KR20100108526A - 지방산 및 우유 단백질을 포함하는 항균성 조성물 - Google Patents

Abstract

우유 혈청 지질에서 유래된 2종 이상의 천연 유리지방산, 부틸산(C4), 카프로산(C6), 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16), 팔미톨레산(C16:1), 스테아르산(C18), 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3)으로부터 선택된 유리지방산, 그의 에스테르화된 유도체 및 유리지방산의 유화제로서의 우유 단백질의 혼합물을 포함하며, 총 지질 함량의 적어도 35%는 부틸산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산 및 라우르산으로부터 선택된 1종 이상의 유리지방산을 포함하는 항균성 조성물

Description

지방산 및 우유 단백질을 포함하는 항균성 조성물{Antimicrobial compositions comprising fatty acids and milk proteins}

본 발명은 유리지방산의 혼합물 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 항균성 유리지방산의 혼합물에 관한 것이다.

버터산은 주로 알코올 에스테르로서 자연에 존재하는 유리지방산(카르복시산)이며, 이들은 식물 및 동물성 오일과 지방의 주성분을 포함한다. 이들은 관습적으로 일단의 카르복시산 (극성) 기의 단, 중 또는 장쇄 탄소 분자 및 타단의 메틸 (비극성) 기로 분류된다. 카르복시산 말단은 친수성이고 메틸기는 지용성이므로 이 극성은 양극성 성질에 기여한다. 초 단쇄 산 (부틸산)을 제외하고는 친수성 산 말단에도 불구하고, 지방산은 일반적으로 물에 불용성이나, 유기 용매 및 오일에는 용해된다.

지방산 탄소 골격은 단일 공유 결합에 의해 연결되었을 때 '포화'이며, 탄소의 전체 결합가는 -CH₂- 구성에서 수소에 의해 채워진다. 탄소가 이중 결합에 의해 연결되었을 경우, 탄소의 전체 결합가는 채워지지 않으며 탄소는 불포화로 정의된다; 그러므로, 전통적으로 지방을 포화 또는 불포화로 정의한다.

또한, 전통적으로 지방산을 분자 구조에서 탄소수, 탄소수는 거기에 포함되는 이중결합의 수에 의해 정의한다: C _18:2 는 두개의 이중 결합, 예를 들어 두개의 불포화 C=C 연결을 갖는 18개의 탄소 사슬 길이를 갖는 리놀레산이다. 포화 지방산은 직쇄 분자인 경향이 있고 서로 단단하게 결합하며, 불포화 지방은 대개 이중 결합의 지점에서 뒤틀리고 덜 단단하게 결합되어 있다. 탄소 사슬 길이가 증가하면 전체 분자량은 증가하고 지방의 전체 녹는점이 증가한다. 그러나, 불포화 지방은 예외이며, 그들의 (대개의) 비 선형 구조 때문에, 그들은 덜 단단하게 결합되며 훨씬 낮은 녹는점을 가진다.

식물 및 동물성 오일 및 지방에서, 지방산은 모노, 디 또는 트리글리세라이드를 제공하기 위해서 1, 2 또는 3개의 지방산에 결합될 수 있는 글리세롤(삼수산화 알코올)과 같은 알코올에 에스테르화된다. 사실상, 이들은 대개 각 알코올 그룹에서 다른 지방산과 결합된 트리글리세라이드이다. 또한, 어느 트리글리세라이드의 녹는점은 에스테르화된 지방산의 녹는점의 특성이므로, 지방 또는 오일의 총 경도는 각각의 지방산의 비율 및 이들이 포화되었는지 아닌지의 특성을 나타낸다: 트리글리세라이드는 실온에서 액체일 때 오일로 정의되며 고체일 때는 지방이다.

포유동물 우유로부터의 유지방은 식물 또는 채소에서 발견되지 않는 단쇄산 내지 중쇄산을 포함하는 광범위 지방산을 제공한다. 일부 종 가변성이 있지만, 일반적으로 부틸산(C4), 카프로산(C6), 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16), 스테아르산(C18), 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3) 및 일부 저농도의 고급산으로 구성된다. 단지 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산 3개만이 불포화 지방산이고 이들이 전체의 30%이하를 구성한다는 것은 놀랍다; 하기의 표(표 1)는 소 유지방의 지방산 함유량의 전형적인 프로필을 나타낸다.

지방 함유량의 65%가 포화지방이라는 사실에 불구하고, 버터는 특별히 단단한 지방이 아니고 37℃의 온도에서 액화되며, 이런 이유의 일부는 불포화산 뿐만아니라 단쇄 내지 중쇄 포화산 (C: 10 이하) 모두가 37℃이하(그들의 짧은 사슬 길이 때문)의 녹는점을 가지고, 이들이 총 지방 함량의 10%를 구성하기 때문이다.

유지방으로부터의 고콜레스테롤혈증 원인으로는 대개 미리스트산의 함량에서 발생하고 그보다 정도는 덜하지만 팔미트산에서 발생한다; 스테아르산 및 어느 단쇄산 (C: 12 이하)도 상승된 혈청 콜레스테롤에 기여하지 않는다(9). 이와 반대로, 단쇄산 (C:4 에서 C:12)은 그들의 항균성 속성 및 그들의 쉽게 이용할 수 있는 에너지 함량의 면에서 중요한 잠정적 이점을 가지고 있다. 단쇄 포화 유리지방산은 장쇄 산과 비교하여 흡수되고 대사되는 방법에 차이가 있다. 가스트릭 리파아제에 의해 트리글리세라이드로부터 방출된 단쇄 지방산은 위장세포에서 흡수되고 간문맥을 통하여 간에 직접 이송되며, 그들은 탄수화물의 동일한 중량의 칼로리 수치보다 2.5 배인 즉각적이고 강력한 에너지원을 부여한다. 장쇄 산은 위장세포에서 트리글리세라이드로서 재조합되고 림프에서 카이로마이크론으로서 지방조직에 이송된다(8).

사실상, 대부분의 지방산은 지방 또는 오일의 지질부분의 주성분인 트리글리세라이드로서 존재한다. 섭취시에 지질은 리파아제 효소에 의해 부숴지고, 글리세라이드로부터 유리지방산을 방출한다. 가수분해 과정은 프리-가스트릭(타액) 리파아제의 작용으로 시작하고, 대부분의 타액 리파아제는 우유 지질로부터 단쇄 내지 중쇄산을 우선적으로 방출하는 것으로 알려져 있으며, 이 단쇄 내지 중쇄산은 그람 양성 장구균 및 그람 음성 대장균에 대항하는 강력한 억제성 속성을 가지고 있다(1 & 2). 단쇄산 뿐만 아니라, 리놀레산 및 리놀렌산 모두는 치아우식증 미생물인 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)에 대항하는 억제성 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다(3). 유리 단쇄산 뿐만 아니라 지방산의 모노글리세라이드는 항 진균 작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(4). 또한, 바이러스에 대항하는 항바이러스 작용도 보고되어 있다(7).

타액 리파아제에 의한 항균성 단쇄 지방산(C:4 에서 C:12)의 초기 및 우선적인 방출은 신생동물의 소화관에서 보호 기능을 제공하고 위 장 염증의 예방에 중요하게 기여한다. 유리지방산은 일반적으로 수성 매질에서 불용성이어서 그들의 수송 및 생물학적 이용 가능성은 그들의 에멀젼화에 의존한다.

WO 03/018049은 잠재적인 병원체가 인간 또는 동물 상피막에 부착하는 것을 억제하는 우유 혈청 아포단백질의 용도를 공개하였다; 아포단백질은 돼지 췌장 추출물로부터 유래된 리파아제에 의해 우유 혈청 리포단백질로부터 효소적으로 생성되었다. 아포단백질은 비단백질 물질(지질/ 탄수화물/ 다당류/ 금속이온)에 정상적으로 공유결합된 후에 남겨진 '백-본'이 제거된 잔여 단백질이다. 아포단백질은 보통 특정 비단백질 콘쥬게이트에 커다란 친화성을 가지고 있다. 아포 리포단백질의 경우, 이 친화성은 극성 및 비극성 또는 지질, 지방 또는 지방산의 수성 매체에서 결합 및 수송을 용이하게 하는 양극성 성질에 근거하고 있다.

우유 가공에서, 버터 제조는 기계적 수단에 의해서 지방구 피막을 쪼개고 버터지방구가 표면에 응축되어 떠오르게 하는 것을 포함하며 그들은 버터로서 집합된다. 잔여 버터우유는 자주 산성화되어 우유 혈청 단백질, 유당 및 파괴된 지방구 피막의 구성성분을 포함하는 '산 유청'을 남김으로써 카제인 단백질 불용성 산을 촉진한다. 또한, 유청 단백질은 카제인 및 지방을 응고시키는데 리넷이 사용되는 치즈 제조에서 응유의 런-오프로부터 재생되며, 이 '유청'은 또한 지방구 피막의 구성 성분을 포함할 것이다. 유청 단백질은 잔여 유당 및 지질을 제거하는 과정을 더욱 포함할 수 있고 그 후에 스프레이는 비단백질 물질을 최소화할 때 유청 단백질(whey protein concentrate, WPC) 또는 유청 단백질(whey protein isolate, WPI)을 형성하기 위해 건조될 수 있다.

전유 외에도, 상업용 낙농업의 '1차' 생산물은 버터 및 치즈이고, 버터우유 및 산 카제인, 유당, 미네랄 및 유청은 버터 제조시의 '이차' 생산물인 반면, 유청, 미네랄 및 유당은 치즈 제조시의 '이차' 생산물이다. 근대 낙농업에서, 일차 및 이차라는 용어는 매우 중요한 경제적 공헌을 하는 이차 '부산물'로서 오도될 수 있다. 게다가, 근대 낙농업은 전통적인 생산물의 가치를 개선하고 증가시키기 위해 점차적으로 복잡한 기술적 방법을 사용하고 있다. 이러한 변형의 하나로서 유지방으로부터 유리지방산을 발생시키기 위해 효소를 사용하여, 식품 가공, 짭짤한 스낵의 제조 및 간편식에 사용하기 위한 치즈 풍미(효소 숙성 치즈)를 얻는다.

1. Cynthia Q Sun et al (Chemico-Biological Interactions 140 (2002), ppl 85-198). 2. R. Corinne Sprong et al (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, April 2001, pp 1298- 1301). 3. Schuster et al (Pharmacology and Therapeutics in Dentistry 5: pp25 - 33; 1980) 4. Gudmundur Bergsson et al (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, November 2001 , pp 3209 - 3212). 5. Yong-Ching Yang et al. J. Chin. Inst. Chem. Engrs., VoI 34, No 6, 617-623-. A Process for Synthesis of High Purity Monglyceride 6. Catrienus DeJong and Herman T. Badings 1990. Determination of free fatty acids in milk and cheese, procedures for extraction, clean up and capillary gas chromatographic analysis. Journal of high resolution chromatography, Vol. 13, Feb. 1990. Pages 94-98. 7. Halldor Thormar et al (Antimicrobial Agents and Chemotherapy;. Jan 1987. .pp 27- 31)This author reports the growth inhibitory properties of various free fatty acids against Enterococci, which are gram-positive, and coliform bacteria, which are gram-negative 8. Christopher Beerman et al (Lipids in Health and Disease 2003, 2:10) Short term, Effects of dietary medium-chain fatty acids and N-3 long-chain polyunsaturated fatty acids on the fat metabolism of Healthy volunteers. 9. P.L. Zock, J.H. de Vries and M.B. Katan. Impact of Myristic acid Vs Palmitic acid on serum lipid and lipoprotein levels in healthy women and men. J Am Heart Association:Arterioscloerosis, Thrombosis and Vacular Biology: 1994;14;567 - 575

본 발명은 우유 혈청 지질에서 유래된 2종 이상의 천연 유리지방산, 부틸산(C4), 카프로산(C6), 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16), 팔미톨레산(C16:1), 스테아르산(C18), 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3)으로부터 선택된 유리지방산, 그의 에스테르화된 유도체 및 유리지방산의 유화제로서의 우유 단백질의 혼합물을 포함하며, 총 지질 함량의 적어도 35%는 부틸산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산 및 라우르산으로부터 선택된 1종 이상의 유리지방산을 포함하는 항균성 조성물을 제공한다. 총 지질 함량의 적어도 50%는 부틸산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산 및 라우르산으로부터 선택된 1종 이상의 유리지방산을 포함할 수 있다. 본 조성물의 총 지질 함량의 나머지는 C14 또는 그 이상의 비 항균성 유리지방산, 비가수분해된 지질 성분, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드 등 및 그의 조합을 포함할 수 있다.

혼합물은 카프릴산, 카프르산 및 라우르산을 포함할 수 있다.

유리지방산 혼합물의 녹는점은 개개의 유리지방산 중 어느 하나의 최고 녹는점보다 낮을 수 있다. 혼합물의 녹는점은 45℃보다 낮을 수 있으며, 예를 들어 37℃, 18℃보다 낮을 수 있다.

카프릴산 : 카프르산 : 라우르산의 비율은 약 40 : 30 : 30 일 수 있다.

본 조성물의 유리지방산의 적어도 일부는 에스테르화될 것이다. 에스테르화된 유리지방산은 모노- 및/또는 디- 및/또는 트리-글리세라이드 형태일 수 있다. 유리지방산과 에스테르화된 글리세라이드의 비율은 약 50:50일 수 있다.

본 조성물은 물 분산성일 수 있다.

유화제는 우유 혈청 단백질일 수 있으며, 예를 들어 아포단백질일 수 있다. 그렇지않으면, 유화제는 카제인일 수 있다. 유화제는 약 5중량% 내지 45중량%의 농도 범위로 존재할 수 있다.

본 조성물의 pH는 약 4.5 에서 5.0 일 수 있다.

본 발명은 또한 여기에 기재된 조성물 및 담체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 상기 조성물은 약 0.5% 내지 10%의 농도 범위로 존재할 수 있다.

상기 약제학적 제제는 용액, 비누, 겔, 페이스트, 연고, 거품, 스프레이, 분말, 페서리, 드레싱, 정제 또는 식품의 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 감염의 예방 또는 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다. 상기 제제는 질내크림 또는 겔 또는 페서리일 수 있다. 본 발명은 또한 비특이성 세균성 질염의 예방 또는 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다. 상기 제제는 질내크림 또는 겔 또는 페서리일 수 있다. 본 발명은 또한 피부 감염의 예방 또는 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다. 상기 제제는 국소 적용에 적합한 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 화상의 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다. 상기 제제는 국소 적용에 적합한 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 감염의 예방 또는 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다. 상기 제제는 수술용 드레싱의 형태일 수 있다. 상기 제제는 눈, 코, 입 또는 생색기의 점막에 적용하는 약제 형태일 수 있으며, 예를 들어, 임질, 클라미디아, 헤르페스 및 HIV 중에서 선택된 1종 이상의 성적으로 전염되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 용도일 수 있다.

본 발명은 또한 위장염의 예방 또는 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다. 상기 제제는 식품 또는 음료의 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 경구 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제의 용도를 제공한다. 상기 제제는 치약, 츄잉검, 구강세정제 또는 기타 세치제에서 선택된 경구 보건 제제의 형태일 수 있다.

다른 관점에서 본 발명은 여기에 기재된 조성물을 포함하는 식품 보충물을 제공한다. 상기 조성물은 약 0.5% 내지 10%의 농도 범위로 존재할 수 있다. 본 발명은 또한 유화제에서 유래된 우유 단백질 및 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산의 혼합물을 포함하는 식품 보충물을 제공한다. 상기 식품 보충물은 오일 형태일 수 있다.

상기 식품 보충물은 낙농 우유를 재구성하는데 사용될 수 있다. 상기 낙농 우유는 탈지 우유 또는 버터 우유일 수 있다. 상기 재구성된 우유는 식품 보충물의 20%이하로 구성될 수 있으며, 예를 들어 식품 보충물의 10%이하로 구성될 수 있다. 여기에 기재된 본 조성물에 사용된 우유의 재구성은 자연 발생 올리고당, 우유 미네랄, 비타민의 수치를 강화할 수 있다.

본 발명은 또한 여기에 기재된 조성물을 포함하는 재구성된 우유를 제공한다. 상기 재구성된 우유는 올리고당을 더욱 포함할 수 있다. 상기 재구성된 우유는 우유 미네랄을 더욱 포함할 수 있다. 상기 재구성된 우유는 비타민을 더욱 포함할 수 있다.

다른 관점에서는, 본 발명은 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 올레산으로부터 선택된 적어도 두 개의 다른 유리지방산의 비수성 혼합물을 포함하는 살균제 스프레이를 제공한다. 상기 스프레이는 유기 용매 증량제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여, 단지 예로만 제공되는 하기에 기재된 본 발명의 실시예에 의해 보다 명확하게 이해될 것이다.

도 1은 다른 효소를 사용하는 신선한 패스튜라이즈된(pasturised) 생크림으로부터 유리지방산의 수율을 설명하는 도면이다.
도 2는 부틸산의 %감소를 나타내는 물 분리의 도면이다.
도 3은 세척되고 가수분해된 유지방의 분별증류 후의 지방산 함량을 나타내는 도면이다.
도 4는 2분 동안 다양한 지방산에 노출된 황색 포도상구균의 접촉 생존성을 나타내는 도면이다.
도 5는 카프릴산의 %의 증가에 따른 팔미트산, 라우르산, 미리스트산 및 카프르산의 녹는점의 저하를 나타내는 도면이다.
도 6은 카프릴산 또는 올레산의 함량의 증가에 따른 라우르산의 녹는점의 저하를 나타내는 도면이다.
도 7은 올레산 함량의 증가에 따른 카프릴산, 카프르산 또는 라우르산의 항균성 효능의 감소를 나타내는 도면이다.
도 8은 유리지방산의 다양한 에멀젼에 2분 동안 노출시킨 후의 칸디다 알비칸스의 접촉 생존성을 나타내는 도면이다.
도 9는 소 사체 세척제로서의 유리지방산의 장출혈성 대장균 O157(EHEC)에 대한 효과를 나타내는 도면이다.

상업적으로 이용가능한 리파아제 효소를 사용하여 유지방으로부터 유리지방산의 조성물을 생성할 수 있다. 이러한 효소적 가수분해는 효소 숙성 치즈에 근거를 둔 생산을 형성한다. 생성된 유리지방산의 조성물의 비율은 효소의 종류, 기질 농도 및 온도 및 pH와 같은 다른 물리-화학적 상태에 의존할 것이다. 진균 리파아제 및 도살장에서 송아지, 새끼염소 및 양의 혀밑샘으로부터 추출된 천연 동물 프리-가스트릭(타액) 리파아제는 풍미의 생성을 위해 치즈 산업에서 정기적으로 사용되고 있다. 독특한 풍미는 효소의 선택 및 단쇄 내지 중쇄 유리지방산의 방출 특성에 영향을 받을 것이다. 부틸산(C4)은 특히 자극적인 '저급한' 향을 갖는 반면에, 카프로산(C6) 및 카프릴산(C8)도 냄새가 날 뿐만 아니라 훨씬 자극적이며, 다른 단쇄 휘발성산(프로피온산)은 지방의 치즈 풍미의 국제적인 레퍼토리에 기여하는 모든 미생물 작용을 통해 간접적으로 생성된다.

풍미에 대한 그들의 사용과는 별개로, 단쇄 내지 중쇄산(C4 에서 C12) 은 특히 강력한 항균 효과를 가지고 있으나, 이 목적을 위한 그들의 의약적 사용은 수용성 매질에서의 그들의 불용성에 의해 제한되며, 국소 적용시에 특이한 그들의 냄새는 바람직하지 않다. 타액 리파아제의 가수분해 작용에 의해 단쇄 내지 중쇄 유리지방산의 초기 방출은 잠재적인 미생물 병원체로부터 신생아의 소화관을 보호하는 '모계 수여된' 선천적인 면역 기능의 일부로서 간주된다(1 & 2).

본 발명자는 어떻게 효소 가수분해된 유지방의 냄새나는 정도가 물의 일부 용적에서 가수분해된 지방의 세척 또는 절단에 의해 감소될 수 있는지 설명한다. 부틸산은 비교적 수용성이므로 수상으로 분할할 것이며, 비록 카프릴산은 수성 용액에서 단지 드물게 용해되나 카프릴산의 일부도 그렇게 될 것이다. 본 발명자는 부틸산이 유기용매로서 작용하여 카프릴산의 분할을 가능하게 하므로 부틸산의 존재가 카프릴산의 용해도를 증가시키는 것을 발견하였다.

효소 작용은 기질의 완전한 가수분해를 달성할 수 있고, 이것은 주로 효소 작용 생성물의 결합 또는 반응 혼합물로부터 생성물의 제거에 의해 달성된다. 효소 가수분해된 지방산 혼합물의 분별 증류는 더 휘발성인 단쇄 유리지방산, 및/또는 담즙산과 같은 유화제의 역할을 할 것이므로, 기질의 완전한 가수분해를 달성할 수 있다.

효소 가수분해에 의한 유리지방산의 생성은 비교적 간단한 반면에 비가수분해된 지질에서 가수분해된 유리지방산의 비율은 고 항균성 효능을 획득할 수 있다는 점에서 중요하다. 혼합물에서 비가수분해된 지질의 초과량이 있을 때, 비가수분해된 지질은 유리지방산이 그들의 친유성 때문에 격리되는 싱크인(sink in)으로서 작용한다. 항균성 적용은 고비율의 유리산을 필요로 하며, 유리산 함량은 혼합물의 총 지질함량의 약 35%보다 더 커야 한다. 도 6 및 도 7을 참조하여, 실시예 4에서 더욱 자세하게 기재된 것과 같이, 다른 녹는점을 갖는 다른 유리지방산을 갖는 것은 개개의 유리지방산의 어느 하나의 녹는점보다 낮은 녹는점을 갖는 조성물을 만들어 낼 수 있다. 이 녹는점의 저하는 개개의 지방산이 액체 형태일 때에만 항균 효과를 나타내므로 항균성 유리지방산 조성물을 형성하는데 사용될 수 있다. 낮은 녹는점을 갖는 각 유리지방산은 높은 녹는점을 갖는 산의 용매로서 작용하고, 낮은 녹는점을 갖는 이러한 유리지방산은 항균성 지방산을 격리하도록 작용할 수 있고 그들을 어떤 비율 이하로 불활성시킬수 있으므로; 격리 효과를 극복하기 위해, 항균성 지방산은 조성물의 총 지질함량의 적어도 35%를 포함해야 한다.

유리지방산은 항균제로서의 그들의 의약적 용도를 제한하는 수용성이다. 본 발명자는 수성 기반 용액에서 유리산의 조성물을 유화시킴으로서, 지방구가 항균 효과가 강화된 증가된 곡면적을 갖도록 형성되는 것을 발견했다. 적합한 유화제는 낙농 유청에서의 우유 혈청 단백질 또는 우유 혈청 아포 리포단백질과 같은 우유 단백질이다.

유리지방산의 조성물은 상업적으로 이용될 수 있고 매매되며 식품 제조에 풍미를 위한 '버터산'으로서 이용된다; 버터산은 미국 FDA에 의해 식품 사용에 일반적으로 안전한 물질(GRAS)로서 확인되었다.

본 발명자는 항균 효과에 적합한 버터산의 구성을 설명한다. 유리지방산의 구성은 유지방의 효소 가수분해 또는 진공하에서 유리지방산의 추출 및 응집에 의해 생성될 수 있다. 또한, 상업적으로 이용할 수 있는 유리산의 혼합은 유리지방산의 혼합을 어셈블링할 때 조립되고, 특히 국소 항균 목적으로 적용한다면 더 냄새가 나는 부틸산 및 카프로산은 제거하는 것이 바람직하다. 강화된 항균 효과를 위해서는, 항균성이라고 알려진 유리지방산의 함량을 증가하는 것이 바람직하고, 이것들은 덜 냄새나는 카프릴산, 카프르산 및 라우르산이다. 본 발명자는 이들 세 유리산(카프릴산, 카프르산 및 라우르산)의 녹는점이 혼합된 개개의 녹는점의 산물이고 유리지방산 혼합물의 총 녹는점은 혼합물에서 유리지방산의 비율을 바꿈으로써 조정될 수 있음을 발견하였다.

유리지방산 혼합물의 총 녹는점은 이 혼합물의 항균 효능에 중심되는 효과를 갖는다. 카프르산 및 라우르산이 대부분인 카프릴산, 카프르산 및 라우르산의 혼합물은 카프릴산이 대부분인 같은 산의 혼합물에 비해 더 높은 녹는점을 가질 것이다. 이러한 혼합물의 항균 효과는 규모의 각자의 자릿수에 의해 혼합물의 녹는점보다 감소되며; 이와 반대로 각자의 자릿수에 의해 혼합물의 녹는점보다 상승된다.

포유동물의 내부 체온은 보통 37℃인 반면, 피부온도는 18℃ ~ 2O℃정도로 낮다. 유리지방산의 혼합물이 피부에서 항균효과를 제공하기 위해 형성된 경우, 유리지방산혼합물의 녹는점은 약 18℃ 보다 낮아야 하나, 내부 사용을 위해서는 혼합물의 녹는점은 더 높을 것이며(예를 들어, 혼합물은 더 높은 녹는점의 산의 고비율을 포함할 것이다), 어쨌든 내부(위장) 항균효과가 필요하다면 37℃를 넘어서는 안된다.

유리지방산은 쓴 '후추' 향을 가지고 농축된 형태에서 그들은 포유동물 조직을 자극한다. 유리지방산의 불유쾌한 맛과 자극적인 성질은 유화 단백질을 첨가함으로써 다소 개선될 것이나, 유리지방산은 카제인과 같은 단백질 및 칼슘염과 같은 기타 바람직한 첨가제를 녹이지 않는 산과 양립할 수 없는 산성 pH를 갖는다. 사실상, 유리산은 대체로 알코올 에스테르의 형태(우유 유지방에서 삼수산화 알코올 글리세롤의 에스테르로서)로서 존재하며, 이들은 거의 항상 각 글리세롤에 공유적으로 결합한 세개의 다른 지방산의 혼합된 에스테르이다. 바람직하지 않는 산성 특성, 맛 및 자극성을 제거하기 위해서는, 혼합물에서 유리지방산의 일부 또는 전부를 원래의 모노, 디 또는 트리글리세라이드 에스테르 형태로 변환하는 것이 바람직할 것이다.

응축반응을 촉진하기 위해 글리세롤 및 황산, 무수 나트륨 황산염 또는 기타 적합한 건조제의 존재하에 환류증류하여 유리지방산을 글리세라이드로 재-에스테르화할수 있다. 리파아제 효소는, 글리세라이드에 대한 그들의 가수분해 효과와 함께, 에스테라아제로서 작용하고 유리지방산과 글리세롤을 결합함으로써 글리세라이드의 합성에 사용될 수 있다. (5). 형성되는 글리세라이드의 종류 및 에스테르화의 정도는 글리세롤에 대한 유리지방산의 화학양론적인 비율; 반응 조건; 및 용매의 선택을 바꿈으로써 조절될 수 있다.

개개의 유리지방산의 모노, 디 또는 트리글리세라이드 에스테르 및 이들의 혼합을 어느 바람직한 비율로 구성하거나, 유리지방산의 바람직한 혼합에서 시작하여 혼합된 트리글리세라이드 에스테르를 형성하는 것이 가능하다.

유리산의 글리세라이드는 유리지방산과 비교하여 훨씬 낮은 항균 효능을 갖는 반면, 글리세라이드는 섭취시에 프리-가스트릭 타액 리파아제 및 소화관의 췌장 리파아제에 의해 즉시 가수분해된다. 위장염의 예방 및/또는 치료와 같은 위장 항균 효과가 바람직한 경우, 단쇄 내지 중쇄 지방산의 글리세라이드의 섭취는 수용자가 바람직하지않은 유리지방산의 감각수용 특성을 받지 않고 장내공간에서 유리지방산을 국소적 및 통제적으로 이동시킨다.

본 발명자는 유청단백질(우유 혈청 단백질)을 상업적으로 이용할 수 있는 조합 및 비율의 변화에서 선택된 비율의 유리지방산, 그들의 모노, 디 또는 트리글리세라이드를 유화시키는 과정을 상술한다. 섭취시에 강력한 항균 속성을 갖는 중간 용적을 제공하기 위해서 안정제, 항산화제, 미량 원소, 착향료 및/또는 방향제가 에멀젼에 결합될 수 있다.

낙농 우유는 유당을 갖거나 갖지않는 우유 카제인 및 우유 미네랄의 수성 형태에서 분산된 맞춤형 유리지방산 및/또는 그들의 모노글리세라이드 혼합물의 유청단백질 에멀젼을 사용하여 재구성될 수 있다. 또한, 맞춤형 재 에스테르화된 유리지방산 및/또는 유청단백질 에멀젼의 유리지방산을 이용하거나, 탈지 우유 또는 버터 우유에서 유리지방산을 분산시키거나 유화시킴으로써 오일로서 낙농 우유를 재구성하는 것이 가능하다. 이러한 조성물들은 병원균을 가지고 있는 음식으로부터 증강된 GI 보호를 제공하므로 실제적인 상업적 가치를 가지고 있다.

한 실시예에서, 본 발명은 우유 지질내에 존재하는 자연적으로 생성되는 유리지방산으로부터 선택되는 유리지방산들의 조성에 관련되는 것이다. 상기 조성은 부틸산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산으로부터 선택되는 두 개 이상의 유리지방산들의 조합이 된다. 우유 지질은 소, 염소, 또는 양과의 종류로부터 추출하는 것이 바람직하나, 또한 어느 포유류 동물에서 추출하는 것도 괜찮다.

유리지방산들은 우유 지질의 효소적 또는 화학적 가수분해에 의해 생성될 수 있으며 부분적으로 경화된(hydrogenated) 우유 지질의 제형으로서 이용되거나 또는 그것들은 진공 상태에서 분별 증류에 의해 천연 가수분해물로부터 추출되고 정제될 수 있다. 유리지방산들은 또한 상업적으로 얻어질 수 있으며 이러한 것들의 원래 소스는 옥수수, 야자, 야자속 오일, 코코넛 카놀라 등과 같은 식물성 기름들의 가수 분해물로부터 얻어질 수 있다. 그러나, 아무튼, 그것들은 자연산으로서 버터산과 같이, 상업적으로 기술된 우유 지질에서 자연적으로 발생하는 지방산들로 한정될 것이다.

유리지방산의 조성은, 혼합물에서 다른 유리지방산에 비해 부틸산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산과의 비율을 증가시킴으로써 증강된 항균성 효과를 위해 최적화가 될 수 있다. 그러므로 혼합물의 전체 녹는점은 정상적인 체온인 약 37℃보다 낮은 것이 바람직하며, 아무튼 단지 45℃가 된다.

항균성 유리지방산의 조성은 그 조성의 냄새를 최소화하기 위하여 카프릴산, 카프르산 및 라우르산으로 제한되는 것이 바람직하다. 이 점에서, 부틸산과 카프로산들은 상업적으로 얻어지는 가축에서 수성 분할, 분별 증류 또는 선택해제(de-selection)에 의해 천연 가수분해물로부터 제거될 수 있다.

항균성 유리지방산의 조성은 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산 및/또는 리놀렌산 또는 그들의 유도체로부터 선택되는 다른 자연적으로 발생하는 유리지방산들 중 한 개 또는 그 이상의 지방산과 결합되거나 독단적으로 사용될 수 있다. 항균성 효과를 위해 결합되는 경우에, 항균성 유리지방산의 조성(C4에서 C12의 유리지방산들) 또는 그의 유도체들은 전체 유리지방산, 유리지방산의 유도체 및/또는 가수분해되지 않은 지질 성분의 약 80% 이상을 구성하는 것이 바람직하고, 어쨌든 항균성 유리지방산 또는 그의 유도체들은 약 35% 이하가 되어서는 안 되며, 그 조성의 전체 지질 또는 지질양(lipid-like) 물질의 80%와 같이 50%가 되는 것이 바람직하다.

다른 실시예에서는, 선택된 각각의 유리지방산 또는 그들의 혼합체들은 산 환류 응축(acid reflux condensation) 또는 효소에 의해, 글리세롤로 에스테르화 될 수 있으므로, 지방산 피드 스톡(feed-stock)의 조성 및 농도에 따라 균질하거나 또는 혼합된 글리세라이드가 될 수 있는 모노-, 디-, 트리글리세라이드를 생성하게 된다. 항균성 유리지방산을 식품내에 포함시키기 위해 결합하는 경우와, 유리산들의 산성도, 자극성 및/또는 맛을 감소시키는 것이 바람직한 경우에는, 에스테르화는 바람직한 것이나, 필수적인 것은 아니다.

유리지방산들의 혼합물로부터 혼합된 트리글리세라이드를 재구성하는 것은 그것의 항균성 효과와 별도로 또는 함께 의학 분야에서 응용성이 높아지는 맞춤형 지질의 재구성을 촉진하게 될 것이다. 단쇄 내지 중쇄 지방이 우세한 지질은 간문맥을 통해 간으로 직접 이송되는 원리에 근거하여 더욱 신속한 신진대사 에너지 수율을 가지게 될 것이다. 이와 같이, 미리스트산 또는 팔미트산을 포함하지 않는 지방산들로부터 선택되는 재구성된 지질은 증가된 혈청 콜레스테롤에 민감한 사람들에게는 더욱 적합하다.

부형제를 포함하거나 또는 포함하지 않는 항균성 유리지방산 및/또는 그들의 유도체들의 조성은 도살장내의 동물의 시체에 있는 잠재적인 병원균들의 바이오-버든(bio-burden)을 감소시키기 위해 스프레이 또는 와시(wash)로서 사용될 수 있으며, 비슷한 이유로 인해 바로 수확한 채소와 과일들에 대해서도 사용될 수 있다.

항균성 및/또는 영양 효과를 위한 생물학적 이용가능성을 증가시키기 위해 가수분해된 지질, 유리지방산 및/또는 그들의 유도체들을 유화시키는 것이 바람직하나, 필수적인 것은 아니다. 적합한 유화제는 낙농 처리에서 얻어지는 우유, 우유 단백질, 우유 카제인, 우유 혈청 단백질, 우유 혈청 아포-단백질과 유청을 포함한다.

유리지방산의 제형들은 종래의 의약품, 의료 기구, 화장품 또는 다이어트 성분의 형태로 제공될 수 있다. 그리고 다이어트 성분으로 사용되는 경우에 그것들은 높은 열량과 같은 영양 효과 및/또는 소화관에서의 항균성 효과 또는 그 두 개의 효과들을 얻기 위해 조성될 수 있다.

한 실시예에서는, 항균성 유리지방산들 또는 그들의 글리세라이드 및/또는 우유 지질의 천연 가수분해물의 선택된 조성은 유청 단백질내에서 유화되며, 피부, 머리 및 손톱의 감염의 국소적인 치료 및/또는 예방을 위해 연고, 로션, 겔, 크림, 페이스트 또는 다른 약물의 성분으로서 사용된다.

다른 실시예에서는, 선택된 항균성 유리지방산들의 유청 단백질 에멀젼은 치약 또는 구강세정제 또는 구강 위생을 위한 틀니 접착제 또는 고정제의 항균성 성분 및 충치, 치은염, 치주염, 아구창과 아프타궤양의 치료 및/또는 예방을 위한 약물로서 사용된다.

다른 실시예에서는, 항균성 유리지방산들의 유청 단백질 에멀젼은 겔 또는 페서리내에 포함될 수 있으며 효모 질염과 비특이적인 박테리아 질증(Vaginosis)을 포함하는 질염의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되며, 이와 같이 임질, 매독, 클라미디아, 헤르페스와 HIV와 같은 성적으로 전염되는 질병의 예방을 위한 배리어(barrier)로서 사용된다.

항균성 유리지방산들의 유청 단백질 에멀젼은 병원과 환자 보호 시설기관에서 항생물질 저항성 박테리아의 교차 감염을 방지하기 위해, 비누, 핸드-겔 및 습식 와이프의 성분으로서 사용될 수 있으며, 또한, 항생물질 저항성 박테리아의 알려진 무증상 감염의 탈콜론화(de-colonisation)에 사용될 수 있다.

유리지방산들의 항균성 조성은 전염성 임균, 유사막 대장염과 다른 내장 감염의 예방 및/또는 치료에 적합한 관장제를 조성하기 위해 가열 처리된 유청 단백질 및 다른 부형제들을 이용하여 거품 형태로 유화될 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예들로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다.

실시예

방법

지방산의 가스 크로마토그라피 분석

(유리지방산을 포함하는) 샘플들의 지질 성분은 가스 크로마토그라피(GC)에 의한 분석 이전에 원래의 샘플내에 존재하는 어느 비지질 물질로부터 추출된다. 여기에서 사용되는 방법은 DeJong과 Badings로부터 변형되었다(6). 샘플(0.1-0.5g)의 무게가 측정되고, 10ml 에탄올, 1.0ml 2.5M 황산, 15.0 ml 50:50 디에틸 에테르:헵탄과 내부 표준 1ml(즉, 발레르산(C_{5 :0}), 마르가르산(C_{7 :0})과 운데카노익산(undecanoic acid, C_{11 :0}), 모두 헵탄내에서 1mg/ml)을 포함하는 용액내에 첨가되었다. 그 용액은 잘 혼합된 후에 상층액(supernatant)을 회수하기 위해 원심분리된다. 지질을 포함하는 상층은 파스퇴르 피펫을 이용하여 무수 나트륨 황산염 (건조제) 1g을 포함하는 비이커로 이동된다.

고형추출분석법(Solid Phase Extraction, SPE)은 500mg, 3ml 스트라타 아미노프로필 컬럼(Strata aminopropyl columns)(Phenomenex, 메이클즈필드, 체셔, 영국)를 이용하여 실행되었다. 이러한 SPE 컬럼들은 먼저 2x10ml의 헵탄으로 처리되며, 다음에는 상기 비이커의 지질 분획이 컬럼에 첨가되고 진공에 의해 추출되었다. 중성 지질들은 헥산:프로파놀(3:2 v/v)의 2x10ml 플러시(flushes)를 이용하여 용출되었고; 지방산들은 디에틸 에테르에서 2% v/v 포름산 5ml를 이용하여 SPE 컬럼들로부터 용출되었다.

각각의 유리지방산(C_{4 ;0},C_{6 :0},C_{8 :0},C_{10 :0},C_{12 ;0},C_{14 :0},C_{16 :0,} C_{I8 :0},C_{18 :1},C_{18 :2} 및 C_{18 :3})은 불꽃 이온화 검출 기능을 가지는 Varian 3800 가스 크로마토그라프, Varian 1079 유니버설 모세관 인젝터, Varian 8410 액체 오토샘플러(liquid autosampler)와 Varian Star 운용 소프트웨어(Varian Analytical Instruments, 하버시티, 캘리포니아, 미국)를 이용하는 GC에 의해 정량화되었다. 사용되는 컬럼은 컬럼 인젝션에 직접 이용되는 Chrompack WCOT 융합 실리카 모세관 컬럼(fused silica capillary column) CP FFAP-CB, 25mx32mm ID,0.3DF(Varian Analytical Instruments, 하버시티, 캘리포니아, 미국)이다. 인젝터의 온도는 65℃(0.1분간 유지)이며, 매분 마다 200℃에서 250℃로 증가했으며(1분 동안 유지), 그 후에는 매분 마다 200℃에서 65℃로 냉각되었다(20분 동안 유지). 유동 압력은 8psi로 고정되었다. 오븐 온도는 65℃이며(1.5 분 동안 유지), 그 후에는 매분 마다 10℃에서 240℃로 가열되었으며, 총 시간은 44분이었다. 검출기 온도는 300℃가 되었다. 모든 샘플들은 3번 분석되었다.

항균성 분석( antimicrobial Analysis )

항균성 효과를 평가하고 각 샘플들의 효능을 비교하기 위해 두 가지 기술들이 일반적으로 사용되었으며, 이들은 성장 금지 분석 접촉 생존력 분석과 최소 저지 농도(MIC)용 분석이다. 몇 개의 지표 미생물들이 보통 사용되었으며, 이들은 그람 양성 박테리아(스트렙토코커스 뮤탄스), 그람 음성 박테리아(살모넬라 티피무리움)와 효모(칸디다 알비칸스)를 포함한다. 시험용 미생물은 MicroBank 냉동보호 바이알(cryoprotectant vials)(Pro-Lab, 온타리오주, 캐나다)에서 -80℃에서 보존되었으며, 분석을 위해 액체 배양액을 투입하기 전에 적합한 한천에서 배양되었다. 박테리아는 Brain Heart Infusion 한천 및 브로스(broth)(옥스포드, 영국)에서 성장되었으며, 효모는 YEPD(옥스포드 영국, 세균배양 한천 1.8% W/V이 요구하는 1%W/V 효모 추출물, 1%W/V 펩톤, 및 2% W/V 글루코스 )에서 성장되었다.

접촉 생존력 분석

이러한 분석은 치료 및 영양공급용 전달 시스템을 구성하는 다른 활성 또는 비활성 구성요소들을 포함하거나 또는 포함하고 있지 않는 유리지방산 및/또는 그의 유도체들을 포함하는 제형들에 대해 소정의 시간 동안 노출되는 표준화된 미생물 개체수의 생존력의 감소를 측정하기 위해 사용된다.

상기 절차는 적합한 배지에서 성장한 말기 로그기 박테리아(late log-phase bacteria) 또는 효모로부터 조성된, 접종원(inoculum)내의 집락 형성 단위(CFU's)의 수를 계수한 결과와, 소정 양의 시험용 물질에 대해 소정의 노출 시간을 가진 후에 동일한 접종원으로부터 회수되는 CFU's의 수와 상기 계수 결과를 비교하는 것에 근거하고 있다. CFU's의 계수는 연속 희석과 생균수 측정(plate counting)의 표준 미생물 절차를 통해 이루어진다. 상기 절차에 의해 이용되는 농도액내의 겔, 연고와 다른 점성 및 불투명한 혼합물의 총체적인 항균성 효능을 직접 그리고 비교적으로 측정할 수 있다. 그 결과들은 일반적으로 접종원과 시험용 물질사이의 CFU's의 로그 수(log numbers)의 감소로서 표현된다.

시험용 박테리아 또는 효모의 보존 배양(stock culture)은 한천 사면배지와 한천 평판배지상에 보존된다. 분석하기 전에, 액체 배양균이 적합한 액체 배지에 조성되며 말기 로그기 농도를 얻기 위해 적합한 조건하에서 배양된다. 배양균은 원심 분리에 의해 얻어지며, X lO 농도액을 얻기 위해 자신의 상층액의 1/10 부피내에서 재부유시킨다. X lO 접종원(inoculum)은 시험용 물질의 1gram(또는 1ml) 샘플에 첨가되고, 잘 혼합되며 30초에서 수 분 이상까지 연장될 수 있는 소정의 시간 동안에 배양되었다. 노출 단계의 후반에서, 적합한(비성장을 지원하는)희석액의 9ml가 각 시험용 샘플에 첨가되며 잘 혼합된다. 그 후에, 1 :10 희석물이 살균한 페트리 접시에 참가된 각 희석물의 분취량에 의해 순차적으로 이루어진다. 적합한(성장을 지원하는) 한천이 45℃에서 첨가되며 교반에 의해 희석된 세포들의 분취량이 이것과 혼합된다. 일단 조성되면, 한천 평판배지들은 적합한 조건(호기성 또는 비호기성)하에서 배양되며, 각 콜로니들이 관찰되면, 그것들은 30과 300사이의 콜로니들을 관찰할 수 있는 희석 포인트에서 카운트된다. 희석 인자에 의해 카운트되고 증가된 수는 시험용 또는 제어용 샘플내의 생존 세포들의 수를 측정한 것이다.

최소 저지 농도 분석( Minimum Inhibitory Concentration ( MIC ) Assay )

미생물에 대한 시험용 샘플들의 MIC는 표준 한천 배지 희석법을 이용하여 실행되었다. 상기 시험 방법은 희석 항미생물물질 감수성시험(Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests)을 위한 National Committee for Clinical Laboratory Standard (NCCLS) 문서 M7-A6-방법에 근거한 것이다.

시험 샘플들은 1:2에서 1:24까지 물로 희석되었으며, 항균성 활동이 1:20에서 1:240에 이르는 농도 범위에서 평가될 수 있도록 용융된 한천 배지에 의해 10배 희석되었다. 박테리아용 한천 배지는 미생물의 우수한 성장을 위해 필요한 5% 양의 피에 의해 보충된 뮐러 힌튼(Mueller Hinton) 한천이었으며; 효모를 포함하는 진균은 사부로 포도당(Sabouraud Dextrose) 배지상에서 성장하였다. 미생물들은 16-24 시간동안 적절한 환경 조건하에서 35℃ ± 2℃에서 한천 평판배지상에서 배양되었다. 각 배양균의 생존능력과 순도를 검사한 후에, 미생물들은 McFarland 표준 0.5의 광학 밀도에 대해 0.9% w/v 생리식염수내에서 현탁되었다. 각 미생물의 현탁액은, 플레이트 표면에 약 0.3 μL 현탁액을 스팟으로 전달하는 멀티포인트 접종기(multipoint inoculator)를 이용하여 실험 물질의 희석물의 범위를 포함하는 한천 평판배지에 적용되었다. 이것은 각 스팟에 대한 유닛들을 형성하는 약 10⁴ 콜로니와 동등하다. 성장을 촉진하는 한천배지의 기능과 접종원의 생존력을 증명하기 위한 대조군으로서, 미생물들은 또한 시험 물질을 포함하지 않는 배지상에서 배양되었다. 현탁액의 스팟들은 공기층류 캐비넷(laminar air flow cabinet)내에서 한천 평판배지에서 건조되며, 플레이트들은 뒤집어지고, 호기성, 미호기성(micro- aerophilic) 또는 혐기성 조건하에서, 각 미생물들의 성장을 위해 적합한 배양기들내에 배치된다.

플레이트들은 시험 물질을 포함하지 않는 대조군 플레이트상에서 성장이 확실히 관찰되기까지 약 24에서 48시간 가량 배양 후에 배양기로부터 제거되었다. 이러한 늦은 성장 진균인 트리코피톤 멘타그로파이테스(Trichophyton mentagrophytes)와 트리코피톤 루브럼(Trichophyton rubrum)의 경우에, 플레이트들은 평가 이전에 8일 동안 배양되었다. 배양된 플레이트들은 4℃에서 저장되고 시각 검사에 의해 평가되었으며 MIC 데이터를 기록하기 위해 구성된 특허 등록된 영상 분석 시스템을 이용하였다.

배양 스팟에서의 성장의 유무가 기록되었으며, 실험된 각 미생물에 대해 LactiSAL의 MIC가 결정되었다. 항균성 물질의 MIC는 단일한 콜로니를 무시하고 육안으로 판단되는 뚜렷한 미생물 성장을 완전히 억제하는 시험 아이템중 가장 낮은 농도 또는 배양 스팟의 영역내에서 가느다란 헤이즈(haze)로 정의된다.

실시예 1 - 유지방으로부터 유리지방산의 지방분해 생성

효소의 선택

6개의 상업적으로 이용가능한 지방분해 효소들이 본 실시예에서 이용되었다: Lipomod 187 (혼합 진균원); Lipomod 338 (Penicillium roqueforti); Lipomod 621 (Candida cylindricia 및 Penicillium roqueforti)은 영국, 카디프, Biocatalysts 주식회사로부터 얻어졌으며, Lipase AY 30 (Candida rugosa로부터) 및 Lipase R (Aspergillus niger)는 영국, 취핑노튼, Amano-Enzyme Europe 주식회사로부터 얻어졌으며, 송아지 프리-가스트릭 효소는 뉴질랜드, Renco로부터 얻어졌다. 절차는 이러한 특별한 효소들에 한정되는 것은 아니며, 적절한 수율을 얻기 위해 프로테아제와 알파-아밀라제 외에도 췌장 리파아제를 포함하는 Sigma UK로부터 조 돼지 판크레아틴(crude porcine pancreatin)과 같은 다른 것들과 이러한 것들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 실시예에서는, 신선한 소독된 생크림이 사용되었으나, 유지방의 다른 소스들, 채소 또는 동물 지질도 효소 가수 분해를 통해 유리지방산의 소스로서 사용될 수 있다. 크림들은 40%가 유지방으로 존재하는 50% w/w 건조한 물질을 포함한다. 각 다이제스트(digest)에 첨가된 효소의 양은 존재하는 유지방의 농도에 대해서 계산되었다. 예를 들면, 특정한 지방분해 조성물의 1% w/w 투여량은 유지방 함량의 1%, 즉 0.4g/100 ml 크림이었다.

가수분해 절차

가수분해 반응들은 크림 100ml를 포함하는 250ml 삼각 플라스크내에서 세 번 실행되었다. 이 실시예에서 가수분해 온도는 45℃로 설정되었으나, 그 절차는 적당한 수율을 만들어내는 어느 온도에서 실행될 수도 있다. 플라스크와 성분들은 효소 조성물이 첨가되기 전에 상기 온도로 맞추어진다. 플라스크들은 150rpm으로 회전 배양기(Stuart Scientific)내에서 절차 진행 동안에 배양되었다. 샘플들은 정해진 시간 간격에서 제거되었으며(약 10ml), 10분 동안 85℃의 항온 수조에서 열처리되어 효소를 비활성화시켰고; 이러한 절차들은 상기 방법에서 기재된 GC에 의해 지방산 분석을 거치게 되었다.

도 1은 45℃(3개의 다이제스트의 중간값)에서 8시간 동안 여러 가지 효소를 가지고 소화시킨 후에 지방산 프로필을 요약한 것이다. 항균성 유리지방산들은 카프로산, 카프릴산, 카프르산 및 라우르산(C:6에서 C: 12)이며, 이러한 것들 중 가장 높은 수율은 Amano AY, Lipomod 187과 Lipomod 621에 의한 소화에서 관찰되었으며, 가장 낮은 수율은 Amano R이 사용된 경우에 관찰되었다.

실시예 2 - 효소 가수분해된 유지방으로부터 단쇄 내지 중쇄 유리지방산의 분리 및 항균성 평가

물 분리

가장 냄새가 나고 항균성면에서 가장 비활성적인 부틸산도 또한 유리지방산들 중 수용성이 강하며, 물 분리에 의해 분리된다(상 분리). 상기 실시예 1의 Amano AY에서 얻어진 다이제스트를 이용하여, 4 체적의 물이 40℃에서 첨가되었으며, 혼합물은 물 속에서 지질 성분을 분산시키기 위해 활발하게 교반되었으며, 실내 온도에서 분리되도록 놔두었다.

수상은 다른 곳으로 이동되었으며, 4체적의 물을 가지고 두 개의 연속적인 세척을 시작하였다. 이러한 방법은 부틸산의 80%와, 도 2에 도시된 다이제스트로부터 카프로산, 카프릴산, 카프르산과 라우르산(C:6에서 C: 12까지)의 약 18%를 제거하였다.

상기 제 3의 세척(도 2)으로부터 세척된( washed ) 유지방의 분별 증류

분별 증류는 당업자에게 공지된 기술이며, 다른 지방, 오일 및/또는 지질 및/또는 물, 유기 용매와 같은 유체 및 고체를 포함하거나 또는 포함하지 않는, 유리지방산과 같은 휘발성 물질의 조 혼합물을 가열하는 단계를 포함한다. 가장 낮은 비등점을 가지는 성분들은 먼저 혼합물로부터 증발되며, 그 후에 혼합물의 온도가 증가함에 따라 각각의 더욱 높은 비등점의 순차적인 증발이 이루어진다. 증발된 휘발성 물질들은 냉각 코일에서 응축되며 적합한 수용기내에 수집될 수 있다. 가열 및 냉각의 폐쇄 시스템상의 진공 펌프를 이용하여 가장 적합하게 얻어지는 방법에서 가열된 혼합물에 대해 압력을 감소시킴으로써, 모든 구성성분들의 비등점이 대기 압력에서의 비등점의 인자가 되는 크기, 진공 수준(트루톤 방정식) 및 휘발성 물질들과 등비등 혼합체(azeotropic mixtures)로 알려진 다른 용매 간의 결합 수준에 의해 감소된다. 정교한 시스템에서는, 증발 컬럼의 상부 온도가 검사되므로 요구되는 성분들이 증발하여 응축될 때에 응축액의 수집이 시작된다.

유리지방산의 증류를 위한 적합한 장비는 스위스, Buchi로부터 얻어지며, Kjeldahl. K-355 증기 증류를 포함한다. 이러한 방법은, 기본적으로 휘발성 물질과 압력이 센 증기의 조 혼합물을 퍼징하고, 이것을 응축시켜 휘발성 유리지방산과 물의 혼합물을 얻는 것이다. 물에서 용해되지 않는 지방산들은 일단 냉각되고 분리된 후에 혼합물로부터 디캔팅됨으로써 수집된다.

증류에 대한 더욱 정교한 제어는 진공 제어기 V-855를 가지는 Buchi Rotavapor R-210과 같은 회전 증발기를 이용하여 이루어진다. 회전 증발기는 회전하는 둥근 바닥 플라스크내에서 조 혼합물이 항온 수조에서 일정한 온도에서 보존되도록 하며, 폐쇄 시스템상에서의 진공은 낮은 수준에서 중간 수준으로 수정될 수 있다: 즉, 3.000에서 0.1 파스칼(대기 압력은 1Bar/ 100,000 파스칼이다.). 압력이 감소하면 각 성분들의 비등점이 감소되며 다른 용매의 첨가에 의해 방지될 수 있는 등비등 혼합체가 형성되지 않는다면 성분들이 순차적으로 증발하게 된다.

세척된 유지방의 분별 증류의 실시예가 도 3에 도시되어 있다.

이 증류액에서는, 부틸산이 세척된 유지방 중 원래의 4.5%에서 상승한, 전체의 9.8%를 차지하며, 항균성 그룹(C:6에서 C: 12)은 세척된 농축물의 32%에서 상승된, 총 증류액 중 81%를 차지하고 있으며, 장쇄 지방산(C:14에서 C:18.1)은 91%에서 8.5%로 감소되었다. 전체 농도면에서는, 세척된 농축물내의 항균성 그룹은 원래의 99%에서 근본적으로 변하지 않았으며, 잔류물(retentate)은 26%(-3.8 X)이며 증류액은 251% (+2.5X)이다.

증류액내의 유리지방산(C:4에서 C:12) 조성물은 하기와 같다:

부틸산 9.8%

카프로산 5%

카프릴산 10%

카프르산 24%

라우르산 38%

항균성 평가

상기 기재된 최소 저지 농도(MIC) 방법은 농축물, 세척된 농축물, 잔류물과 증류액의 상대적인 항균성 효능을 비교하기 위해 사용되었다. 사실, 유리지방산의 물에 대한 불용해성으로 인해, 용해된 한천과 증류액을 혼합하는 것이 어렵다는 것이 판명되었다. 계면활성제가 유리지방산의 항균성 효과를 무력화시키므로 용해를 촉진시키기 위해 계면활성제를 사용하는 것은 별로 가치가 없다. 그러므로, 설정 포인트보다 높은 온도에서 활발한 교반(agitation)에 의해 용해된 한천에 농축된 지방산들을 분산시키는 것이 필요하였다. 항균성 효능은 항균성 그룹의 농도와 직접적으로 연관되어 있을것으로 예상되었으나, 놀랍게도 이것은 그 경우가 아니었다.

표 2에 도시된 바와 같이, 2.5배로 더욱 농축되었음에도 불구하고, 증류액은 원래의 농축액보다 단지 1.3배 더 효능이 있었다. 다음 평가는 설명되지 않는 차이점이 원래의 농축액의 우유 혈청 단백질의 존재, 세척 농축액으로 이러한 단백질이 부분적으로 이동하는 것과 증류액에서는 존재하지 않는다는 것과 관련된다는 것을 암시하고 있었다. 추후 연구에서는, 원래의 생크림 중 유리지방산과 다른 지질 또는 비지질 거대 분자들 간의 여러 가지 시너지 형태들이 있었다는 것이 명백해졌으며, 이는 하기의 실시예로 설명된다.

실시예 3 생크림의 지질 또는 비지질 성분들을 가지는 항균성 유리지방산의 조합

생크림의 비지질 성분들은 우유 혈청 단백질, 리포단백질 프로테오글리칸(lipoproteins proteoglycans), 올리고당과 우유 지방구 막의 성분을 포함한다. 우유 혈청 단백질(whey)의 조성물을 가지고 유리지방산들의 농도를 유화시키는 것이 비교적 쉽다는 것이 판명되었다. 그리고 아래에 설명하는 바와 같이, 이것들은 상당히 증가된 항균성 효과를 나타내고 있다. 설명에 의해 제한되는 것을 원하지는 않지만, 우유 혈청 성분은 유리지방산의 항균성 효과를 촉진시킬 수가 있다. 왜냐하면, 그것들 중 일부는 양극성이며(amphipathic) 매우 증가된 표면적을 가지는 물방울내에서 불용해성 지방산의 분산을 촉진시키거나 또는 지방산들과 미생물 세포 표면 또는 그 양 쪽사이의 응력 효과(bridging effect)를 가지고 있기 때문이다.

정제된 우유 혈청의 적합한 소스는 아일랜드, 킬케니, Glanbia PLC로부터 상업적으로 이용가능한 정제된 유청 단백질 (WPI) 'Provon 190'이다.

유화 방법 1

비이온화된 물에서 WPI의 20% W/V 분산액은 일정한 교반 하에서 4-6 시간 동안 수화된다. 가장 적합한 0.2%W/V, 폴리소르베이트(Tween 20)가 첨가되며, 10분 뒤에, 10% V/V의 적당한 염, 또는 용매 또는 다른 삼투성 약품이 일정한 교반 하에서 천천히 첨가된다; 적당한 삼투성 약품은 염화나트륨, 황산 암모늄, 인산 나트륨, 에탄올, 메탄올, 글리세린 또는 유당이 될 수 있다. 폴리소르베이트는 표면 장력을 감소시키기 위해 필요하며 삼투성 약품은 WPI 용액의 삼투성을 증가시키기 위해 필요하다. 그러므로, 용해성 한계에 근접하게 된다. 30분 후에, 실시예 2의 증류액에서 얻어진 것과 같은 유리지방산의 30% V/V 조성물이 고속의 균질기(homogenizer)에 의해 생성된 소용돌이 속으로 한 방울씩 첨가된다. 적합한 균질기는 S18N - 19G 분산 도구를 가지는 Ultra-Turax Model Tl8 (IKA Works, 월밍턴, NC 28405, 미국)이며, 6,000에서 8,000 RPM으로 동작한다. 절차는 대기 온도(18℃에서 22℃)에서 실행되며, 생성물은 생크림과 거의 일치하는 흰색 에멀젼이 된다.

유화 방법 2

상기 유화 방법 1에 기재된 방법은 대기 온도에서 액체 상태인 지방산들의 조성에 가장 적합하며, 대기 온도보다 더 높은 녹는점(C:8보다 더 큰 포화 지방들)을 가지는 각각의 지방산들의 에멀젼 또는 그들의 조합을 조성할 필요가 있는 경우에는, 유화 처리는 상기 각각의 또는 혼합 녹는점 이상의 온도에서 실행되어야 한다: 카프르산과 라우르산들은 각각 31.4℃와 44℃의 녹는점을 가지고 있으며, 이것들은 46℃에서 모든 성분과 같이 유화된다. WPI의 20% W/V 현탁액이 50℃ 이상의 온도에서 변성되기 시작하므로, 이 방법에서는 WPI의 농도는 10%W/V로 감소된다.

비이온수에서 Provon 190의 10%W/V 현탁액은 대기 온도에서 일정한 교반에 의해 4-6시간 동안 가수분해 된다. 방법 1과는 달리, 표면 장력 또는 삼투성의 수정을 할 필요는 없다. 용액은 46℃에서 평형상태가 된다. 10% W/V(최종 체적)의 라우르산은 46℃에서 평형화되며, 그 온도에서 액체가 된다. 상기 방법 1에 기재된 Ultra Turax와 같은 적합한 균질기를 이용하면, 소용돌이가 유청 단백질 용액내에서 발생되며, 용융된 라우르산의 체적이, 한 개의 로트(lot)내에서 신속하게 이러한 소용돌이 속으로 첨가된다. 라우르산의 첨가 후에 바로, 유청 단백질과 라우르산의 총 결합 체적과 동등한 부서진 얼음의 체적이 첨가되며 전체 액체를 8℃ 이하로 냉각시키기 위해 균질화된다. 그 생성물은 낙농 우유와 거의 일치하는 흰색 에멀젼이 된다.

상기 방법 1을 이용하면, 실시예 2의 증류액으로부터 유리지방산들의 유화된 조성물은 자체의 유리산들의 거의 절반(효능 X2)이 되는 MIC를 가지고 있다. 그 에멀젼은 유리산의 30 중량%를 포함하고 있다. 그리고 MIC 분석 투여량은 시험 절차로부터 유리산과 유화된 산의 동등한 투여량을 얻기 위해 조절된다.

30mg/ml의 MIC와 자체의 증류액을 비교하면, 유화된 증류액에 대해 관찰된 MIC는 15mg/ml이었으며, 이것은 4.5mg/ml과 동등한 유리산 투여량, 즉 증류액의 효능의 6.6배를 얻기 위해 3.3 인자만큼 조절된다.

실시예 4 - 항균성 효능에 영향을 미치는 유리지방산의 조성물의 물리적인 특성들

유리지방산의 여러 가지 조성물들의 항균성 특성을 평가하기 위해 실시예 3에 기재된 유화 절차들을 이용한 경우에, 3개의 다른 예기치 못한 특징들이 나타나게 되었다.:

A) 유리지방산들의 유화된 조성물들은 그것들의 혼합 녹는점 이하의 온도들에서 항균성 특성이 미미하거나 또는 가지고 있지 않다. 예를 들면, 카프르산의 에멀젼은 31.4℃ 이하에서 항균성 효과를 가지고 있지 않으나, 그 온도보다 높은 온도, 즉 37℃와 같은 생리학적으로 정상인 온도에서, 큰 효과를 가지고 있다.

B) 전체 비율에 따라, 유리지방산들의 조성물들은 가장 낮은 녹는점을 갖는 성분의 녹는점보다 더 낮은 혼합 녹는점을 가지고 있으며; 조성물의 녹는점을 낮추는 용매 효과가 명백하게 있다.

C) 유리지방산들의 조성물들이 비항균성 유리산들의 상당 부분 또는 가수분해 되지 않은 지질을 포함하고 있는 경우에, 뚜렷한 격리 효과(sequestration effect)가 있다. 항균성 지방산의 친유성 성질은 그것들을 잔여 지질 또는 비항균성 유리산에서 우선적으로 용해될 수 있게 하며, 그로 인해 항균성 효과를 상당히 감소시키거나 또는 제거하게 된다.

실시예 2에 기재된 바와 같이 분별증류에 의해 각각의 항균성 유리지방산을 정제시키는 것이 기술적으로 가능하지만, '버터산' 혼합과 같이 실용축으로부터 이러한 것들을 얻는 것이 더욱 편리하며; 천연 유리지방산의 적합한 공급자는 미국, 뉴저지, Advanced Biotech 주식회사이다.

상기 유화 방법 2를 이용하는 경우에, 천연 카프릴산, 카프르산과 라우르산의 개별적인 에멀젼이 조성되었고; 실시예 2의 증류액의 에멀젼은 또한 방법 2에 의해 조성되었으며 비교 목적을 위해 다음의 분석 시험에서 사용되었다. 이러한 ‘개별적인’에멀젼들(및 증류액)은 모두 46℃에서 조성되었으며 방법 1에 의해 조성된 에멀젼들내에 포함된 30%W/V에 비하여 개별적인 산들의 5%W/V를 포함하고 있다.

접촉 생존력 분석 방법은 18℃, 35℃와 46℃의 물에서 각 에멀젼의 2% W/V 현탁액들의 항균성 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 상기 분석은 유리관내에서 실행되었으며 모든 시험 성분들은 배양 전과 현탁 기간(2분) 동안에 항온 수조내에서 유두 온도에서 평형화되었다. 접종원은 Brain Heart Infusion Broth에서 성장한 황색 포도상구균의 18시간 배양물이 된다. CFU 's의 감소는 도 4에 도시되어 있다.

도 4는 18℃에서 35℃와 46℃에 이르는 분석 온도에서의 변화가 로그 8에 있는 CFU's(N=3)를 가지는 접종원의 생존력에 대해 상당한 효과를 가지지 못한다는 것을 나타내고 있다. 카프릴산(녹는점=16.7℃)의 에멀젼은 모든 시험 온도에서 3로그 감소를 나타낸 반면, 카프르산과 라우르산은 모두 18℃에서 아무 효과도 나타내지 않았으며, 카프르산은 35℃와 46℃에서 3 로그 감소를 나타내었으며, 단지 라우르산만 46℃에서 효과가 있었다. 증류액은 16℃의 녹는점을 가지고 있으며 18℃에서 2로그 감소를 나타내었으며, 35℃에서 3로그 감소를 나타내었으며, 46℃에서 4로그 감소를 나타내었다. 그 결과들은 지방산들이 그것들의 녹는점 또는 그 이하에서 항균성 효과는 매우 미미하다는 것을 나타내고 있다.

지방산 혼합물 및 녹는점의 강하

서로 다른 녹는점들을 가지는 각각의 지방산들을 다른 비율로 혼합함으로써, 혼합물의 녹는점에 대해 각 구성 성분들이 미치는 상대적인 효과를 구축하는 것이 가능하다. 녹는점들을 측정하기 위해 상업적으로 사용가능한 여러 가지 장치들이 있으나, 이러한 값들은 또한, 용융된 결합물들의 50 마이크로리터의 체적을 96개의 웰 마이크로티트레 플레이트(microtitre plate(Nunc Nalgene))의 웰들(wells)내에 배치함으로써 측정될 수 있다. 그 플레이트들은 가장 낮다고 알려진 성분의 녹는점 이하(모든 웰들이 고체가 되는)로 냉각된다. 그리고 플레이트는 냉각된 물(4℃)의 수조에서 부유하도록 되며, 온도 제어 가열기의 도움으로 천천히 따뜻해진다. 가열 비율은 분당 1℃ 이상이면 안되고, 반투명이 불투명으로 변화하기 때문에 면밀한 관측에 의해 액체가 되는 웰의 온도는 명백하다.

도 5는 팔미트산(63.5℃), 미리스트산(58.5℃) 및 라우르산(44℃)의 녹는점에서 카프릴산(녹는점=16.7℃)의 증가 비율(W/W)의 효과를 나타내었다.

한쪽의 순수 고융점 개체 및 다른 쪽의 순수 저융점 개체 사이에서의 관계는 직선이라고 예상되었으나, 놀랍게도, 관계는 선형이 아니고, 게다가 비교적 근사한 녹는점을 가진 두 지방산(이 경우 카프르산 및 카프릴산)에 의해 아주 쉽게 입증되는 예기치 않은 효과가 있다.

저융점 카프릴산의 비율이 50%에서 60% 및 70%를 지나 증가됨에 따라, 혼합물의 녹는점은 순 카프릴산의 녹는점 이하로 내려가며: 정확한 값은 아래와 같다:

카프르산 50% : 카프릴산 50% 15℃

카프르산 40% : 카프릴산 60% 14℃

카프르산 30% : 카프릴산 70% 12℃

카프르산 20% : 카프릴산 80% 14℃

카프르산 0% : 카프릴산 100% 16℃

도 6에 도시된 바와 같이, 라우르산과 카프르산 사이의 관계 및 카프릴산의 농도를 증가함에 따른 카프르산과 라우르산의 50:50 혼합물 사이의 관계에서 효과가 유사함은 명백하다. 라우르산과 카프르산의 50:50 혼합물은 카프르산의 녹는점 31.4℃ 보다 5도 정도 낮은 26℃의 녹는점을 가지고 있다. 카프르산의 비율이 60%, 70% 및 80%로 증가함에 따라, 녹는점은 섭씨 27, 29 및 30도로 증가한다. (카프르산 녹는점보다 4, 2 및 1도 낮음)

2개에서 3개의 지방산으로 혼합의 복잡성이 증가함에 따라 녹는점의 유사한 저하가 관찰되었다. 도 6은 카프릴산의 농도가 증가함에 따른 라우르산과 카프르산(녹는점 26℃)의 50:50 혼합물의 관계를 나타내었다. 12℃의 최저 녹는점은 50% 카프릴산과 50% 라우르산: 카프르산 (예를 들어, 25% 라우르산, 25% 카프르산)의 농도에서 발견되며; 같은 값이 60% 카프릴산에서 존재하고, 70%와 80% 카프릴산에서 15℃ 및 100% 카프릴산에서 16.7℃로 증가한다.

도 6은 또한 라우르산과 카프르산의 희석액으로서의 올레산의 사용을 나타낸다. 올레산은 4℃의 녹는점을 가진 C 18:1 불포화 지방산이고, 라우르산과 카프르산의 녹는점에 현저한 효과를 가지고 있다고 예상된다. 이 혼합물에서 최저 녹는점의 저하는 분명하지 않으나, 올레산의 농도가 50% 이상 증가됨으로써 카프르산 녹는점에 현저한 급격한 효과가 있다.

항균성 지방산의 혼합물에 희석액으로써 올레산의 값은 한계값을 가지고 있다. 그러나 올레산 자체에 현저한 항균 효과를 가지고 있지 않더라도, 그것은 또한 다른 항균성 지방산이 격리될 수 있는 지질 '싱크(sink)'로서 작용한다.

도 7은 올레산에서 농도 변화에 따른 카프릴산:올레산, 카프르산:올레산 및 라우르산:올레산의 에멀젼의 항균성 효과를 나타낸다. 에멀젼은 실시예 3의 방법 2에 의해 제조된다. 황색포도상구균에 대한 각 에멀젼의 수중 2%W/V의 효능 평가를 위해 2분 접촉 생존 능력 분석 방법이 사용되었으며: 테스트는 45℃에서 수행되었다. 결과는 세 유리지방산(카프릴산, 카프르산 및 라우르산)의 각각의 효능이 60% W/V를 초과하는 올레산의 농도에서 현저히 감소되는 것을 나타낸다.

실시예 5 - 유리지방산 또는 그의 글리세라이드 또는 둘 모두의 에멀젼의 항균성 제제

이전의 실시예에 나타난 바와 같이, 우유 지질(트리글리세라이드)에서 지방산을 분해하고, 이것들을 분별하여 원하지 않는 성분을 선택적으로 제거하거나 제외하는 것이 가능하다. 특히 부틸산은 효소 가수분해된 분획으로부터 분리되거나, 개별 유리지방산은 버터산의 실용축으로부터 선별되고, 경도(녹는점), 냄새(부틸산 및 카프로산의 감소), 맛(부틸산을 소량 유지) 및 향균성 효과(C:6 에서 C:12 비율 > 50%)와 같은 다양한 물리적 및 화학적 특성의 조작을 용이하게 하는 다양한 비율로 혼합될 수 있다.

또한, 이전의 실시예에 개별 유리지방산의 선택된 혼합물이 유청 단백질로 유화될 수 있음을 나타내었다. 이 에멀젼은 주요 우유 단백질 카제인과 우유 미네랄 성분을 이용하고, 선택적으로 유당을 포함하거나 이를 예를 들어 폴리올과 같은 다른 올리고당 또는 장쇄 다당류(가용성 섬유소) 또는 폴리에틸렌 글리콜이나 이의 결합과 같은 대사적 비활성 고분자로 대체하며, 비타민 및/또는 항산화제를 강화하거나 강화하지 않은 낙농 우유를 재구성하는데 사용될 수 있다. 더 간단하게, 그것들은 탈지 우유를 재구성하는데 사용할 수 있다.

그들의 특성에 의해, 유리지방산은 산성 pH를 가지고, 주요 우유 단백질 카제인은 pH 4.5 이하에서 즉시 침강되는 산 불용성 단백질로서의 특성을 나타낸다. 만약 유리지방산의 성분이 카제인 용액에 직접적으로 첨가된다면, 빠르게 응고되고 따라서 이 둘은 양립할 수 없다고 추정하는 것이 합리적일 것이다. 사실 유리지방산이 유청 단백질에서 유화될 때, 효과적으로 구분되고 그들의 산성 pH 효과는 최소화되어 실시예 3의 방법 1에 의해 제조된 에멀젼의 농도 20% W/V 이상의 양이 카제인 성분에 어떤 해로운 효과를 주지 않고 탈지 우유에 첨가될 수 있다.

표 4는 지방산들의 목록, 정상 낙농 우유에서 그들의 비율 및 라우르산과 스테아르산의 함량이 증가하고 올레산이 약간 감소하였기 때문에 증가된 항균 효과 및 보통 구성에 가까운 물리적 특성(경도)을 갖는 실용축으로부터 선택된 천연 유리지방산 비율의 한 예를 제공한다.

표 4에 기재된 것과 같은 지방산들의 성분은 재생 우유에 톡 쏘거나 쓴 맛을 주고, 필요하다면 이 유리산을 Yang et al (5)에 적절히 기술된 효소 재 에스테르화 과정을 이용하여 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 트리글리세라이드로 변환함으로써 개선될 수 있다. 아실 에스테라아제 효소도 리파아제 같이 작용하고, 재 에스테르화의 정도는 지방산과 글레세롤의 화학양론적인 비율에 의존하며, 또한 혼합된 글레세라이드의 형태는 중량 퍼센트 비율이 아닌, 지방산의 어느 혼합물에서 몰 비율의 특성이 될 것이라는 점을 주의해야 한다.

재구성된 항균성 탈지 우유

삼투압 조정을 위해 염화나트륨을 사용하여, 실시예 3의 방법 1에 의한 유청 단백질에서 에멀젼을 제조할 때, 표 4의 4열에서 유리지방산의 변경된 구성은 원 유지방을 바꾸기 위해 탈지 우유에 첨가될 수 있으며, 강화된 항균 효과를 가지는 우유 생산을 달성한다.

마블이라는 상품명을 가진 상업용 분말 탈지 우유는 영국, 링컨셔, 스팔딩, Premier International Foods (UK) 주식회사로부터 구입할 수 있으며, 산 불용성 카제인을 포함하는 다른 우유 성분과 유화된 유리지방산의 호환성을 나타내는 데 사용될 수 있다.

실시예 6 - 유리지방산 또는 글리세라이드 또는 두 가지 모두의 항균성 에멀젼

실시예 4의 상세한 고찰에 근거하여, 유리지방산의 조성물은 실용축으로부터 구성될 수 있고 이들의 비율은 최적의 항균성 효과를 위해 최적화될 수 있다. 적합한 항균성 조성물의 예는 표 5에 나타냈으며, 그것은 10℃의 녹는점을 갖고 항균성 지방산과 비항균성 산의 비율은 3:1이다.

실시예3의 방법 1에 의해 유청단백질과 유화될 때, 에멀젼은 신선한 생크림과 거의 일치하며 4.2 에서 4.8의 pH를 가진다. 이 방법에서 기술된 MIC 기술을 사용하면, 에멀젼은 그람음성균과 그람양성균을 포함하는 광범위한 미생물종, 효모 및 진균에 대하여 강력한 항균성 효과를 나타내는 것을 알 수 있으며: 데이터는 표 6에 나타내었다. 항생물질에 내성이 있는 황색포도상구균 MRSA을 포함한 대부분의 미생물종은 1:240 (0.4% W /V)의 희석액에, 가장 내성이 있는 종인 녹농균(Pseudomonas)은 1 :60 (1.6% W/V)에 그리고 대장균(E. coli)은 1:100 (1% W/V) 희석액에 민감하다. 따라서, 0.5% W/V 와 10% W/V 사이의 세균 함유물에서, 에멀젼을 포함하는 항균성 제형은 바람직한 항균성 효과를 제공할 수 있으며, 개인의 정상적인 면역 기능이 어떤 이유로 쇠약하게 되었을 때 발병되거나 발병되지는 않지만 미용상의 이유로 바람직하지 않는 인간 및 동물 조직의 병원균 및 기회감염균(opportunistic colonisers)에 대한 치료나 예방법 모두에 사용되어 질 수 있다.

유화된 유리지방산을 기초로 하는 항균성 제형

이 실시예에서 기술된 항균성 에멀젼은 농축된 형태 또는 부형제, 습윤제, 연화제, 산도 조절제, 항산화제, 보존제, 방향제 및/또는 소독제, 방부제, 항생제, 항진균제, 항원충제 및 항바이러스제를 포함하는 기타 항균성 물질을 가지거나 또는 가지지 않는 수성 제형에서 0.5%W/V 와 10%W/V 사이의 희석액이 사용될 수 있다.

항균성 에멀젼은 실시예3에서 기술된 형태의 균질기(homogeniser)의 도움으로 수용성 매질(aqueous media)에서 분산될 수 있다. 일단 분산되면, 에멀젼은 시간이 흐르면서 서서히 가라앉는 경향을 가질 것이며 그리고 이것은 매질의 점성도를 증가시키는 겔의 사용으로 예방할 수 있다. 의약품 또는 화장품 제형에 일반적으로 사용되는 많은 종래의 폴리머가 있으며 이들은 당업자에게 잘 알려져 있다; 유도된 셀룰로오스 폴리머(derivatised cellulose polymers)가 주로 사용되고, 이들은 미국 도우 화학 회사(The Dow Chemical Company)로부터 입수 가능한 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드로프로필 셀룰로오스 및 하이드록시에틸 셀룰로오스와 같은 메틸, 에틸 및 프로필 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 종래의 부형제는 유리지방산의 에멀젼과 호환되지 않고, 지방, 지질 및 유리지방산을 길항하는 대부분의 계면활성제를 포함한다. 지방산의 항균성 효과에 대한 최적 pH는 4.5에서 5.0 정도이며, 이는 정상 생리적 pH가 7.0 정도일지라도, 0.01M 에서 0.1M 구연산 나트륨과 같은 완충제를 첨가한 제형의 사용으로 일시적으로 유지될 수 있다.

항생제를 포함하는 대다수 종래의 항균 물질의 효능 및 효험은, 주로 대상 미생물 종에 의한 이들의 화합물에 대해서 내성 (또는 이차 내성)이 발생하기 때문에 사용시 시간이 경과하면서 감퇴된다. 이것에 대해서는 메티실린 내성 포도상구균(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 반코마이신 내성 장구균(Vancomycin Resistant Enterococcus faecalis, VREF) 및 현대 보건의료 산업에서 커다란 걱정거리인 많은 기타 병원내 감염을 포함하는 다수의 예들이 있다.

대상종(target species)에 이차 억제 효과(partial inhibitory effect)를 가지는 항균제의 예는 아졸 화합물 클로트리마졸이며, 이것은 주로 효모 칸디다 알비칸스의 감염을 치료하기 위해 사용된다. 클로트리마졸의 일반의약품(OTC) 제형의 하나는 1% 에서 2%W/V 항진균제를 포함한, 독일, 바이엘 에이지사의 카네스텐이다. 칸디다 알비칸스의 신선한 임상 분리균에 대한 1% 카네스텐 크림의 살균 효과를 평가하기 위해 방법 단락에 기재된 접촉 생존력 방법을 이용하면, 도 8에 도시된 바와 같이, 그 제형은 2분 동안 1로그 단위 만큼 생존력을 감소시킬 것이다: 유리지방산 에멀젼 자체의 1% 수용성 분산은 3로그 만큼 생존력을 감소시킬 것이고, 0.2% W/V 유리지방산 에멀젼을 카네스텐에 첨가하면 1에서 3로그 만큼 항진균 효능이 증가되는 반면; 0.2 %W/V의 에멀젼 자체는 단지 1로그 이하로 생존력을 감소시키게 된다.　

단순 유리지방산 에멀젼의 겔 제형은 3% W/V 카르복시메틸 셀룰로오스 폴리머를 사용하여 만들어질 수 있다. 3% W/V 카르복시메틸 셀룰로오스 폴리머는 먼저 5%W/V 글리세린 BP으로 분쇄되고, pH 4.5에서 0.1 몰랄 구연산나트륨의 84mls (용량 %)가 45℃로 가열되며, 여기에 5%W/V 폴리에틸렌 글리콜 900이 용해되고, 1% W/V 페녹시에탄올이 여기에 첨가되어 균질기에 의해 분산되고, 이어서 2% W/V 유리지방산 에멀젼이 첨가되고 또한 균질기에 의해 분산된다. 폴리에틸렌 글리콜, 페녹시에탄올 및 유리지방산 에멀젼의 현탁액은 그 후, 글리세린에서 분쇄된 카르복시메틸 셀룰로오스에 첨가되고 분산이 되도록 잘 저어준다; 겔이 완전히 수화되는데 60분 정도가 요구될 것이다.

유사한 방법을 사용하고 부형제의 호환성에 대한 충분한 고려가 주어진다는 조건하에, 겔, 크림, 페이스트, 연고, 로션, 거품, 스프레이, 좌약, 페서리 및 상처 드레싱을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 약제가 유리지방산 에멀젼을 포함하여 만들어질 수 있고, 피부, 점막, 시각, 청각, 후각, 구강, 치아, 위장 및 질의 보건의료에 적용된다.

실시예 7- 유리지방산의 비-유화 조성물의 항균성 적용

영양 및 보건의료 산업에서 유리지방산의 에멀젼을 사용하는 몇가지 바람직한 이유가 있는 반면, 농축 형태 또는 유기산을 포함하는 유기용매에 희석된 형태의 비-유화 오일(non-emulsified oil)은 표면 소독 및 특히 음식 처리에 있어서 바이오-버든(bio-burden)을 감소시키는 데에 특별히 적용이 된다; 대상포진에 있어서 급성 간섭(acute intervention)과 같은 일부 예외는 있지만, 일반적으로 농축된 형태의 유리지방산은 보통의 보건의료 용도로는 너무 공격적이다.

음식 처리 및 특히 식용 동물을 도살하는 도살장에서, 막 도살된 동물 사체(carcass)가 장 내용물에 의해 오염되는 매우 큰 위험성이 있다. 이러한 배설물 문제는 살모넬라균종(salmonella species)과 장출혈성 대장균 0157 (EHEC)에 의해 종종 오염된다. 이러한 병원균을 갖는 음식은 가정용 주방과 상업용 음식 처리에서 매우 큰 위험 원인이 된다; EHEC는 잠재적으로 5세 이하 어린이에게 치명적이다. 유리지방산의 항균성 조성물은 본질적으로 푸드-그레이드 '버터산'이고 막 도살되어 손질된 쇠고기, 돼지고기, 양고기, 닭고기, 사냥고기(game) 및 물고기의 전체 표면에 스프레이로서 적용되어 질 수 있어서 특히 동물 사체(carcass)처리 사용에 적합하다.

표 5에 나타낸 유리지방산 조성물은 오일이며 강력한 살균작용을 얻기 위해 표면 처리된 신선한 고기 또는 음식에 분무될 수 있다. 상기 오일은 항균성 효과를 증가하도록 올레산과 라우르산 비의 전체적 비율을 감소시킴으로써(낮은 녹는점을 유지하기 위해) 유용하게 변경될 수 있다. 동일하게 오일은 항균성 효능의 중요한 손실 없이 농(concentrated) 젖산 또는 기타 유기산의 50% 이상으로 희석될 수 있다.

소 사체 세척 실험(beef carcass wash tests)에서 유리지방산 오일은 신선한 쇠고기 절편에 분무되었고, 쇠고기 절편은 대장균 O157:H7 (EHEC)의 말기 로그기 배양물에 의해 감염되었다. 상기 박테리아는 스프레이가 모든 실험 절편에 적용된 후 30분 동안 절편에 부착되었고; 대조군은 증류수 만이 분무되었다. 처리된 쇠고기절편은 60분후에 매세라이트되고 잔존 박테리아를 계수하였다.

도 9에, 대장균 O157:H7 을 이용한 4가지 별개의 실험이 도시되어있다. 한 시간 후 물 세척된 대조군내의 잔존 대장균은 평방 인치당 생균 세포가 8 로그 이상이었다. 처리된 절편은 계열 희석과 플레이트 계수가 뒤따르며 매세레이션을 통해 회수된 생존 세포에서 4 에서 5 (99.99%) 로그감소를 나타낸다. 유사한 결과는 살모넬라균 종을 포함하는 다른 박테리아에서도 얻어졌다.

본 발병은 상기에 기술된 실시 예에 국한되지 않으며, 구성 및 세부 사항에서 변화가 가능하다.

Claims (52)

1. 우유 혈청 지질에서 유래된 2종 이상의 천연 유리지방산, 부틸산(C4), 카프로산(C6), 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16), 팔미톨레산(C16:1), 스테아르산(C18), 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3)으로부터 선택된 유리지방산, 그의 에스테르화된 유도체 및 유리지방산의 유화제로서의 우유 단백질의 혼합물을 포함하며, 총 지질 함량의 적어도 35%는 부틸산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산 및 라우르산으로부터 선택된 1종 이상의 유리지방산을 포함하는 항균성 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   총 지질 함량의 적어도 50%는 부틸산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산 및 라우르산으로부터 선택된 1종 이상의 유리지방산을 포함하는 항균성 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 혼합물은 카프릴산, 카프르산 및 라우르산의 혼합물을 포함하는 항균성 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   유리지방산의 혼합물의 녹는점은 각 유리지방산의 어느 하나의 최고 녹는점보다 낮은 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 혼합물의 녹는점은 45℃보다 낮은 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 혼합물의 녹는점은 37℃보다 낮은 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 혼합물의 녹는점은 18℃보다 낮은 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   카프릴산, 카프르산 및 라우르산의 비율은 약 40:30:30인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   유리지방산의 적어도 일부는 에스테르화된 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 에스테르화된 유리지방산은 모노글리세라이드 및/또는 디글리세라이드 및/또는 트리글리세라이드 형태인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    유리지방산과 에스테르화된 글리세라이드의 비율은 약 50:50인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 수화제인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유화제는 우유 혈청 단백질인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
14. 제13항에 있어서,
    상기 유화제는 아포 리포단백질인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유화제는 카제인인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유화제는 약 5중량% 내지 45중량%의 농도 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물의 pH는 약 4.5 내지 5.0인 것을 특징으로 하는 항균성 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물 및 담체를 포함하는 약제학적 제제.
19. 제18항에 있어서,
    상기 조성물은 약 0.5% 내지 10%(w/v)의 농도 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    용액, 비누, 겔, 페이스트, 연고, 거품, 스프레이, 분말, 페서리, 드레싱, 정제 또는 식품인 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
21. 칸디다 알비칸스의 예방 또는 치료를 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
22. 제21항에 있어서,
    상기 제제는 질내크림 또는 겔 또는 페서리인 것을 특징으로 하는 용도.
23. 비특이성 세균성 질염의 예방 또는 치료를 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
24. 제23항에 있어서,
    상기 제제는 질내크림 또는 겔 또는 페서리인 것을 특징으로 하는 용도.
25. 피부 감염의 예방 또는 치료를 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
26. 제25항에 있어서,
    상기 제제는 국소 적용에 적합한 형태인 것을 특징으로 하는 용도.
27. 화상의 치료를 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
28. 제27항에 있어서,
    상기 제제는 국소 적용에 적합한 형태인 것을 특징으로 하는 용도.
29. 감염의 예방 또는 치료를 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
30. 제29항에 있어서,
    상기 제제는 수술용 드레싱의 형태인 것을 특징으로 하는 용도.
31. 눈, 코, 입 또는 생색기의 점막에 적용하는 약제 형태인 것을 특징으로 하는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
32. 제26항에 있어서,
    성적으로 전염되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 용도인 것을 특징으로 하는 용도.
33. 제27항에 있어서,
    상기 성적으로 전염되는 질병은 임질, 클라미디아, 헤르페스 및 HIV 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 용도.
34. 위장염의 예방 또는 치료를 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
35. 제34항에 있어서,
    상기 제제는 식품 또는 음료의 형태인 것을 특징으로 하는 용도.
36. 경구 질환의 예방 또는 치료를 위한 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
37. 제36항에 있어서,
    상기 제제는 치약, 츄잉검, 구강세정제 또는 기타 세치제에서 선택된 경구 보건 제제의 형태인 것을 특징으로 하는 용도.
38. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 보충물.
39. 제38항에 있어서,
    상기 조성물은 약 0.5% 내지 10%(w/v)의 농도 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 식품 보충물.
40. 유화제에서 유래된 우유 단백질 및 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산의 혼합물을 포함하는 식품 보충물.
41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식품 보충물은 오일 형태인 것을 특징으로 하는 식품 보충물.
42. 낙농 우유를 재구성하는 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항의 제제의 용도.
43. 제42항에 있어서,
    상기 낙농 우유는 탈지 우유 또는 버터 우유인 것을 특징으로 하는 용도.
44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    상기 재구성된 우유는 식품 보충물의 20%(w/v) 이하로 구성된 것을 특징으로 하는 용도.
45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재구성된 우유는 식품 보충물의 10%(w/v) 이하로 구성된 것을 특징으로 하는 용도
46. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재구성은 우유에 포함된 자연 발생 올리고당, 우유 미네랄, 비타민의 수치를 강화하는 것을 특징으로 하는 용도.
47. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 재구성된 우유.
48. 제47항에 있어서,
    올리고당을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 재구성된 우유.
49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    우유 미네랄을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 재구성된 우유.
50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    비타민을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 재구성된 우유.
51. 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 올레산으로부터 선택된 적어도 두개의 다른 유리지방산의 비수성 혼합물을 포함하는 살균제 스프레이.
52. 제51항에 있어서,
    유기 용매 증량제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 스프레이.

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