污染物与包含表7中列出的细菌的生物修复组合物接触，所述细菌被改造为表达本文公开的一种或多种芳香族阳离子肽。
在一些实施例中，本文公开的方法包括原位生物修复，其中本文描述的生物修复组合物在环境污染场所处施用。在一些实施例中，该方法包括非原位生物修复，其中污染材料从其原始位置取出且在其他地方处理。
在一些实施例中，非原位生物修复包括土地耕作，其中被污染的土壤从其原始位置挖出，与本文描述的生物修复组合物组合，铺展在制备的床上，并且定期耕耘直至污染物被去除或降低至可接受的水平。在一些实施例中，非原位生物修复包括堆肥，其中被污染的土壤从其原始位置挖出，与本文描述的生物修复组合物和无害有机材料组合，并且维持在堆肥容器中直至污染物被去除或降低至可接受的水平。在一些实施例中，非原位生物修复包括在生物反应器中的去污，其中将被污染的土壤或水置于经改造的包含系统中，与本文描述的生物修复组合物组合，并且维持直至污染物被去除或降低至可接受的水平。
用于生成本文描述的重组细菌的方法是本领域熟知的。技术人员将理解许多常规分子生物学技术可用于生成编码一种或多种芳香族阳离子肽的细菌质粒。例如，使用限制性酶和连接酶，编码肽的核酸序列可被合成且克隆到选择的质粒内。连接产物可被转化到大肠杆菌内，以便生成大量产物，所述产物随后可转化到选择的生物修复细菌内。类似地，策略可用于生成携带编码一种或多种芳香族阳离子肽的核酸序列的细菌转座子，且将转座子转化到选择的生物修复细菌内。
技术人员还将理解常规细菌学方法可用于生成大量本文描述的重组细菌，以用于大规模的生物修复操作。技术人员将理解精确的培养条件将取决于使用中的具体细菌物种而改变，并且多种生物修复细菌的培养条件是本领域可容易获得的。
生物修复的一般参考文献及其他相关申请在下述参考文献中提供，所述参考文献在此全文以引用方式并入：美国专利号6,913,854；Reimers,C.E.等人"Harvesting Energyfrom Marine Sediment-Water Interface"Environ.Sci.Technol.2001,35,192-195,2000年11月16日；Bond D.R.等人"Electrode Reducing Microorgaisms that Harvest Energyfrom Marine Sediments"Science,第295卷，483-4852002年1月18日；Tender,L.M.等人"Harnessing Microbially Generated Power on the Seafloor"Nature Biology,第20卷,pp.821-825,2002年8月；DeLong,E.F.等人"Power From the Deep"Nature Biology,第20卷，第788-789页，2002年8月；Bilal,"Thermo-Electrochemical Reduction of Sulfateto Sulfide Using a Graphite Cathode,"J.Appl.Electrochem.,28,1073,(1998)；Habermann等人，"Biological Fuel Cells With Sulphide Storage Capacity,"AppliedMicrobiology Biotechnology,35,128,(1991)；和Zhang等人，"Modelling of aMicrobial Fuel Cell Process,"Biotechnology Letters,第17卷No.8,第809-814页(1995年8月)。
在纳米线应用中的芳香族阳离子肽、心磷脂和细胞色素c
本文公开的芳香族阳离子肽、细胞色素c和/或掺杂心磷脂或掺杂肽或掺杂心磷脂/肽的细胞色素c可用于纳米线应用中。通常，纳米线是具有纳米级别的直径(10-9米)的纳米结构。作为另外一种选择，纳米线可定义为具有限于数十纳米或更少的厚度或直径和不受限制的长度的结构。在这些规模上，量子机械效应发挥作用。存在许多不同类型的纳米线，包括金属的(例如Ni、Pt、Au)、半导体的(例如Si、InP、GaN等)、和绝缘的(例如SiO2、TiO2)。分子纳米线由有机(例如DNA、本文公开的芳香族阳离子肽、细胞色素c和/或掺杂心磷脂或肽或肽/心磷脂的细胞色素c等)或无机(例如Mo6S9-xIx)的重复分子单元组成。本文公开的纳米线例如可用于将部件连接到极小电路内。使用纳米技术，部件由化学化合物制成。
纳米线合成
存在合成纳米线的两种基础方法：自上而下和自下而上的方法。在自上而下的方法中，通过不同方法例如光刻技术和电泳，将大片材料切割成小片，然而，在自下而上的方法中，通过组合组成成分附加原子来合成纳米线。大多数合成技术基于自下而上的方法。
纳米线结构通过几种常见实验室技术得到生长，所述常见实验室技术包括悬浮、沉积(电化学或其他方式)和VLS生长。
悬浮的纳米线是保持在纵向端处在高真空室中产生的线。悬浮的纳米线可通过下述产生：化学蚀刻、或较大线的轰击(通常使用高能离子)；在金属表面中接近其熔点缩进STM的尖端，且随后将它缩回。
用于产生纳米线的另一种常见技术是汽-液-固(VLS)合成方法。该技术使用激光消融颗粒或进料气体(例如硅烷)作为源材料。该源随后暴露于催化剂。对于纳米线，最佳催化剂是液体金属(例如金)纳米簇，其或以胶体形式购买且沉积在基底上，或通过反湿润由薄膜自装配。该过程通常可在半导体材料的情况下产生结晶纳米线。该源进入这些纳米簇且开始使其饱和。一旦达到超饱和，该源就固化且从纳米簇向外生长。最终产物的长度可通过简单关闭源进行调节。具有交替材料的超晶格的化合物纳米线可通过在仍处于生长期时转换源来产生。在一些实施例中，可使用源材料例如芳香族阳离子肽、细胞色素c和/或掺杂心磷脂或肽或心磷脂/肽的细胞色素c。无机纳米线例如Mo6S9-xIx(其可替代地视为簇聚合物)在单步气相反应中在高温下合成。
另外，许多类型的材料例如芳香族阳离子肽、细胞色素c和/或掺杂心磷脂或肽或心磷脂/肽的细胞色素c的纳米线可在溶液中生长。溶液相合成具有下述优点：与在表面上产生纳米线的方法相比较，它可按比例增加以产生非常大量的纳米线。其中乙二醇是溶剂和还原剂两者的多元醇合成已证明在产生Pb、Pt和银的纳米线方面是特别通用的。
一般方法
细胞色素c还原：将渐增量的芳香族阳离子肽加入氧化型细胞色素c的溶液中。还原型细胞色素c的形成通过在500nm处的吸光度进行监控。细胞色素c还原率通过非线性分析(Prizm软件)进行测定。
时间分辨的UV-可见吸收光谱法用于研究在肽的存在下的细胞色素c电子传递过程。还原型细胞色素c通过在宽带光谱范围(200-1100nm)处的吸光度进行监控。吸收改变用UV/可见分光光度计(Ultrospec3300pro,GE)在具有1或2mm径长的石英池中记录。N-乙酰半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽用作电子供体，以还原氧化型细胞色素c。细胞色素c还原的速率常数通过添加多种浓度的肽进行估计。肽的剂量依赖性与细胞色素c还原动力学关联。
线粒体O2消耗和ATP生产：新鲜线粒体如先前描述的从大鼠肾中分离。电子流量如先前描述的通过O2消耗(Oxygraph Clark电极)进行测量，其中使用不同的C1(谷氨酸盐/苹果酸盐)、C2(琥珀酸盐)和C3(TMPD/抗坏血酸盐)底物。测定在低底物条件下进行，以便避免使酶反应饱和。分离的线粒体中的ATP生产使用萤光素酶方法(Biotherma)在96孔发光板阅读器(Molecular Devices)中动态测定。ATP合成的初始最大速率经过第一分钟进行测定。
循环伏安法：循环伏安法使用Bioanalytical System CV-50W VoltammetricAnalyzer进行，其中使用具有+0.237V电位相对于NHE的Ag/AgCl/1M KCl参考电极(Biometra,德国)和铂对电极。金丝电极根据建立的方案进行清洁。细胞色素c在溶液中的电化学研究使用巯基丙醇修饰的电极(在20mM巯基丙醇中温育24小时)进行。记录使用在1MKCl和10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4/7.8中的20μM细胞色素c的循环伏安法。克式量电位计算为在不同扫描速率(100-400mV/s)下的阳极和阴极峰电位与来自根据Randles-Sevcik方程在不同扫描速率下的峰电流的扩散系数之间的中点。
实例
通过下述实例进一步举例说明本发明，所述实例不应解释为以任何方式限制本发明。
实例1.芳香族阳离子肽的合成
使用固相肽合成并且所有的氨基酸衍生物均是商购可得的。在肽装配完成后，以通常方式从树脂切割肽。通过制备型反相色谱法净化粗制肽。通过FAB质谱法证实肽的结构特性(identity)，并且通过分析型反相HPLC和薄层色谱法在三个不同的系统中评估其纯度。将达到>98％的纯度。通常，使用5g的树脂的合成运行获得约2.0-2.3g的纯肽。
实例2.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)促进细胞色素c还原。
吸收光谱法(UltroSpec3300Pro；220-1100nm)用于测定SS-31是否调节细胞色素c还原(图1)。用谷胱甘肽还原细胞色素c与Q带(450-650nm)中的多重转变相关，其中具有在550nm处的突出转变。SS-31的添加产生显著的在550nm处的谱重转移(图1A)。时间依赖性光谱法显示SS-31增加细胞色素c还原率(图1B)。这些数据提示SS-31改变细胞色素c的电子结构且增强Fe3+还原为Fe2+血红素。
实例3.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增强通过细胞色素c的电子扩散
执行伏安法(CV)，以测定SS-31是否改变电子流和/或细胞色素c的还原/氧化电位(图2，上图)。使用Au工作电极、Ag/AgCl参考电极和Pt辅助电极完成CV。SS-31增加细胞色素c的还原和氧化过程两者的电流(图2，上图)。SS-31不改变还原/氧化电位(图2，上图)，而是增加通过细胞色素c的电子流，从而提示SS-31减少复合物III至IV之间的电阻。对于图2(下图)，所有伏安测量均使用与BASi C3Cell Stand联接的BASi-50W Voltammetric Analyzer进行。Ag/AgCl电极用作参考，并且玻璃碳和铂电极用于标准测量。在每次测量前，溶液用氮完全脱气，以避免电极结垢。如图2(下图)中所示，对于Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液、缓冲液加上细胞色素c、和缓冲液加上细胞色素c加上两种不同SS31剂量获得循环伏安图。电流(电子扩散率)增加几乎200％，因为SS31剂量就细胞色素c而言加倍(cyt c:SS31＝1:2)。结果指示SS31促进细胞色素c中的电子扩散，从而使得该肽可用于设计更灵敏的生物检测器。
实例4.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增强细胞色素c中的电子容量。
执行光致发光(PL)，以检查SS-31对细胞色素c血红素的导带的电子结构的作用，所述导带为负责电子传递的能态(图3)。Nd:YDO4激光器(532.8nm)用于激发细胞色素c中的电子(图2A)。细胞色素c状态中的强PL发射可在650nm处明确鉴定(图2B)。PL强度随着SS-31的添加呈剂量依赖性增加，从而意味着在细胞色素c中的导带中的可用电子态增加(图2B)。这提示SS-31增加细胞色素c导带的电子容量，从而与SS-31介导的通过细胞色素c的电流的增加一致。
实例5.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)诱导围绕细胞色素c血红素的新型π-π 相互作用。
执行圆二色性(Olis分光偏振计，DSM20)，以监控索雷带(在415nm处的负峰)，作为用于细胞色素c中的π-π*血红素环境的探针(图4)。SS-31促进该峰至440nm的“红色”转变，从而提示SS-31诱导细胞色素c内的新型血红素-酪氨酸π-π*转变，而不变性(图4)。这些结果提示SS-31必须修饰血红素的中间环境，或通过提供另外的Tyr用于对血红素的电子隧穿，或通过降低内源Tyr残基和血红素之间的距离。围绕血红素的π-π*相互作用的增加将增强电子隧穿，其将有利于电子扩散。
实例6.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加线粒体O2消耗。
使用Oxygraph测定分离的大鼠肾线粒体的耗氧量(图5)。呼吸速率在不同浓度的SS-31的存在下在2态(仅400μM ADP)、3态(400μM ADP和500μM底物)和4态(仅底物)中进行测量。所有实验均一式三份完成，其中n＝4-7。结果显示SS-31促进对氧的电子转移，而不使线粒体解偶联(图5)。
实例7.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加分离的线粒体中的ATP合成。
在添加400mM ADP后1分钟，通过测量从分离的线粒体收集的呼吸缓冲液中的ATP测定线粒体ATP合成率(图6)。ATP通过HPLC进行测定。所有实验均一式三份进行，其中n＝3。SS-31对分离的线粒体的添加剂量依赖性增加ATP合成率(图6)。这些结果显示通过SS-31的电子转移的增强与ATP合成偶联。
实例8.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增强细胞色素c耗尽的丝状体中的呼 吸。
为了证实细胞色素c在SS-31对线粒体呼吸的作用中的作用，在由冷冻一次的大鼠肾线粒体制备的细胞色素c耗尽的丝状体中测定SS-31对线粒体O2消耗的作用(图7)。在500μM琥珀酸盐连同或不连同100μM SS-31的存在下测量呼吸速率。实验一式三份执行，其中n＝3。这些数据提示：1)SS-31经由IMM紧密结合的细胞色素c起作用；2)SS-31可援救功能细胞色素c的下降。
实例9.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)和Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)促进 细胞色素c还原。
SS-31和SS-20可加速由谷胱甘肽(GSH)作为还原剂诱导的细胞色素c还原的动力学(图13)。细胞色素c的还原通过在550nm处的吸光度的增加进行监控。GSH的添加导致在550nm处的吸光度的时间依赖性增加(图13)。使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为还原剂获得相似结果(未示出)。SS-31单独以100μM浓度的添加不还原细胞色素c，但SS-31剂量依赖性增加NAC诱导的细胞色素c还原率，从而提示SS-31不贡献电子，而是加速电子转移。
实例10.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)和Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)增 加线粒体电子流量和ATP合成。
SS-20和SS-31两者均可促进电子流量，如通过分离的大鼠肾线粒体中的O2消耗测量的(图14)。SS-20或SS-31以100μM浓度加入呼吸缓冲液中的分离的线粒体，所述呼吸缓冲液含有0.5mM琥珀酸盐(复合物II底物)和400μM ADP。当使用低浓度的复合物I底物(谷氨酸盐/苹果酸盐)时，观察到O2消耗的相似增加(数据未示出)。电子流量的增加与分离的线粒体中的ATP生产率的显著增加关联，所述分离的线粒体由低浓度的琥珀酸盐供能(图15)。这些数据提示将SS-20和SS-31靶向IMM可促进电子传递链中的电子流量且改善ATP合成，尤其是在减少底物供应的条件下。
实例11.细胞色素c分离和纯化
分离且纯化细胞色素c的方法是本领域已知的。提供了一种示例性非限制性方法。细胞色素c具有几个带正电的基团，从而给予其约10的pI。因此，它通常通过与膜上的磷脂负电荷的离子吸引而与线粒体膜结合。组织和线粒体首先通过在低pH下在硫酸铝溶液中在搅拌机中的匀浆化来打碎。带正电的铝离子可通过与带负电的磷脂结合置换来自膜的细胞色素c，且释放溶液中的蛋白质。过量硫酸铝通过将pH升高至8.0得到去除，其中铝以氢氧化铝的形式沉淀。
在过滤以消除沉淀的氢氧化铝后，离子交换色谱法用于根据其电荷分离蛋白质。细胞色素c具有几个带正电的基团；通常，柱由Amberlite CG-50带负电的或离子交换树脂制备。
一旦已收集洗脱液，硫酸铵沉淀就用于选择性沉淀细胞色素c制剂中的剩余污染蛋白质。大多数蛋白质在硫酸铵中以80％饱和沉淀，然而，细胞色素c保持可溶。溶液中存在的过量盐随后通过凝胶过滤色谱法进行去除，所述凝胶过滤色谱法基于其大小分离蛋白质。
为了评估纯化，在每个纯化步骤时收集制剂样品。这些样品随后使用Bradford方法测定总蛋白质含量，并且通过分光光度法测量其细胞色素c浓度。
实例12：可溶性硫酸盐通过脱硫脱硫弧菌的异化还原
本文描述的生物修复组合物和方法还将通过下述实例举例说明。该实例提供仅用于举例说明的目的，并且不预期是限制性的。化学品及其他组分作为典型的呈现。考虑到前述公开内容在本文描述的方法和组合物范围内可衍生修饰。
表达载体构建：化学合成编码芳香族阳离子肽的寡核苷酸。寡核苷酸将设计为包括在任一末端处的独特限制位点，所述限制位点将允许直接克隆到携带在多克隆位点上游的组成型启动子的细菌质粒内。质粒将通过限制性消化进行制备，其中使用对应于寡核苷酸末端上的限制性位点的酶。使用常规分子生物学技术，使寡核苷酸退火且连接到制备的质粒内。将连接产物转化到在选择性培养基上生长的大肠杆菌内。使用本领域已知的方法，通过DNA测序就cDNA插入片段筛选几个阳性克隆。将扩增阳性克隆且制备表达构建体原种。
脱硫脱硫弧菌的转化：将100ml脱硫脱硫弧菌过夜培养物(OD600＝0.6)离心，并且用无菌水将团块洗涤三次且重悬浮于终体积200μl无菌水中。使30μl等分试样与4μl质粒制剂(1μg)混合，且通过电脉冲仪器实施5,000V/cn电脉冲共6ms。基于由重组质粒赋予的抗生素抗性，选择重组细菌。
重组脱硫脱硫弧菌的硫酸盐还原酶活性的测定：野生型和重组脱硫脱硫弧菌菌株测试还原可溶性硫酸盐的能力。细菌将在由Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物收藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures))推荐的培养基中在30℃下在厌氧条件下进行培养。用野生型和重组脱硫脱硫弧菌接种1280ppm硫酸盐的水溶液且培养12小时。
硫酸盐测量：硫酸盐浓度将使用比浊法技术(Icgen等人，2006)进行测量。硫酸盐将在具有氯化钡的盐酸培养基中沉淀，以形成不溶性硫酸钡结晶。新鲜制备经修饰的含有甘油(104.16mL)、浓盐酸(60.25mL)和95％异丙醇(208.33mL)的条件化混合物。对于每次反应，2mL无细胞上清液将在250mL锥形瓶中的Millipore水中稀释1:50，并且添加5mL条件化混合物。整个悬浮液将通过搅拌充分混合。添加大约1克氯化钡结晶，同时搅拌继续1分钟。在420nm处分光光度计测量浊度前，允许混合物在静止条件下沉降2分钟。硫酸盐离子的浓度将由使用范围为0-40ppm Na2SO4的标准制备的曲线进行测定。
结果：预测表达芳香族阳离子肽的重组细菌在这些条件下将展示增强的异化硫酸盐还原率。
实例13.肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)、Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2 (SS-37)和Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)与心磷脂(CL)的疏水结构域相互作用。
肽Dmt-D-Arg-(atn)Dap-Lys-NH2(SS-19)和Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)阳离子肽在中性pH下携带净正电荷。它们预期基于静电相互作用与阴离子磷脂心磷脂结合。小肽与脂质膜的相互作用可使用荧光光谱法(Surewicz和Epand，1984)进行研究。在与磷脂囊泡结合后，固有Trp残基的荧光显示出增加的量子得率，并且这还伴随最大发射的蓝移，指示在更疏水环境中Trp残基的掺入。极性-灵敏的荧光探针掺入肽内，并且荧光光谱法用于测定SS-19、SS-37和SS-36是否与CL相互作用。结果显示于图21中。
肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)含有掺入二氨基丙酸内的氨茴酰。当在320-330nm处激发时，氨茴酰衍生物发出在410-420nm范围中的荧光(Hiratsuka T,1983)。氨茴酰衍生物的量子得率强烈依赖于局部环境，并且从水到80％乙醇可增加5倍，连同发射最大值(λmax)<10nm的蓝移(Hiratsuka T,1983)。使用Hitachi F-4500荧光分光光度计，在320nm处的激发后，监控单独和在渐增浓度的CL(5-50μg/ml)的存在下的SS-19(1μM)荧光发射谱。CL(5-50μg/ml)的添加导致SS-19的量子得率的2倍增加，没有λmax的显著转变(图21A)。这些发现提示SS-19与CL的疏水结构域相互作用。
肽Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)含有另外的氨基酸aladan(Ald)，其已据报道对其环境的极性是特别敏感的，并且它已用于探测蛋白质的静电特征(Cohen等人，2002)。当在350nm处激发时，λmax从水中的542nm转变为庚烷中的409nm，伴随量子得率的显著增加(Cohen等人，2001)。在350nm处的激发后，监控单独和在渐增浓度的CL的存在下的SS-37(1μM)荧光发射谱。CL(5-50μg/ml)的添加导致SS-37的量子得率的3倍增加以及λmax的明确蓝移，从不含CL的525nm到含有50μg/ml CL的500nm(图21B)。这些结果提供SS-37与CL的疏水结构域相互作用的证据。
肽Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)含有Ald代替Phe3。在350nm处的激发后，监控单独和在渐增浓度的CL的存在下的SS-36(1μM)荧光发射谱。SS-36对CL的添加最敏感，其中添加低得多的CL量(1.25-5μg/ml)观察到量子得率和蓝移的急剧增加。λmax从不含CL的525nm转变为含有少至1.25μg/ml CL的500nm，并且使用5μg/ml CL的添加，量子得率增加超过100倍(图21C)。这些结果提供SS-36与CL的疏水结构域强烈相互作用的证据。
实例14.肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)与细胞色素c的相互作用。
荧光猝灭用于证实肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)与细胞色素C的相互作用。使用Hitachi F-4500荧光分光光度计，在320nm处的激发后，监控在420nm处SS-19的最大荧光发射。结果显示于图22中。
SS-19荧光(10μM)通过0.2mg分离的大鼠肾脏肾线粒体的序贯添加得到猝灭(图22A，M+箭头)，从而提示SS-19由线粒体的摄取。当添加细胞色素c耗尽的丝状体(0.4mg)时，SS-19的猝灭显著降低，从而提示细胞色素c在通过线粒体的SS-19猝灭中起重要作用(图22B)。SS-19荧光(10μM)通过2μM细胞色素c的序贯添加类似地猝灭(图22C，C+箭头)。通过细胞色素c的猝灭不通过牛血清白蛋白的序贯添加移位(图22C，A+箭头)(500μg/ml)。这些数据指示SS-19可能在血红素环境中的细胞色素c内部非常深入地相互作用。SS-19与细胞色素c的相互作用线性依赖于添加的细胞色素c的量(图22D)。
实例15.肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)、Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2 (SS-37)和Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)与细胞色素c和CL相互作用。
荧光光谱法用于证实肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)、Dmt-D-Arg-Phe-Lys-Ald-NH2(SS-37)和Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)在CL的存在下与细胞色素c相互作用。结果显示于图23中。
使用Hitachi F-4500荧光分光光度计，实时监控SS-19(10μM)的荧光发射(Ex/Em＝320nm/420nm)。细胞色素C(2μM)的添加导致荧光信号的立即猝灭(图23A)。
使用Hitachi F-4500荧光分光光度计，实时监控SS-19(10μM)的荧光发射(Ex/Em＝320nm/420nm)。CL(2μM)的添加导致SS-19荧光的增加。与不含CL的细胞色素C的添加相比较，细胞色素c(2μM)的后续添加导致更大程度的SS-19荧光猝灭(图23B)。这些数据指示SS-19与细胞色素c的相互作用在CL的存在下得到增强。CL可通过充当两个阳离子分子的阴离子平台来加强SS-19和细胞色素c之间的相互作用。
在CL(50μg/ml)的存在下，通过2μM细胞色素c的序贯添加，类似地猝灭SS-37荧光(10μM)(图23C，C+箭头)。通过细胞色素c的猝灭不通过牛血清白蛋白(500μg/ml)的序贯添加移位(图23C，A+箭头)。因此，这些肽与CL的相互作用不干扰其在细胞色素c内部非常深入地相互作用的能力。
SS-36还含有极性敏感的荧光氨基酸aladan。CL(2.5μg/ml)的添加导致SS-36荧光的增加(图23D)。在细胞色素c(2μM)的后续添加后，SS-36的发射谱显示肽的荧光的急剧猝灭，伴随发射最大值的大蓝移(510nm至450nm)(图23D)。这些数据提示该肽与细胞色素c-CL复合物内部深入的疏水结构域相互作用。
实例16.肽Dmt-D-Arg-Phe-(atn)Dap-NH2(SS-19)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS- 20)、D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)、Dmt-D-Arg-Ald-Lys-NH2(SS-36)和D-Arg-Tyr-Lys- Phe-NH2(SPI-231)保护细胞色素c的血红素环境不受CL的酰基链影响。
执行圆二色性(CD)，以检查肽对保护细胞色素C的血红素环境不受CL的酰基链影响的作用。对于血红素蛋白质，索雷CD谱与血红素袋构象严格关联。特别地，负416-420nm科顿效应视为天然细胞色素C中的Fe(III)-Met80配位的特征(Santucci和Ascoli,1997)。科顿效应的丧失揭示血红素袋区的改变，所述改变涉及Met80从轴向配位到血红素铁的移位。使用AVIV CD Spectrometer Model410获得CD谱。结果显示于图24中。
在30μg/ml CL的不存在(点线)和存在(虚线)下，加上不同肽的添加(10μM)(实线)，记录细胞色素C(10μM)的索雷CD谱的改变(图24)。CD测量使用20mM HEPES,pH7.5，在25℃下执行，且表示为摩尔椭圆率(θ)(m Deg)。CL的添加导致负科顿效应的消失，并且这通过这些肽的添加得到完全防止。这些结果提供肽与细胞色素c的血红素袋相互作用且保护Fe-Met80配位的明确证据。
实例17.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)、Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)和D- Arg-Tyr-Lys-Phe-NH2(SPI-231)防止由CL引起的细胞色素c还原的抑制。
细胞色素c是线粒体中的呼吸复合物III和IV之间的电子载体。细胞色素c在它接受来自细胞色素c还原酶的电子后是还原的(Fe2+)，并且它随后通过细胞色素c氧化酶氧化为Fe3+。CL结合的细胞色素c具有明显比天然细胞色素c更负的氧化还原电位，并且细胞色素c的还原在CL的存在下得到显著抑制(Basova等人，2007)。
细胞色素c(20μM)的还原通过在CL(100μg/ml)的不存在或存在下添加谷胱甘肽(500μM)得到诱导(图25A)。使用96孔UV-VIS板阅读器(Molecular Devices)，通过在550nm处的吸光度监控细胞色素c的还原。CL的添加使细胞色素c还原率减少一半。SS-31(20、40或100μM)的添加剂量依赖性防止CL的抑制作用(图25A)。
SS-31剂量依赖性克服CL对细胞色素c还原的动力学的抑制作用，所述细胞色素c还原由500μM GSH或50μM抗坏血酸盐诱导(图25B)。SS-20和SP-231也防止由500μM GSH引起的细胞色素C还原的CL抑制(图25C)。
实例18.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)和Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(SS-20)增 强分离的线粒体中的O2消耗。
SS-20和SS-31两者均可促进电子流量，如通过分离的大鼠肾线粒体中的O2消耗测量的。SS-20或SS-31以10μM或100μM浓度加入呼吸缓冲液中的分离的线粒体，所述呼吸缓冲液含有谷氨酸盐/苹果酸盐(复合物I底物)、0.5mM琥珀酸盐(复合物II底物)或3μM TMPD/1mM抗坏血酸盐(细胞色素C的直接还原剂)。加入400μM ADP以起始3态呼吸。结果显示于图26中。
使用复合物I或复合物II底物，或当细胞色素c由TMPD/抗坏血酸盐直接还原时，SS-31增加3态呼吸中的O2消耗(图26A)。当使用这些底物时，SS-20还增加3态呼吸中的O2消耗(图26B；使用谷氨酸盐/苹果酸盐和TMPD/抗坏血酸盐的数据未示出)。
这些数据提示SS-31增加电子传递链中的电子流量，并且作用位点在细胞色素c和复合物IV(细胞色素c氧化酶)之间。
实例19.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增加分离的线粒体中的ATP合成。
电子传递链中的电子流量的增加可导致ATP合成的增加或者电子泄露和自由基生成的增加。分离的线粒体中的ATP合成由HPLC测定。SS-31剂量依赖性增加ATP合成，提示电子流量的增加与氧化磷酸化偶联(图27)。
实例20.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)增强细胞色素c耗尽的丝状体中的呼 吸。
与线粒体心磷脂紧密结合的细胞色素c模型用于研究SS-31与线粒体中的细胞色素c-CL复合物的相互作用。在用洋地黄皂苷去除外膜后，用120mM KCl洗涤丝状体，以去除所有自由和静电结合的细胞色素c，仅留下与CL紧密结合的细胞色素c。D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)以剂量依赖性方式增强丝状体中的复合物II呼吸，所述丝状体具有与线粒体内膜紧密结合的细胞色素c(图28)。这些数据提示SS-31与细胞色素c-CL复合物直接相互作用，并且促成从复合物III到复合物IV的电子转移。
实例21.肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2(SS-31)防止CL将细胞色素c从电子载体转变 为过氧化物酶活性。
细胞色素c中的血红素的六配位防止H2O2与催化金属位点的直接相互作用，并且溶液中的天然细胞色素c是弱过氧化物酶。在与CL相互作用后，细胞色素c经历结构改变，伴随Fe-Met80配位的破裂。这导致血红素Fe3+对H2O2的暴露，并且过氧化物酶活性急剧增加(Vladimirov等人，2006；Sinibaldi等人，2008)。细胞色素c过氧化物酶的作用机制类似于其他过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRP)的作用机制。因此，能够使用amplex红-HRP反应研究细胞色素c过氧化物酶活性。在过氧化物酶的存在下，amplex红(AR)与H2O2反应，以形成红色荧光氧化产物试卤灵(Ex/Em＝571/585)。
使细胞色素c(2μM)与20mM HEPES,pH7.4中的CL(25μg/ml)和10μM H2O2混合。随后加入amplex红(50μM)，并且使用Hitachi F4500荧光分光光度计，实时监控荧光发射。amplex红的添加引起由于试卤灵形成导致的荧光信号的快速增加，从而提供细胞色素c/CL复合物的过氧化物酶活性的直接证据(图29A)。SS-31的包括减少amplex红过氧化速率，从而提示SS-31与细胞色素c直接相互作用，以防止CL诱导的过氧化物酶活性(图29A)。
SS-31的添加剂量依赖性降低细胞色素c过氧化物酶活性的动力学(图29B)，但对HRP活性没有作用(数据未示出)。图29C显示多种肽在10μM的固定浓度下关于其抑制细胞色素c过氧化物酶活性的能力的比较。
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等价方案
本发明并不限于在本申请中描述的特定实施例，所述特定实施例预期作为本发明的单个方面单独举例说明。如对于本领域技术人员显而易见的，可作出本申请的多种修改和变化而不背离其精神和范围。根据上述说明书，除本文中列举的之外，在本发明范围内的功能上等价的方法和仪器对于本领域的技术人员将是显而易见的。此类修改和变化预期落入所附权利要求的范围内。本发明仅受所附权利要求书连同此类权利要求书赋予权力的等价物的全部范围限制。应当理解，本发明并不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、组合物和生物系统可变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实例，并不预期是限制性的。
另外，当本公开内容的特征或方面按照Markush组进行描述时，本领域技术人员将认识到本公开内容由此也按照Markush组的任何个别成员或成员亚组进行描述。
如本领域的技术人员应当理解的，为了任何和所有目的，特别是在提供书面说明书方面，本文公开的所有范围还可涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可容易地视为充分描述并使相同范围能够分解成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还应理解的，所有的语言例如“上至”、“至少”、“大于“、”小于“等等包括所述数目，并且指随后可分解成如上文讨论的子范围的范围。最后，如本领域的技术人员应当理解的，范围包括每一个别成员。因此，例如，具有1-3个单元的组指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组指具有1、2、3、4或5个单元的组等等。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物包括所有附图和表格全文以引用的方式并入，到它们不与本说明书的明确教导相矛盾的程度。
在下述权利要求中阐述了其他实施例。

Claims (28)

1.一种用于环境污染物的生物修复的组合物，所述组合物包含：表达芳香族阳离子肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2的重组细菌。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重组细菌包含编码所述芳香族阳离子肽的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述核酸序列在诱导型启动子的控制下表达。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述核酸序列在组成型启动子的控制下表达。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述核酸序列包含质粒DNA。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述核酸序列包含基因组插入片段。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重组细菌源自表7中列出的细菌物种。
8.一种用于环境污染物的生物修复的方法，所述方法包括：使含有环境污染物的材料与生物修复组合物接触，所述生物修复组合物包含表达芳香族阳离子肽D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2的重组细菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境污染物包含金属。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述金属包含Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Pd、Ag、Cd、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Cn、Al、Ga、In、Sn、Ti、Pb或Bi。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境污染物包含非金属。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述非金属包含硫酸盐。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境污染物包含高氯酸盐。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境污染物包含NH4ClO4、CsClO4、LiClO4、Mg(ClO4)2、HClO4、KClO4、RbClO4、AgClO4或NaClO4。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境污染物包含HNO3和硝酸盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述硝酸盐包含LiNO3、NaNO3、KNO3、RbNO3、CsNO3、Be(NO3)2、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2、Sr(NO3)2、Ba(NO3)2、Sc(NO3)3、Cr(NO3)3、Mn(NO3)2、Fe(NO3)3、Co(NO3)2、Ni(NO3)2、Cu(NO3)2、Zn(NO3)2、Pd(NO3)2、Cd(NO3)2、Hg(NO3)2、Pb(NO3)2或Al(NO3)3。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境污染物包含放射性核素。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述放射性核素包含锕系元素。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述放射性核素包含铀。
20.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境污染物包含甲基-叔丁基醚(MTBE)、氯乙烯或二氯乙烯。
21.根据权利要求8所述的方法，其中生物修复原位进行。
22.根据权利要求8所述的方法，其中生物修复非原位进行。
23.根据权利要求8所述的方法，其中所述细菌包含编码所述芳香族阳离子肽的核酸序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列在诱导型启动子的控制下表达。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列在组成型启动子的控制下表达。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列包含质粒DNA。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸序列包含基因组插入片段。
28.根据权利要求8所述的方法，其中所述重组细菌源自表7中列出的细菌物种。
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