CN103217415B - 利用核酸适配体修饰纳米金粒子的三聚氰胺检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种食品安全技术领域的利用核酸适配体修饰纳米金粒子的三聚氰胺检测方法，通过构建含有已知三聚氰胺浓度的检测体系后，采用紫外分光光度计分别测定其在640nm和520nm处的吸光值之比并制作标准曲线；然后将经过前处理的待测对象加入含有三聚氰胺适配体、纳米金以及PDDA的混合液中；最后经测定其在640nm和520nm处的吸光值之比，通过对照标准曲线得到待测对象中的三聚氰胺的浓度。本发明操作简便，反应快速可视，检测限可达到4.3ppb。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体是一种利用核酸适配体修饰纳米金粒子，然后通过肉眼及紫外分光光度计检测牛奶中最低检测限4.3ppb的三聚氰胺的方法。
背景技术
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，主要用途是用于生产三聚氰胺-甲醛树脂塑料，加热升华，升华温度300℃，急剧加热分解，分解后可能产生毒性很大的氰化物。三聚氰胺显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。其含氮量高达66.6%，且它是一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，若在100g牛奶中添加0.1g三聚氰胺，就能提高0.4%的蛋白质虚假含量，有“蛋白精”之名。
三聚氰胺本身毒性较小，但在酸或碱的作用下，或在哺乳动物体内及细菌中，可经连续的去氨水解作用，被分解为三聚氰胺二酰胺（ammeline），三聚氰胺一酰胺（ammelide）及三聚氰酸（cyanuric acid）等代谢物（见图1-1）。其中三聚氰胺和三聚氰酸通过分子间氢键相互作用，会形成不溶于水的网状缔合大分子复合物，造成严重的肾结石。
中国国家食品质量监督检测中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加的，同年10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的管理值：
1.婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，高于1mg/kg的产品一律不得销售；
2.液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售；
3.含乳15%以上的其他食用产品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于2.5mg/kg的产品一律不得销售。
目前针对三聚氰胺检测主要有高效液相色谱法、液相色谱．质谱／质谱法等。此外，酶联免疫吸附法、毛细管电泳、质谱、红外吸收光谱、化学发光以及电化学的方法也有文献报道，这些方法一般需要进行复杂的样品前处理，仪器价格昂贵，检测成本高，且方法操作复杂，需要经过专门训练的人员才能操作，不能完全满足对牛奶中三聚氰胺残留快速筛查的检测需要。
核酸适配体是通过指数富集配体系统体外进化(SELEX)技术，从大量寡聚核苷酸库中筛选出对靶物质具有高特异性和高结核性的核酸片段。但与蛋白质类抗体和生物酶相比，核酸适配体具有更高的亲和力、稳定性和特异性，且易于标记设计出传感器，已经用于核酸、蛋白、无机金属离子及病毒颗粒和细胞的检测。尽管根据现有技术可以实现适配体与三聚氰胺通过氢键结合，但现有技术中尚无法利用PDDA（邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯）聚合纳米金颗粒，并且使用紫外分光光度计用于检测。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种利用核酸适配体修饰纳米金粒子的三聚氰胺检测方法，通过特定的适配体可以在体系中没有三聚氰胺的情况下，包裹纳米金粒子并且结合PDDA这一特点，使得三聚氰胺的加入竞争结合了体系中的适配体，从来使纳米金失去保护与PDDA反应，并且聚合，导致体系颜色从宝石红变成紫色甚至蓝色，而体系在640nm及520nm处的吸光值发生显著变化，用于三聚氰胺的检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种三聚氰胺光敏性的实现方法，通过将三聚氰胺适配体依次和纳米金溶液以及PDDA溶液混合后与三聚氰胺混合，使得混合后得到的产物在640nm和520nm波长处的共振散射信号的峰值比值与三聚氰胺浓度呈正比关系。
所述的三聚氰胺适配体的序列为：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，具体为浓度为25nM的ssDNA（single-stranded DNA，即单链DNA）。
所述的纳米金溶液的浓度为55.9μg/mL。
上述混合后得到的产物中三聚氰胺的浓度范围为：0.1–1.0μmol/L；
所述的混合具体是指：在5mL的离心管里，分别加入1.0mL25nM的ssDNA和3.0mL55.9μg/mL的纳米金溶液，静置10分钟后，添加100μL0.44nM的PDDA，在MOPS缓冲液中孵育10分钟后加入三聚氰胺。
所述的纳米金溶液是指：向100mL沸腾的0.01wt%的氯金酸中加入3.5mL1.0%的柠檬酸酸三钠溶液，加热煮沸搅拌30分钟，溶液颜色由灰色变为亮红色，停止加热并继续搅拌至冷却，然后用0.2μm超滤膜过滤。所得溶液即为纳米粒径为15nm的纳米金，并置于4°C冰箱保存备用。
本发明涉及一种利用核酸适配体修饰纳米金粒子的三聚氰胺检测方法，通过构建含有已知三聚氰胺浓度的检测体系后，采用紫外分光光度计分别测定其在640nm和520nm处的吸光值之比并制作标准曲线；然后将经过前处理的待测对象加入含有三聚氰胺适配体、纳米金以及PDDA的混合液中；最后经测定其在640nm和520nm处的吸光值之比，通过对照标准曲线得到待测对象中的三聚氰胺的浓度。
所述的前处理是指：在10mL的离心管中，添加5mL1%醋酸和1.0mL的待测液并静置5分钟；然后10000r离心10分钟，取上清后，用2.0mol/L NaOH调节pH到8.0，用于浓度检测。前处理的作用是去除牛奶中各种蛋白质等杂质的色泽影响。
所述的含有已知三聚氰胺浓度的检测体系是指：取10支包含三聚氰胺适配体、纳米金溶液以及PDDA溶液的离心管，分别加入不同浓度且经过前处理的三聚氰胺标准液，使得整个检测体系中三聚氰胺含量维持在0.1-1.0μM，反应10min后测定。
对于远高于检测体系上限的待测液可以通过比例稀释后再进行检测；其中根据3σ/slope，即标准差与斜率的比值，求得标准曲线的最低检测限为43nM，可以通过标准曲线的下延伸段实现。
所述的标准曲线是指：用紫外分光光度计检测检测体系在640nm和520nm处的吸光值A640和A520（OD），并以三聚氰胺浓度为横坐标，ΔA=A640/A520作为纵坐标得到标准曲线。
本发明的原理在于：利用核酸适配体可以在没有三聚氰胺存在的情况下，包裹纳米颗粒，结合PDDA的特点，而三聚氰胺的加入竞争结合核酸适配体，使纳米粒子失去保护，在PDDA作用下进行聚合，聚合过程溶液颜色由宝石红逐渐变为紫色甚至蓝色，对应是紫外分光光度计检测其620nm处峰值逐渐升高，540nm处峰值逐渐降低。而A640/A520的值与一定范围内三聚氰胺的浓度成线性关系，所以通过分析吸光度的信号变化，可以实现牛奶中三聚氰胺的检测。技术效果
与现有技术相比，本发明的优点在于操作简便，反应快速可视，且有较低的检测限。
附图说明
图1为核酸适配体修饰纳米粒子快速检测三聚氰胺的原理示意图。
图2为检测体系的圆二色谱图。
图3为PDDA浓度对检测体系的影响示意图。
图4为核酸适配体浓度对检测体系的影响示意图。
图5为反应时间对检测体系的影响示意图。
图6为三聚氰胺浓度与吸光度比值的关系示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1）制备检测液：制备粒径为18nm的纳米金颗粒，核酸适配体的序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。制备检测液，在5mL的离心管里，分别加入1.0mL25nM的ssDNA和3.0mL55.9μg/mL的纳米金溶液，静置10分钟后，添加100μL0.44nM的PDDA，在MOPS缓冲液中孵育10分钟，得到检测液。
2）牛奶样品的前处理：在10mL的离心管中，添加5mL1%醋酸和1.0mL的牛奶样品，静置5分钟。然后10000r离心10分钟，取上清后，用2.0mol/L NaOH调节pH到8.0。
3）制备已知三聚氰胺浓度的检测体系：取10支已添加检测液的离心管，分别加入前处理后的不同浓度三聚氰胺标准液，使得整个检测体系中三聚氰胺含量维持在0.1-1.0μM，反应10min后测定。
4）取200μL制备的标准溶液，置于96孔板板孔中，记录颜色变化后，用紫外分光光度计分别测定其在640nm和520nm处的吸光值。640nm和520nm处吸光值分别为A640和A520，计算ΔA=A640/A520
5）以不同浓度三聚氰胺与不同波长的峰值比值ΔA作图，绘制标准曲线；如图6所示，该标准曲线经拟合得到为：y=-0.002+0.883x（R2=0.998）。
6）制备样品待测体系：进行前处理后，与检测液混合，充分混匀后反应10min，按步骤4测定其ΔA。
7）根据样品所得ΔA，查标准曲线，可以求得样品中三聚氰胺含量。
8）验证：用本方法测定三份含三聚氰胺浓度分别为0.2、0.5、1.0ppm的牛奶，得到的回收率为90%～120%，证明了本方法的可靠性。
9）本方法测定牛奶中三聚氰胺的最低检测限为34nM（4.3ppb）。nM与ppm的转化过程如下，1nM melamine为10-9mol/L melamine，melamine分子量126,所以1nM=126*10-9g/L=0.126*10-3ppm=0.126ppb。
Claims (2)
1.一种三聚氰胺光敏性的实现方法，其特征在于，通过将三聚氰胺适配体依次和纳米金溶液以及PDDA溶液混合后与三聚氰胺混合，使得混合后得到的产物在640nm和520nm波长处的共振散射信号的峰值比值与三聚氰胺浓度呈正比关系；
所述的三聚氰胺适配体的序列为：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，具体为浓度为25nM的单链DNA；
所述的纳米金溶液的浓度为55.9μg/mL；所述的混合后得到的产物中三聚氰胺的浓度范围为：0.1–1.0μmol/L；
所述的混合具体是指：在5mL的离心管里，分别加入1.0mL 25nM的单链DNA和3.0mL55.9μg/mL的纳米金溶液，静置10分钟后，添加100μL 0.44nM的PDDA，在MOPS缓冲液中孵育10分钟后加入三聚氰胺；
所述的纳米金溶液是指：向100mL沸腾的0.01wt％的氯金酸中加入3.5mL 1.0％的柠檬酸酸三钠溶液，加热煮沸搅拌30分钟，溶液颜色由灰色变为亮红色，停止加热并继续搅拌至冷却，然后用0.2μm超滤膜过滤；所得溶液即为纳米粒径为15nm的纳米金，并置于4℃冰箱保存备用。
2.一种利用核酸适配体修饰纳米金粒子的三聚氰胺检测方法，其特征在于，通过构建含有已知三聚氰胺浓度的检测体系后，采用紫外分光光度计分别测定其在640nm和520nm处的吸光值之比并制作标准曲线；然后将经过前处理的待测对象加入含有三聚氰胺适配体、纳米金以及PDDA的混合液中；最后经测定其在640nm和520nm处的吸光值之比，通过对照标准曲线得到待测对象中的三聚氰胺的浓度；
所述的前处理是指：在10mL的离心管中，添加5mL 1％醋酸和1.0mL的待测液并静置5分钟；然后10000r离心10分钟，取上清后，用2.0mol/L NaOH调节pH到8.0，用于浓度检测；
所述的含有已知三聚氰胺浓度的检测体系是指：取10支包含三聚氰胺适配体、纳米金溶液以及PDDA溶液的离心管，分别加入不同浓度且经过前处理的三聚氰胺标准液，使得整个检测体系中三聚氰胺含量维持在0.1-1.0μM，反应10min后测定；
所述的标准曲线是指：用紫外分光光度计检测检测体系在640nm和520nm处的吸光值A640和A520(OD)，并以三聚氰胺浓度为横坐标，ΔA＝A640/A520作为纵坐标得到标准曲线；
所述的标准曲线为y＝-0.002+0.883x。
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