CN101938999A - 包含脂肪酸和乳蛋白的抗微生物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗微生物组合物，其包含源自乳清脂质的两种或多种天然游离脂肪酸的掺合物，以及作为所述游离脂肪酸的乳化剂的乳蛋白，所述游离脂肪酸选自丁酸(C4)；己酸(C6)；辛酸(C8)；癸酸(C10)；月桂酸(C12)；肉豆蔻酸(C14)；棕榈酸(C16)；棕榈油酸(C16:1)；硬脂酸(C18)；油酸(C18:1)；亚油酸(C18:2)；亚麻酸(C18:3)；和它们的酯化衍生物，其中总脂质含量的至少35％包含选自丁酸、己酸、辛酸、癸酸和月桂酸中的一种或多种的游离脂肪酸。

Description

包含脂肪酸和乳蛋白的抗微生物组合物
技术领域
本发明涉及游离脂肪酸的掺合物(blend)及其应用。具体而言，本发明涉及抗微生物的游离脂肪酸混合物。
背景技术
奶油酸(butter acid)是通常以醇酯的形式天然存在的游离脂肪酸(羧酸)，其中它们构成了植物和动物的油和脂肪的主要组分。它们通常被分类为在一端具有羧酸(极性)基团且在另一端具有甲基(非极性)基团的短链、中链或长链碳分子。这种极性导致两性的性质，其中羧酸末端是水溶性的且甲基末端是脂溶性的。除去极短链酸(丁酸)以外，尽管具有亲水的酸末端，但脂肪酸通常不溶于水，但溶于有机溶剂和油。
脂肪酸碳链在通过单个共价键连接时是“饱和的”，其中在-CH2-构型中碳的全部化合价都被氢占据。当碳通过双键连接时，碳的全部化合价未被占据，且碳被称为不饱和的；因此常将脂肪称为饱和的或不饱和的。
也常通过脂肪酸的分子结构中的碳数(C数)和在后的脂肪酸中所含的双键数来描述脂肪酸：C18:2是亚油酸，其具有18个碳的链长以及两个双键，即两个不饱和的C＝C键。饱和脂肪酸常为直链分子并紧密地堆积(pack)在一起，不饱和脂肪酸通常在双键处扭曲并展现较不紧密的堆积。随着碳链长度增加，脂肪的整体分子量增加，且脂肪的整体熔点增加。然而，由于不饱和脂肪的(通常的)非线性的构象，它们是例外的，它们展现较不紧密的堆积且具有较低的熔点。
在植物和动物的油和脂肪中，脂肪酸与醇酯化，所述醇为例如甘油(三元醇)，其可与1个、2个或3个脂肪酸结合形成甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。实际上，这些通常是在每个醇基团处具有不同脂肪酸的混合的甘油三酯。还已知任何甘油三酯的熔点将是酯化的脂肪酸的熔点的体现，且因此脂肪或油的整体硬度是不同脂肪酸比例以及这些脂肪酸是饱和还是不饱和的体现：将在室温下为液体的甘油三酯称为油，且将为固体的甘油三酯称为脂肪。
来自哺乳动物乳的乳脂提供了宽范围的脂肪酸，包括未在植物或蔬菜来源中发现的短链至中链酸。虽然有一些物种差异，但其通常包括丁酸(C4)、己酸(C6)、辛酸(C8)、癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、硬脂酸(C18)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)和一些低浓度的较高级酸。注意到仅有的三种不饱和脂肪酸是油酸、亚油酸和亚麻酸，且这些酸占总量的约30％或更低；下表(表1)显示了牛乳脂中脂肪酸含量的典型特征。
Figure BPA00001189468500021
尽管事实是脂肪含量中的65％是饱和的，但黄油不是特殊的硬脂且在37℃下液化，其部分原因是由于除了不饱和酸外，短链至长链的饱和酸(C:10和以下)都具有小于37℃的熔点(因为它们的短的链长度)，且这些占总脂肪含量的10％。
由乳脂导致的血胆甾醇过多很大程度上是由于肉豆蔻酸的含量，且较小程度上是由于棕榈酸；硬脂酸和任何较短链的酸(C:12和以下)均不会导致血清胆固醇升高(9)。相反地，短链酸(C:4至C:12)在其抗微生物性质和可容易地获得的能量含量方面具有显著的潜在益处。与较长链的酸相比，短链的饱和的游离脂肪酸在吸收和代谢方式上存在差异。通过胃脂肪酶从短链脂肪酸的甘油三酯核释放出的短链脂肪酸在肠上皮细胞处被吸收，并在肝门静脉中被直接转运到肝，在肝处，它们表现为即刻和强力的能量源，热值是等重量碳水化合物的热值的约2.5倍。较长链的酸在肠上皮细胞中重组为甘油三酯，并在淋巴中以乳糜微粒的形式被转运至脂肪组织(8)。
实际上，大多数脂肪酸以甘油三酯的形式存在，甘油三酯是脂肪或油中的脂质部分的主要组分。在摄食时，脂质被脂肪酶分解，从甘油酯中释放出游离脂肪酸。水解过程起始于前胃(唾液的)脂肪酶的作用，且已知大多数唾液的脂肪酶优先从乳脂中释放短链至中链的酸，且这些短链至中链的酸对革兰氏阳性肠球菌和革兰氏阴性大肠菌具有很强的抑制性质(1和2)。除了短链酸以外，还已知亚油酸和亚麻酸均对龋齿生物体变形链球菌(Streptococcus mutans)有抑制作用(3)。已知脂肪酸的甘油单酯以及游离短链酸具有抗真菌活性(4)。也已经报道了针对包膜病毒的杀病毒活性(7)。
通过唾液脂肪酶的杀微生物的短链脂肪酸(C:4至C:12)的早期且优先的释放在新生动物的肠道中提供保护机制，且明显有助于预防胃肠道感染。游离脂肪酸通常不溶于水介质，因此它们的转运和生物利用度取决于它们的乳化。
WO 03/018049公开了使用乳清脱辅基蛋白来抑制潜在病原体粘附到人或动物上皮膜；脱辅基蛋白通过源自猪胰腺提取物的脂肪酶从乳清脱辅基蛋白酶解产生。脱辅基蛋白是正常缀合的非蛋白物质(脂质/碳水化合物/多糖/金属离子)被去除后所留下的剩余蛋白“骨架”。脱辅基蛋白通常对特定的非蛋白缀合物具有很好的亲合力。在脱辅基蛋白的情况中，此亲合力是基于有助于在脂质、脂肪或游离脂肪酸的水介质中结合和转运的极性和非极性或两性部分。
在乳加工期间，黄油生产包括通过机械方式将脂肪球膜破裂，且使乳脂球结合并飘浮在表面上，在其上它们被以黄油的形式收集。通常将剩余的酪乳酸化以沉淀不溶于酸的酪蛋白，留下“酸性乳清”，其包括乳清蛋白、乳糖(milk sugar lactose)和破碎的脂肪球膜的成分。也将乳清蛋白从干酪生产中的凝乳的流出物中回收，其中使用凝乳酶来凝结酪蛋白和脂肪，此“甜乳清”也将包含脂肪球膜的成分。可进一步加工乳清蛋白以去除剩余乳糖和脂质，并随后喷雾干燥以形成乳清蛋白浓缩物(WPC)，或当被加工以最大程度降低非蛋白物质时，形成乳清蛋白分离物(WPI)。
除了全乳以外，乳品业的“主要”产品是黄油和干酪，酪乳和酸性酪蛋白、乳糖、矿物质和酸性乳清是来自黄油制备的“次要”产品，而甜乳清、矿物质和乳糖是来自干酪生产的“次要”产品。在现代乳品业中，术语“主要”和“次要”会被误解，因为次要的“副产物”产生极显著的经济贡献。此外，现代乳品业利用越来越复杂的技术方法来改变并增加传统产品的价值。一种这类改变是使用酶来从乳脂中产生游离脂肪酸，以获得用在食品加工、开胃点心生产和方便膳食中的干酪香精(酶改性的干酪)。
发明内容
本发明提供了抗微生物组合物，包括源自乳清脂质的两种或更多种天然游离脂肪酸的掺合物，和作为所述游离脂肪酸的乳化剂的乳蛋白，所述游离脂肪酸选自丁酸(C4)；己酸(C6)；辛酸(C8)；癸酸(C10)；月桂酸(C12)；肉豆蔻酸(C14)；棕榈酸(C16)；棕榈油酸(C16:1)；硬脂酸(C18)；油酸(C18:1)；亚油酸(C18:2)；亚麻酸(C18:3)；和它们的酯化衍生物，其中总脂质含量的至少35％包含选自丁酸、己酸、辛酸、癸酸和月桂酸中一种或多种的游离脂肪酸。
总脂质含量可包含至少50％的游离脂肪酸，所述游离脂肪酸选自丁酸、己酸、癸酸和月桂酸中的一种或多种。
所述组合物的总脂质含量的剩余部分可包括C14或更高的非抗微生物的游离脂肪酸、未水解的脂质成分、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯等或它们的组合。
所述掺合物可包括辛酸、癸酸和月桂酸的混合物。
所述游离脂肪酸掺合物的熔点可低于任一单独的游离脂肪酸的最高熔点。所述掺合物的熔点可小于45℃，如小于37℃，如小于18℃。
辛酸∶癸酸∶月桂酸的比例可为约40∶30∶30。
所述掺合物中的至少一些所述游离脂肪酸可被酯化。所述酯化的游离脂肪酸可为甘油单酯和/或甘油二酯和/或甘油三酯形式。游离脂肪酸∶酯化的甘油酯的比例可为约50∶50。
所述组合物可为水可分散的。
所述乳化剂可为乳清蛋白，例如所述乳化剂可为载脂蛋白。或者，所述乳化剂可为酪蛋白。所述乳化剂的浓度可在约5重量％至45重量％的范围内。
所述组合物的pH可为约4.5至5.0。
本发明进一步提供了包含本文所述组合物和载体的药物制剂。所述组合物的浓度可在约0.5重量/体积％至10重量/体积％的范围内。
所述制剂可为溶液剂、皂、凝胶剂、糊剂、软膏剂、泡沫剂、喷雾剂、散剂、阴道栓剂、敷料、片剂或食品的形式。
本发明进一步提供了制剂在预防或治疗白色念珠菌(Candida albicans)感染中的应用。所述制剂可为阴道内乳膏剂或凝胶或阴道栓剂(pessary)的形式。本发明还提供了制剂在预防或治疗非特异性细菌性阴道炎中的应用。所述制剂可为阴道内乳膏剂或凝胶或阴道栓剂的形式。本发明进一步提供了制剂在预防或治疗皮肤感染中的应用。所述制剂可为适合局部施用的形式。本发明还提供了制剂在治疗烧伤中的应用。所述制剂可为适合局部施用的形式。本发明进一步提供了制剂在预防或治疗感染中的应用。所述制剂可为外科敷料的形式。所述制剂可为用于经粘膜施用至眼、鼻、口、肠或生殖器的药物的形式，如用于预防或治疗性传播疾病如淋病、梅毒、衣原体、疱疹和HIV中的一种或多种。
本发明还提供了制剂在预防或治疗胃肠道感染中的应用。所述制剂可为食品或饮料的形式。本发明进一步提供了在预防或治疗口腔疾病中的应用。所述制剂可为选自牙膏、口香糖、嗽口水或其它洁齿剂中的口腔保健制剂的形式。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述组合物的食品补充剂。所述组合物的浓度可在约0.5重量/体积％至10重量/体积％的范围内。本发明还提供了其包含源自乳蛋白的乳化剂以及辛酸、癸酸、月桂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的混合物的食品补充剂。所述食品补充剂可为油的形式。
所述食品补充剂可用于重组(reconstitute)牛奶。所述牛奶可为脱脂乳或酪乳。所述重组的乳可包含20重量/体积％或更低的所述食品补充剂，如10重量/体积％或更低的所述食品补充剂。使用本文所述的组合物来重组的乳可提高所述乳中天然存在的寡糖、乳矿物质和维生素的水平。
本发明进一步提供了包含本文所述组合物的重组的乳。所述重组的乳可进一步包含寡糖。所述重组的乳可进一步包含乳矿物质。所述重组的乳可进一步包含维生素。
在另一方面，本发明提供了包含至少两种不同游离脂肪酸的非水混合物的消毒剂喷雾，所述游离脂肪酸选自辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸。所述喷雾可进一步包含有机溶剂稀释剂。
附图说明
将参照附图，通过仅以实施例方式给出的下述本发明的实施方案来更清楚地理解本发明，其中：
图1的图表明使用不同酶从新鲜巴氏杀菌的牛乳中产生游离脂肪酸；
图2的图显示丁酸降低百分数的水分配(water partition)；
图3的图说明在将经洗涤的、水解的乳脂分馏蒸馏后的脂肪酸含量；
图4的图说明在暴露于各种脂肪酸2分钟后，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的接触生存力；
图5的图说明随辛酸的百分数的增加，棕榈酸、月桂酸、肉豆蔻酸和癸酸的熔点的降低；
图6的图说明随辛酸、癸酸或油酸的浓度增加，月桂酸的熔点的降低；
图7的图说明随油酸的浓度的增加，辛酸、癸酸或月桂酸的抗微生物效力的降低；
图8的图说明在暴露于游离脂肪酸的各种乳液2分钟后，白色念珠菌的接触生存力；和
图9的图说明游离脂肪酸油作为牛肉体消毒剂对于抗肠出血型大肠杆菌(E.coli)O157(EHEC)的有效性。
具体实施方式
可使用可商购的脂肪酶自乳脂产生游离脂肪酸的组合物。此类酶促水解构成酶修饰的干酪的生产基础。所产生的游离脂肪酸的比例和组成将取决于酶的类型、底物浓度和其它物理化学条件如温度和pH。通常将提取自屠宰场中小牛、小羊和羔羊的舌下腺的真菌脂肪酶和天然动物胃前(唾液的)脂肪酶用在干酪工业中用于产生味道。具体的味道将受酶的选择和短链至中链游离脂肪酸的释放特性的影响。丁酸(C4)具有特别有刺激性的“干酪质(cheesy)”气味，而己酸(C6)和辛酸(C8)也是有气味的，但更“令人陶醉(heady)”，而其它较短链的挥发性酸(丙酸)通过微生物作用间接产生，全部这些都导致区域性干酪味道的国际清单。
除了它们在味道中的应用以外，短链至中链酸(C4至C12)具有特别强的抗微生物效果，然而它们在此目的中的医药应用受限于它们在水介质中的不溶性，且更特别地，受限于它们的气味，其在局部应用中是不受欢迎的。短链至长链游离脂肪酸通过唾液脂肪酶的水解作用的早期释放被认为是“母体赋予的”先天免疫能力的一部分，其保护新生儿的肠道抵抗潜在的微生物病原体(1和2)。
我们描述了如何通过在若干体积水中清洗或“切割”水解的脂肪来减少酶水解乳脂的更具气味的内容物。丁酸在水中相对可溶，且将因此分配进入水相，尽管辛酸仅微溶于水溶液中，但部分辛酸也是如此。我们发现丁酸的存在能增加辛酸的溶解度，因为丁酸起有机溶剂的作用，因此使得能够分配辛酸。
可推进酶反应以实现底物的完全水解，这通常通过结合酶反应的产物或从反应混合物中去除产物来完成。可使用酶水解脂肪酸混合物的分馏来去除更多的挥发性短链游离脂肪酸，和/或反应混合物中乳化剂如胆汁酸或乳清蛋白分离物的存在将用来结合反应产物，因此使得能够完成底物的水解。
虽然通过酶水解来产生游离脂肪酸相对简单，但水解的游离脂肪酸与未水解的脂质的比例对实现高抗微生物效力而言至关重要。当混合物中存在过多未水解的脂质时，未水解的脂质起槽的作用，游离脂肪酸由于它们的亲脂性(lipophylicity)而被螯合。抗微生物应用需要高比例的游离酸，游离酸含量应大于混合物的总脂质含量的约35％。如实施例4中的更详细的描述，并参照图6和7，可将具有不同熔点的多种游离脂肪酸合并，以产生熔点低于单个游离脂肪酸组分中任一组分的熔点的组合物。熔点的这种下降可用于形成游离脂肪酸的抗微生物组合物，因为单个的游离脂肪酸仅当其为液体形式时才显示出抗微生物效果。具有低熔点的单个游离脂肪酸作为具有较高熔点的酸的溶剂，且因此具有低熔点的游离脂肪酸可作为抗微生物的脂肪酸的螯合剂，且使它们在低于某一比例时无活性；因此为了克服螯合作用，抗微生物的游离脂肪酸应占组合物的总脂质含量的至少35％。
游离脂肪酸不溶于水，这限制了它们作为抗微生物剂的医药应用。我们已经显示出通过在含水基溶液中乳化游离酸的组合物，形成具有更大的表面积的脂肪球，这导致更强的抗微生物作用。适合的乳化剂为乳蛋白，如来自牛奶乳清的乳清蛋白或乳清载脂蛋白。
游离脂肪酸的组合物是可商购的，且作为食物生产中的调味用的“奶油酸”销售和使用；美国FDA宣称奶油酸对于食品应用而言一般认为是安全的(GRAS)。
我们描述了可将抗微生物效果最佳化的奶油酸制剂。游离脂肪酸的组合物可通过乳脂质的酶水解，或通过在真空蒸发下提取和浓缩游离脂肪酸来产生。当组合游离脂肪酸的掺合物时，也可组合可商购的游离酸的掺合物，可能希望除去更具气味的丁酸和己酸，特别是当用于局部抗微生物目的时。为了增强抗微生物作用，希望增加掺合物中已知的可抗微生物的游离脂肪酸的含量，这些是气味较弱的辛酸、癸酸和月桂酸。我们已经显示这三种脂肪酸(辛酸、癸酸和月桂酸)的混合物的熔点是单个熔点组合的产物，且游离脂肪酸掺合物的整体熔点可通过改变混合物中游离脂肪酸的比例来调整。
游离脂肪酸掺合物的整体熔点对这些掺合物的抗微生物能力具有至关重要的作用。其中以癸酸和月桂酸为主的辛酸、癸酸和月桂酸的掺合物将比其中以辛酸为主的相同的酸的混合物具有更高的熔点。低于混合物的熔点，此类掺合物的抗微生物作用降低若干数量级；相反地，高于所述熔点，增加若干数量级。
哺乳动物的体内温度通常为37℃，而皮肤温度可低至18℃～20℃。当配制游离脂肪酸的混合物以提供对皮肤的抗微生物作用时，游离脂肪酸混合物的熔点应小于约18℃，对于体内应用，混合物的熔点可较高(即混合物应包含较高比例的较高熔点的酸)，但如果需要体内(胃肠的)抗微生物作用，则在任何情况下熔点均不应超过37℃。
游离脂肪酸具有难以接受的“辛辣”味道且处于浓缩形式时它们对哺乳动物组织具有刺激。游离脂肪酸的令人不快的滋味和刺激性可通过加入乳化蛋白来略微地缓解，但游离脂肪酸具有酸性pH，其与酸不溶性蛋白如酪蛋白和其它合意的赋形剂如钙盐不相容。实际上，脂肪酸大多以醇酯的形式存在(在乳乳脂中以三元醇甘油的酯的形式存在)，这些醇酯几乎总是为具有与每个甘油共价结合的三种不同脂肪酸的混合的酯。为了消除不希望的酸性、滋味和应激性，可希望将混合物中一些或全部游离脂肪酸转化回甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的形式。
可在甘油中，且在促进缩合反应的硫酸、无水硫酸钠或其它适合的干燥剂的存在下，使用回流蒸馏，将游离脂肪酸再酯化为甘油酯。除了对甘油酯的水解活性外，脂肪酶还起酯酶的作用，且可用于自游离脂肪酸和甘油的组合合成甘油酯(5)。所形成的甘油酯的类型和所经历的酯化程度可通过改变游离脂肪酸与甘油的化学计量比；反应条件和溶剂的选择来控制。
可构建单个游离脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，并将它们以任何所需的比例掺合，或由所需的游离脂肪酸的混合物开始，并形成混合的甘油三酯。
虽然与游离脂肪酸相比较，脂肪酸的甘油酯具有低得多的抗微生物效力，但甘油酯通过肠道中前胃唾液脂肪酶和胰腺脂肪酶在摄食中被迅速水解为游离酸。当需要肠抗微生物作用时，如在胃肠炎的预防和/或治疗中，短链至中链脂肪酸的甘油酯的摄取将导致游离脂肪酸在肠腔内的局部和受控的递送，而不会使接受者经历游离脂肪酸的不希望的器官感觉性质。
我们描述了使用可商购的乳清蛋白分离物(乳清蛋白)，乳化所选比例的游离脂肪酸，不同组合和比例的它们的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的方法。稳定剂、抗氧化剂、微量营养素、香精和/或香料可与乳液组合，以提供在摄食时具有强力抗微生物性质的重要中间体。
牛奶可使用分散在乳酪蛋白和乳矿物质(含或不含乳糖)的含水制剂中的经调整的游离脂肪酸和/或它们的甘油单酯掺合物的乳清蛋白乳液重组。也可以使用经调整的再酯化的游离脂肪酸，和/或乳清蛋白乳液中的游离脂肪酸重组牛奶，或通过将游离脂肪酸在脱脂乳或酪乳中分散或乳化而以油的形式重组牛奶。此类制剂具有显著的商业价值，因为它们对于食物携带的病原体提供了更强的GI保护。
在一个实施方案中，本发明涉及游离脂肪酸的组合物，所述游离脂肪酸选自乳脂质中天然存在的游离脂肪酸，所述组合物是两种或更多种游离脂肪酸的组合，所述游离脂肪酸选自：丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。乳脂质优选来自牛、山羊或绵羊物种的乳，但也可来自任何哺乳动物物种。
游离脂肪酸可通过乳脂质的酶促或化学水解产生，并用作部分氢化的乳脂质的制剂，或它们可通过在真空下分馏而自粗水解产物提取和纯化。游离脂肪酸也可从商业渠道获得，且这些游离脂肪酸的最初来源可来自植物油如玉米油、棕榈油、棕榈核油、椰子籽油等的水解产物，但在任何情况下，它们将是天然来源，并限于天然存在于乳脂质中的那些脂肪酸(商业上称为奶油酸)。
为增强抗微生物作用，可通过如下方法优化游离脂肪酸的组合物，通过增加组合中丁酸、己酸、辛酸、癸酸和月桂酸相对于其它游离脂肪酸的比例，使得掺合物的整体熔点优选地小于约37℃的正常生理温度，且在任何情况下都不大于约45℃。
抗微生物的游离脂肪酸的组合物可优选地局限于辛酸、癸酸和月桂酸，以最大程度降低组合物的气味性质。就此而言，丁酸和己酸可通过在可商购的原料(stock)中进行水分配、分馏或去选择(de-selection)而从粗水解产物中去除。
抗微生物的游离脂肪酸的组合物可单独使用，或与一种或多种其它天然存在的游离脂肪酸组合使用，所述其它天然存在的游离脂肪酸选自肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和/或亚麻酸或它们的衍生物。当为抗微生物作用而组合时，抗微生物的游离脂肪酸(C4至C12游离脂肪酸)或其衍生物的组合物应优选地占总游离脂肪酸、游离脂肪酸衍生物和/或未水解的脂质组分的大于约80％，且在任何情况下，抗微生物的游离脂肪酸或其衍生物不应小于组合物中总脂质或脂质类物质的含量的约35％，优选不小于50％，如不小于80％。
在另一个实施方案中，所选的单个游离脂肪酸或其混合物可通过酸回流缩合或酶促法而与甘油酯化，以生成甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，根据脂肪酸进料的组成和浓度，它们可为均质的(homogenous)或混合的甘油酯。当将抗微生物的游离脂肪酸的组合组合以包含在食品产品中时，以及当希望降低游离酸的酸度、过敏性和/或滋味时，优选酯化，但其不是必需的。
混合的甘油三酯自游离脂肪酸的混合物的重组有助于经调整的脂质的重组，其在医学应用中有更强的效用，这与它们的抗微生物作用无关或与它们的抗微生物作用相结合。主要基于短链至中链脂肪的脂质将具有更快的代谢能量生成，这基于它们经由肝门静脉直接转运至肝。同样，自所选不含肉豆蔻酸或棕榈酸的脂肪酸重组的脂质将更易于被易患血清胆固醇升高的个体接受。
可将包含或不包含赋形剂的抗微生物的游离脂肪酸和/或其衍生物的组合物用作喷雾剂或洗剂，以降低在屠宰场中动物躯体上，以及刚收获的水果和蔬菜上的潜在病原体的生物荷载(bio-burden)。
希望将水解的脂质、游离脂肪酸和/或其衍生物乳化，以增加它们在抗微生物和/或营养作用上的生物利用度，但这不是必需的。适合的乳化剂包括来自乳品加工的乳、乳蛋白、乳酪氨酸、乳清蛋白、乳清脱辅基蛋白和乳清。
游离脂肪酸的制剂可以以常规的药物、医疗装置、化妆品或膳食组分的形式存在，且当用作膳食组分时，可将它们配制，以实现肠道中的营养作用如高热值和/或抗微生物作用。
在一个实施方案中，将抗微生物的游离脂肪酸或其甘油酯和/或乳脂质的粗水解产物的所选组合物在乳清蛋白中乳化，并用作用于局部治疗和/或预防皮肤、毛发和指甲的感染的软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏剂、糊剂或其它药物中的成分。
在另一个实施方案中，将所选抗微生物游离脂肪酸的乳清蛋白乳液用作口腔卫生用的牙膏或嗽口水或牙科粘合剂或牙科固定剂中的抗微生物成分，和用作用于治疗和/或预防龋齿、龈炎、牙周炎、鹅口疮和口疮性溃疡的药物。
在另一个实施方案中，可将抗微生物游离脂肪酸的乳清蛋白乳液并入凝胶剂或阴道栓剂中，并用于预防和/或治疗阴道感染，包括酵母阴道炎和非特异性细菌阴道炎，和以类似形式用作屏障，用于预防性传播疾病，包括淋病、梅毒、衣原体、疱疹和HIV。
抗微生物游离脂肪酸的乳清蛋白乳液可用作皂、净手凝胶和湿巾中的成分，用于预防医院和病人康复机构中耐抗生素细菌的交叉污染，且也可用于已知的耐抗生素细菌无症状携带者的去菌落化(de-colonisation)。
可使用经热处理的乳清蛋白和其它赋形剂将游离脂肪酸的抗微生物组合物乳化为泡沫，以制备适用于预防和/或治疗感染性腹泻、假膜性结肠炎和其它肠道传染病的灌肠剂。
将通过以下实施例来更清楚地理解本发明。
实施例
方法
脂肪酸的气相色谱分析
在气相色谱(GC)分析前，自存在于初始样品中的任何非脂质物质中提取样品的脂质组分(含游离脂肪酸)。所用方法改编自DeJong和Badings(6)。称量出样品(0.1-0.5g)并加入到含10ml乙醇、1.0ml 2.5M硫酸、15.0ml 50∶50乙醚∶庚烷和1ml内标(即戊酸(C5:0)、十七酸(C7:0)和十一酸(C11:0)，全部为1mg/ml，在庚烷中)的溶液中。将溶液混合均匀并离心以回收上清液。使用Pasteur移液管将含脂质的上部相转移至含1g无水硫酸钠(干燥剂)的烧杯中。
使用500mg，3ml Strata氨基丙基柱(Phenomenex，Macclesfield，Cheshire，UK)进行固相提取(SPE)。这些SPE柱首先用2×10ml庚烷调节，随后将来自上述烧杯的脂质组分加入柱中并抽真空。中性脂质使用2×10ml洗液(己烷∶丙烷(3∶2体积/体积))洗脱；随后使用5ml 2％体积/体积的甲酸的乙醚溶液将脂肪酸自SPE柱洗脱。
单个游离脂肪酸(C4:0、C6:0、C8:0、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:2和C18:3)使用具有火焰离子化检测器、Varian 1079通用毛细管注射器、Varian 8410液体自动取样器和Varian Star操作软件(Varian Analytical Instruments，Harbor City，California，USA)的Varian 3800气相色谱仪通过GC定量。所用的柱为直接柱上进样的Chrompack WCOT熔融石英毛细管柱CP FFAP-CB，25m×32mm ID，0.3 DF(Varian Analytical Instruments，Harbor City，California，USA)。注射器温度为65℃(保持0.1分钟)，以每分钟200℃增加至250℃(保持1分钟)，随后以每分钟200℃冷却至65℃(保持20分钟)。流动压力固定在8psi。烘箱温度为65℃(保持1.5分钟)，随后以每分钟10℃加热为240℃。总运行时间44分钟。检测器温度为300℃。全部样品一式三份进行分析。
抗微生物分析
通常使用两种技术来评价抗微生物效果并比较单个样品的效力，这些技术是生长抑制试验、接触生存力试验和最低抑制浓度(MIC)试验。也通常使用若干“指示物”生物体，这些生物体包括革兰氏阳性菌(变形链球菌)、革兰氏阴性菌(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))和酵母(白色念珠菌)。在-80℃下将测试生物体置于MicroBank冷冻保护剂小瓶(Pro-Lab，Ontario，Canada)中，并在接种液体培养物前在适合的琼脂上培养以用于试验：细菌在Brain Heart Infusion琼脂和肉汤(Oxoid，UK)上生长，而酵母在YEPD(来自Oxoid UK，1％重量/体积酵母提取物、1％重量/体积蛋白胨和2％重量/体积葡萄糖，在需要时，细菌学的琼脂1.8％重量/体积)上生长。
接触生存力试验
此试验方法用于测定标准化微生物种群的生存力(生存)，所述标准化微生物种群暴露于制剂一段规定的时间，所述制剂包含游离脂肪酸和/或其衍生物且包含或不包含可构成用于治疗或营养应用的递送体系的其它活性或非活性成分。
此方法基于接种物中菌落形成单位(CFU)的计数，所述接种物由在适合的培养基中生长的对数后期细菌或酵母菌制得，以及在暴露于规定量的测试物质一段规定的时间后，将这些值与从相同接种物获得的CFU数的比较。CFU的计数通过连续稀释和平板计数的标准微生物学方法来完成。此方法可直接测定和比较性测定凝胶剂、软膏剂和其它粘性和不透明的组合物在它们预期的使用浓度下的整体抗微生物效力。结果通常表示为在接种物和测试物质之间的CFU对数值的降低。
将测试细菌或酵母菌的贮存培养物置于琼脂斜面和平板上。在测试前，在适合的液体培养基中制备肉汤培养物，并将其在适合的条件下温育以达到对数后期密度。通过离心收集培养物，并以它们自身上清液的十分之一的体积重悬浮，以达到×10的浓度。将×10的接种物加入到测试物质的1g(或1ml)样品中，混合均匀并温育一段时间，其可为30秒至若干分钟至更长时间。在暴露时期的最后，将9ml适合的(非支持生长的)稀释剂加入每个测试样品中并混合均匀。随后，使用加入到无菌培养皿中的每个稀释的等分试样以连续的方式进行1∶10稀释。将适合的(支持生长的)琼脂在45℃下加入，并通过搅拌将稀释的细胞的等分试样与其混合。一旦凝固，将琼脂平板在适合的(需氧或厌氧)条件下温育，且当单个菌落可见时，将它们在显示30至300个可见菌落的稀释点下计数。计数值乘以稀释因子即为测试或对照样品中可见细胞的数目的量值。
最低抑制浓度(MIC)试验
测试样品对于微生物的MIC使用标准琼脂稀释法测定。测试方法基于用于稀释抗微生物的易感性测试的National Committee for Clinical Laboratory Standard(NCCLS)文件M7-A6-方法。
将测试样品在水中稀释1∶2至1∶24，并使用熔融琼脂培养基进一步稀释10倍，使得可在1∶20至1∶240的浓度范围内评价抗微生物活性。用于细菌的琼脂培养基为添加有生物体的良好生长所需的5％羊血的Mueller Hinton琼脂；真菌(包括酵母)在Sabouraud右旋糖培养基上生长。在适合的环境条件下，在35℃±2℃下，将微生物在琼脂培养基平板上培养16-24小时。在检查每个培养物的生存力和纯度后，将微生物悬浮在0.9重量/体积％盐水中，使McFarland标准的光密度为0.5。随后使用多点接种器将每种生物体的悬浮液施用至含一系列测试物质稀释物的琼脂平板，所述多点接种器将约0.3μL悬浮液点样至平板表面。这等于每个点有约104个菌落形成单位。作为表明接种物生存力和琼脂培养基促进生长能力的对照，将生物体同样接种到不含测试物质的培养基上。在分层气流柜中使悬浮液的点在琼脂平板中干燥，将平板倒置并置于适合单个生物体生长(即在需氧、微好氧或厌氧条件下)的温育器中。
在约24至48小时温育，直到生长物在不含测试物质的对照平板上清晰可见后，将平板从温育器中移出。在这些缓慢生长的真菌须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)和红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的情况中，在分析前将平板温育8天。将温育的平板在4℃下储存，并通过肉眼检查和使用为记录MIC数据而配置的专有图像分析系统来分析。
记录在接种点处是否存在生长，并针对单个测试微生物测定LactiSAL的MIC。将抗微生物物质的MIC定义为由肉眼判断的完全抑制可见微生物生长的测试物的最低浓度，无论接种点区域内是单一菌落还是微弱的浑浊。
实施例1-由乳脂脂解生成游离脂肪酸
酶的选择
在此实施例中使用6种可商购的脂解酶制剂：Lipomod 187(混合的真菌来源)；Lipomod 338(娄地青霉(Penicillium roqueforti))；Lipomod 621(Candida cylindricia和娄地青霉)，获自Biocatalysts Ltd，Cardiff，UK。Lipase AY 30(获自皱褶假丝酵母(Candida rugosa))和Lipase R(黑曲霉(Aspergillus niger))获自Amano-Enzyme Europe Ltd，Chipping Norton，UK。小牛前胃酶获得自Renco，New Zealand。此方法不限于这些特定的酶，且其它酶，如包含胰腺脂肪酶的获自Sigma UK的粗猪胰酶(panvreating)以及蛋白酶和α-淀粉酶以及这些酶的混合物也可用于获得最佳产率。
在此实施例中，将新鲜的巴氏杀菌的牛乳用作底物，但乳脂的其它来源的蔬菜或动物脂质也可通过酶水解而用作游离脂肪酸的来源。奶油(cream)包含50重量％的干物质，其中的40％是乳脂。相对于存在的乳脂的浓度来估计加入到每种消化物中的酶的量。例如，1重量％剂量率的特定脂解制品是乳脂含量的1％，如0.4g/100ml奶油。
水解方法
水解反应在包含100ml奶油的250ml Erlenmeyer烧瓶中进行，一式三份。在此实施例中将水解温度设为45℃，但此方法可在产生适合产率的任何温度下进行。在加入酶制剂之前，使烧瓶和内容物达到此温度。在此方法期间，将烧瓶在150rpm的旋转温育器(Stuart Scientific)中温育。在各个时间间隔处将样品取出(约10ml)并在85℃水浴中热处理10分钟以灭活酶；随后对这些样品通过方法部分中所述的GC进行脂肪酸分析。
图1显示在45℃下用各种酶消化8小时后汇总的脂肪酸特征(三种消化物的平均)。抗微生物的游离脂肪酸是己酸、辛酸、癸酸和月桂酸(C:6至C:12)，且在用Amano AY，Lipomod 187和Lipomod 621消化时观察到这些抗微生物游离脂肪酸的最高产率，当使用Amano R时观察到最低产率。
实施例2-由酶水解的乳脂中分离短链至中链游离脂肪酸及其抗微生物评价
水分配
丁酸是气味最强且抗微生物活性最低的游离脂肪酸，还是水溶性最高的游离脂肪酸，且其可通过水分配(相分离)来分离。使用从上述实施例1的Amano AY获得的消化物，在40℃下加入4体积水，将混合物剧烈搅拌以将脂质内含物分散在水中，并随后在室温下静止分离(分配)。
将水相倒出，并用4体积水进行两次连续的洗涤。如图2所示，此方法从消化物中去除80％的丁酸和约18％的己酸、辛酸、癸酸和月桂酸(C:6至C:12)。
自上述第三洗涤物中分馏经洗涤的乳脂(图2)
分馏的方法是本领域技术人员熟知的，此方法包括加热挥发分如游离脂肪酸(含或不含其它脂肪、油和/或脂质)的粗混合物，和/或其它流体如水、有机溶剂和固体。沸点最低的组分将首先从混合物中蒸发，随后随着混合物的温度升高，连续蒸发出各沸点较高的组分。蒸发出的挥发分可在冷却盘管中冷凝，并在适合的接收器中收集。以通过在加热和冷却密闭系统上使用真空泵而实现的最适合的方式降低加热的混合物的压力，使得全部组分的沸点都降低了一定的量，所述量是大气压下的沸点、真空度(Trouton公式)和已知为共沸混合物的挥发分和其它溶剂间的缔合度的因子。在复杂的体系中，监测蒸发柱顶部的温度，使得冷凝物的收集可在所需组分正在蒸发和冷凝时开始。
用于蒸馏游离脂肪酸的适合装置可获自Buchi，Switzerland，且包括Kjeldahl，K-355蒸汽蒸馏，其基本上是如下方法：通过流通蒸汽吹扫挥发分的粗组合物，并将其冷凝以获得挥发性游离脂肪酸和水的混合物；在被冷却和分离后，不溶于水的脂肪酸可通过自混合物中倒出而收集。
对蒸馏的较好控制可使用旋转蒸发器如具有真空控制器V-855的Buchi Rotavapor R-210来获得。旋转蒸发器使得旋转的圆底烧瓶中的粗混合物能够在水浴中保持恒温，而施加在所述封闭体系上的真空可从低度真空调节到中度真空，即3,000至0.1帕斯卡(大气压为1巴/100,000帕斯卡)。随着压力降低，单个组分的沸点降低，且它们连续地蒸发，条件是不形成共沸混合物，其可通过加入其它溶剂来防止。
经洗涤的乳脂的分馏的实例显示在图3中。
在蒸馏物中，丁酸从经洗涤的乳脂中的初始的4.5％升高至总蒸馏物的9.8％，抗微生物组(C:6至C:12)从经洗涤的浓缩物中的32％升高至总蒸馏物的81％，而较长链的脂肪酸(C:14至C:18.1)从91％降低至8.5％。就整体浓度而言，在经洗涤的浓缩物中抗微生物组基本未改变，为初始的99％，渗余物为26％(-3.8X)，且蒸馏物为251％(+2.5X)。
在蒸馏物中游离脂肪酸(C:4至C:12)的组成是：
丁酸          9.8％
己酸          5％
辛酸          10％
癸酸          24％
月桂酸        38％
抗微生物评价
使用上述最低抑制浓度(MIC)方法来比较浓缩物、经洗涤的浓缩物、渗余物和蒸馏物的相对抗微生物效力。实际上，已证明由于游离脂肪酸不溶于水，因此难以将蒸馏物与熔融的琼脂混合。使用表面活性剂促进增溶的意义不大，因为已发现这些表面活性剂降低游离脂肪酸的抗微生物作用。因此必须在略高于其凝固点的温度下通过剧烈搅拌而将浓缩的脂肪酸分散在熔融的琼脂中。预期抗微生物效力将与抗微生物组的浓度直接相关，但出人意料的是并非如此。
Figure BPA00001189468500181
如表3所示，尽管进一步浓缩了2.5倍，但蒸馏物的效力是初始浓缩物的1.3倍。进一步的评价表明所述未解释的差异与初始浓缩物中存在乳清蛋白有关，这些乳清蛋白的一部分进入经洗涤的浓缩物，且不存在于蒸馏物中。在进一步研究中，显然在游离脂肪酸和初始牛乳的其它脂质或非脂质大分子之间有某些形式的协同作用，且这将在以下的实施例中进行说明。
实施例3-抗微生物的游离脂肪酸与牛乳的脂质或非脂质组分的组合
牛乳的非脂质组分包括乳清蛋白、脂蛋白蛋白聚糖、寡糖和乳脂肪球膜的组分。证明将游离脂肪酸的浓缩物用乳清蛋白(乳清)的组合物乳化相对容易，且如下所示，这将引起显著放大的抗微生物作用。尽管不希望受限于解释，但似乎乳清组分可能有助于游离脂肪酸的抗微生物作用，这是因为它们中的一些是两性的，且有助于不溶性脂肪酸分散在具有更大表面积的液滴中，和/或它们具有脂肪酸和微生物细胞表面或两者之间的桥接作用。
纯化的乳清的适合来源是纯化的乳清蛋白分离物(WPI)“Provon 190”，其可商购自Glanbia PLC，Kilkenny，Ireland。
乳化方法1
将去离子水中WPI的20重量/体积％的分散物在恒定搅拌下水合4至6小时。加入一定量的聚山梨酸酯(吐温20)，所述量最适合为0.2重量/体积％，且在10分钟后，在恒定搅拌下缓慢加入10体积/体积％的适合的盐、或溶剂或其它渗透剂；适合的渗透剂可为氯化钠、硫酸铵、磷酸钠、乙醇、甲醇、甘油或乳糖。聚山梨酸酯是降低表面张力所必需的，且渗透剂是增加WPI溶液的同渗浓度所必需的，使其接近其溶解度极限。在30分钟后，将30体积/体积％的游离脂肪酸的组合物(如从实施例2的蒸馏物中获得的那些)滴加入由高速均质器产生的漩涡中。适合的均质器是安装有S18N-19G分散器，在6,000至8,000RPM下操作的Ultra-Turax Model T18(IKA Works，Wilmington，NC 28405，USA)。此方法在环境温度(18℃至22℃)下进行，且产物是白色乳液，其稠度与牛乳的稠度近似。
乳化方法2
如上所述的乳化方法1最适于在环境温度下为液体的脂肪酸组合物，当需要制备熔点高于环境温度的单个脂肪酸或组合(大于C:8的饱和脂肪)的乳液时，乳化方法必须在高于单个或组合的熔点的温度下进行：癸酸和月桂酸分别具有31.4℃和44℃的熔点，且将它们与全部组分在46℃下乳化。由于20重量/体积％的WPI悬浮液将在大于50℃的温度下开始变性，因此在此方法中将WPI的浓度降低至10重量/体积％。
通过在环境温度下恒定搅拌使Provon 190在去离子水中的10重量/体积％的悬浮液水合4至6小时。与方法1不同，不需要改变表面张力或同渗浓度。将溶液在46℃下平衡。将10重量/体积％(终体积)的月桂酸在46℃下平衡，在其中其变为液体。使用适合的均质器如方法1中所述的Ultra Turax，在乳清蛋白溶液中产生漩涡，且将熔融的月桂酸的体积迅速地一次性地加入此漩涡中。在加入月桂酸后，立即加入体积与乳清蛋白和月桂酸的总合并体积相同的碎冰，并均质至将全部液体冷却至低于8℃。产物是白色乳液，其稠度与牛乳的稠度近似。
使用上述方法1，来自实施例2的蒸馏物的游离脂肪酸的乳化的组合物具有约为游离酸自身的MIC的一半的MIC(效力×2)。乳液包含30重量％的游离酸，且应相应地调节MIC试验剂量，以由测试方法获得等剂量的游离酸和乳化的酸。
与自身MIC为30mg/ml的蒸馏物相比，观察到的乳化的蒸馏物的MIC为15mg/ml，其应被调节3.3倍以获得等价于4.5mg/ml的游离酸剂量，即是蒸馏物效力的6.6倍。
实施例4-影响其抗微生物效力的游离脂肪酸组合物的物理性质
使用实施例3中所述的乳化方法来评价游离脂肪酸的不同组合物的抗微生物性质，显示出另外三种出人意料的特征：
A)游离脂肪酸的乳化的组合物在低于其组合熔点温度下几乎没有或没有抗微生物效力。例如，癸酸的乳液在低于31.4℃时无抗微生物活性，但在高于此温度时如在37℃的正常生理温度时有显著的作用。
B)取决于整体比例，游离脂肪酸的组合物可能具有低于具有最低熔点的组分的熔点的组合熔点；有明显的溶剂效应，其使组合物的熔点降低。
C)当游离脂肪酸的组合物包括显著比例的非抗微生物游离酸或未水解的脂质时，有明显的螯合效果。抗微生物的脂肪酸的亲油性质使它们优先溶于剩余脂质或非抗微生物的游离酸中，这严重地降低或消除了抗微生物作用。
虽然在技术上容易通过如实施例2所述的分馏来纯化单个的抗微生物游离脂肪酸，但更适于从商业供应物(commercial stock)以“奶油酸”掺合物的组分的形式获得这些微生物游离脂肪酸；天然游离脂肪酸的适合的供应商是Advanced Biotech Inc，New Jersey，USA。
使用上述乳化方法2，制备天然辛酸、癸酸和月桂酸的单独的乳液；来自实施例2蒸馏物的乳液也通过方法2制备，并用在以下的比较试验中。这些“单个的”乳液(和蒸馏物)全部在46℃下制备，且与通过方法1制备的乳液中包含30重量/体积％的单个酸相比较，其包含5重量/体积％的单个酸。
使用接触生存力试验方法来评价在18℃、35℃和46℃下每种乳液在水中的2重量/体积％悬浮液的抗微生物效力。此试验在玻璃管中进行，且在接种前和悬浮期间(2分钟)将全部测试组分在水浴中在试验(teat)温度下平衡。接种物是在脑心浸出液肉汤中生长18小时的金黄色葡萄球菌培养物。CFU的降低显示在图4中。
图4显示试验温度从18℃经35℃至46℃的变化对接种物的生存力无显著影响(CFU(N＝3)log数为8)。辛酸的乳液(MP＝16.7℃)在全部测试温度下使得降低3个log数，而癸酸和月桂酸在18℃下无影响，癸酸在35℃和46℃下使得降低3个log数，而月桂酸仅在46℃下有效。蒸馏物具有16℃的熔点，且在18℃下使得降低2个log数，在35℃下使得降低3个log数，且在46℃下使得降低4个log数。结果表明脂肪酸在其熔点或低于其熔点时几乎没有或没有抗微生物作用。
脂肪酸的组合和熔点的下降
通过将不同熔点的单个脂肪酸以不同比例组合，可建立单个组分对组合物熔点相对作用的图。有各种用于测定熔点的可商购的装置，但这些值也可以通过将50μl体积的熔融组合置于96孔微量滴定板(Nunc Nalgene)的孔中来测定。将板冷却至低于最低的已知组分的熔点(此时全部孔都是固体)，使板浮在冷水浴(4℃)中，并在热静力学控制的加热器辅助下缓慢加热。加热速率应不大于每分钟1℃，且通过仔细观察，由于从不透明变为半透明，因此孔变为液体的点很明显。
图5说明了辛酸(MP＝16.7℃)的比例(重量比)增加对棕榈酸(63.5℃)、肉豆蔻酸(58.5℃)和月桂酸(44℃)的熔点的作用。
预期在一侧的纯高熔点实体和另一侧的纯低熔点实体之间是直线关系。出人意料地，此关系不是直线，此外具有出人意料的作用，其最容易通过具有相对接近的熔点的两种脂肪酸来说明；在此情况中为癸酸和辛酸。
随着低熔点辛酸的比例从50％增加，通过60％直至70％，组合的熔点降至纯辛酸的熔点之下，确切的值是：
癸酸50％∶辛酸50％    15℃
癸酸40％∶辛酸60％    14℃
癸酸30％∶辛酸70％    12℃
癸酸20％∶辛酸80％    14℃
癸酸0％∶辛酸100％    16℃
在月桂酸和癸酸之间的关系中，以及在50∶50的癸酸∶月桂酸混合物与浓度渐增的辛酸之间的关系中，类似作用是明显的，二者均示于图6中。50∶50的月桂酸和癸酸的混合物具有26℃的熔点，其比31.4℃的癸酸的熔点低约5℃。随着癸酸的比例增加至60％、70％和80％，熔点增加至27、29和30℃(比癸酸的熔点低4、2和1℃)。
随着混合物的复杂度从两种脂肪酸增至三种脂肪酸，可检测到类似的熔点下降。图6说明了50∶50的月桂酸和癸酸的混合物(熔点26℃)与浓度渐增的辛酸的关系。12℃的最低熔点可在50％辛酸和50％月桂酸∶癸酸(即25％月桂酸，25％癸酸)的浓度下检测到；相同值存在于60％辛酸的浓度下，并在70％和80％辛酸的浓度下增加至15℃，并在100％辛酸的浓度下增加至16.7℃。
图6还说明了油酸作为月桂酸和癸酸的稀释剂的应用。油酸是具有4℃的熔点的C18:1不饱和脂肪酸，且预期其对月桂酸和癸酸的熔点具有显著作用。此组合的最低熔点的下降不明显，然而当油酸的浓度增加大于50％时，对癸酸的熔点具有显著的突降作用。
然而，在抗微生物的脂肪酸组合中作为稀释剂的油酸的值具有受限的值，这是由于油酸本身没有显著的抗微生物作用，且由于其起到脂质“槽”的作用，其它抗微生物的脂肪酸可螯合到其中。
图7说明了具有不同浓度油酸的辛酸:油酸、癸酸:油酸和月桂酸:油酸的乳液的抗微生物作用。乳液通过实施例3中的方法2制备。使用2分钟接触生存力试验方法来评价每种乳液的2重量/体积％水溶液抗金黄色葡萄球菌的效力；测试在45℃下进行。结果表明当油酸浓度大于60重量/体积％时，三种游离脂肪酸(辛酸、癸酸和月桂酸)中每种的效力都显著降低。
实施例5-游离脂肪酸或其甘油酸酯或两者的乳液的抗微生物制剂
如前述实施例所示，可将脂肪酸在乳脂(甘油三酯)中分解，并将其分馏以选择性地去除或排除不希望的组分。具体而言，丁酸可从酶水解的馏分中分离，或单个游离脂肪酸可选自奶油酸的商业供应物，且以不同比例掺合在一起，这有助于操纵各种物理和化学性质如硬度(熔点)、气味(丁酸和己酸降低)、香味(保持低丁酸)和抗微生物作用(C:6至C:12比例＞50％)。
在前述实施例中还已显示出单个游离脂肪酸的选择性掺合物可使用乳清蛋白乳化。这些乳液可用于重组牛奶，其使用主要的乳蛋白酪氨酸和乳矿物质的组合物，可选地包括乳糖或将其替换为其它寡糖如多元醇或较长链的多糖(可溶纤维)，或代谢上惰性的大分子如聚乙二醇或这些的组合，使用或未使用纤维素和/或抗氧化剂加强，或更简单地，它们可用于重组脱脂乳。
由于它们的性质，游离脂肪酸具有酸性pH，且主要的乳蛋白酪氨酸的特征是酸不溶性蛋白，其在低于pH 4.5时将易于沉淀。如果将游离脂肪酸的组合物直接加入酪氨酸的溶液中，其快速凝结(凝固)，因此有理由假定这两种成分是不相容。事实上，当游离脂肪酸在乳清蛋白中乳化时，它们被有效地隔开(compartmentalise)，且它们的酸性pH作用被最小化，使得可将由实施例3方法1制备的量多至20重量/体积％的浓缩乳液加入到脱脂乳中，而对酪蛋白的含量无任何有害作用。
表4提供了普通牛奶中的脂肪酸和它们的比例的列表，和来自商业供应物的所选天然游离脂肪酸的比例的一个实例，所述商业供应物具有增强的抗微生物作用和接近普通组合物的物理性质(硬度)，这是因为它们月桂酸和硬脂酸的含量增加和油酸含量的略微降低。
脂肪酸例如表4中所列的那些脂肪酸的组合物将使重组的乳具有辣味或苦味，且如果需要，此味道可通过使用由Yang等详细描述(5)的酶促再酯化方法将这些游离酸转化为甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯来减轻。应注意到酰基酯酶也起脂肪酶的作用，且再酯化的程度取决于脂肪酸和甘油的化学计量比，且还应注意到混合的甘油酯的类型是脂肪酸的任何混合物中的摩尔比的表征，而非重量百分比的表征。
Figure BPA00001189468500241
重组的抗微生物脱脂乳
当通过实施例3中的方法1制备乳清蛋白中的乳液时，使用氯化钠调节同渗浓度，可将表4第4栏中的修改的游离脂肪酸的组合物加入到脱脂乳中以替代初始的乳脂，获得具有更强的抗微生物作用的乳制品。
可商购的脱脂奶粉(商品名Marvel)可购自Premier International Foods(UK)Ltd，Spalding，Lincolnshire，England，其可用于说明乳化的游离脂肪酸与包括酸不溶性酪蛋白的其它乳组分的相容性。
Figure BPA00001189468500251
实施例6-游离脂肪酸或甘油酯或两者的抗微生物乳液：
基于实施例4中所述，游离脂肪酸的组合物可从商业供应物制造，且为了抗微生物作用而将这些游离脂肪酸的比例最佳化。适合的抗微生物组合物的实例示于表5中，其熔点为10℃且抗微生物的脂肪酸与非抗微生物酸的比例为3∶1。
Figure BPA00001189468500252
当通过实施例3中的方法1使用乳清蛋白乳化时，乳液的稠度与新鲜牛奶的稠度接近，且具有4.2至4.8的pH使用方法中所述的MIC技术，乳液可以显示出抑制抗广谱微生物种类(包括革兰氏阴性菌和阳性菌、酵母和真菌)的强力抗微生物作用：数据示于表6中。大多数微生物物种对1∶240(0.4重量/体积％)的稀释敏感，包括抗生素抗性的金黄色葡萄球菌MRSA，最具抗性的物种是假单胞菌(Pseudomonas)，，为1∶60(1.6重量/体积％)，以及大肠杆菌，为1∶100(1重量/体积％)。因此，乳液含量在0.5重量/体积％和10重量/体积％之间的抗微生物制剂将提供所希望的抗微生物作用，其可用于对抗病原体和人和动物组织的机会菌落的治疗和预防方法中，所述机会菌落在个体的正常免疫能力因某原因减弱时可为致病的，或可为非致病的，但出于美容原因是不希望的。
Figure BPA00001189468500261
Figure BPA00001189468500271
ATCC＝American Type Culture Collection (USA)；NCTC＝National Collection of Type Culture(UK)；NCPF＝National Collection of Pathogenic Fungi(UK)；其它菌株号名称是指分离自医院实验室的临床分离株。
基于乳化的游离脂肪酸的抗微生物制剂
此实施例中所述的抗微生物乳液可以以浓缩形式使用，或在含水制剂中以0.5重量/体积％至10重量/体积％之间的稀释物的形式使用，所述含水制剂包含或不包含赋形剂、润湿剂、缓和剂、酸性调节剂、抗氧化剂、防腐剂、香味剂和/或其它抗微生物物质，包括消毒剂、杀菌剂、抗生素、杀真菌剂、杀原生动物剂和抗病毒剂，通过这些，所述抗微生物乳液具有增强的作用。
应通过实施例3中所述类型的均质器的辅助将抗微生物乳液分散在含水介质中。一旦分散，乳液将随时间推移而趋于凝固，且这可通过使用凝胶来防止，以增加介质的粘度。有许多常用在药物或化妆品制剂中的常规聚合物，且这些聚合物是本领域技术人员熟知的；常使用衍生的纤维素聚合物，且这些衍生的纤维素聚合物包括但不限于甲基、乙基和丙基衍生物，如羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和羟乙基纤维素，它们可购自The Dow Chemical Company，USA。一些常规赋形剂与游离脂肪酸的乳液不相容，且这些赋形剂包括拮抗脂肪、脂质和游离脂肪酸的大多数表面活性剂。脂肪酸的抗微生物作用的最佳pH在4.5至5.0之间，且即使正常生理pH为7.0时，在使用制剂中仍可通过加入缓冲液如0.01M至0.1M柠檬酸钠短暂保持此值。
在使用中，许多常规抗微生物剂，包括抗生素，的效力和功效随使用时间而降低，这主要是因为靶微生物物种出现对这些化合物的抗性(或部分抗性)。对此有许多实例，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素粪肠球菌(VREF)和许多其它医院传染病的出现，其是现代卫生保健实践中所关注的主要原因。
对其靶物种具有部分抑制作用的抗微生物剂的实例是唑化合物克霉唑，其通常被用于治疗酵母白色念珠菌感染。克霉唑的非处方(OTC)制剂是来自Bayer AG，Germany的Canestan，其以1重量/体积％至2重量/体积％加入杀真菌剂。使用方法部分中所述的接触生存力方法来评价1％ Canestan乳液对白色念珠菌的新鲜临床分离株的杀微生物作用，图8显示此制剂在2分钟内将生存力降低1个log数：游离脂肪酸乳液的1％水分散体自身将生存力降低3个log数，而向Canestan中加入0.2重量/体积％游离脂肪酸乳液将杀真菌效力从1增至3个log数；0.2重量/体积％乳液自身仅将生存力降低小于1个log数。
游离脂肪酸乳液的简单凝胶制剂可使用3重量/体积％的羧甲基纤维素聚合物来制备，首先将所述羧甲基纤维素聚合物用5重量/体积％甘油BP来研磨。将84ml(体积％)的0.1M柠檬酸钠(pH 4.5)加热至45℃，将5重量/体积％聚乙二醇900溶解于其中，向其中加入1重量/体积％苯氧基乙醇并通过均质分散，随后加入2重量/体积％游离脂肪酸乳液并同样通过均质分散。随后将聚乙二醇、苯氧剂乙醇和游离脂肪酸乳液的悬浮液加入到在甘油中的经研磨的羧甲基纤维素中，并充分搅拌以分散；凝胶将需要约60分钟来完全水合。
使用类似的方法并假设考虑赋形剂的相容性，可制备含游离脂肪酸乳液的多种药物，包括但不限于用于皮肤、粘膜、眼、耳、鼻、口、牙齿、胃肠道和阴道保健中的凝胶剂、乳膏剂、糊剂、软膏剂、洗剂、泡沫剂、喷雾剂、栓剂、阴道栓剂和伤口辅料。
实施例7-游离脂肪酸的非乳化的组合物的抗微生物应用
虽然有若干合理的原因将游离脂肪酸的乳液用在营养和保健应用中，但浓缩形式的非乳化的油，或在有机溶剂(包括有机酸)中稀释的非乳化的油在表面消毒中以及特别是在降低食品加工的生物荷载方面具有特定的应用；除了一些例外如带状疱疹的急性介入，浓缩形式的游离脂肪酸对于常规保健应用而言通常过于强烈。
在食品加工且特别是在屠宰肉食动物的屠宰场中，新鲜屠体被肠内容物污染的可能性很大。此类粪尿通常被沙门氏菌属物种和肠出血型大肠杆菌O157(EHEC)所污染。此类由食物携带的病原体通常是商业食品加工和家庭厨房中的巨大危害的来源；EHEC对5岁下儿童可能是致命的。游离脂肪酸的抗微生物组合物特别适合用在屠体处理中，因为它们基本上为食品级“奶油酸”，且可以以喷雾剂的形式被施用至新屠宰并剥皮的牛、猪、羊和禽、野味和鱼的整个表面。
表5中所示的游离脂肪酸组合物是油，且可被喷雾至新鲜的肉或食物加工的表面上以实现强力消毒。可通过按比例降低油酸和月桂酸的整体比例(以保持低熔点)来有效改变相同的油，以增强其抗微生物作用。同样，油可通过浓缩的乳酸或其它有机酸被稀释至多50％，而不显著损失抗微生物效力。
在牛肉屠体洗涤测试中，将游离脂肪酸的油喷雾至已被大肠杆菌O157:H7(EHEC)的对数后期培养物感染的新鲜牛肉的切片上。使细菌附着在牛肉切片上30分钟，随后对全部测试切片施用喷雾剂。将经处理的牛肉切片浸软(macerate)，并在60分钟后评价残留的细菌。
在图9中，说明了使用大肠杆菌O157:H7的四个独立的测试。在1小时后，在水洗涤的对照中残留大肠杆菌多至每平方英尺8个log数的活细胞。经处理的切片显示，在经过浸软回收，随后连续稀释和平板计数的活细胞中，log数降低4至5(99.99％)。类似结果已从其它细菌包括沙门氏菌属物种中获得。
本发明不限于上述实施方案，其可在结构和细节上改变。
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Claims (52)

1.抗微生物组合物，其包含可源自乳清脂质的两种或更多种天然游离脂肪酸的掺合物，以及作为所述游离脂肪酸的乳化剂的乳蛋白，所述游离脂肪酸选自丁酸(C4)；己酸(C6)；辛酸(C8)；癸酸(C10)；月桂酸(C12)；肉豆蔻酸(C14)；棕榈酸(C16)；棕榈油酸(C16:1)；硬脂酸(C18)；油酸(C18:1)；亚油酸(C18:2)；亚麻酸(C18:3)；和它们的酯化衍生物，其中总脂质含量的至少35％包含选自丁酸、己酸、辛酸、癸酸和月桂酸中的一种或多种的游离脂肪酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其中总脂质含量的至少50％包括选自丁酸、己酸、辛酸、癸酸和月桂酸中的一种或多种的游离脂肪酸。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述掺合物包含辛酸、癸酸和月桂酸的混合物。
4.如权利要求1至3之一所述的组合物，其中所述游离脂肪酸的掺合物的熔点低于任一单独的游离脂肪酸的最高熔点。
5.如权利要求1至4之一所述的组合物，其中所述掺合物的熔点小于45℃。
6.如权利要求1至5之一所述的组合物，其中所述掺合物的熔点小于37℃。
7.如权利要求1至6之一所述的组合物，其中所述掺合物的熔点小于18℃。
8.如权利要求3至7之一所述的组合物，其中所述辛酸∶癸酸∶月桂酸的比例为约40∶30∶30。
9.如权利要求1至8之一所述的组合物，其中所述游离脂肪酸中的至少一些被酯化。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述酯化的游离脂肪酸为甘油单酯和/或甘油二酯和/或甘油三酯的形式。
11.如权利要求9或10所述的组合物，其中所述游离脂肪酸∶酯化的甘油酯的比例为约50∶50。
12.如权利要求1至11之一所述的组合物，其中所述组合物是水可分散的。
13.如权利要求1至12之一所述的组合物，其中所述乳化剂是乳清蛋白。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述乳化剂是载脂蛋白。
15.如权利要求1至13之一所述的组合物，其中所述乳化剂是酪蛋白。
16.如权利要求1至15之一所述的组合物，其中所述乳化剂存在的浓度在约5重量％至45重量％的范围内。
17.如权利要求1至16之一所述的组合物，其中所述组合物的pH为约4.5至5.0。
18.药物制剂，其包含如权利要求1至17之一所述的组合物以及载体。
19.如权利要求18所述的药物制剂，其中所述组合物存在的浓度在约0.5重量/体积％至10重量/体积％的范围内。
20.如权利要求18或19所述的制剂，其为溶液剂、皂、凝胶剂、糊剂、软膏剂、泡沫剂、喷雾剂、散剂、阴道栓剂、敷料、片剂或食品的形式。
21.如权利要求18至20之一所述的制剂在预防或治疗白色念珠菌感染中的应用。
22.如权利要求21所述的应用，其中所述制剂为阴道内乳膏剂或凝胶剂或阴道栓剂的形式。
23.如权利要求18至20之一所述的制剂在预防或治疗非特异性细菌性阴道炎中的应用。
24.如权利要求23所述的应用，其中所述制剂为阴道内乳膏剂或凝胶剂或阴道栓剂的形式。
25.如权利要求18至20之一所述的制剂在预防或治疗皮肤感染中的应用。
26.如权利要求25所述的应用，其中所述制剂为适合局部施用的形式。
27.如权利要求18至20之一所述的制剂在治疗烧伤中的应用。
28.如权利要求27所述的应用，其中所述制剂为适合局部施用的形式。
29.如权利要求18至20之一所述的制剂在预防或治疗感染中的应用。
30.如权利要求29所述的应用，其中所述制剂为外科敷料的形式。
31.如权利要求18至20之一所述的制剂在以用于经粘膜施用至眼、鼻、口、肠或生殖器的药物的形式的应用。
32.如权利要求26所述的应用，其用于预防或治疗性传播的疾病。
33.如权利要求27所述的应用，其中所述性传播的疾病是淋病、梅毒、衣原体、疱疹和HIV中的一种或多种。
34.如权利要求18至20之一所述的应用，其用于预防或治疗胃肠道感染。
35.如权利要求34所述的应用，其中所述制剂为食品或饮料的形式。
36.如权利要求18至20之一所述的应用，其用于预防或治疗口腔疾病。
37.如权利要求36所述的应用，其中所述制剂为选自牙膏、口香糖、嗽口水或其它洁齿剂中的口腔保健制剂的形式。
38.食品补充剂，其包含权利要求1至17之一所述的组合物。
39.如权利要求38所述的食品补充剂，其中所述组合物存在的浓度在约0.5重量/体积％至10重量/体积％的范围内。
40.食品补充剂，其包含源自乳蛋白的乳化剂，以及辛酸、癸酸、月桂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的混合物。
41.如权利要求38至40之一所述的食品补充剂，其中所述食品补充剂为油的形式。
42.如权利要求38至41之一所述的食品补充剂在重组牛奶中的应用。
43.如权利要求42所述的应用，其中所述牛奶是脱脂乳或酪乳。
44.如权利要求42或43所述的应用，其中所述重组的乳包含20重量/体积％或更低的所述食品补充剂。
45.如权利要求42至44之一所述的应用，其中所述重组的乳包含10重量/体积％或更低的所述食品补充剂。
46.如权利要求42至44之一所述的应用，其中所述重组提高所述乳中天然存在的寡糖、乳矿物质和维生素的水平。
47.重组的乳，其包含如权利要求1至17之一所述的组合物。
48.如权利要求47所述的重组的乳，其进一步包含寡糖。
49.如权利要求47或48所述的重组的乳，其进一步包含乳矿物质。
50.如权利要求47至49之一所述的重组的乳，其进一步包含维生素。
51.消毒喷雾剂，其包含至少两种不同的游离脂肪酸的非水混合物，所述游离脂肪酸选自辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸。
52.如权利要求51所述的喷雾剂，其进一步包含有机溶剂稀释剂。
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