CN112080637B - 一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法 - Google Patents

一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法 Download PDF

Info

Publication number
CN112080637B
CN112080637B CN202010855490.9A CN202010855490A CN112080637B CN 112080637 B CN112080637 B CN 112080637B CN 202010855490 A CN202010855490 A CN 202010855490A CN 112080637 B CN112080637 B CN 112080637B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leaching
culture
4cgmcc
metallosphaera
photoelectron
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010855490.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112080637A (zh
Inventor
姜成英
刘双江
宋金龙
樊华
周楠
刘畅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN202010855490.9A priority Critical patent/CN112080637B/zh
Publication of CN112080637A publication Critical patent/CN112080637A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112080637B publication Critical patent/CN112080637B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C22—METALLURGY; FERROUS OR NON-FERROUS ALLOYS; TREATMENT OF ALLOYS OR NON-FERROUS METALS
    • C22B—PRODUCTION AND REFINING OF METALS; PRETREATMENT OF RAW MATERIALS
    • C22B3/00—Extraction of metal compounds from ores or concentrates by wet processes
    • C22B3/18—Extraction of metal compounds from ores or concentrates by wet processes with the aid of microorganisms or enzymes, e.g. bacteria or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C22—METALLURGY; FERROUS OR NON-FERROUS ALLOYS; TREATMENT OF ALLOYS OR NON-FERROUS METALS
    • C22B—PRODUCTION AND REFINING OF METALS; PRETREATMENT OF RAW MATERIALS
    • C22B15/00—Obtaining copper
    • C22B15/0063—Hydrometallurgy
    • C22B15/0065—Leaching or slurrying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P10/00—Technologies related to metal processing
    • Y02P10/20—Recycling

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Geology (AREA)
  • Geochemistry & Mineralogy (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种促进微生物Ar‑4生物冶金浸出率的光电能法。本发明提供了光电子催化或外加恒电势电子在提高嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar‑4CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液从硫化金属矿中浸取目的金属或目的金属离子浸出率中的应用。本发明发现模拟光电子的催化作用下，M.cuprina Ar‑4对黄铜矿中的铜离子浸出率和铁离子浸出率菌提高，具有良好的生物冶金能力。

Description

一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法。
背景技术
生物冶金的实际应用中，起初主要是利用中温(20-40℃)细菌，大多源自于Acidithiollus菌属和Leptospirillum菌属(Zhao et al.,2015)。然而，由于矿物在氧化的过程中往往产生大量的热，导致浸出槽和浸堆的温度升高，为了维持中温细菌生长条件，就需要采取各种降温措施，这大大的增加了生物冶金的运行成本并导致浸出效率可控性的下降。此外，中温细菌代时长，浸出效率低，且对黄铜矿等某些难溶矿物处理效率低下。为了解决这一问题，科研工作者将注意力集中在了能够在高温条件下生长的中度耐热菌(40-60℃)和极端嗜热(60-80℃)古菌上，并进行了大量的研究和报道。结果表明，运用一些嗜酸热古菌不但能够解决浸出过程中降温的问题，且浸出效率高，对一些难浸出的矿物如辉钼矿和黄铜矿也能持续的浸出，大大的提高了生物冶金效率。
迄今为止，发现的大多数具有生物冶金实际应用价值的嗜酸热古菌多源自于硫化叶菌目中的SulfulobusSulfolobus、Metallosphaerea以及Acidianus菌属。其中S.metallicus、A.brierleyi和M.sedula是公认目前发现的具有良好冶金效果的菌株，已被广泛用于世界范围内的生物冶金工业(Zhu et al.,2011)。
人们长期以来认为微生物能量来源分为光能与化学能，因此，微生物可分为光能营养微生物与化能营养微生物。光能营养微生物通过将太阳光转化为化学能维持生长代谢活动，化能营养微生物由于缺少光合反应系统不能直接利用太阳光能，只能通过氧化有机物或无机物获得化学能维持生长代谢活动。尽管如此，已有研究结果表明，非光合微生物可以通过接收光照条件下半导体激发的电子，从而间接利用太阳光能。这种可以通过天然半导体矿物介导作用间接利用太阳光能的非光合微生物被称为“光电能微生物”，这种能量利用途径被称为光电能营养途径。
微生物电化学系统(Bioelectrochemical System，BES)，是近年来能源和环境领域中兴起的研究热点，是在电化学、微生物学、过程工艺学等学科交叉与综合的基础上所构建的体系(Logan and Rabaey,2013)。BES最显著的特点是电荷可在微生物和电极间相互迁移。
在BES中,电化学活性细菌(Electrochemically active bacteria,EAB)具有其独特的生理特性,可以外源导电性介质(如电极)作为细胞代谢过程中的电子供体或电子受体(Babauta et al.,2012)。光照催化下，矿物光电子和微生物之间形成一个电解池系统，矿物相当于电解池的阴极提供电子，微生物在阴极接受电子，目前生物阴极的电子传递途径以及EAB在电极表面的生物膜机制仍不明确。
在生物阴极中，EAB以电极作为电子供体，电子从电极转移到微生物细胞，用于还原阴极液中的电子受体或参与细菌体内的代谢过程。生长在电极表面的微生物在氧化阴极液中的电子受体时释放的能量以ATP或NADH2的形式固定到细胞内，继而参与微生物体内一系列合成代谢反应。因此，通过对生物阴极上EAB代谢途径进行定向选择或改造，可实现某些高附加值产品的微生物电化学合成(Microbial Electrosynthesis)。
这项崭新的研究，将改变人类长期以来对地球微生物生命活动、能量获取与利用方式的认知，为探索地球早期生命起源与进化中能量来源问题提供新颖的思路。然而，当前光电子促进非光合微生物生长代谢的分子生物学机理尚未揭示。
发明内容
本发明一个目的是提供光电子催化或外加恒电势电子在提高嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液的某种用途应用。
本发明提供了提供光电子催化或外加恒电势电子在提高嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液从硫化金属矿中浸取目的金属或目的金属离子浸出率中的应用。
或本发明还提供了光电子催化或外加恒电势电子在促进嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4CGMCC NO.3402生长中的应用；
或本发明还提供了光电子催化或外加恒电势电子在提高嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4CGMCC NO.3402生物量中的应用。
嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液在光电子催化或外加恒电势电子的作用下从硫化金属矿中浸取目的金属或目的金属离子中的应用也是本发明保护的范围；
或，嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液在光电子催化或外加恒电势电子的作用下提高从硫化金属矿中浸取目的金属或目的金属离子浸出率中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述光电子催化或外加恒电势电子为外加固定阴极电势；
或，所述光电子催化或外加恒电势电子为外加固定阴极电势，所述固定阴极电势具体为400mV-500mV。
上述应用为将所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液、硫化金属矿和培养基混匀，得到电子反应体系，再在外加恒电势电子作用下进行通电反应。
上述应用中，所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402在电子反应体系中混匀的初始浓度为5.0×106-5.0×107cell/mL；
和/或，所述硫化金属矿在电子反应体系中的初始浓度为2-10g/ml。
和/或，所述通电反应的条件为：60-70℃、pH值2.0-4.0。
本发明另一个目的是提供一种从硫化金属矿中浸取目的金属的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：在光电子催化或外加恒电势电子的作用下，用嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402对硫化金属矿进行生物浸矿，得到游离的目的金属单质或目的金属离子。
上述方法中，所述光电子催化或外加恒电势电子为外加固定阴极电势；
或，所述光电子催化或外加恒电势电子为外加固定阴极电势，所述固定阴极电势具体为400mV-500mV。
上述方法中，所述生物浸矿包括如下步骤：
将所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液、硫化金属矿和培养基混匀，得到电子反应体系，再在外加恒电势电子作用下进行通电反应；
或，所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402在所述电子反应体系中混匀的初始浓度为5.0×106-5.0×107cell/mL；
和/或，所述硫化金属矿在电子反应体系中的初始浓度为2-10g/ml。
和/或，所述通电反应的条件为：60-70℃、pH值2.0-4.0。
上述中，所述硫化金属矿为黄铜矿或辉铜矿；
和/或，所述目的金属为铜或铁；
和/或，所述目的金属离子为铜离子或铁离子。
上述培养基为改进Allen培养基：
所述改进Allen培养基(用于自养培养)：配方为(1L)：(NH4)2SO4 1.30g，KH2PO40.28g，MgSO4·7H2O 0.25g，CaCl2·2H2O 0.07g，FeCl3·6H2O 0.02g，微量元素溶液1ml/L，pH 3.0，余量为水。
微量元素溶液配制(1L)：MnCl2·4H2O 0.18g，Na2B4O7·10H2O 4.5g，ZnSO4·7H2O0.22g，CuCl2·2H2O 0.05g，Na2MoO4·2H2O 0.03g，CoSO4·7H2O 0.01g，VoSO4·xH2O 0.03g，用1:5浓硫酸调节至pH 2.0，余量为水。
本发明对实验室前期分离得到的一株嗜酸嗜热生金球菌进行光电子响应研究，以发现其接受半导体光电子的关键基因，并对可能的电子传递途径进行探讨，发掘光能催化半导体介体产光电子促进生物浸矿效果的应用价值。分析菌株全基因组中参与电子传递的基因，为进一步阐述嗜酸嗜热生金球菌的光电子响应代谢途径奠定理论基础。利用电化学反应装置研究嗜酸嗜热生金球菌M.cuprina Ar-4对模拟光电子的响应能力，运用Designexpert 8.0软件进行了17组的试验设计，研究了M.cuprina Ar-4浸出黄铜矿的最适条件。根据实验结果计算出最适浸出反应温度为66.1℃，pH 2.07，最适接种量为1.22×107cell/mL。选择了两株广泛应用于生物冶金实际生产的嗜酸嗜热古菌M.prunae DSM10039与A.brierleyi DSM1561作为参比菌株，研究了模拟光电子对M.cuprina Ar-4生物浸矿的促进作用。结果表明，在模拟光电子的催化作用下，M.cuprina Ar-4在14d内对黄铜矿中的铜离子浸出率达79.7％，铁离子浸出率达48.2％，具有良好的生物冶金能力。检测了浸出过程中pH、生物量和氧化还原电势的变化，结果表明M.cuprina Ar-4与参比菌株相比具有更高的生物量、更低的pH和更适于黄铜矿浸出的氧化还原电势。
EPS的分析结果显示，在无光电能加入时M.cuprina Ar-4产生EPS中主要成分是多糖和蛋白质，且在浸出的过程中不断积累难以消除。X射线衍射、扫描电镜的实验结果表明，在浸出的过程中，没有检测到单质硫和硫层的形成，黄钾铁矾是浸出主要的产物。这说明模拟光电子可以消除硫膜钝化、同时抑制黄钾铁矾的生产来促进M.cuprina Ar-4生物浸矿的效率，特别是铁离子的浸出率升高了25％。电极表面没有生物膜形成，说明菌体以游离状态分散在培养基中。细胞生成的胞外多糖有助于电子传递，透射电镜和能谱扫描结果也支持了胞外多糖的形成。
附图说明
图1为双室电化学反应装置示意图。
图2为黄铜矿粉做电子受体时M.cuprina Ar-4对外加电子的响应随时间变化。
图3为M.cuprina Ar-4响应电子过程中亚铁离子变化。
图4为M.cuprina Ar-4响应电子过程中氧化还原电位变化。
图5为M.cuprina Ar-4响应电子过程中pH变化。
图6为响应面展示M.cuprinaAr-4生物浸出最适条件。
图7为运用电化学装置检测外加固定电势对铜离子浸出率的影响。
图8为运用电化学装置检测外加固定电势对总铁离子浸出率的影响。
图9为运用电化学装置检测外加固定电势对生物量的影响。
图10为三株嗜酸热古菌对黄铜矿中铜离子(a)和总铁(b)的浸出浓度
图11为三株嗜酸热古菌对黄铜矿浸出过程中生物量的变化
图12为三株嗜酸热古菌对黄铜矿浸出过程pH的变化
图13为黄铜矿浸出过程中胞外多聚物的成分分析
图14为XRD对黄铜矿原矿(A)和浸出4d(B)，8d(C)14d(D)后表面成分的检测
图15为运用扫描电镜对黄铜矿原矿(A)和酸浸出(B)和生物浸出14d(C,D)后表面形态的观察。
图16为荧光显微镜观察M.cuprinaAr-4。
图17为透射电镜观察M.cuprina Ar-4在通电自养和不通电异养下的菌体。
图18为ESEM显微镜观察M.cuprina Ar-4的通电自养菌体及能谱分析结果。
图19为ESEM显微镜观察M.cuprina Ar-4的胞外产物以及能谱分析。
图20为通电培养后的石墨电极表面用扫描电镜观察。
图21为亚铁离子标准曲线。
图22为铜离子标准曲线。
图23为葡萄糖测定标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中M.prunae DSM10039与A.brierleyiDSM1561购买于德国微生物保藏和细胞培养股份有限公司(DSMZ)。
下述实施例中浸出过程中重要参数的分析方法如下：
下述实施例中pH用Seven multi型pH计(Sartorius)及以Hg/HgCl作参比电极进行检测。
下述实施例中氧化还原电位(ORP)测定方法：ORP用Seven multi型pH计(Sartorius)及以Hg/HgCl作参比电极进行检测。
下述实施例中亚铁离子测定方法：
亚铁离子的测定采用1,10-邻菲罗啉分光光度法，原理参照Tamura等人于1974年的描述(Tamura et al.,1974)。试剂配制如下：铁盐标准液：0.0379g[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O]溶于50mL 1mol/L的HCl，移入1L容量瓶，加水稀释至1L。取0.5mL的乙酸钠(mol/L，pH4.5)于刻度管中，依次加入0.25mL的盐酸羟胺(1％，g/ml)，0.5mL的1,10-邻菲罗啉(0.1％，g/ml)和1mL待测样品，加水至5mL，静置10min后在510nm处检测吸光值。
绘制标准曲线(图21)用铁盐标准液代替样品，加入的量为0mL，0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL和0.7mL。
下述实施例中铜离子测定方法：
铜离子的测定原理：碱性条件下，BCO与铜离子形成蓝色可溶于水的络合物，并且在波长为580-600nm处有最高吸收峰。利用柠檬酸可以掩蔽Fe2+等元素的干扰，中性红用于指示pH，氨水用来调节体系pH值[任蔚等，2010]。
溶液配制：(1)铜标准溶液(200μg/ml)，取0.2克铜粉(优级纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，C103838-100g)，误差±0.0001g，加入25毫升浓度20％硝酸溶液，加热溶解至不再出现红棕色气体，冷却后定容至1L；(2)50％(m/m)柠檬酸水溶液；(3)0.1％(m/V)中性红的乙醇溶液；1:1氨水；1g/L的BCO(双环乙酮草酰二腙)，向装有1g BCO的烧杯中加100ml乙醇及一定量60℃的ddH2O，摇晃至溶解，冷却后加水定容至1L。
取铜的标准溶液分别加入6个含水的容量瓶中，使最终浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3mg/L。再加入2毫升柠檬酸溶液，滴入一滴中性红，向溶液中加氨水至变黄，再多加约2ml(共约5ml)，加15mlBCO，定容至50ml，反应10min后在590nm处测吸光值。根据吸光值与浓度绘制标准曲线(图22)。
铜离子浓度测定：取50ml容量瓶，加入约10ml水，吸取一定样品(终浓度在0-3mg/L之间)于其中，加入2ml柠檬酸溶液，一滴中性红，加氨水至溶液变黄后再多加约2ml(共约5ml)，加15毫升BCO溶液，加ddH2O补至刻度线，反应10min后在590nm处测吸光值，利用标准曲线可求出铜离子浓度。
下述实施例中生物量检测方法为：取1μl培养液滴于1mm×1mm血球计数板上，在显微镜油镜下放大1000倍计数，培养液中细胞或微生物的数量/mL＝每个小方格细胞或微生物平均数×稀释倍数×4×106
下述实施例中胞外蛋白含量检测：用牛血清法测蛋白含量，具体方法参考文献(Olson and Markwell,2007)。
下述实施例中胞外多糖检测：
1、EPS中总多糖的测定
苯酌硫酸法是一种测定浸矿微生物胞外多聚物中总多糖含量的有效方法。微生物胞外多糖在浓硫酸水合放热产生的高温下迅速水解成单糖，并且在酸性条件下生成的单糖脱水生成糠酸衍生物，苯酚与该衍生物会反应生成一种橙黄色的物质，在490nm处有最大吸收峰，且其吸光度与多糖的浓度呈线性关系，可根据吸光值的大小来测定微生物胞外总多糖的含量(Kinzler et al.,2003)。
标准品溶液的配制：取干燥至恒重的无水葡萄糖(北京化工厂，HG/T3475-1999)作为标准品，准确称取标准品25mg，置于烧杯中加入蒸饱水溶解，溶解后转移到250mL容量瓶中，稀释至刻度，配制成浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。
标准曲线与样品的测定：分别取浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL加入到25mL的比色管中，并分别用ddH2O补至2mL，再加入新鲜配制的6％的苯酚1mL，振荡混加热结束后立刻放入冰水浴中冷却至室温，最后用分光光度仪于490nm处比色检测吸光度值。记录并绘制标准曲线(图23)。
2、EPS中总蛋白质的测定
EPS中的总蛋白含量采用BCA法(Zeng.et al.,2010)，使用BCA蛋白质定量试剂盒(Tiangen)，以牛血清蛋白(BSA)溶液作为蛋白质标准溶液，步骤如下:(1)标准品的稀释：用无菌水对BSA标准品进行梯度稀释(20-2000μg/mL)；(2)BCA工作液的配制：根据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。(3)样品检测：分别取25μL各个梯度BSA标准液和待测样品加入到96孔板中，每个样品做3个平行实验。每孔中加入200μL BCA工作液，并充分混匀并室温放置2小时，用酶标仪于562nm处检测其吸光度。(4)含量计算：根据标准曲线计算出样品中的蛋白质浓度。
3、胞外多糖含量
用苯酚硫酸法检测胞外多糖含量，具体方法可参考文献(Dubois et al.,1951；徐光域et al.,2005)。
生物浸出过程中，相同时间间隔取样检测菌浓度、pH、ORP、硫酸根离子,铜离子和铁离子等。其中溶液中的菌浓度通过光学显微镜直接进行计数，pH和ORP用Seven multi型pH计(Sartorius)及以Hg/HgCl作参比电极进行检测，铜离子和铁离子浓度通过ContrAA700型原子吸收光谱(jena)法进行检测(Zhu et al.,2013)。
下述实施例中菌株形态和生物膜观察
1、不通电条件下菌体形态观察
利用投射电镜和扫描电镜观察不通电条件下菌体形态，10,000rpm离心15min收集菌体，去除上清后用铜网吸附置于镜头下观察。
2、石墨电极表面生物观察
利用扫描电镜(SEM)观察阴极室石墨电极表面的生物膜。
3、菌体表面元素定性分析
用环境扫描显微镜和能谱对细胞元素进行定性检测。
实施例1、嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4分离纯化鉴定
一、分离纯化鉴定
嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4是2008年6月6日从中国云南省腾冲县富含硫的热泉泥样中分离纯化得到的。Ar-4可利用FeSO4·7H2O、单质硫和还原型硫化物K2S4O6为能源好氧自养生长，具有嗜热、嗜酸、抗金属毒性的特性，而且具有氧化无机硫、二价铁或硫化矿自养生长、利用有机碳源异养生长以及利用无机碳源和有机碳源混养生长的能力。
菌株Ar-4的16S rRNA基因同源性为基础，构建了包括Ar-4在内的16株相关嗜酸热古菌的系统发育树，发育分析表明，Ar-4与Metallosphaera属的三个菌种聚成一支，并有很高的支持率，属于Metallosphaera属的新成员。
将Ar-4于2009年11月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3402，该菌株的分类命名为(Metallosphaera sp.)Ar-4；该菌株记载在授权专利：ZL 201010139731.6中，授权公告号为CN 101792728B，授权公告日为2012.08.08；以下也称为M.cuprinaAr-4。
二、菌株培养的培养基
改进Allen培养基(用于自养培养)：配方为(1L)：(NH4)2SO4 1.30g，KH2PO4 0.28g，MgSO4·7H2O 0.25g，CaCl2·2H2O 0.07g，FeCl3·6H2O 0.02g，微量元素溶液1ml，pH 3.0，余量为水。
微量元素溶液配制(1L)：MnCl2·4H2O 0.18g，Na2B4O7·10H2O 4.5g，ZnSO4·7H2O0.22g，CuCl2·2H2O 0.05g，Na2MoO4·2H2O 0.03g，CoSO4·7H2O 0.01g，VoSO4·xH2O 0.03g，余量为水，用1:5浓硫酸调节至pH 2.0。
Allen-Y培养基(用于异养培养)：在改进Allen培养基中添加酵母(0.2g/L)；
Allen-矿粉/硫粉培养基(用于自养培养)：在改进Allen培养基中加入矿粉/硫粉(2g/L)。
实施例2、嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4对光电能的响应的研究
一、设置5组实验确定菌株M.cuprinaAr-4是否具备响应矿物光电能的能力
利用恒电流电位仪提供-400mV的阴电极恒电势，用恒电势模拟光电能，研究菌株对光电子的响应过程。
实验条件分别为：1)通入CO2做为唯一能源；2)通入CO2，加入硫粉做为能源；3)通入CO2，用福建紫金黄铜矿做能源；4)自然通气，用福建紫金黄铜矿做能源；5)自然通气，用奕川黄铜矿做能源。每组实验均以不通电培养做对照，并且设置3组通电培养平行实验和3组不通电培养平行实验。
实验采用的电化学装置-双室反应器(结构如图1所示)如下：为了研究外加电势对生物冶金过程的影响，搭建了由双室电化学反应器和电化学工作站组成的研究装置。电化学反应器由两个分离开的玻璃容器组成，分为阴极室和阳极室，接合部分用螺扣连接并用阳离子交换膜(PEM,DuPont)相隔；工作电极和对电极均为光滑石墨板电极(2.5cm×10cm，上海弘枫石墨科技中心)，参比电极为218型Ag/AgCl电极，将工作电极和参比电极放置于阴极室，对电极置于阳极室，用704硅胶密封。
实验采用的黄铜矿样品的制备：黄铜矿样品由北京有色金属研究总院生物冶金国家工程实验室提供。矿样先经研磨后过200目筛，使得矿样粉末直径<75μm。矿粉用pH 2.0的酸水浸泡后烘干，使矿粉pH稳定在2.0。黄铜矿的金属成分分析通过X-射线衍射完成，主要成分为:Cu 24.64％，Fe 28.21％，Mn 0.015％，Mg 0.39％，Pb 0.08％。物相分析结果显示黄铜矿为主要物相成分，此外含有少量的石英(SiO2)。
具体方法如下：
1、Metallosphaera sp.Ar-4种子液
将实施例1得到的Metallosphaera sp.Ar-4在500mL锥形瓶中培养，每个锥形瓶中接入200mL pH 3.0的改进Allen培养基，放置在65℃高温摇床上，150rpm培养7天，得到Ar-4种子液。
2、接种培养
将上述1得到的Ar-4种子液按照5％的体积接入已经添加灭菌后改进Allen培养基的双室反应器工作电极室(阴极室)中(取样记录初始细胞数量)，得到Ar-4悬浮液，再将2g的硫粉、紫金黄铜矿或奕川黄铜矿添加至100mL Ar-4悬浮液(表1中第1种方式则不加入此)中，参比电极(Ag/AgCl)和工作电极同在阴极室。按照表1所示的5种方式65℃通电培养14天，需要通CO2时在通电培养开始向双室反应器的工作电极室中通CO2至培养瓶中无氧气存在，培养初期pH值调节至3.0，将各电极与用1000A型电化工作站(上海辰华仪器有限公司)相应导线连接，选用I-T curve法固定阴极电势400mV(恒电势)。
检测表1所示的5种方式在通电情况下培养14天后，培养液中菌的生物量(细胞数)，5种方式中每一种均设置通电培养(外加电子催化)的三个平行实验。
表1为M.cuprinaAr-4响应模拟光电子能力检测
Figure BDA0002646280410000091
注：“-”表示未检测到。
表1为通电条件下5种方式的结果，可以看出，外加电子催化条件下，菌株M.cuprina Ar-4不能利用外加电子自养厌氧生长(CO2做碳源，通电，缺氧)；虽然M.cuprinaAr-4具有硫代谢能力，但是在外加电子条件下不能以单质硫为能源，CO2做碳源进行厌氧生长(硫粉做能源，通电，缺氧)；也不能以黄铜矿为能源厌氧生长(紫金黄铜矿做能源，通电，缺氧)；而以奕川黄铜矿为能源，自然通空气条件下，通电条件下生物量增长大于不通电(奕川黄铜矿做能源，通电)；以紫金黄铜矿为能源，自然通空气条件下，通电条件生物量可以实现10倍增长，大于不通电条件(紫金黄铜矿做能源，通电)(图2)。
将表1中5种培养方式得到的培养液离心收集上清液，检测上清液中总蛋白含量和胞外多糖含量，结果如表1，在培养过程中，检测了培养液中的总蛋白含量和胞外多糖含量，均没有检测到胞外蛋白和胞外多糖的生成。
因此，推测在M.cuprinaAr-4响应外加电子的过程中没有蛋白类或糖类物质做为还原中间体来回运输电子，细胞从阴极接收电子的方式可能是直接传递的模式。
二、检测M.cuprinaAr-4在通电和不通电情况下以黄铜矿为能源具备响应外加电子的能力
按照一的方法，进行表1中紫金黄铜矿或奕川黄铜矿做能源通电实验，且以紫金黄铜矿做能源不通电和奕川黄铜矿做能源不通电为对照。
结果如下：
图2为黄铜矿粉做电子受体时M.cuprina Ar-4对外加电子的响应随时间变化，结果表明，以黄铜矿为能源时，外加恒电势电子促进M.cuprina Ar-4的生长代谢，通电条件下实验组的细胞生物量均高于不通电对照组；紫金黄铜矿的效果优于奕川黄铜矿，菌体生物量达到10倍增长，奕川黄铜矿做能源时菌体生物量增长3.9倍。
说明菌株M.cuprinaAr-4在有氧条件下、以黄铜矿为能源，具备响应外加电子的能力。
上述结果表明，光电能(外加恒电势电子)可以促进M.cuprinaAr-4生长，以便于进一步促进了对矿石的浸取率。
实施例3、模拟光电子催化嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4生物浸矿
一、模拟光电子催化M.cuprinaAr-4生物浸矿效果研究
1、Metallosphaera sp.Ar-4种子液
将实施例1得到的Metallosphaera sp.Ar-4在500mL锥形瓶中培养，每个锥形瓶中接入200mL pH 3.0的改进Allen培养基，放置在65℃高温摇床上，150rpm培养7天，得到Ar-4种子液。
2、接种培养
通电实验组：将上述1得到的Ar-4种子液按照5％的体积接入已经添加灭菌后改进Allen培养基的双室反应器工作电极室(阴极室)中(取样记录初始细胞数量)，再将2g的紫金黄铜矿添加100mLAr-4悬浮液中，培养初期pH值调节至3.0，65度通电培养(浸矿反应)14天时间，收集培养液。通电培养条件：将各电极与用1000A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)相应导线连接，选用I-T curve法固定阴极电势400mV(恒电势，模拟光电子催化)。
不通电实验组：与通电实验组的区别仅在于不通电。
设置如下不通电对照组和通电对照组：
通电对照组：与通电实验组的区别在于，不加入Ar-4种子液；
不通电对照组：与不通电实验组的区别在于，不加入Ar-4种子液；
1)亚铁离子检测
将浸矿反应14天后的培养液于8000rpm离心20min，收集上清液，检测上清液中亚铁离子(参照前面亚铁离子测定方法)变化。
结果如图3所示，在不通电条件下，菌株Ar-4对黄铁矿中铁离子的浸出先升高后下降，浓度最高为2.36mg/L，后期迅速下降到1.24mg/L；通电条件下菌株对铁的浸出在培养后期浓度较高，浓度达到2.3mg/L。菌株进入通电体系后要适应一段时间才能进入对数增长期，通电体系在8天后浸出浓度持续增长。
上述结果表明，模拟光电能可以提高菌株Ar-4对黄铁矿中铁离子的浸出能力。
2)氧化还原电位检测
将浸矿反应14天后的培养液于8000rpm离心20min，收集上清液，检测上清液中氧化还原电位变化。
结果如图4所示，通电实验组中，氧化还原电位随着Fe3+的浸出不断上升，氧化还原电势由初始的212mV上升到393mV，而不通电实验组中ORP变化平缓，氧化还原电势比通电体系低，说明通电条件可以促进M.cuprina Ar-4的生物浸矿效果。生物浸出过程中氧化还原电势的变化主要由溶液中的Fe3+/Fe2+浓度变化引起的，铁的离子形式影响氧化还原电位，沉淀度越高的铁化合物，还原电势越低，如：FeOOH/Fe2+和Fe2O3/Fe2+的还原电势为-274和-287mV，需要的吉布斯自由能大于0，较难反应；而酸性条件下Fe3+/Fe2+的中点电势Em为0.77V，吉布斯自由能△G为-74.2KJ/moL，反应较易进行。因此在浸出后期，部分Fe3+生成黄钾铁矾，氧化还原电势不再升高。
通电对照组中氧化还原电势由433mV下降到292mV，不通电对照组中氧化还原电势从412mV下降到287mV。说明在没有菌株培养时，通电条件下铁离子沉淀生成黄钾铁矾的速度比不通电更快。
3)pH值检测
将浸矿反应14天后的培养液于8000rpm离心20min，收集上清液，检测上清液中pH值变化。
结果如图5所示，表明，通电实验组pH值均是先升高后降低，其中通电对照组的变化更剧烈，反应过程中pH升高至8.8。不通电实验组体系的pH值总体变化平缓，终值为2.6。通电对照组pH升高至8.8，可能是外加电势引起体系内氧化还原反应导致。
上述结果表明，在M.cuprinaAr-4响应电子过程中，氧化还原电势和总铁离子浸出升高，pH下降，符合生物浸出过程特征，培养5天后进入对数生长期，氧化矿物生成硫酸，导致pH下降，有利于生物浸出。
二、响应面法研究M.cuprina Ar-4的最适浸出条件
通过单因素试验确定了各个影响因素的最优区间，分别为温度(60-70℃)，pH值(1.5-2.5)，接种浓度(0.1-2.0×107cell/mL培养基)，以浸出率为响应值，进行Box-Behnken试验设计，再运用Design Expert8.0软件对所得结果进行二次多项回归拟合以及方差分析，计算M.cuprina Ar-4最适的浸出黄铜矿条件。试验因素水平编码见表2。
表2为基于Box-behnken设计的三因素三水平试验参数
Figure BDA0002646280410000121
X1:temperature,–1(60℃),0(65℃),1(70℃)；X2:pH,–1(1.5),0(2.0),1(2.5)；X3:inoculum,–1(0.1×107cell/mL),0(1.1×107cell/mL),1(2.0×107cell/mL).
运用Design expert 8.0软件进行了3因素3水平的Box-design设计，3个影响因素为温度、pH、和接种浓度，共进行了17个条件的设置，培养14d后，测定每组反应中铜离子浓度，结果如表3所示。
表3为Box-Behnken设计实验结果
Figure BDA0002646280410000131
X1:temperature,–1(60℃),0(65℃),1(70℃)；X2:pH,–1(1.5),0(2.0),1(2.5)；X3:inoculum,–1(0.1×107cell/mL),0(1.1×107cell/mL),1(2.0×107cell/mL).
对所获得的结果进行了方差分析及二次多项回归拟合,得出了浸出效率对温度、pH值、接种量的多元回归方程:
Figure BDA0002646280410000132
计算模型P值＜0.000 1，说明该模型高度显著。R2＝0.9881,RAdj2＝0.9898,说明该模型相关度较好。分析的结果表明，在温度(P＜0.05)、pH(P＜0.05)和接种量(P＜0.05)3个影响因素均为显著影响因素。
图6展示了固定初始接种量为1.2×107cell/mL时，温度和pH对铜离子浸出效率的响应面图谱。在响应面的顶点，计算出最高的铜离子浸出率为83.7％，相对应的最适温度为66.1℃，最适pH2.1。从影响面法分析的结果可以看出，最适的温度和pH都与对M.cuprinaAr-4的长期驯化有关，使原本最适由pH2.5降至pH 2.0，同时也说明M.cuprina Ar-4具有良好的环境适应性。
也就是说，M.cuprina Ar-4时机最佳浸矿体系如下：
将Ar-4接入已经添加灭菌后改进Allen培养基的双室反应器工作电极室(阴极室)中，此时的初始细胞数量为1.2×107个cell/mL(培养基)，再将2g的黄铜矿添加100mL中，66.1℃度通电培养，培养中pH值维持在2。通电培养条件：将各电极与用1000A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)相应导线连接，选用I-T curve法固定阴极电势400mV(恒电势)。
三、M.cuprina Ar-4响应恒电势电子促进浸矿效果
1、Metallosphaera sp.Ar-4种子液
将实施例1得到的Metallosphaera sp.Ar-4在500mL锥形瓶中培养，每个锥形瓶中接入200mL pH 3.0的改进Allen培养基，放置在65℃高温摇床上，150rpm培养7天，得到Ar-4种子液。
2、接种培养
设置如下4组试验：
通电实验组(Mr-4+矿+电)：将上述1得到的Ar-4种子液按照5％的体积接入已经添加灭菌后100mL改进Allen培养基的双室反应器工作电极室(阴极室)中，使初始细胞数量为1.2×107个cell/mL，得到Ar-4悬浮液，再将2g的紫金黄铜矿粉添加100mLAr-4悬浮液中，阳极只加入改进Allen培养基作为缓冲液。将各电极与用1000A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)相应导线连接，选用I-T curve法固定阴极电势400mV。66.1℃度通电培养，培养中pH值维持在2。
通电不接菌对照组(无菌对照+矿+电)：与通电实验组的区别仅在于不加入Ar-4种子液。
不通电接菌实验组(Mr-4+矿)：与通电实验组的区别仅在于不通电。
不通电不接菌(无菌对照+矿)：与不通电接菌实验组的区别仅在于不通电。
上述培养时间设定为14d，结束后分析不同处理组间浸出过程的差异。运用双室反应器装置研究了外加恒电势对M.cuprina Ar-4浸出黄铜矿的影响。
检测各组培养后铜离子、亚铁离子和生物量。
生物浸取率是指在微生物的作用下，对矿石的浸取率，计算方法：(浸取后溶液中Fe2+或Cu2+的浓度-浸取前Fe2+或Cu2+的浓度)/浸取矿石中Fe或Cu的量×100％
运用电化学装置检测外加固定电势对铜离子浸出率的影响结果如图7所示，没有外加电势的情况下，经过14d的浸出后，黄铜矿的铜离子酸(CL)浸出率为9.1％(无菌对照+矿)，生物(BL)浸出率为63.5％(Mr-4+矿)，均低于摇瓶试验时的铜浸出率，这很可能是电化学反应装置通气方式不同造成的。在阴极外加400mV电势后，无论是生物(BEL)铜浸出率或是酸(CEL)浸出率均有不同程度的提高，分别达到了84.9％(Mr-4+矿+电)和24.8％(无菌对照+矿+电)。
具体分析造成浸出效率提高的原因可能有以下几点。首先，在外加恒电势400mV的情况下，浸出初期无论是生物浸出或者酸浸出，阴极(工作电极)反应体系中的电势都趋向于达到400mV，也就是说Fe2+趋向于失电子而生成Fe3+，Fe3+增加有助于非酶催化黄铜矿浸出。到了浸出反应中期，随着反应进行Fe3+的积累使得氧化还原电势升高，Fe3+在低pH的条件下易与硫酸根和K+生成黄钾铁矾沉淀，从而抑制浸出反应的进行。而外加恒电势的条件下，阴极(工作电极)反应体系中的Fe3+趋向于得电子生成Fe2+，减少了黄钾铁矾形成。从BEL和CEL的铁离子浸出率可以发现，由于黄钾铁矾沉淀的减少，铁离子的酸浸出率和生物浸出率分别提高了25％和11.3％(图8)。此外，M.cuprina Ar-4具有氧化Fe2+的能力，在反应中后期也可以成为菌体生长的能源物质。从生长量的结果中可以看出，外加电势时M.cuprinaAr-4的生物量(细胞数)大幅提高，达到了32.1×107cell/mL(图9)。
由此可见，外加电势对黄铜矿生物浸出的影响是多方面的。初步的结果表明，一个合适的外加固定电势是有利于黄铜矿的生物浸出的。
四、模拟光电子促进生物浸出效果分析
为了研究M.cuprina Ar-4浸出黄铜矿的能力，选择了2株广泛应用于生物冶金实际生产的嗜酸热古菌M.prunaeDSM10039和A.brierleyiDSM1561作为参比菌株，在相同的条件下，测定了对黄铜矿中铜离子和铁离子的浸出浓度。
1、Metallosphaera sp.Ar-4种子液
将实施例1得到的Metallosphaera sp.Ar-4在500mL锥形瓶中培养，每个锥形瓶中接入200mL pH 3.0的改进Allen培养基，放置在65℃高温摇床上，150rpm培养7天，得到Ar-4种子液。
2、接种培养
通电实验组：将上述1得到的Ar-4种子液按照5％的体积接入已经添加灭菌后100mL改进Allen培养基的双室反应器工作电极室(阴极室)中，使初始细胞数量为1.2×107cell/mL，再将2g的紫金黄铜矿粉添加100mLAr-4悬浮液中，阳极只加入改进Allen培养基作为缓冲液。将各电极与用1000A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)相应导线连接，选用I-T curve法固定阴极电势400mV(模拟光电子)。66.1℃度通电培养，培养中pH值维持在2。
以嗜酸热古菌M.prunaeDSM10039和A.brierleyiDSM1561为对照。
检测14d的通电培养浸出反应的培养液中铜离子的浓度和亚铁离子浓度。
结果如图10所示，
经过了14d的通电培养浸出反应后，M.cuprina Ar-4，A.brierleyiDSM1561和M.prunaeDSM10039对黄铜矿中铜离子浸出浓度分别达到3.913g/L(79.7％)、3.765g/L(75.6％)和2.555g/L(52.2％)，M.cuprina Ar-4的浸出能力明显高于M.prunaeDSM10039，略高于A.brierleyiDSM1561。
总铁的测定结果表明M.cuprinaAr-4与A.brierleyiDSM1561浸出浓度接近，分别为2.753g/L(48.2％)、2.715g/L，M.prunaeDSM10039则为2.172g/L；
对两种离子的浸出结果都表明M.cuprinaAr-4在光电子催化作用下具有良好的生物冶金能力。
检测14d的通电培养浸出反应中生物量、pH和氧化还原电势的变化。
生物量的研究结果表明(图11)，三株嗜酸热古菌的生物量由最初的1.0×107cell/mL分别增长至18.0×107cell/mL、17.8×107cell/mL和16.2×107cell/mL，浸出过程中生物量也十分接近，M.cuprina Ar-4具有更长对数生长周期。M.prunae DSM10039虽然也有较高的生物量，其对黄铜矿浸出效率却较低，很可能是三株菌之间的硫氧化能力不同所造成的。
pH测定的结果表明(图12，在黄铜矿浸出的过程中，pH变化幅度较大，都经历了先升高再降低的过程，M.cuprina Ar-4的浸矿体系中pH下降最多，由初始的2.02下降至1.46，A.brierleyiDSM1561与M.prunae DSM10039所在体系内pH则由初始的2.07和2.03降至1.54与1.70。浸矿过程初期，所有浸出体系中的pH均保持上升趋势至4d，这一期间酸的消耗主要是质子攻击矿物所致(Chen et al.,2014)。4d后，浸出体系内的pH开始迅速下降，这是由于微生物开始进入对数生长期，其对浸出体系内的单质硫的不断氧化而产生了硫酸，致使pH迅速下降。在无菌对照中，pH变化的幅度相对较小，但整体上也呈现出先升高后降低的趋势。
生物浸出过程中氧化还原电势的变化主要由溶液中Fe3+/Fe2+浓度变化而引起的，在黄铜矿浸出过程中，氧化还原电势随着Fe3+的浸出不断上升，到了浸出后期，虽然pH依然在下降，但由于部分三价铁离子生成了黄钾铁钒沉淀，因此氧化还原电势不再继续升高。在M.cuprina Ar-4的浸矿体系中，氧化还原电势由初始的291.5mV上升到479.6mV，当浸出达到第6天后，均维持在400mV以上，这一范围十分适合黄铜矿的浸出反应。
五、浸出过程中矿渣表面EPS的分析
将上述四中通电培养不同时间后矿渣转移到50mL离心管中，加入10mL无菌水和1.5克直径为0.425-0.6mm的无菌玻璃珠，放置于振荡器上振荡10分钟，振荡器转速为250r/min。结束后于离心机3000rpm/min离心2min，收集上清液，并于光学显微镜下检测上清液中菌体浓度，若有细菌则重复上述步骤，再向离心管中加入10mL无菌水，振荡10min后离心收集上清液，检测上清液中细菌菌体浓度，直到收集到的上清液中在显微镜下观察不到菌体为止(Karkhanis et al.,1978)，将上述收集的上清液合并于离心管中，置于高速冷冻离心机4℃，12000rpm/min离心10min，弃去管底的沉淀，上清液为矿物表面吸附细菌EPS的提取液I。为了彻底提取矿物表面细菌的EPS，将反复振荡处理过的矿渣加热处理。在收集有矿渣的离心管中加入10mL无菌水，混匀，置于75℃的水浴锅中加热30min，冷却后离心8000rpm/min、5min，收集上清液为矿物表面吸附细菌EPS的提取液II。合并后于-20℃冰箱里冷冻保藏(Zhu et al.,2012)。
对上述提取的EPS进行了成分分析(图13)，矿渣中EPS的主要成分为糖类，而蛋白质和DNA较少，不同浸出时间提取的EPS成分含量也不同，尤其是浸出反应前期变化较大。在浸出4d时，EPS总量较低，总糖为7.16mg/g，总蛋白为0.62mg/g，DNA仅有0.08mg/g。这是由于浸矿微生物刚刚到达对数生长期，缺乏足够的时间和能源物质来产生EPS。而到第8天时，EPS含量迅速提高，总糖、总蛋白和DNA分别达到了20.32mg/g、2.53mg/g和0.5mg/g。EPS的大量分泌可以帮助浸矿微生物更好的结合在矿物的表面，从而提高黄铜矿的浸出速率。到了12d时，M.cuprina Ar-4达到了最高的生物量，此时EPS中总糖、总蛋白和DNA的浓度也增加到29.28mg/g，4.53mg/g和0.89mg/g。浸出后期，尽管浸矿微生物的细胞浓度开始降低，但矿渣中EPS的含量基本保持稳定，14d时，总糖、总蛋白和DNA的浓度分别为30.24mg/g，4.86mg/g和0.88mg/g，这表明在生物浸出系统中矿物表面EPS一旦生成很难被降解或消除。
六、浸出矿渣表面成分和形态分析
为了研究浸出过程中矿物表面成分和形态的变化，运用XRD对原矿样及将上述四中通电培养4d、8d和14d的矿渣进行了分析。
结果如图14所示，Chalcopyrite为黄铜矿，Jarosite为黄钾铁钒，Quartz为石英；在4个样品中都检测到了少量的SiO2，说明其不是浸出产物。浸出4d后，矿渣表面检测到了黄钾铁钒(KFe3(SO4)2(0H)6)和辉铜矿(Cu2S)的特征峰，黄铜矿的特征峰开始减弱。到了8d时，辉铜矿(Cu2S)的特征峰消失，说明其为浸出的中间产物。黄钾铁钒的特征峰增强，开始大量积累，直至反应结束，黄钾铁矾的产生都与黄铜矿的减少成负相关，说明黄钾铁矾是浸出反应的主要产物。与大多数研究报道结果不同的是，整个浸出过程中都没有检测到单质硫的特征峰。
本发明只运用M.cuprinaAr-4单菌即达到了抑制浸出过程中单质硫的产生，说明该菌具有良好的硫氧化能力，具备运用于工业化生产的前景。
运用扫描电子显微镜对不同处理的黄铜矿表面进行了观察，从图中(图15)可以看出，原始的黄铜矿样品表面细致、光滑较为平整。经过14d酸浸出后，矿石表面出现了许多裂缝和碎片，但整体结果依然完整。相比之下，生物浸出14d后的矿石表面松散，布满孔洞和裂缝。大的裂缝中可以观察到菌体吸附在矿物表面腐蚀矿物，菌体密集的位置则出现了大的腐蚀坑。此外，从扫描电镜的图片中同样没有检测到单质硫所形成的硫层，这也与XRD的结果一致。
八、菌体形态观察
1、通电培养
1)、Metallosphaera sp.Ar-4种子液
将实施例1得到的Metallosphaera sp.Ar-4在500mL锥形瓶中培养，每个锥形瓶中接入200mL pH 3.0的改进Allen培养基，放置在65℃高温摇床上，150rpm培养7天，得到Ar-4种子液。
2)、接种培养
通电实验组：将上述1得到的Ar-4种子液按照5％的体积接入已经添加灭菌后100mL改进Allen培养基的双室反应器工作电极室(阴极室)中，使初始细胞数量为1.2×107cell/mL，再将2g的紫金黄铜矿粉添加100mLAr-4悬浮液中，阳极只加入改进Allen培养基作为缓冲液。将各电极与用1000A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)相应导线连接，选用I-T curve法固定阴极电势400mV。66.1℃度通电培养，培养中pH值维持在2。
2、不通电培养
1)、Metallosphaera sp.Ar-4种子液
将实施例1得到的Metallosphaera sp.Ar-4在500mL锥形瓶中培养，每个锥形瓶中接入200mL pH 3.0的改进Allen培养基，放置在65℃高温摇床上，150rpm培养7天，得到Ar-4种子液。
2)、接种培养
不通电异养：将上述1得到的Ar-4种子液按照5％的体积接入已经添加灭菌后100mL改进Allen培养基的双室反应器工作电极室(阴极室)中，使初始细胞数量为1.2×107cell/mL，再将2g的紫金黄铜矿粉添加100mLAr-4悬浮液中，阳极只加入改进Allen培养基作为缓冲液。66.1℃度不通电培养，培养初始pH值维持在2.1。
检测两种培养14天的培养液：
在荧光显微镜下观察通电培养和不通电培养的M.cuprinaAr-4菌体生长情况，结果如图16(染料：SYTO9，碘化丙啶混合物)所示，a、不通电培养；b、通电培养，显微镜下观察到通电条件下活菌数量较高。
透射电镜下观察通电培养和不通电培养的M.cuprinaAr-4菌体生长，结果如图17所示(A1，A2：通电培养；B1，B2：不通电培养)，表示了在透射电镜下观察M.cuprinaAr-4经外加电流电势催化后的生长情况，菌体呈球状，在以紫金黄铜矿为能源且通电培养的情况下菌体致密度较高，并且胞外有絮状物生成；不通电培养菌体为球状，表面无黑色致密层，胞外絮状物较少。
用ESEM显微镜观察通电培养和不通电培养的M.cuprinaAr-4菌体生长，用扫描电镜上配备的能谱仪检测元素种类，结果表明电镜观察到的球状体主要成分为C、O和P，还有Cu、Fe等金属元素(图18)，推测透射显微镜下菌体致密度高可能与吸收矿物金属离子有关；不通电培养，电镜观察到的球状体主要成分也为C、O和P但O和P含量较低，吸附少量Cu、Fe等金属元素，没有N元素，说明不是蛋白质类物质，推测为多糖类物质(图19)。
将通电培养后的石墨电极表面用扫描电镜观察(图20)，发现电极表面并没有生物膜的形成，培养过程中没有M.cuprinaAr-4细胞粘附在电极表面；不通电培养电极表面也未观察到生物膜的形成，培养过程中没有M.cuprinaAr-4细胞粘附在电极表面。

Claims (6)

1.光电子催化在提高嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402培养物或其发酵产物或其悬浮液从硫化金属矿中浸取目的金属或目的金属离子中的应用；
所述光电子催化采用外加固定阴极电势，所述固定阴极电势具体为400 mV-500mV；
所述应用为将所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液、硫化金属矿和培养基混匀，得到电子反应体系，再在外加恒电势电子作用下进行通电反应；
所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402在电子反应体系中混匀的初始浓度为5.0×106-5.0×107 cell/mL；
所述硫化金属矿在电子反应体系中的初始浓度为2-10 g/ml；
所述通电反应的条件为：60-70℃、pH值2.0-4.0。
2.光电子催化在促进嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402生长中的应用；
或光电子催化在提高嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4CGMCC NO.3402生物量中的应用；
所述光电子催化采用外加固定阴极电势，所述固定阴极电势具体为400 mV-500mV。
3.嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402培养物或其发酵产物或其悬浮液在光电子催化作用下从硫化金属矿中浸取目的金属或目的金属离子中的应用；
或，嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402培养物或其发酵产物或其悬浮液在光电子催化作用下提高从硫化金属矿中浸取目的金属或目的金属离子浸出率中的应用；
所述光电子催化采用外加固定阴极电势，所述固定阴极电势具体为400 mV-500mV；
所述应用为将所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液、硫化金属矿和培养基混匀，得到电子反应体系，再在外加恒电势电子作用下进行通电反应；
所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402在电子反应体系中混匀的初始浓度为5.0×106-5.0×107 cell/mL；
所述硫化金属矿在电子反应体系中的初始浓度为2-10 g/ml；
所述通电反应的条件为：60-70℃、pH值2.0-4.0。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：
所述硫化金属矿为黄铜矿或辉铜矿；
和/或，所述目的金属为铜或铁；
和/或，所述目的金属离子为铜离子或铁离子。
5.一种从硫化金属矿中浸取目的金属的方法，包括如下步骤：在光电子催化作用下，用嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402对硫化金属矿进行生物浸矿，得到游离的目的金属单质或目的金属离子；
所述光电子催化采用外加固定阴极电势，所述固定阴极电势具体为400 mV-500mV；
所述生物浸矿包括如下步骤：
将所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402或其培养物或其发酵产物或其悬浮液、硫化金属矿和培养基混匀，得到电子反应体系，再在外加恒电势电子作用下进行通电反应；
所述嗜酸嗜热生金球菌Metallosphaera sp.Ar-4 CGMCC NO.3402在所述电子反应体系中混匀的初始浓度为5.0×106-5.0×107 cell/mL；
所述硫化金属矿在电子反应体系中的初始浓度为2-10 g/ml；
所述通电反应的条件为：60-70℃、pH值2.0-4.0。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：
所述硫化金属矿为黄铜矿或辉铜矿；
和/或，所述目的金属为铜或铁；
和/或，所述目的金属离子为铜离子或铁离子。
CN202010855490.9A 2020-08-24 2020-08-24 一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法 Active CN112080637B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010855490.9A CN112080637B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010855490.9A CN112080637B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112080637A CN112080637A (zh) 2020-12-15
CN112080637B true CN112080637B (zh) 2021-11-23

Family

ID=73729490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010855490.9A Active CN112080637B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112080637B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3236671A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Marc Rodriguez Bioreactor system to produce metal

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792728B (zh) * 2010-04-01 2012-08-08 中国科学院微生物研究所 一种从金属矿石中浸取金属的方法及其专用菌株
CN103131856A (zh) * 2013-02-28 2013-06-05 中国科学院城市环境研究所 一种用于硫化铜矿浸出的生物电化学系统
EP3034635B1 (en) * 2014-12-15 2018-10-31 Middle East Mine and Industry Company Tank bioleaching of copper sulfide ores
CN108239703B (zh) * 2016-12-23 2019-09-03 有研工程技术研究院有限公司 一种控制生物浸出过程的电化学方法和设备
CN106957078B (zh) * 2017-02-17 2020-06-12 湖南有色金属研究院 一种基于铁氧化细菌的光催化半导体硫化矿降解选矿废水残余药剂的方法
CN110016554B (zh) * 2019-05-06 2020-04-24 中南大学 一种黄钾铁矾强化光催化半导体硫化矿物生物浸出的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112080637A (zh) 2020-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101792728B (zh) 一种从金属矿石中浸取金属的方法及其专用菌株
CN105734285B (zh) 一种强化闪锌矿微生物浸出的方法
CN105154474A (zh) 红色纳米硒的生物制备方法
CN110577909A (zh) 一株具有耐受重金属特性的高效解磷附球菌的制作方法
CN112080637B (zh) 一种促进微生物Ar-4生物冶金浸出率的光电能法
CN104450564B (zh) 一株可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌
Deng et al. A Geobacter strain isolated from rice paddy soil with higher bioelectricity generation capability in comparison to Geobacter sulfurreducens PCA
Glass et al. Trace metal imaging of sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea at single-cell resolution by synchrotron x-ray fluorescence imaging
CN103966128B (zh) 一株那不勒斯硫杆菌及其在生物脱硫中的应用
CN105543145B (zh) 一株脱除镁离子、磷酸根离子和铵根离子的细菌及其用途
Fang et al. Transformation of iron in pure culture process of extremely acidophilic microorganisms
CN104332645A (zh) 一种处理含铅污水的微生物燃料电池
CN103805778A (zh) 利用氨基酸加强微生物对黄铜矿中金属铜浸出的方法
Marchenko et al. Leaching heavy metal from deposits of heavy metals with bacteria oxidizing elemental sulphur
CN114854630B (zh) 一种耐硒芽孢杆菌及其选育方法和应用
Xu et al. Natural formation of copper sulfide nanoparticles via microbially mediated organic sulfur mineralization in soil: Processes and mechanisms
CN107090423B (zh) 一株喜温酸硫杆状菌的应用
US20180179512A1 (en) Novel self-photosensitized nonphotosynthetic microorganism
CN105132316A (zh) 嗜硒微生物Wautersiella enshiensis YLX-1及其应用
Mustafi et al. Biohydrogen production from Euglena acus microalgae available in Bangladesh
CN111057737B (zh) 一种铀尾矿渗滤浸出场的环境污染程度评价方法
CN102618472A (zh) 一种高砷氧化菌的选育与分离方法
CN108130286B (zh) 一种海洋细菌Bacillus sp. GP及其应用
Vasyliv et al. The changes of spectroscopic characteristics of sulfurreducing bacteria Desulfuromonas acetoxidans under the influence of different metal ions
Zheng et al. Synergy between Rhizobium phaseoli and Acidithiobacillus ferrooxidans in the bioleaching process of copper

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant