CN109520984B - 一种海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法 - Google Patents

一种海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海水中硫酸盐还原菌的快速检测方法，将待测样品与选择性培养基在厌氧条件下培养，培养结束后将培养液经滤膜过滤，然后加入到GSH‑Au(I)‑Pb(II)荧光检测液中，待测样品中的硫酸盐还原菌代谢产生的硫离子可与荧光检测液中的GSH‑Au(I)‑Pb(II)反应，使得荧光检测液的荧光淬灭，通过荧光检测液的荧光强度变化可得出待测样品中硫酸盐还原菌的浓度。本发明不使用生物酶，反应条件温和，易保存。本发明方法选择性高，检测周期短，成本低，具有极大的推广价值。

Description

一种海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种海水中硫酸盐还原菌的快速检测方法。
背景技术
硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB)是一种腐蚀性微生物，其可通过自身的代谢过程将硫酸根离子或亚硫酸根离子还原为硫离子，产生的硫离子可促进钢铁的腐蚀，对海洋工程材料造成严重的损失和威胁。目前广泛使用的硫酸盐还原菌的检测方法为最大可能数法。虽然最大可能数法具有检测灵敏度高的特点，但其检测周期过长(15天以上)。因此，开发一种灵敏度高、成本低的硫酸盐还原菌的快速检测方法显得尤为重要。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供一种海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：一种海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，将待测样品与选择性培养基在厌氧条件下培养，培养结束后将培养液经滤膜过滤，然后加入到GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液中，待测样品中的硫酸盐还原菌代谢产生的硫离子与所述荧光检测液中的GSH-Au(I)-Pb(II)反应，使得所述荧光检测液的荧光淬灭，通过所述荧光检测液中的荧光强度变化得出待测样品中硫酸盐还原菌的浓度。
所述待测样品经6000-8000转/分钟离心10-15分钟后，收集沉淀加入到选择性培养基中培养。
所述选择性培养基为：1升陈海水中加入0.4-0.6克硫酸钠，0.4-0.6克硫酸氢二钾，1.0-1.5克氯化铵，0.1-0.2克氯化钙，1.5-2.0克硫酸镁，1.0-1.5克酵母提取物，3-5毫升乳酸钠。所述陈海水是把取来的新鲜海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后得到的海水。
所述待测样品与选择性培养基在厌氧条件下培养时间为1-3天。
所述待测样品与选择性培养基在厌氧条件下的培养温度为30-35℃。
培养结束后所述培养液经0.25微米滤膜过滤。
所述GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液的制备方法为，将四氯金酸与还原性谷胱甘肽于室温下混合均匀后，加入氢氧化钠调节溶液至无色透明，老化1小时后，向其中加入硝酸铅反应5-10分钟，使其发出荧光。
所述荧光检测液的荧光强度是在激发波长为360nm，发射波长为560nm条件下测得的。
所述待测样品包括但不限于水样、土壤。
所述待测样品中硫酸盐还原菌的浓度由所述荧光检测液中的荧光完全淬灭所需要的时间计算得出，其关系式为LogCSRB＝9-0.08333t，t是培养时间。
本发明的有益效果在于：
本发明利用硫酸盐还原菌代谢产生的硫离子对检测液的响应，通过荧光检测液中的GSH-Au(I)-Pb(II)与硫酸盐还原菌的代谢产物硫离子反应，使荧光检测液的荧光强度降低，从而实现对硫酸盐还原菌的快速检测。本发明不使用生物酶，反应条件温和，易保存。本发明方法选择性高，检测周期短，成本低，具有极大的推广价值。此外，本发明不限于对海水环境中的硫酸盐还原菌作快速检测，对于其他水环境中的硫酸盐还原菌的快速检测同样适用。
附图说明
图1为GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液由无荧光变为发出强荧光。
图2为GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液加入硫酸盐还原菌待测样品前后的荧光光谱图。
图3为GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液由于加入硫酸盐还原菌待测样品导致其荧光完全淬灭所需要的时间与硫酸盐还原菌浓度的关系。
图4为GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液对相同浓度的四种细菌(硫酸盐还原菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌)降低的相对荧光强度(1-F/F0)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
一种海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，将待测样品与选择性培养基在厌氧条件下培养，培养结束后将培养液经滤膜过滤，然后将过滤后的培养液加入到GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液中，待测样品中的硫酸盐还原菌代谢产生的硫离子与所述荧光检测液中的GSH-Au(I)-Pb(II)反应，使得所述荧光检测液的荧光淬灭，通过所述荧光检测液中的荧光强度变化得出待测样品中硫酸盐还原菌的浓度。
实施例1
GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液的制备
将1.2mL 25mM四氯金酸与0.6mL 100mL还原性谷胱甘肽加入13.2mL水中，于室温下混合均匀后，加入氢氧化钠调节溶液至无色透明，老化1小时后，向其中加入1.5mL 500mM硝酸铅反应5分钟，使其在360nm激发下，由无荧光变为在560nm处有最大荧光发射(见图1)。
实施例2
将包含硫酸盐还原菌的待测样品经6000-8000转/分钟离心10-15分钟后，收集沉淀加入到选择性培养基中，厌氧条件、30-35摄氏度下培养1-3天。然后将100uL培养液经0.25微米滤膜过滤，过滤后的培养液加入到实施例1制备的100uLGSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液中，室温条件下反应5min，检测其在激发波长为360nm的荧光光谱。图2是GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液加入硫酸盐还原菌待测样品前后的荧光光谱图。从图2可见，由于硫酸盐还原菌的代谢产物硫离子与Pb2+反应，使得GSH-Au(I)-Pb(II)由聚集态重新变为解离态，GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液在加入硫酸盐还原菌待测样品前后的荧光强度有很大的差异。图3是GSH-Au(I)-Pb(II)荧光检测液由于加入硫酸盐还原菌待测样品导致其荧光完全淬灭所需要的时间与硫酸盐还原菌浓度的关系。根据其培养时间，可以定量地检测出待测样品中的硫酸盐还原菌(SRB)的浓度，其关系式为LogCSRB＝9-0.08333t，t指培养时间。
实施例3
按照实施例2的方法，检测1×105cfu mL-1的四种细菌(硫酸盐还原菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌)，四种细菌按照本方法反应1天后的荧光检测结果见图4，可见硫酸盐还原菌的荧光强度变化量远远高于另外三种细菌，表明本发明的检测方法具有良好的选择性。
本发明通过荧光检测液中的GSH-Au(I)-Pb(II)与硫酸盐还原菌的代谢产物硫离子反应，使荧光检测液的荧光强度降低，从而实现对硫酸盐还原菌的快速检测。本发明不使用生物酶，反应条件温和，易保存。本发明方法选择性高，检测周期短，成本低，具有极大的推广价值。本发明不限于对海水环境中的硫酸盐还原菌作快速检测，对于其他水环境中的硫酸盐还原菌的快速检测同样适用。
除上述实施例以外，本发明还可以有其他方式实现，在不脱离本发明内容的前提下，任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，将待测样品与选择性培养基在厌氧条件下培养，培养结束后将培养液经滤膜过滤，然后将过滤后的培养液加入到GSH-Au(Ⅰ)-Pb(Ⅱ)荧光检测液中，待测样品中的硫酸盐还原菌代谢产生的硫离子与所述荧光检测液中的GSH-Au(Ⅰ)-Pb(Ⅱ)反应，使得所述荧光检测液中的荧光淬灭，通过所述荧光检测液中的荧光强度变化得出所述待测样品中硫酸盐还原菌的浓度；
所述选择性培养基为，1升陈海水中加入0.4-0.6克硫酸钠，0.4-0.6克硫酸氢二钾，1.0-1.5克氯化铵，0.1-0.2克氯化钙，1.5-2.0克硫酸镁，1.0-1.5克酵母提取物，3-5毫升乳酸钠；
所述GSH-Au(Ⅰ)-Pb(Ⅱ)荧光检测液的制备：将1.2mL 25mM四氯金酸与0.6mL 100mL还原性谷胱甘肽加入13.2mL水中，于室温下混合均匀后，加入氢氧化钠调节溶液至无色透明，老化1小时后，向其中加入1.5mL 500mM硝酸铅反应5分钟，使其在360nm激发下，由无荧光变为在560nm处有最大荧光发射。
2.根据权利要求1所述的海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，所述待测样品经6000-8000转/分钟离心10-15分钟后，收集沉淀加入到选择性培养基中培养。
3.根据权利要求1所述的海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，所述待测样品与选择性培养基在厌氧条件下培养时间为1-3天。
4.根据权利要求1所述的海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，所述待测样品与选择性培养基在厌氧条件下的培养温度为30-35℃。
5.根据权利要求1所述的海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，培养结束后所述培养液经0.25微米滤膜过滤。
6.根据权利要求1所述的海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，所述荧光检测液的荧光强度是在激发波长为360nm，发射波长为560nm条件下测得的。
7.根据权利要求1～6任一所述的海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，所述待测样品包括但不限于水样、土壤。
8.根据权利要求1所述的海水环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法，其特征在于，所述待测样品中硫酸盐还原菌的浓度由所述荧光检测液中的荧光完全淬灭所需要的时间计算得出，其关系式为LogCSRB＝9-0.08333t，t是培养时间。
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